Влияние бактериальных гликополимеров на функционально-метаболический статус лейкоцитов и активность ключевых ферментов метаболизма мышей

Фомина, Алла Анатольевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Влияние бактериальных гликополимеров на функционально-метаболический статус лейкоцитов и активность ключевых ферментов метаболизма мышей
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Влияние бактериальных гликополимеров на функционально-метаболический статус лейкоцитов и активность ключевых ферментов метаболизма мышей"

2955

На правах рукописи

Фомина Алла Анатольевна

Влияние бактериальных гликополимеров на функционально-метаболический статус лейкоцитов и активность ключевых ферментов метаболизма мышей

03.00.04 - биохимия 03.00.07 - микробиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Саратов-2010

004602955

Работа выполнена на кафедре биохимии и биофизики ГОУ ВПО «Саратовский государственный университет имени Н.Г.Чернышевского» и в лаборатории биохимии Учреждения Российской академии наук Института биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАН (ИБФРМ РАН)

Научные руководители: доктор биологических наук, профессор

Коннова Светлана Анатольевна

доктор биологических наук, профессор Тихомирова Елена Ивановна

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Дыкман Лев Абрамович

доктор медицинских наук, профессор Федорова Валентина Анатольевна

Ведущая организация: ГОУ ВПО «Ульяновский государственный

университет»

Защита состоится «17» февраля 2010 г. в 14.00 на заседании диссертационного совета Д 002.146.01 при Институте биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАН (410049, г. Саратов, пр. Энтузиастов, 13). Факс (8452) 97 03 83.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Учреждения Российской академии наук ИБФРМ РАН Автореферат диссертации размещен на сайте Ьйр:/Ауту. ibppm.saratov.ru/obyav_dis.html

Автореферат разослан « января 2010 г.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор биологических наук, профессор Никитина В.Е.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. В последние десятилетия значительно возрос интерес к биополимерам, активно участвующим во взаимодействиях макро- и микроорганизмов (различные формы симбиоза, инфекции и связанные с ними патологические процессы, иммунный ответ). Гликополимеры клеточной поверхности проявляют широкий спектр биологической активности, в том числе являются основными антигенами клетки и играют ключевую роль в процессах межклеточного узнавания. В практическом плане перспективным оказалось использование биогликанов в качестве компонентов вакцин, адъювантов, противоопухолевых препаратов, неспецифических стимуляторов, а также применение их для решения экспериментальных задач в лабораторных исследованиях и в биопромышленности (Васильев с comm., 1984; Ryan et al, 2001; Valiante et al, 2003).

Особое внимание уделяется поиску новых природных иммуномодули-рующих веществ, среди которых перспективны микробные полисахариды (ПС) в силу большого разнообразия их строения и свойств. Благодаря способности к многоточечному взаимодействию с поверхностью клеток, полисахаридсодер-жащие полимеры могут обеспечивать выраженную стимуляцию различных этапов иммуногенеза (Feizi, 2000; Medzhitov and Janeway, 2000). В медицинской практике уже применяются препараты на основе бактериальных липополисаха-ридов (ЛПС) - пирогенал, продигиозан, сальмозан; экзополисахаридов (ЭПС) -ксантан, леваны, маннаны; растительных ПС - транслам, зостерин, декстраны, дрожжевой ПС - зимозан, которые значительно повышают устойчивость макроорганизма к бактериальным и вирусным инфекциям и обладают противоопухолевым действием (Хаитов и Пинегин, 2004; Ryan et al, 2001). Широко исследованы механизм и последствия воздействия на организм человека и животных ЛПС патогенных бактерий, так как они являются наиболее мощными индукторами локальной и генерализованной реакций, включая септический шок, что остается одной из серьёзных проблем современной медицины при инфекциях, вызванных грамотрицательными бактериями. В то же время характер и последствия воздействия ЛПС и других ПС непатогенных бактерий на организм человека и животных изучены крайне слабо. Многие микроорганизмы активно экс-кретируют ПС поверхности в окружающую среду, среди них ризобии, бациллы, псевдомонады и азоспириллы, которые широко распространены в природе и в последние годы используются как компоненты бактериальных удобрений (Lucy et al, 2004). Гликополимеры имеют сложную химическую структуру, большое количество функциональных групп и являются медиаторами взаимодействия бактерий с различными объектами, в связи с этим изучение характера их влияния на эукариотические организмы представляется актуальным. Важно это и с точки зрения выявления стимулирующего воздействия малых доз ПС на индукцию неспецифической резистентности макроорганизма.

В связи с этим целью данной работы явилась оценка влияния полисаха-ридсодержащих полимеров бактериального происхождения на функциональ-

ную и метаболическую активность лейкоцитов и ключевых ферментов обмена веществ в организме экспериментальных животных.

Для достижения цели были поставлены и решались следующие задачи:

1. Выделить ЛПС из внешней мембраны трех видов бактерий рода Azos-pirillum - A. irakense КВС1, A. lipoferum Sp59b, A. brasilense Sp245, Sp245.5, SRI5 и SI7— и оценить их токсичность по отношению к эукариотическим организмам.

2. Исследовать влияние ЛПС азоспирилл и ЭПС Paenibacillus polymyxa 1465 in vitro на активность перитонеальных макрофагов мышей при фагоцитозе бактериальных клеток и индукцию основных провоспалительных цитокинов клетками крови человека.

3. Изучить индукцию медиаторов кислородзависимого и кислороднеза-висимого киллинга в лейкоцитах мышей и человека для оценки их метаболического статуса на фоне действия in vitro ЛПС азоспирилл и ЭПС P. polymyxa 1465.

4. Оценить пролиферацию спленоцитов мышей в реакции бласттранс-формации лимфоцитов в присутствии полисахаридсодержащих полимеров бактерий.

5. Установить влияние in vivo ЛПС A. brasilense Sp245 на активность ключевых ферментов белкового, углеводного и липидного обменов в организме белых мышей.

Научная новизна. Впервые проведено комплексное исследование действия полисахаридсодержащих полимеров ризобактерий in vitro и in vivo на функционально-метаболическую активность лейкоцитов и ключевых ферментов метаболизма в организме экспериментальных животных. Показано, что ЛПС, выделенные с поверхности почвенных ассоциативных бактерий A. irakense КВС1, A. lipoferum Sp59b, A. brasilense Sp245, Sp245.5, SR15 и S17, обладают слабой токсичностью по отношению к эукариотическим организмам.

Установлено, что ЛПС азоспирилл и ЭПС Р. polymyxa 1465 in vitro значительно стимулируют фагоцитоз бактериальных клеток и метаболические процессы в лейкоцитах мышей и человека. Показано умеренное индуцирующее влияние исследуемых ЛПС азоспирилл на продукцию ведущих провоспалительных цитокинов ИЛ-1|3 и ФНО-а клетками цельной крови и фагоцитирующими мононуклеарами человека. ЭПС P. polymyxa 1465 преимущественно индуцируют образование ИЛ-ip мононуклеарами и незначительно - ФНО-а.

Впервые показана значительная митогенная активность препаратов ЛПС A. brasilense Sp245, A. irakense КВС1 и A. lipoferum Sp59b в отношений мышиных спленоцитов.

Доказано, что ЛПС A. brasilense Sp245 in vivo не оказывает эндотоксиче-ского действия на протекание белкового, углеводного и липидного обменов у белых мышей, но значительно стимулирует механизмы кислородзависимого киллинга в макрофагах, что позволяет рассматривать этот препарат как потенциальный иммуномодулятор.

Практическая значимость работы. Полученные результаты исследования биологической активности разных по строению бактериальных липо- и эк-

зополисахаридов в отношении эукариотических клеток необходимы для понимания и прогнозирования уровня, характера и последствий воздействия биомакромолекул непатогенных бактерий на организм человека и животных.

Скрининговые данные о биологической активности ряда полисахаридсо-держащих биополимеров в отношении механизмов клеточной резистентности могут быть использованы при выборе наиболее перспективных препаратов для дальнейшего изучения в плане возможного использования в качестве иммуно-модуляторов в медико-биологической практике. Отобраны препараты для дальнейшей химической модификации с целью нивелирования негативных эффектов при сохранении проявленной ими биологической активности. Важным положительным моментом при возможном промышленном производстве препаратов на основе гликополимеров непатогенных бактерий является их полная безопасность для персонала.

По материалам диссертационной работы опубликовано пособие «Методические рекомендации по изучению биологической активности биогликанов в отношении эукариотических клеток» (в соавторстве с С.А. Конновой и В.В. Игнатовым, 2009 г.) для практических занятий студентов старших курсов, а также для работы аспирантов и научных работников, специализирующихся в области биохимии, микробиологии и иммунохимии, рекомендованные Учебно-методической комиссией и одобренные Ученым советом биологического факультета Саратовского государственного университета им. Н.Г. Чернышевского (протокол № 10 от 1 июля 2009 г.). Результаты диссертационной работы используются в преподавании студентам биологического и химического факультетов СГУ курсов: «Основы гликологии» и «Химия и биохимия углеводов».

Основные положения диссертации, выносимые на защиту:

1. Гликополимеры ризобактерий (ЛПС бактерий рода Azospirillum и ЭПС P. polymyxa 1465) in vitro активируют процесс фагоцитоза бактериальных клеток, усиливают метаболизм лейкоцитов человека и животных и оказывают умеренное стимулирующее действие на продукцию провоспалительных цитокинов клетками цельной крови и мононуклеарами человека.

2. ЛПС A. brasilense Sp245, A. irakense КВС1 и A. lipoferum Sp59b значительно и дозозависимо стимулируют пролиферативный ответ мышиных спле-ноцитов.

3. ЛПС A. brasilense Sp245 индуцирует изменение биохимических и гематологических показателей в сыворотке крови белых мышей, не проявляя при этом эндотоксического действия; стимулирует продукцию нитрогенных и ок-сидазных форм радикалов в макрофагах.

Государственного НИИ особо чистых биопрепаратов (г. Санкт-Петербург). Эксперименты по определению активности белкового, углеводного и липидно-го обменов в организме белых мышей проведены совместно с сотрудниками биохимической группы ГНУ Саратовской научно-исследовательской ветеринарной станции РАСХН. На защиту вынесены только те положения и результаты экспериментов, в получении которых роль автора была определяющей.

Апробация работы. Основные результаты и положения работы представлены на: I и II объединенном иммунологическом форуме (Россия, Екатеринбург, 2004 г. и Санкт-Петербург, 2008); научных конференциях молодых ученых «Исследования молодых ученых и студентов в биологии» (Россия, Саратов, СГУ, 2006, 2008, 2009 гг.); XI и XIII Всероссийских научных форумах с международным участием им. академика В.И. Иоффе (Россия, Санкт-Петербург, 2007, 2009 гг.); I конференции молодых ученых медико-биологической секции Поволжской ассоциации государственных университетов (Россия, Ульяновск, 2007 г.); 4-ой Межрегиональной конференции молодых ученых «Стратегия взаимодействия микроорганизмов и растений с окружающей средой» (Россия, Саратов, ИБФРМ РАН, 2008 г.); VI Международной научной конференции «Современное состояние и перспективы развития микробиологии и биотехнологии» (Беларусь, Минск, 2008 г.); XLVII Международной научной конференции «Студент и научно-технический прогресс», посвященной 50-летию НГУ (Россия, Новосибирск, 2009 г.); Scientific Conference Biologically active substances: Fundamental and Applied Problems (Ukraine, Novy Svet, 2009 г.).

Работа частично поддержана грантом Российского фонда фундаментальных исследований в 2005-2007 гг. № 05-04-48123, руководитель д.б.н., проф. Игнатов В.В.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 18 работ, из них 2 статьи и 3 публикации материалов конференций в журналах из перечня, рекомендованного Высшей аттестационной комиссией Российской Федерации.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, трех глав, включающих обзор литературы, описание материалов и методов исследования, изложения полученных результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы, содержащего 259 источников, в том числе 109 зарубежных. Работа изложена на 149 страницах, иллюстрирована 14 рисунками и содержит 17 таблиц.

Список сокращений. AJIT - аланинаминотрансфераза; ACT - аспартата-минотрансфераза; АФК - активные формы кислорода; ЖК - жирная кислота; ИЗФ - индекс завершённости фагоцитоза; ИЛ - интерлейкин; КК - креатинки-наза; КФ - кислая фосфатаза; ЛДГ - лактатдегидрогеназа; ЛПС - липополиса-харид; МПК - мононуклеары периферической крови; МПО - миелопероксида-за; НСТ-тест - тест восстановления нитросинего тетразолия; ПМФ - перитоне-альный макрофаг; ОПС - О-специфический полисахарид; ФИ - фагоцитарный индекс; ФНО - фактор некроза опухоли; ЩФ - щелочная фосфатаза; ЭПС - эк-зополисахарид.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Обзор литературы

Глава посвящена анализу литературных данных по проблеме поиска новых природных иммуномодуляторов среди гликополимеров непатогенных бактерий, связи между особенностями их строения и биологической активностью в отношении эукариотических клеток. В обзоре литературы уделено внимание описанию тонких молекулярных механизмов взаимодействия гликополимеров с клетками-мишенями и охарактеризовано их возможное влияние на факторы естественной резистентности и обменные процессы в организме человека и животных.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ Материалы и методы исследования

В работе использованы бактерии рода АгозртИит из коллекции ИБФРМ РАН (табл. 1).

Таблица 1

Штаммы бактерий рода АияртИит, используемые в работе

Бактериальный штамм Растение-хозяин Ссылка

A. irakense КВС1 = С1Р 103311 Рис (Oryza sativa) Khammas el al., 1989

A. lipoferum Sp59b = АТСС 29708 Пшеница (Triticum aestivum) Tarrand etal., 1978

A. brasilense Sp245 Пшеница (Triticum aestivum ) Baldani et al., 1983

A. brasilense SRI5 Ежа сборная (Dactilis glomerata L.) Позднякова с соавт., 1988

A. brasilense S17 Жемчужное просо (Pennisetum glaucum) получен от Dr. Lahiri, Индия

A. brasilense Sp245.5 Спонтанный мутант, утративший 40-, 85-и 120-МДа плазмиды и образовавший ре-пликон с молекулярной массой более 300 МДа Кацы с соавт., 2002

Бактерии выращивали на жидкой синтетической малатно-солевой среде до окончания экспоненциальной фазы роста (Konnova et al, 1994). ЛПС извлекали из освобождённых от капсульного материала бактерий горячим 45%-ым раствором фенола, очищали хроматографически как в работе (Федоненко с со-авт., 2001). Определение состава жирных кислот (ЖК) ЛПС в виде метиловых эфиров ЖК проводили с помощью газожидкостной хроматографии (ГЖХ) на хроматографе Shimadzu GL-2010 (Япония). Метилирование ЛПС проводили по методу (Mayer et al., 1985). Препараты ЭПС бактерий P. polymyxa 1465, выращенных на синтетических средах с глюкозой (ЭПС1465гл) и сахарозой (ЭПСМб5сах) в качестве источников углерода, любезно предоставлены сотрудниками лаборатории биохимии ИБФРМ РАН (Егоренкова с соавт., 2008). В качестве препаратов сравнения исследовали коммерческие ЛПС Escherichia coli 055:В5 (ЛПС055 В5). продигиозан, пирогенап и растительные ПС - нейтральный (н-ПС1) и кислый (к-ПСЗ), выделенные из рдеста пронзённолистного

(Potamogeton per/oliatus L.) водной экстракцией совместно с коллегами из лаборатории биохимии ИБФРМ РАН (Фучеджи с соавт., 2008).

Для оценки биологической активности ПС препаратов по отношению к эу-кариотическим клеткам был использован комплекс тестов. Острую токсичность ЛПС определяли на тест-объектах - инфузориях колподах (Colpoda steinii) и белых лабораторных мышах, сенсибилизированных D-галактозамингидро-хлоридом, рассчитывали ЛД50 (Прозоровский с соавт., 1978). Эксперименты проведены на 210 лабораторных белых мышах, в возрасте 2-2,5 месяца, вес 1820 г, соблюдая «Правила проведения работ с использованием экспериментальных животных», утвержденные МЗ РФ. Перитонеальные макрофаги (ПМФ) и спленоциты из организма животных выделяли стандартными методиками. В работе использовали венозную кровь 28 человек - условно здоровых доноров-добровольцев. Мононуклеары (МПК) и нейтрофилы периферической крови выделяли в двойном градиенте плотности фиккол-урографина.

ПМФ использовали для моделирования процесса фагоцитоза в течение 1, 2, 4, 6 и 24 ч. Объектом фагоцитоза служила суточная культура Е. coli Са53 из коллекции Фридерика музея кафедры микробиологии и физиологии растений СГУ. Препараты ПС в концентрации 1 мкг/мл добавляли в инкубационные чашки Петри непосредственно перед внесением бактерий. Учет результатов осуществляли с помощью иммерсионной микроскопии, рассчитывали фагоцитарные индексы (ФИ) и индексы завершённости фагоцитоза (ИЗФ).

Влияние бактериальных гликополимеров на функционально-метаболический статус клеток исследовали на модели мышиных макрофагов и клеток крови человека. Образование активных форм кислорода (АФК) в клетках крови человека оценивали методом хемилюминесценции на люминометре LKB-Wallac 1251 (Финляндия), а также при постановке спектрофотометриче-ского варианта теста восстановления нитросинего тетразолия (НСТ-тест) на модели мышиных ПМФ. Активность миелопероксидазы (МПО) в лизате ПМФ оценивали спектрофотометрически при 495 нм (Саидов и Пинегин, 1991). Интенсивность продукции NO спленоцитами определяли методом Грисса по накоплению в инкубационной среде ионов N02~. Для определения активности кислой фосфатазы в нейтрофилах человека использовали коммерческий набор реактивов производства «Biozyme» (Россия).

Индукцию основных провоспалительных цитокинов (ИЛ-lß, ИЛ-8 и ФНО-а) клетками цельной крови человека исследовали на фоне действия гликополимеров в концентрациях 0,01; 0,1 и 1 мкг/мл. Определяли влияние 1 мкг/мл исследуемых препаратов на характер индукции цитокинов МПК в динамике процесса фагоцитоза Е. coli Са53 через 1, 2,4, 6 и 24 ч. Содержание цитокинов анализировали в супернатанте иммуноферментным методом с тест-системами на основе моноклональных антител производства ООО «Цитокин», г. Санкт-Петербург.

ПС-индуцированную пролиферацию мышиных спленоцитов оценивали в реакции бласттрансформации, основанной на включении меченного тритием тимидина в ДНК. Результаты пролиферативного отклика клеток представляли в импульсах за минуту (имп/мин).

Для исследования активности ключевых ферментов белкового, углеводного и липидного обменов ЛПС вводили внутрибрюшинно однократно в дозе 0,1 мкг/мышь. Через 1, 3 и 5 сут животных умерщвляли, забирали кровь и исследовали сыворотку крови с помощью полуавтоматического биохимического анализатора BS 3000 Р (Китай). Для определения активности аспартатами-нотрансферазы (ACT), аланинаминотрансферазы (АЛТ), лактатдегидрогеназы (ЛДГ), креатинкиназы (КК), щелочной фосфатазы (ЩФ), общей кислой фосфа-тазы (КФ) использовали кинетические спектрофотометрические методы. Для оценки активности углеводного и белкового обмена у мышей в сыворотке крови определяли содержание глюкозы унифицированным глюкозооксидазным методом, общего белка - методом осаждения сульфосалициловой кислотой, альбумина - методом с бромкрезоловым зеленым, мочевины - уреазным методом, креатинина - методом, основанным на реакции М. Jaffe. Для оценки липидного обмена исследовали в плазме крови содержание общего холестерина и его фракций, общих триглицеридов и их фракций, вычисляли индекс атероген-ности. Содержание гемоглобина, количество эритроцитов и лейкоцитов определяли по общепринятым методикам. Метаболическое состояние выделенных тканевых макрофагов мышей оценивали на 1, 3 и 5 сутки после введения ЛПС: продукцию АФК, N0, активность МПО по методикам, указанным выше. Результаты подвергали статистической обработке (Лакин, 1980).

Результаты и их обсуждение

Характеристика полисахаридсодержащих препаратов

Для исследования использовали ЛПС азоспирилл представителей серо-группы I - штаммы A. brasilense Sp245 (ЛПС8р245) и SRI5 (ЛЛС5!ш), и серо-группы II -A. irakense КВС1 (ЛПСквсО. A. lipoferum Sp59b (ЛПС5р59ь), а также штаммы, не отнесённые ни к одной из названных серогрупп - A. brasilense Sp245.5 CHnCsp245.s) и S17 (ЛПС3|7)- Выбор исследуемых штаммов азоспирилл для получения препаратов ЛПС обусловлен имеющимися данными, полученными сотрудниками лаборатории биохимии ИБФРМ РАН, относительно разнообразия структур ОПС, что предоставляет возможность изучения структурно-функциональных взаимосвязей проявления их активности в отношении эука-риотических организмов. Анализ особенностей известных структур ОПС на сегодняшний день позволяет разделить их на 2 группы: первая и наиболее многочисленная объединяет бактерии, ОПС которых представлены линейными гомо-полимерами различным образом связанной и замещённой рамнозы (ЛПС5р245 и ЛПС5к15); вторая группа бактерий имеет ОПС с гетерополисахаридными разветвлёнными повторяющимися звеньями (ЛПСква. ЛПС817, ЛПС5р59ь) разнообразной структуры, но сходной архитектуры (Коннова, 2008; Бойко, 2009). Как известно, высокую эндотоксическую активность проявляют липидные компоненты ЛПС, однако о структурах липидов А изучаемых препаратов сведений пока не получено. Методом ГЖХ были охарактеризованы соотношения ЖК в липидах А полученных препаратов ЛПС (рис. 1). Исследования показали, что основными по содержанию в данных ЛПС азоспирилл были 3-

гидрокситетрадекановая (3-ОН-С,4:0), гексадекановая (С16:0), 3- гидроксигекса-декановая (3-ОН-С160), октадеценовая (С,81) ЖК. Липид А ЛПС8р59ь существенно отличался от прочих препаратов высоким содержанием дидекановой (С^л), 2- и 3-гидроксидидекановой кислот (2-ОН-С12:0; 3-ОН-С12;о), а также полным отсутствием 3-гидроксигексадекановой кислоты (З-ОН-С^ р).

ЛПСЭрбЭЬ Л ПС Эр245 ЛПС в17 ЛПС КВС1 ЛПС Этб ЛПСЭр245.5

ИС12:0 ■ 2-ОН-С12:С) ПЗ-ОН-С12:0 ВЗ-ОН-С14:0 ШС16:0 иЗ-ОН-С16:0 0С18:1

Рис. 1. Содержание основных жирных кислот в препаратах ЛПС азоспирилл.

Липид А является мощным фактором, влияющим на эукариотические клетки, который может экранировать эффекты, вызываемые углеводными компонентами препаратов. Этого компонента лишены ЭПС других диазотрофных ризобактерий Р. ро1утуха 1465, представляющие собой высокомолекулярные заряженные гетерогликаны, в состав которых входит уроновая кислота (Его-ренкова и Игнатов, 2005; Егоренкова с соавт., 2006), являющаяся возможной детерминантой биологической активности. Для сравнительного изучения биологической активности микробных гликанов с растительными исследовали водорастворимые ПС водного растения рдеста пронзеннолистного, состав которых и физиологическая активность в отношении бактериальных клеток была изучена Фучеджи с соавт. (2008).

Оценка острой токсичности гликополимеров

В отношении ЭПС бактерий Р. ро1утуха и ПС высших водных растений имеются многочисленные исследования, показывающие, что в большинстве своем, они малотоксичны или нетоксичны. ЛПС грамотрицательных бактерий наряду с высокой иммунореактивностью проявляют высокую токсичность, что значительно затрудняет их использование и внедрение в медицинскую практику, поэтому на первом этапе работы исследовали токсичность ЛПС азоспирилл. В биопробе на инфузориях колподах наибольшую токсичность показал ЛПСквсь Через 15 мин его инкубации в дозе 10 мкг/мл с инфузориями наблюдали повреждение клеточных оболочек особей и отделение ее от цитоплазмы. При меньших дозах ЛПСква и остальных ЛПС азоспирилл в диапазоне доз 0,110 мкг/мл подобных токсических явлений не наблюдали. Токсичность препаратов уменьшалась в ряду ЛПСЮ!С1 > ЛПС.Чр245 > ЛПС8р59ь > ЛТ1С5р245 5 ~ ЛГ1Сяа15 = ЛПС817.

На сенсибилизированных Б-галактозамингидрохлоридом белых лабораторных мышах исследовано токсическое действие препаратов ЛПС, которые в

биопробах с инфузориями показали наибольший токсический эффект. ЛД50 для ЛПСквсьЛПС5р245 И ЛПС5р59Ь составили 4,5±0,5; 5,б±0,8 и 8,9±1,1 мкг/мышь соответственно, что полностью соотносится с результатами биопробы на простейших. Данный факт позволяет предположить, что острая токсичность ■iinCsP245.5, JinCsim и JinCSi7 будет ниже таковой исследованных ЛПС. По сравнению с классическим эндотоксином ЛПС055 В5 ЛД50 для ЛПСква в 30 раз больше, что свидетельствует о невысокой токсичности изучаемых препаратов ЛПС азоспирилл. Имеются многочисленные данные о том, что решающую роль в проявлении эндотоксической активности играет строение липида А, в частности степень фосфорилирования, состав и длина углеродных цепей ЖК (Holst et al., 1996; Seydel et al., 2005). Показано, что содержание фосфора в молекулах ЛПС азоспирилл различается (от 0 до 3,4%). Наибольшее содержание фосфора в составе ЛПСква (3,4%), а также наличие в составе наиболее длинноцепочеч-ной нанодекановой кислоты (С190) очевидно объясняет более высокую токсичность ЛПСква по сравнению с другими исследованными препаратами.

Влияние полисахаридсодержащих полимеров на активность и завершенность процесса фагоцитоза Фагоцитоз - основная функция макрофагов, которые являются преградой на пути вторжения различных инфекционных агентов в макроорганизм. Показано, что все исследуемые препараты стимулировали фагоцитоз Е. coli Са53 (табл. 2).

Таблица 2

Изменение фагоцитарных индексов при фагоцитозе E.coli Са53 перитонеальными макрофагами мыши в присутствии гликополимеров

Препарат (1 мкг/мл) Фагоцитарный индекс, %

Время воздействия 1 ч 2ч 4ч 6ч 24 ч

Контроль (без ПС) 34±2,1 32±5,7 37±0,7 40±3,5 33±2,8

ЛПСква 63±0,6* 70±2,9* 69±1,0* 63±1,5* 51±3,1*

лпс8о59Ь 63±0,7* 57±1,4* 63±0,7* 46±2,7 34±1,4

jmCsp245 45±2,8* 59±1,4* 59±2,8* 46±2,1 44±4,2*

■nnCsD245.5 47±2,6* 56±2,б* 55±4,0* 64±3,1* 43±3,5*

jmcSR15 36±1,5 41±2,3 56±4,0* 65±3,7* 65±5,4*

ЛПСш 55±1,7* 59±1,5* 61±1,0* 57±2,1* 41±2,5*

Продигиозан 51 ±2,8* 53±0,7* 63±4,9* 39±1,7 38±2,1

ЭПСмб5гл 51 ±0,7* 58±1,4* б2±0,7* 70±2,1* 58±2,1*

ЭПСмб5сах 55±2,1* 67±1,4* 67±2,8* 57±1,4* 57±2,8*

Н-ПС1 51±2,8* 5б±3,1* 66±2,0* 61±3,7* 58±4,5*

к-ПСЗ 33±2,4 48±2,1* 51±3,8* 60±1,2* 42±2,б*

Примечание: * - достоверные различия по сравнению с контролем при р<0,05.

Максимально активировал процесс фагоцитоза бактерий ЛПСква: количество активных макрофагов было достоверно выше контрольных значений на 18-38%, при этом значения ФИ превышали таковые при действии продигиоза-на, кроме 4-х часовых культур ПМФ. На фоне действия ЛПСквсь ЛПС5р55ь> ЛПСдп и ЭПС]4б5сах показана резкая активация стадии адгезии фагоцитоза: уже

к 1 ч процесса значения ФИ были на 19-29% выше контроля. При последующем моделировании процесса фагоцитоза эти же препараты, а также ЛПС5р245 и про-дигиозан максимально стимулировали увеличение количества активных макрофагов на стадии образования фаголизосомы (т.е. к 2 и 4 ч), а ЛПС$Р245.5 и ЭПС 14б5гл - к 4 и 6 ч процесса фагоцитоза бактерий. Растительные ПС в аналогичной дозе показали стимулирующее действие на фагоцитоз эшерихий на том же уровне. В присутствии JCICsris стимуляция фагоцитоза начиналась только по истечению 4 ч, что может быть связано с присутствием ассоциированного с ним опина - N5-( 1 -карбоксиэтил)-орнитина, который мог повлиять на механизм взаимодействия ЛПС с поверхностью макрофагов.

На основе ФИ были рассчитаны ИЗФ эшерихий макрофагами. В соответствии с градацией, предложенной авторами методики (Васильева с соавт., 1987), положительные показатели ИЗФ свидетельствовали о частично завершённом процессе фагоцитоза бактерий при добавлении в культуру макрофагов JinCsp59b, продигиозана, JinCsi7 и ЛПСква. ИЗФ является важным показателем для оценки способности клеток осуществлять киллинг бактерий. В условиях in vivo персистенция, либо неспособность фагоцитов к перевариванию микробов, может привести к хронизации инфекционных процесов (Маянский и Маянский, 1989; Волянский с соавт., 2005). Для ЛПСдШ5, ЭПС1465гл, ЭПСИ65сах, н-ПС1 и к-ПСЗ ИЗФ имели отрицательные значения, что позволяет предположить, что данные препараты не влияют на механизмы киллинга эшерихий. В культуре фагоцитов при добавлении ЛПС5[ш наблюдали эффект «нафаршированных» макрофагов, которые, вероятно, не были способны эффективно осуществить киллинг вследствие чрезмерного количества поглощенных ими бактериальных клеток.

Метаболический статус лейкоцитов человека и животных под воздействием биогликанов in vitro

Известно, что в результате активации лейкоцитов млекопитающих различными веществами - стимуляторами, в том числе и ЛПС грамотрицательных бактерий, изменяется их функционально-метаболическое состояние (Cadenas and Cadenas, 2002; Cuscheeri and Maier, 2007).

Установлено, что только ЛПСква и ЛПС5р59ь через 1 и 2 ч инкубации с клетками цельной крови человека усиливали образование АФК в диапазоне высоких концентраций 10-1000 мкг/мл в 1,2-1,7 раза по сравнению с контролем. В то же время классический стимулятор «респираторного взрыва» зимозан проявил высокую хемилюминесцентную активность - в 1,5 и 8 раз выше по сравнению с ЛПСква и ЛПС$р59ь через 1 и 2 ч инкубации с клетками соответственно. Полученные результаты свидетельствуют о слабом влиянии ЛПСква и ЛПС5р59ь на активацию гексозомонофосфатного шунта в клетках и окисления НАДФ-Н -ферментным комплексом - НАДФ-Н -оксидазой с образованием су-пероксиданион радикала.

Для оценки внутриклеточного кислородзависимого метаболизма мышиных макрофагов использовали НСТ-тест. Показано, что только ЛПС5р245 5 и ЛПС517 в дозе 1 мкг/мл незначительно стимулировали синтез АФК. Получен-

ные результаты при отсутствии в среде культивирования бактерий свидетельствуют о возможных протекторных свойствах этих препаратов в отношении собственных клеток макроорганизма. Выявлены возможные антиоксидантные свойства ЭПС|465сах и к-ПСЗ в интервале доз 0,01-1 мкг/мл, которые оказывали ингибирующее действие на образование АФК в макрофагах примерно на 1529%. Концентрационно-зависимого ингибирующего действия ПС препаратов на продукцию АФК выявлено не было. В исследованиях Серегиной и Михайловой (2002) ряда растительных полисахаридных препаратов отмечено, что они практически полностью ингибируют образование в клетках крови АФК и являются антиоксидантами. Полученные эффекты, возможно, связаны с тем, что в результате оказанного ПС воздействия на клетки, их метаболизм активируется, что сопровождается расходованием АФК.

Одним из ведущих ферментов кислородзависимого аппарата макрофагов наряду с НАДФ-Н-оксидазой является МПО. Установлено, что характер и уровень изменения активности фермента при добавлении во взвесь макрофагов ЛПС5р245 и ЛПС5р59Ь в диапазоне концентраций 0,01-1 мкг/мл практически совпадали с таковыми для пирогенала. Под воздействием данных ЛПС активность МПО была выше контроля в 1,4-1,7 раз. ЛПСква достоверно стимулировал активность МПО в клетках только в максимальной дозе 1 мкг/мл в 1,2 раза по сравнению с контролем. Эффекты JinCsP245.5. JinCsRis и ЛПС5п на активность фермента были практически одинаковыми: препараты в дозе 1 мкг/мл активировали МПО в ПМФ в 1,7 раза по сравнению с контрольными значениями. Растительный н-ПС1 стимулировал активность МПО в макрофагах на том же уровне только при десятикратно увеличенной дозе. Таким образом, все исследуемые ЛПС азоспирилл активировали МПО в ПМФ мышей, обеспечивающую альтернативный механизм кислородзависимого киллинга.

В настоящее время показана важность исследования еще одного метаболита активированных клеток - оксида азота. Исследования показали, что активация спленоцитов мышей ЛПС исследуемых штаммов азоспирилл приводила к дозозависимому синтезу NO (рис. 2), что согласуется с результатами других авторов, изучавших в этом тесте активность ЛПС сапрофитных бактерий Pseudomonas fluorescens (Веремейченко с соавт., 2005).

В диапазоне концентраций 0,01-1 мкг/мл ЛПС5р59ь, ЛПС3р245, ЛПС5р245.5 продукция NO возрастала в 1,2-1,6 раза по сравнению с контролем. ЛПС5я15 и ЛПСзп достоверно стимулировали образование NO в концентрации 1 мкг/мл, а ЭШС[4б5Сах - в дозе 0,01 мкг/мл. Растительные препараты сравнения Н-ПС1 и к-ПСЗ не влияли на продукцию NO спленоцитами, т.е. не оказывали воздействия на нитрогенные механизмы в клетках.

Следует отметить сильное стимулирующее действие ЛПСква на синтез NO, которое в дозах 0,01 и 0,1 мкг/мл было подобно пирогеналу, а в концентрации 1 мкг/мл - на уровне эффекта ЛПСсш в5- Однако значительная индукция NO может отражать развитие токсигенной реакции макроорганизма на эндотоксин. Возможно, сильное стимулирующее воздействие ЛПСква на синтез NO связано с его токсичностью, установленной ранее в экспериментах на мышах и простейших.

Рис. 2. Влияние ЛПС азоспирилл на продукцию N0 мышиными сгтленоцитами: А (1 -ЛПСзриь, 2 - продигиозан, 3 - пирогенал, 4 - ЛПСквсь 5 - ЛПС055 В5) и Б (6 - ЛПС5п, 7 -nnCsRis, 8 - ЛПС^р245 5, 9 - ЛПС5Р2«).

Показано, что активность КФ в фагоцитирующих нейтрофилах человека повышалась под воздействием 0,01 и 0,1 мкг/мл ЛПС5р245 и 0,01 и 1 мкг/мл JmCSR15 - представителей серогруппы I, а также 0,1 мкг/мл ЛПС3р245 5 в 1,3-1,9 раза по сравнению с контролем. Препараты сравнения продигиозан и пирогенал стимулировали активность фермента на этом же уровне при исследованных концентрациях 0,01; ОД и 1 мкг/мл. Показано, что ЭПСк65гл активировал КФ в концентрациях 0,01 и 1 мкг/мл в 2,0 и 1,8 раза соответственно. Растительный н-ПС1 в дозах 0,01 и 0,1 мкг/мл также оказывал стимулирующее влияние на активность этого фермента кислороднезависимого киллинга.

Таким образом, ЛПС азоспирилл (особенно ЛПСквсО стимулируют продукцию NO и повышение активности МПО в макрофагах, а ЛПС5р245, ЛПС5щ5 (представители серогруппы I) и ЛПС5р245.5 - активность КФ. Полученные результаты свидетельствуют о том, что О-специфическая часть ЛПС оказывает влияние на направленность активации тех или иных механизмов клеточного ответа.

Определение индуцированной полисахаридами продукции провоспалительных цитокинов

Учитывая, что цитокины являются универсальными медиаторами клеточного ответа на бактериальные гликополимеры, исследовали влияние ЛПСквсь ЛПС8Р59Ь, ЛПС$р245 и ЛПСзР245 5 на индукцию основных провоспалительных цитокинов - ИЛ-ip, ИЛ-8 и ФНО-а клетками цельной крови человека {in vitro). Показано, что в диапазоне концентраций ЛПС 0,01-1 мкг/мл продукция цито-

0.01 0.1

конц. ЛПС. мкг/ил

-А-З

-контроль

-X—5

кинов дозозависимо увеличивалась, а в контрольных пробах они не выявлялись. Отмечено стимулирующее влияние всех исследованных ЛПС азоспирилл

на индукцию ведущего провоспали-тельного цитокина ИЛ-1 ß (рис. 3).

Стимуляция продукции хемокина ИЛ-8 наблюдалась только при добавлении 0,1 И 1 МКГ/МЛ ЛПС5р59Ь И ЛПС$р243-При инкубации с клетками крови 1 мкг/мл ЛПСзР59Ь и ЛПС8р245 содержание ИЛ-8 в супернатанте составило 1532±131 пг/мл и 3163±264 пг/мл соответственно, что было достоверно ниже его концентрации при действии ЛПСо55:В5-

Среди исследуемых препаратов только ЛПСквс! и ЛПС5р245 стимулировали продукцию ФНО-а (в дозе 1 мкг/мл до 99±6 пг/мл и 90±7 пг/мл соответственно), что в 1,5 раза ниже эффектов ЛПС055 В5 и продигиозана. Умеренное стимулирующее воздействие ЛПСквс1 и ЛПС$Р245 на индукцию цито-кинов клетками периферической крови человека можно оценить как положительный иммуномодулирующий эффект.

Исследовано влияние гликополимеров на индукцию цитокинов МПК при моделировании процесса фагоцитоза in vitro Е. coli Са53. Концентрации ИЛ-lß в культуре МПК увеличивались с 1 ч фагоцитоза под воздействием всех исследованных ЛПС азоспирилл, кроме ЛПС8р59ь Результаты по его активности были неожиданными, так как в предыдущем эксперименте препарат оказывал значительное ИЛ-1 ß-индуцирующсе действие. По-видимому, это связано с тем, что в культуре цельной крови препарат активировал нейтрофилы, которые и продуцировали основное количество ИЛ-lß, определяемого в пробах. В ходе фагоцитоза в среде культивирования МПК с исследуемыми препаратами концентрация цитокина возрастала к 24 ч: максимально при добавлении ЛПСэп, ЛПС5р245 и продигиозана примерно в 2,5 раза по сравнению с контролем.

Если при добавлении всех исследованных ЛПС в среду культивирования МПК продукция ФНО-а имела плавно нарастающий характер, то ЛПС5р245 значительно индуцировал синтез цитокина уже к 1 ч фагоцитоза в 12 раз по сравнению с контролем, к 2 ч концентрация ФНО-а падала, и вновь увеличивалась на завершающих стадиях фагоцитоза. Вероятно, такие фазные изменения содержания цитокина можно объяснить его аутокринным действием и участием в саморегуляции клеток. Максимальный стимулирующий эффект на продукцию ФНО-а МПК (примерно в 20 раз по сравнению с контролем) отмечен к 24 ч при добавлении ЛПСквсь ЛПС5р59ь,. ЛПС5р245 и продигиозана.

Рис. 3. Влияние ЛПС азоспирилл на продукцию ИЛ-1р клетками цельной крови человека (1 - ЛПС5Р245.5, 2 -ЛПСКВСЬ 3 - ЛПС8р245, 4 - ЛПС5р59Ь, 5 - продигиозан, 6 - ЛПС055 В5)

Установлено, что ЭПС^™ достоверно индуцировал синтез ИЛ-1Р МПК с 1 ч процесса фагоцитоза, а ЭПСиб5сах только с 6 ч фагоцитоза эшерихий. Индукцию синтеза ФНО-а на фоне действия ЭПС бацилл наблюдали только на завершающих стадиях фагоцитоза. Растительные препараты сравнения оказывали цитокин-индуцирующее влияние на фагоциты: н-ПС1 стимулировал образование ИЛ-1, ФНО-а и ИНФ-у, а к-ПСЗ - ФНО-а, ИЛ-6.

Уровень индукции основных провоспалительных цитокинов в присутствии всех исследуемых гликополимеров не носил характера гиперпродукции.

Определение ПС-индуцированной пролиферации спленоцитов

По увеличению пролиферации спленоцитов можно судить об иммуномо-дулирующих, митогенных, а в ряде случаев и аллергенных свойствах препаратов (Хаитов с соавт., 1999). Отмечен концентрационно-зависимый характер ЛПС-индуцированной пролиферации клеток (рис. 4), что согласуется с данными Здоровенко с соавт. (2007). ЛПСква и ЛПС8р59ь усиливали пролиферацию спленоцитов в 2-4 раза по сравнению с контролем, однако, стимулирующее действие этих препаратов было достоверно ниже классического митогена -ЛПС055

Рис. 4. Влияние ЛПС азоспирюш и ЭПС Р. ро1утуха 1465 на пролиферацию мышиных спленоцитов: А (1 - ЛПС5р245 з, 2 - ЛПСквсь 3 - продигиозан, 4 - ЛПСо55:В5, 5 - ЛПС5р24;) и Б (6 - ЭПС1465ГЛ. 7 - ЭГ1С1645сах, 8 - ЛПС5р59Ь, 9 - ПрОДИГИОЗаН, 10 - ЛПСо55.В5).

Наиболее интересные результаты получены при изучении митогенной активности ЛПСзР245- Препарат в дозе 1 мкг/мл оказывал сильнейшее пролифера-

тивное действие на уровне ЛПС055.В5 в аналогичной концентрации. По сравнению с контролем пролиферативная активность в присутствии ЛПС$Р245 была выше в 9 раз. При изучении действия ЛПС5Р245 5 был получен минимальный пролиферативный ответ: в концентрации 0,01 и 1 мкг/мл препарат стимулировал пролиферацию клеток в 1,5 раза. Имеются данные, что основной вклад в митогенную активность ЛПС вносит липид А и фракция олигосахарида кора, но при удалении липида А митогенные свойства остаются, а токсические нет (Варбанец с соавт., 1990). В исследованиях Fedonenko et al. (2002) показано, что в отличие от полисахарида родительского штамма A. brasilense Sp245 му-тантный штамм A. brasilense Sp245.5 имеет иной моносахаридный состав и структуру повторяющегося звена ОПС. Полученные нами результаты позволяют говорить о важной роли ОПС для проявления и степени выраженности ми-тогенных свойств ЛПС азоспирилл в отношении спленоцитов.

Стимуляция ЭПС1465гл и ЭПС|б45сах пролиферации спленоцитов не носила концентрационно-зависимого характера и не была очень высокой (максимально активировал пролиферацию в клетках 0,1 мкг/мл 3nCi465cax в 1,8 раза по сравнению с контролем).

Влияние ЛПС$Р245 'п vivo на активность ключевых ферментов метаболизма в организме экспериментальных животных

В экспериментах in vitro было установлено, что ЛПСбР245 активирует процесс фагоцитоза, стимулирует продукцию NO-синтазы спленоцитами, индуцирует синтез основных провоспапительных цитокинов ИЛ-ip, ИЛ-8 и ФНО-а клетками цельной крови и фагоцитирующими мононуклеарами человека, а также оказывает выраженное пролиферативное действие на уровне классического эндотоксина ЛПС055 В5- В связи с этим именно ЛПС8р245 был выбран для исследования его влияния in vivo в концентрации 0,1 мкг/мышь на активность биохимических показателей состояния белкового, углеводного и липидного обменов.

Установлено, что активность ACT и КК была понижена по сравнению с контролем к 5-м суткам после введения ЛПС5р245> активность конечного фермента гликолиза ЛДГ на протяжении всего исследования оставалась в пределах контрольных значений (табл. 3). Логично предположить, что компенсация энергетической недостаточности клеток происходила за счет глюкозо-аланинового шунта, т.к. активность АЛТ возрастала в 1,5 раза по сравнению с контролем к 5-м суткам после введения ЛПС$Р245- В исследованиях других авторов (Хасина с соавт., 2007) показано, что активность АЛТ, индуцированная действием ЛПСо55 В5, возрастала уже на 1-е сутки после введения препарата в 1,5 раза, что свидетельствовало о функциональных нарушениях в печени животных. В проведённых нами экспериментах активность ЩФ увеличивалась в 5 раз на 3-й и 5-е сутки, а КФ - в 4 раза уже с I-х суток и до 5-х суток находилась на одном уровне. Известно, что фосфатазы конкурируют с креатинкиназой за неорганический фосфат, поэтому логично, что обнаруженное нами повышение их активности происходит на фоне уменьшения КК и снижения синтеза креа-тинфосфата. ЩФ участвует в поддержании нормального уровня глюкозы в кро-

ви, следовательно, рост активности ЩФ в сыворотке крови экспериментальных животных косвенно указывает на увеличение доли анаэробного окисления глюкозы в гликолизе.

Таблица 3

Влияние JinCsp245 на биохимические показатели сыворотки крови мышей

Показатели Интактные мыши Время после введения ЛПС sd245, сут

1 3 5

АЛТ, мкМ/мин-л 303±40 232±12* 370±28 457±35*

ACT, мкМ/мин-л 2261±350 1883±130 1741±167 1612±103*

КК, мкМ/мин-л 12553±1427 13718±1214 6132±698* 9071±875*

ЛДГ, мкМ/мин-л 6377±236 6627±433 6220±405 6131±491

ЩФ, мкМ/мшгл 74±5 79±6 383±22* 355±16*

КФ общая, мкМ/мин-л 20±1,8 72±6,5* 74±5,8* 77±6,1*

а-Амилазз, мкМ/мин-л 2532±178 3234±230* 1982±124* 3870±268*

Липаза, мкМ/мин-л 20±2,3 23±2,1 17±0,8 19±1,2

Общий белок, г/л 65±6,2 61±5,2 66±4,1 84±5,7*

Альбумин, г/л 37±2,0 45±2,4* 31±1,8* 38±2,4

Альбумин/глобулиновое соотношение 1,4±0,2 3,0±0,2* 0,9±0,1* 0,8±0,1*

Мочевина, мМ 7,5±0,9 6,4±0,6 6,5±0,5 7,8±0,6

Креатинин, мкМ 95±11 90±8 81±4 77±5*

Глюкоза, мМ 7,1 ±0,9 7,9±0,7 11±0,9* 7,6±0,7

Холестерин общий, мМ 2,7±0,2 2,3±0,2 2,4±0,2 4,2±0,3*

Холестерин-ЛПВП, мМ 0,7±0,10 1,1±0,08* 1,0±0,05* 1,7±0,11*

Холестерин-ЛПНП, мМ 0,9±0,06 0,7±0,04* 0,8±0,06 1,3±0,09*

Холестерин-ЛПОНП, мМ 0,8±0,08 0,5±0,03* 0,8±0,05 1,2±0,09*

Индекс атерогенности 2,1±0,13 1,1±0,09* 1,8±0,14 1,5±0,12*

Триглицериды общие, мМ 1,8±0,17 1,2±0,10* 1,6±0,13 2,7±0,19*

Триглицериды-ЛПВП, мМ 0,8±0,07 0,2±fl,01* 0,9±0,06 1,5±0,12*

Триглицеридовый индекс 0,7±0,05 5,9±0,45* 0,9±0,07 0,8±0,06

Кальций ионизир., мМ 1,1±0,07 3,8±0,24* 2,7±0,18* 2,1±0,17*

* - достоверные различия по сравнению с контролем при р<0,05; ЛПВП - липопротеины высокой плотности; ЛПНП - липопротеины низкой плотности; ЛПОНП - липопротеины очень низкой плотности.

Повышение содержания общего белка в совокупности с повышением к 5-м суткам концентрации общего холестерина в 1,5 раза указывает на то, что синтетическая функция печени не пострадала при воздействии JCQCsP245- Отмечено антиатерогенное действие ЛПС8р245 (на 5-е сутки количество холестерин-липопротеины высокой плотности увеличивалось в 2 раза; индекс атерогенно-сти понижался по сравнению с контрольными значениями). Вероятно, одновременное повышение активности а-амилазы на 5-е сутки в 1,5 раза, АЛТ, ЩФ и понижение ACT свидетельствуют как об увеличении интенсивности гликоли-тического расщепления глюкозы, так и о том, что работа глюкозо-аланинового шунта направлена преимущественно на синтез аминокислот.

Одновременно было проведено изучение изменения гематологических показателей в ответ на введение мышам ЛПС5р245- Концентрация гемоглобина достоверно повышалась на 3-й сутки на 23% и к 5-м суткам возвращалась к

контрольным значениям. Достоверное повышение количества эритроцитов у мышей в 1,5 раза на протяжении всего наблюдения может указывать на усиление эритропоэза. На этом фоне было снижено количество лейкоцитов в 1,8 раза по сравнению с контролем, что свидетельствует об увеличении маргинального пула лейкоцитов.

Изучение функционально-метаболического состояния мышиных макрофагов показало, что введение ЛПС5р245 приводило к значительной продукции NO спленоцитами к истечению 1-х суток (в 3 раза больше по сравнению с контролем). Индуцированная ЛПС продукция АФК и активность МПО в ПМФ существенно возрастала к 3 и 5-м суткам - в 7 и 9 раз, соответственно, по сравнению с контролем, что свидетельствовало о существенной активации препаратом кислородзависимого метаболизма в клетках.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В ходе проведенных исследований установлено, что препараты ЛПС, выделенные из внешних мембран бактерий A. irakense КВС1, A. lipoferum Sp59b, A. brasilense Sp245, Sp245.5, SR15, S17 и ЭПС P. polymyxa 1465 способны вызывать активацию функционального и метаболического состояния эукариош-ческих клеток. Под влиянием микробных и растительных полисахаридов выявлено увеличение числа активных макрофагов на стадии адгезии и образования фаголизосомы. Для ЛПСзР59ь, ЛПСквсь ЛПСэп и продигиозана процесс фагоцитоза бактерий носил частично завершённый характер, следовательно, препараты способствовали киллингу бактериальных клеток. Выявлено, что для ЛПС азоспирилл - представителей серогруппы II ведущим механизмом бактерицид-ности является индукция образования NO, а для препаратов серогруппы I -стимуляция кислороднезависимого киллинга бактерий. Показано, что исследуемые полисахаридные препараты in vitro индуцируют синтез основных про-воспалительных цитокинов клетками цельной крови и фагоцитирующими моно-нуклеарами человека, при этом уровень их продукции не носит гиперэргиче-ского характера. Данный факт имеет важное значение в перспективе исследования препаратов в качестве антагонистов классических эндотоксинов, так как зачастую именно ЛПС, умеренно стимулирующие индукцию провоспалитель-ных цитокинов, способны предотвращать гиперпродукцию этих медиаторов, и, следовательно, препятствовать формированию синдрома системного воспалительного ответа и эндотоксического шока (Seydel et al., 2004; Vasan étal, 2007).

Выявленная митогенная активность ЛПС§р59ь, JIIICkbci ЛПС$р245 в отношении мышиных спленоцитов показывает их способность воздействовать на специфический иммунный ответ макроорганизма. Активность ЛПС5р245 на уровне классического митогена ЛПС Е. coli 055:В5 может свидетельствовать об иммуномодулирующих свойствах препарата. При сравнительном анализе биохимических показателей белкового, углеводного и липидного обменов у белых мышей на фоне введения ЛПС$Р245 установлено, что в их организме преобладают анаболические процессы, а компенсация энергетической недостаточности клеток происходит за счет глюкозо-аланинового шунта. Известно, что основным органом, обеспечивающим ответ организма на эндотоксин, является

печень. В наших исследованиях показано, что в печени мышей не происходят функциональные нарушения и организм не испытывает интоксикации от введения ЛПС, при этом ЛПСзР245 значительно индуцирует образование метаболитов кислородзависимого киллинга в макрофагах.

Проведённые исследования позволили выделить из числа слаботоксичных углеводсодержащих полимеров наиболее перспективные препараты, для *• которых в ряде тестов выявлена активность на уровне коммерческих препаратов - стимуляторов защитных сил организма. ЛПС азоспирилл могут быть использованы для химической модификации с целью снижения их токсичности и пирогенности при сохранении биологической активности. Появление новых природных иммуномодулируюшдх препаратов на основе гликополимеров непатогенных бактерий может значительно повысить эффективность лечения и профилактики бактериальных инфекций, а также гарантировать безопасность их производства и применения.

ВЫВОДЫ:

1. Выделены препараты ЛПС из внешней мембраны грамотрицательных бактерий A. irakense КВС1, A. lipoferum Sp59b, A. brasilense Sp245, Sp245.5, SRI 5, S17 и охарактеризованы по составу жирных кислот. Показано, что данные ЛПС обладают слабой токсичностью в биопробах со стандартными тест-объектами по сравнению с действием классического эндотоксина ЛПС Е. coli 055:В5.

2. Впервые показано, что ЛПС A. irakense КВС1, A. lipoferum Sp59b, A. brasilense Sp245, Sp245.5 и S17 in vitro стимулируют процесс фагоцитоза бактерий макрофагами и способствуют его завершённости, умеренно индуцируют продукцию ИЛ-lß и ФНО-а клетками цельной крови и фагоцитирующими мононуклеарами человека. ЭПС P. polymyxa 1465 преимущественно стимулируют образование ИЛ-lß и незначительно ФНО-а на завершающих стадиях фагоцитоза.

3. Установлено, что под воздействием ЛПС азоспирилл ведущими механизмами бактерицидности в лейкоцитах являются индукция образования оксида азота и усиление активности миелопероксидазы в макрофагах, кроме того, ЛПС азоспирилл серогруппы I стимулируют активность механизмов кислород-независимого киллинга (в частности, кислую фосфатазу).

4. ЛПС А. brasilense Sp245, A.irákense КВС1 и A. lipoferum Sp59b вызывают дозозависимый пролиферативный ответ мышиных спленоцитов, митоген-ная активность которых увеличивается в 2-4 раза по сравнению с контролем. Воздействие ЛПС A. brasilense Sp245 в концентрации 1 мкг/мл на спленоциты сравнимо с действием классического митогена ЛПС E.coli. ЭПС Р. polymyxa 1465 стимулируют пролиферацию клеток в дозах 0,01 и ОД мкг/мл.

5. ЛПС A. brasilense Sp245 in vivo вызывает активацию анаболических процессов в организме мышей, и компенсация энергетической недостаточности клеток происходит за счет глюкозо-аланинового шунта: установлено увеличение активности аланинаминотрансферазы, а-амилазы, концентрации общего белка и общего холестерина (в 1,5 раза), щелочной и кислой фосфатаз (в 4-5

раз), уменьшение активности аспартатаминотрансферазы и креатинкиназы (в 1,5 раза)), и на этом фоне постоянная концентрация мочевины; отмечено усиление кислородзависимого метаболизма в макрофагах.

6. Показано, что препараты, содержащие длинноцепочечные гидрокси-кислоты в составе липида А, проявляют большую активность в отношении индукции неспецифических и специфических иммунных реакций; выявлены различия в проявлении активности препаратов ЛПС азоспирилл серогрупп I и II в отношении механизмов кислородзависимого и кислороднезависимого киллинга в лейкоцитах, что может указывать на важную роль О-специфической части ЛПС в реализации этих процессов.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

* - публикация в изданиях перечня ВАК

1. *Фомина A.A., Петров A.B., Коннова С.А., Бойко A.C., Федоненко Ю.П., Тихомирова Е.И., Симбирцев A.C. Особенности строения и биологические свойства липополисахаридов азоспирилл в отношении активации факторов неспецифической резистентности макроорганизма // Цитокины и воспаление. - 2009. - Т. 8. - № 4. - С. 23-27.

2. ^Фомина A.A., Малинин М.Л., Коннова С.А., Тихомирова Е.И. Биохимические и гематологические показатели у мышей при введении ЛПС Azospirillum brasilense Sp245 // Токсикологический вестник. - 2009. - № 6. - С. 52-53.

3. *Фомина A.A., Суркина А.К., Бойко A.C., Коннова С.А., Тихомирова Е.И. Перспективы использования ЛПС Azospirillum lipoferum Sp59b и A. brasilense Sp245 в качестве модуляторов функциональной активности фагоцитов // Медицинская иммунология. Материалы XIII Всероссийского научного Форума с международным участием им. академика В.И. Иоффе. - 2009. - Т. 11. - № 4-5. - С. 337-33 8.

4. ^Тихомирова Е.И., Чернова М.Н., Фомина A.A., Коннова С.А. Разработка методических подходов к активизации фагоцитоза бактерий in vivo и in vitro микробными и растительными биополимерами // Российский иммунологический журнал. Материалы Всероссийской научной конференции "Объединенный Иммунологический Форум". - 2008. - Т. 2(11). -№ 2-3. - С. 206.

5. *Фомина A.A., Фучеджи O.A., Коннова С.А., Тихомирова Е.И. Влияние полисахарида Potamogeton perfoliatus in vitro на активность фагоцитоза и индукцию ци-токинов макрофагами // Медицинская иммунология. Материалы XI Всероссийского научного Форума с международным участием им. академика В.И. Иоффе. - 2007. - Т. 9.-№2-3. С. 168-169.

6. Игнатов В.В., Коннова О.Н., Бойко A.C., Фомина A.A., Федоненко Ю.П., Коннова С.А. Характеристика составов жирных кислот липидов А липополисахаридов бактерий рода Azospirillum II Известия Саратовского университета. Серия Химия. Биология. Экология. - 2009. - Т. 9. - Вып. 1. - С. 36-41.

7. Фомина A.A., Суркина А.К., Трегубова К.В. Бактериальные гликополимеры как перспективные модуляторы первичных иммунных реакций человека и животных // Всероссийская молодежная выставка-конкурс прикладных исследований, изобретений и инноваций. Сборник материалов,- Саратов: Изд-во Сарат. ун-та, 2009. - С. 86.

8. Фомина A.A., Бойко A.C. Влияние липополисахаридов азоспирилл на пролиферацию спленоцитов // Материалы XLVII Международной научной студенческой

конференции «Студент и научно-технический прогресс». - Новосибирск. - 2009. - С. 148-149.

9. Суркина А.К., Фомина A.A. Токсичность липополисахаридов азоспирилл и их влияние на фагоцитарную и метаболическую активность мышиных лейкоцитов // Сборник научных трудов «Исследования молодых ученых и студентов в биологии». -Саратов. - 2009. - Вып. 7. - С. 103-107.

10.Yegorenkova I.V., Fomina A.A., Tregubova K.V., Konnova S.A., Ignatov V.V. Physical-chemical properties and biological activity of the exopolysaccharides of the rhizo-bacterium Paenibaclllus polymyxa 1465 // Scientific Conference Biologically active substances: Fundamental and Applied Problems. - Киев, 2009. - P. 267-268.

11. Суркина A.K., Фомина A.A., Бойко A.C. Влияние липополисахаридов азоспирилл на активность факторов естественной резистентности макроорганизма // Сборник научных трудов «Исследования молодых ученых и студентов в биологии». -Саратов. - 2009. - Вып. 6. - С. 40-43.

12. Фомина A.A., Суркина А.К., Фучеджи О.А Влияние полисахаридов Potamogeton perfolialus in vitro на функциональную активность мышиных лейкоцитов // Сборник научных трудов «Исследования молодых ученых и студентов в биологии». -Саратов. - 2009. - Вып. 6. - С. 48-50.

13.Егоренкова И.В., Трегубова К.В., Фомина A.A., Коннова С.А., Игнатов В.В. Образование, физико-химические характеристики и биологические свойства экзопо-лисахаридов бактерий Paenibacillus polymyxa II Материалы VI Международной научной конференции «Современное состояние и перспективы развития микробиологии и биотехнологии». - Минск. - 2008. - Т. 1. - С. 321-323.

Н.Фомина A.A., Коннова С.А., Коннова О.Н., Федоненко Ю.П., Тихомирова Е.И. Влияние липополисахаридов азоспирилл на функциональную активность лейкоцитов белых мышей // Материалы VI региональной конференции молодых ученых «Стратегия взаимодействия микроорганизмов с окружающей средой». - Саратов. -2008. - С. 70.

15.Егоренкова И.В., Трегубова К.В., Фомина A.A., Коннова С.А., Игнатов В.В. Биологическая активность экзогликанов ризобактерий Paenibacillus polymyxa 1465 в отношении корней растений и клеток теплокровных // Материалы VI региональной конференции молодых ученых «Стратегия взаимодействия микроорганизмов с окружающей средой». - Саратов. - 2008. - С. 67.

16. Фомина A.A., Фучеджи O.A. Влияние полисахаридов Potamogeton perfolia-tus in vitro на активность фагоцитоза бактерий // Материалы I конференции молодых ученых медико-биологической секции Поволжской ассоциации государственных университетов. - Ульяновск. - 2007. - С. 75-77.

17. Фомина A.A., Коннова О.Н., Тихомирова Е.И., Коннова С.А. Влияние липо-полисахарида бактерий Azospirillum irakense КВС1 на индукцию синтеза цитокинов in vivo и in vitro фагоцитирующими макрофагами II Фундаментальные исследования. -2006.-№4.-С. 55-56.

18. Фомина A.A., Коннова О.Н., Фучеджи O.A. Влияние полисахаридов растительного и бактериального происхождения на индукцию цитокинов фагоцитирующими макрофагами // Сборник научных трудов «Исследования молодых ученых и студентов в биологии». - Саратов. - 2006. - Вып. 4. - С. 107-110.

Подписано в печать 12.01.2010 Формат 60x84 1/16. Бумага офсетная. Гарнитура Times New Roman. Печать RISO. Объем 1,0 печ. л. Тираж 100 экз. Заказ № 002.

Отпечатано с готового оригинал-макета Центр полиграфических и копировальных услуг Предприниматель Серман Ю.Б. Свидетельство № 3117 410600, Саратов, ул. Московская, д. 152, офис 19, тел. 26-18-19, 51-16-28

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Фомина, Алла Анатольевна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Характеристика полисахаридсодержащих материалов, перспективных для активизации иммунной системы человека и животных

1.1.1. Характеристика ЛПС грамотрицательных бактерий

1.1.1.1. Структурные особенности ЛПС, существенные для проявления биологической активности

1.1.1.2. Особенности строения ЛПС азоспирилл

1.1.2. Экзополисахариды как перспективные иммуномодуляторы 25 1.1.2.1. Особенности строения и свойства экзогликанов бактерий Paenibacillus polymyxa

1.1.3. Растительные полисахариды как неспецифические модуляторы сравнения

1.2. Основные клетки-мишени млекопитающих для полисахаридсодержащих полимеров

1.3. Рецепторы, необходимые для взаимодействия гликополимеров с клетками макроорганизма ,, 36 1.3.1. Внутриклеточные пути проведения сигнала после активации TLR молекулой ЛПС '

1.4. Процесс фагоцитоза и функционально-метаболический статус фагоцитов

1.5. Медиаторы воспаления - цитокины и их основные свойства

1.6. Влияние гликополимеров на обменные процессы человека и животных

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. Объекты исследования

2.2. Выделение полисахаридсодержащих полимеров

2.3. Определение токсичности полисахаридных препаратов с помощью тест-объекта инфузории колподы

2.4. Определение острой токсичности полисахаридных препаратов на сенсибилизированных лабораторных мышах

2.5. Выделение мышиных макрофагов

2.6. Моделирование процесса фагоцитоза in vitro и определение его активности и индекса завершенности

2.7. Постановка теста восстановления нитросинего тетразолия

2.8. Определение активности миелопероксидазы в макрофагах

2.9. Определение индукции образования оксида азота спленоцитами

2.10. Определение ЛПС-индуцированной пролиферации спленоцитов

2.11. Выделение мононуклеаров и нейтрофилов из периферической крови человека

2.12. Определение образования АФК клетками цельной крови методом хемилюминесценции

2.13. Определение активности кислой фосфатазы в нейтрофилах периферической крови человека

2.14. Определение продукции цитокинов клетками цельной крови и мононуклеарами человека

2.15. Определение биохимических и гематологических показателей сыворотки крови белых мышей

ГЛАВА 3. ПОЛУЧЕННЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. Характеристика полисахаридсодержащих препаратов, использованных в исследовании

3.2. Оценка острой токсичности биогликанов

3.3. Влияние полисахаридных препаратов на активность и завершенность процесса фагоцитоза

3.4. Метаболическое состояние лейкоцитов млекопитающих под воздействием биогликанов in vitro

3.4.1. Влияние гликополимеров на продукцию лейкоцитами активных форм кислорода

3.4.2. Влияние полисахаридных препаратов на активность миело-пероксидазы в макрофагах мышей

3.4.3. Продукция оксида азота спленоцитами под воздействием гликополимеров

3.4.4. Влияние полисахаридных препаратов на активность кислой фосфатазы

3.5. Определение индуцированной полисахаридами продукции про-воспалительных цитокинов

3.6. Определение ПС-индуцированной пролиферации спленоцитов

3.7. Влияние ЛПС5р245 на активность ключевых ферментов метаболизма белых мышей

Введение Диссертация по биологии, на тему "Влияние бактериальных гликополимеров на функционально-метаболический статус лейкоцитов и активность ключевых ферментов метаболизма мышей"

Актуальность проблемы. В последние десятилетия значительно возрос интерес к биополимерам, активно участвующим во взаимодействиях макро- и микроорганизмов (различные формы симбиоза, инфекции и связанные с ними патологические процессы, иммунный ответ). Гликополимеры клеточной поверхности проявляют широкий спектр биологической активности, в том числе являются основными антигенами клетки и играют ключевую роль в процессах межклеточного узнавания. В практическом плане перспективным оказалось использование биогликанов в качестве компонентов вакцин, адъювантов, противоопухолевых препаратов, неспецифических стимуляторов, а также применение их для решения экспериментальных задач в лаборатории и в биопромышленности (Васильев с соавт., 1984; Ryan et al., 2001; Valiante et al., 2003).

Особое внимание уделяется поиску новых природных иммуномодули-рующих веществ, среди которых перспективны микробные полисахариды (ПС) в силу большого разнообразия их строения и свойств. Благодаря способности к многоточечному взаимодействию с поверхностью клеток полиса-харидсодержащие полимеры могут обеспечивать выраженную стимуляцию различных этапов иммуногенеза (Feizi, 2000; Medzhitov and Janeway, 2000). В медицинской практике уже применяются препараты на основе бактериальных липополисахаридов (ЛПС) - пирогенал, продигиозан, сальмозан, экзо-полисахаридов (ЭПС) - ксантан, леваны, маннаны, растительных ПС — транслам, зостерин, декстраны, дрожжевой ПС — зимозан, которые значительно повышают устойчивость макроорганизма к бактериальным и вирусным инфекциям и обладают противоопухолевым действием (Хаитов и Пине-гин, 2004; Ryan et al., 2001). Широко исследованы механизм и последствия воздействия ЛПС патогенных бактерий, так как именно они являются наиболее мощными индукторами локальной и генерализованной реакции, включая септический шок, который продолжает оставаться одной из актуальных проблем современной медицины в силу тенденции к росту числа больных и стабильно высокой летальности. В то же время характер и последствия воздействия ЛПС и других ПС непатогенных бактерий на организм человека и животных изучены крайне слабо. Многие микроорганизмы активно экскрети-руют ПС поверхности в окружающую среду, среди них ризобии, бациллы, псевдомонады и азоспириллы, которые широко распространены в природе и в последние годы активно используются как компоненты бактериальных удобрений (Lucy et al., 2004). Гликополимеры имеют сложную химическую структуру, большое количество функциональных групп и являются медиаторами взаимодействия бактерий с различными объектами. Изучение характера их воздействия на эукариотические организмы представляется актуальным с точки зрения выявления возможных негативных эффектов и с целью обнаружения стимулирующих воздействий малых доз ПС на индукцию неспецифической резистентности макроорганизма.

В связи с этим целью данной работы явилась оценка влияния полиса-харидсодержащих полимеров бактериального происхождения на функциональную и метаболическую активность лейкоцитов и ключевых ферментов обмена в организме экспериментальных животных.

Для достижения цели были поставлены и решались следующие задачи:

1. Выделить ЛПС из внешней мембраны трех видов бактерий рода Azospirillum: A. irakense КВС1, A. lipoferum Sp59b, A. brasílense Sp245, Sp245.5, SRI5 и SI7, и оценить их токсичность по отношению к эукариоти-ческим организмам.

2. Исследовать влияние выделенных ЛПС и ЭПС Paenibacillus poly-туха 1465 in vitro на активность перитонеальных макрофагов мышей при фагоцитозе бактериальных клеток и индукцию основных провоспалительных цитокинов клетками крови человека.

3. Изучить индукцию медиаторов кислородзависимого и кислородне-зависимого киллинга в лейкоцитах мышей и человека для оценки их метаболического статуса на фоне действия in vitro ЛПС азоспирилл и ЭПС P. polymyxa 1465.

4. Оценить пролиферацию спленоцитов мышей в реакции бласттранс-формации лимфоцитов (РБТЛ) в присутствии полисахаридсодержащих полимеров бактерий.

5. Установить влияние in vivo ЛПС А. Ъгasílense Sp245 на активность ключевых ферментов белкового, углеводного и липидного обменов в организме белых мышей.

Научная новизна. Впервые проведено комплексное исследование действия полисахаридсодержащих полимеров ризобактерий in vitro и in vivo на функционально-метаболическую активность лейкоцитов и ключевых ферментов обмена в организме экспериментальных животных. Показано, что ЛПС, выделенные с поверхности почвенных ассоциативных бактерий A. irakense КВС1, A. lipoferum Sp59b, A. brasilense Sp245, Sp245.5, SR15 и S17, обладают слабой токсичностью по отношению к эукариотическим организмам.

Установлено, что ЛПС азоспирилл и ЭПС P. polymyxa 1465 in vitro стимулируют фагоцитоз бактериальных клеток и метаболические процессы в лейкоцитах мышей и человека. Показано умеренное индуцирующее влияние исследуемых ЛПС азоспирилл на продукцию ведущих провоспалительных цитокинов ИЛ-ip и ФНО-а клетками цельной крови и фагоцитирующими мононуклеарами человека. ЭПС P. polymyxa 1465 преимущественно индуцируют образование ИЛ-ip мононуклеарами и незначительно — ФНО-а.

Впервые показана значительная митогенная активность препаратов ЛПС A. brasilense Sp245, A. irakense КВС1 и A. lipoferum Sp59b в отношении мышиных спленоцитов.

Доказано, что ЛПС A. brasilense Sp245 in vivo не оказывает эндотоксиче-ского действия на биохимические показатели белкового, углеводного и липидного обменов у белых мышей, но значительно стимулирует механизмы кислородзависимого киллинга в макрофагах, что позволяет рассматривать этот препарат как потенциальный иммуномодулятор.

Практическая значимость работы. Полученные результаты исследования биологической активности разных по строению бактериальных липо- и экзополисахаридов в отношении эукариотических клеток необходимы для понимания и прогнозирования уровня, характера и последствий воздействия биомакромолекул непатогенных бактерий на организм человека и животных.

Скрининговые данные о биологической активности ряда полисахарид-содержащих препаратов в отношении механизмов клеточной резистентности могут быть использованы при выборе наиболее перспективных препаратов для дальнейшего изучения в плане возможного использования в качестве иммунномодуляторов в медико-биологической практике. Кроме того, отобраны препараты для дальнейшей химической модификации с целью нивелирования негативных эффектов при сохранении проявленной ими биологической активности. Важным положительным моментом при возможном промышленном производстве препаратов на основе гликополимеров непатогенных бактерий является их полная безопасность для персонала.

По материалам диссертационной работы опубликовано пособие «Методические рекомендации по изучению биологической активности биоглика-нов в отношении эукариотических клеток» (в соавторстве с С.А. Конновой и В.В. Игнатовым, 2009 г.) для практических занятий студентов старших курсов, а также для работы аспирантов и научных работников, специализирующихся в области биохимии, иммунохимии и микробиологии, рекомендованные Учебно-методической комиссией и одобренные Ученым советом биологического факультета Саратовского государственного университета им. Н.Г. Чернышевского (протокол № 10 от 1 июля 2009 г.). Результаты диссертационной работы используются в преподавании студентам биологического и химического факультетов СГУ курсов: «Основы гликологии» и «Химия и биохимия углеводов».

Основные положения диссертации, выносимые на защиту:

1. Гликополимеры ризобактерий (ЛПС бактерий рода Azospirillum и ЭПС P. polymyxa 1465) in vitro активируют процесс фагоцитоза бактериальных клеток, усиливают метаболизм лейкоцитов человека и животных и оказывают умеренное стимулирующее действие на продукцию провоспалитель-ных цитокинов клетками цельной крови и мононуклеарами человека.

2. ЛПС A. brasilense Sp245, A. irakense КВС1 и A. lipoferum Sp59b значительно и дозозависимо стимулируют пролиферативный ответ мышиных спленоцитов.

3. ЛПС A. brasilense Sp245 индуцирует изменение биохимических и гематологических показателей в сыворотке крови белых мышей, не проявляя при этом эндотоксического действия; стимулирует продукцию нитрогенных и оксидазных форм радикалов в макрофагах.':

Работа выполнена на кафедре биохимии и биофизики ГОУ ВПО «Саратовский государственный университет им. Н.Г. Чернышевского» и в лаборатории биохимии Института биохимии и физиологии растений и микроорганизмов (ИБФРМ) РАН и частично поддержана грантом Российского фонда фундаментальных исследований в 2005-2007 гг. № 05-04-48123, руководитель проф. Игнатов В.В.

Личный вклад соискателя. Экспериментальные результаты, представленные в диссертации, получены лично автором и в совместной работе с сотрудниками лаборатории биохимии ИБФРМ РАН. Выделение ЛПС азоспи-рилл выполнено совместно с сотрудниками лаборатории биохимии ИБФРМ РАН. Исследования методом хемилюминесценции образования реактивных форм кислорода, постановка ИФА для определения индукции цитокинов клетками цельной крови и оценка полисахарид-индуцированной пролиферации спленоцитов проведены совместно с сотрудниками лаборатории иммунофармакологии НИИ особо чистых биопрепаратов (г. Санкт-Петербург). Эксперименты по определению активности белкового, углеводного и липид-ного обменов в организме белых мышей проведены совместно с сотрудниками биохимической группы Саратовской научно-исследовательской ветеринарной станции РАСХН. На защиту вынесены только те положения и результаты экспериментов, в получении которых роль автора была определяющей.

Апробация работы. Основные результаты и положения работы представлены на: I и II объединенном иммунологическом форуме (Россия, Екатеринбург, 2004 г. и Санкт-Петербург, 2008 г.); научных конференциях молодых ученых «Исследование молодых ученых и студентов в биологии» (Россия, Саратов, СГУ им. Н.Г.Чернышевского, 2006, 2008, 2009 гг.); XI и XIII Всероссийских научных форумах с международным участием им. академика В.И. Иоффе (Россия, Санкт-Петербург, 2007, 2009 гг.); I конференции молодых ученых медико-биологической секции Поволжской ассоциации государственных университетов (Россия, Ульяновск, 2007 г.); 4-ой Межрегиональной конференции молодых ученых «Стратегия взаимодействия микроорганизмов и растений с окружающей средой» (Россия, Саратов, ИБФРМ РАН, 2008 г.); VI Международной научной конференции «Современное состояние и перспективы развития микробиологии и биотехнологии» (Беларусь, Минск,

2008 г.); XLVII Международной научной конференции «Студент и научно-технический прогресс», посвященной 50-летию НГУ (Россия, Новосибирск,

2009 г.); Scientific Conference Biologically active substances: Fundamental and Applied Problems (Ukraine, Novy Svet, 2009 г.).

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Фомина, Алла Анатольевна

ВЫВОДЫ:

1. Выделены препараты ЛПС из внешней мембраны грамотрицатель-ных бактерий A. irakense КВС1, A. lipoferum Sp59b, A. brasilense Sp245, Sp245.5, SR15, S17 и охарактеризованы по составу жирных кислот. Показано, что данные ЛПС обладают слабой токсичностью в биопробах со стандартными тест-объектами по сравнению с действием классического эндотоксина ЛПС Е. coli 055:В5.

2. Впервые показано, что ЛПС А. irakense КВС1, A. lipoferum Sp59b, A. brasilense Sp245, Sp245.5 и S17 in vitro стимулируют процесс фагоцитоза бактерий макрофагами и способствуют его завершённости, умеренно индуцируют продукцию ИЛ-lß и ФНО-а клетками цельной крови и фагоцитирующими мононуклеарами человека. ЭПС P. polymyxa 1465 преимущественно стимулируют образование ИЛ-lß и незначительно ФНО-а на завершающих стадиях фагоцитоза.

3. Установлено, что под воздействием ЛПС азоспирилл ведущими механизмами бактерицидности в лейкоцитах являются индукция образования оксида азота и усиление активности миелопероксидазы в макрофагах, кроме того, ЛПС азоспирилл серогруппы I стимулируют активность механизмов кислороднезависимого киллинга (в частности, кислую фосфатазу).

4. ЛПС А. brasilense Sp245, A.irakense КВС1 и A. lipoferum Sp59b вызывают дозозависимый пролиферативный ответ мышиных спленоцитов, ми-тогенная активность которых увеличивается в 2-4 раза по сравнению с контролем. Воздействие ЛПС А. brasilense Sp245 в концентрации 1 мкг/мл на спленоциты сравнимо с действием классического митогена ЛПС E.coli. ЭПС Р. polymyxa 1465 стимулируют пролиферацию клеток в дозах 0,01 и 0,1 мкг/мл.

5. ЛПС А. brasilense Sp245 in vivo вызывает активацию анаболических процессов в организме мышей, и компенсация энергетической недостаточности клеток происходит за счет глюкозо-аланииового шунта: установлено увеличение активности аланинаминотрансферазы, а-амилазы, концентрации общего белка и общего холестерина (в 1,5 раза), щелочной и кислой фосфа-таз (в 4-5 раз), уменьшение активности аспартатаминотрансферазы и креа-тинкиназы (в 1,5 раза) ), и на этом фоне постоянная концентрация мочевины; отмечено усиление кислородзависимого метаболизма в макрофагах.

6. Показано, что препараты, содержащие длинноцепочечные гидро-ксикислоты в составе липида А, проявляют большую активность в отношении индукции неспецифических и специфических иммунных реакций; выявлены различия в проявлении активности препаратов ЛПС азоспирилл серог-рупп I и II в отношении механизмов кислородзависимого и кислороднезави-симого киллинга в лейкоцитах, что может указывать на важную роль О-специфической части ЛПС в реализации этих процессов.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В современной литературе биополимеры клеточной поверхности бактерий получили название «модификаторов биологического ответа» в силу большого разнообразия их строения и физиологических свойств (Оводов с соавт., 1983; Турина и Федорова, 2000; Ермак, 2006; Wu et al, 2003). Большинство гликополимеров действуют на макроорганизм опосредованно, инициируя «реакцию тревоги» по универсальному механизму (Малов и Пак, 1997; Medzhitov and Janeway, 2000; Wang and Ohura, 2002). Именно на этом механизме основан терапевтический эффект пирогенала и продигиозана, длительное время используемых в клинической практике для лечения больных с затяжным и хроническим течением инфекционных заболеваний (Хаитов и Пинегин, 2004; Ryan et al., 2001). В настоящее время ведется активный поиск природных иммуномодуляторов среди гликополимеров непатогенных бактерий в связи с тем, что они могут оказывать стимулирующее действие на организм человека и животных, проявляя при этом слабую токсичность и пи-рогенность по сравнению с биогликанами патогенных бактерий. Веремей-ченко с соавт. (2005) показано, что ЛПС сапрофитных бактерий Р. fluorescens слаботоксичны и умеренно индуцируют образование ФНО и NO перитонеальными макрофагами мышей. Здоровенко с соавт. (2007) установлено, что ЛПС из различных штаммов фитопатогенных бактерий P. syringae pv. atrofaciens стимулируют образование NO и ФНО лейкоцитами мышей и человека, а также пролиферацию мышиных спленоцитов, при этом один из препаратов показал высокую токсичность, поэтому авторы не исключают опасности его действия на организм млекопитающих. Исследованиями ряда ученых показано, что ЭПС, синтезируемые бактериями P. polymyxa, не токсичны, обладают антивирусными и противоопухолевыми свойствами, повышают неспецифическую реактивность организма (Афонская и Колесова, 1980; Jung et al., 2007). В связи с этим актуально исследование активности гликополимеров ризобактерий, стимулирующих развитие растений (ЛПС бактерий рода АгоБрггШит и ЭПС Р. ро1утуха 1465) в отношении функционально-метаболического статуса лейкоцитов и ключевых ферментов метаболизма в организме экспериментальных животных.

Очень часто наряду с высокой биологической активностью ЛПС показывают высокую токсичность, поэтому на первом этапе нашей работы было проведено исследование острой токсичности ЛПС азоспирилл на биотест-объектах инфузориях колподах и мышах. Показано, что токсичность препаратов уменьшалась в ряду ЛПСКвс1 > ЛПСйр245 > ЛПС8р59Ь > ЛПС5р245.5 ~ ЛПСзш5 ~ ЛПС317- При этом для ЛПСквс1 ДД50 была примерно в 30 раз больше по сравнению с таковой для классического эндотоксина ЛПС055:В5э что свидетельствует о слабой токсичности всех исследуемых ЛПС азоспирилл.

При моделировании процесса фагоцитоза бактериальных клеток было выявлено, что все исследуемые препараты стимулировали фагоцитоз Е. соН Са53. Максимально активировал процесс фагоцитоза бактерий ЛПСквсь количество активных макрофагов было достоверно выше контрольных значений на 18-38%, при этом значения ФИ превышали таковые при действии продигиозана, кроме 4-х часовых культур ПМФ. На фоне действия ЛПСквсь ЛПС8Р59Ь, ЛПСзп и ЭПС14б5сах показана резкая активация стадии адгезии фагоцитоза: уже к 1 ч процесса значения ФИ были на 19-29% выше контроля. При последующем моделировании процесса фагоцитоза эти же препараты, ЛПС§Р245 и продигиозан максимально стимулировали увеличение количества активных макрофагов на стадии образования фаголизосомы, т.е. к 2 и 4 ч процесса фагоцитоза, а ЛПС5р245.5> ЛПС8Ш5 и ЭПС1465гл - к 4 и 6 ч процесса фагоцитоза. По сравнению с микробными ПС растительные ПС в аналогичной дозе показали стимулирующее действие на фагоцитоз эшерихий на том же уровне.

На основе ФИ были рассчитаны ИЗФ эшерихий макрофагами. Положительные показатели ИЗФ свидетельствовали о частично завершённом процессе фагоцитоза бактерий в контроле и при добавлении в культуру фагоцитов JITICsp59b продигиозана, ЛПСбп и ЛПСквсь Данный факт является важным показателем для оценки заключительных этапов фагоцитоза, т.к. перси-стенция либо неспособность к перевариванию микробов может привести к хронизации инфекционного процесса in vivo. Для JITICsris, ЭПСиббш, эпс14б5сах, н-ПС1 и к-ПСЗ значения ИЗФ имели отрицательные значения, что позволило предположить, что данные препараты не влияют на механизмы киллинга эшерихий.

При исследовании метаболического состояния лейкоцитов показано, что только ЛПСквс1 и JinCsP59b влияли на продукцию НАДФН-оксидазных радикалов клетками цельной крови человека, однако слабо по сравнению с воздействием зимозана — классического стимулятора респираторного взрыва. В отношении мышиных ПМФ только JmCsP245.5 и ЛПС817 в максимальной дозе 1 мкг/мл незначительно стимулировали продукцию АФК. Так как в среде культивирования отсутствовали бактериальные клетки, то это свидетельствует о возможных протекторных свойствах этих препаратов в отношении собственных клеток макроорганизма. Выявлены антиоксидантные свойства ЭПС i465cax и к-ПСЗ, которые оказывали ингибирующее действие на образование АФК в ПМФ. Альтернативный путь кислородзависимого метаболизма макрофагов, оцениваемый по активности фермента МПО, стимулировали ЛПС азоспирилл и н-ПС1. Вероятно, для ЛПС азоспирилл — представителей серогруппы II, ведущим механизмом бактерицидности является индукция образования N0 спленоцитами, для ЛПС азоспирилл серогруппы I - стимуляция активности кислой фосфатазы.

При изучении цитокининдуцирующей способности ЛПСквсп JETICsP59b5 ЛПСбР245 и JinCsP245.5 установлено их стимулирующее влияние на образование ведущего провоспалительного цитокина ИЛ-1(3 клетками крови человека. Индукция образования хемокина ИЛ-8 наблюдалась только при действии 0,1 и 1 мкг/мл ЛПС5р59ь и ЛПС8р245- Достоверное увеличение концентрации ФНОа в среде культивирования клеток крови наблюдали при добавлении JEICkbci и JITICsp245> что в 1,5 раза ниже эффектов ЛПС055:в5 и продигиозана, и может свидетельствовать о мягком умеренном модулирующем действии данных ЛПС азоспирилл. Вероятно, данная активность JEICkbci и JIIICsp245 связана с преобладанием в их липидной части гидроксикислот (3-гидрокситетрадекановой и 3-гидроксигексадекановой) и наличием фосфатов в молекулах ЛПС.

Далее было исследовано влияние гликополимеров на индукцию цито-кинов МПК при моделировании процесса фагоцитоза in vitro Е. coli Са53. Концентрации ИЛ-1|3 в культуре МПК увеличивались с 1 ч фагоцитоза под воздействием всех исследованных ЛПС азоспирилл, кроме ЛПСзР59ь. Результаты по его активности были неожиданными, так как в предыдущем эксперименте препарат оказывал значительное ИЛ-1|3-индуцирующее действие. По-видимому, это связано с тем, что в культуре цельной крови препарат активировал нейтрофилы, которые и продуцировали основное количество ИЛ-1р, определяемого в пробах. В ходе фагоцитоза в среде культивирования МПК с исследуемыми препаратами концентрация цитокина возрастала к 24 ч: максимально при добавлении ЛПС8п, .JinCsP245 и продигиозана примерно в 2,5 раза по сравнению с контролем.

Если при действии всех исследованных ЛПС индукция ФНО-а МПК имела плавно нарастающий характер, то ЛПСзР245 значительно индуцировал синтез цитокина к 1 ч фагоцитоза в 12 раз по сравнению с контролем, к 2 ч концентрация ФНО-а падала, и вновь увеличивалась на завершающих стадиях фагоцитоза. Такие фазные изменения содержания цитокина можно объяснить его аутокринным действием и участием в саморегуляции клеток. Максимальный стимулирующий эффект на продукцию ФНО-а МПК (примерно в 20 раз по сравнению с контролем) отмечен к 24 ч при добавлении ЛПСквсь ЛПС5р59ь,. JinCsp245 и продигиозана.

Установлено, что ЭПС1465Гл достоверно индуцировал синтез ИЛ-1р МПК с 1 ч процесса фагоцитоза, а ЭПСиббсах только с 6 ч фагоцитоза эшери-хий. Индукцию синтеза ФНО-а на фоне действия ЭПС бацилл наблюдали только на завершающих стадиях фагоцитоза. Растительные препараты сравнения оказывали цитокин-индуцирующее влияние на фагоциты: н-ПС1 стимулировал образование ИЛ-1, ФНО-а и ИНФ-у, а к-ПСЗ - ФНО-а, ИЛ-6.

Уровень индукции основных провоспалительных цитокинов в присутствии всех исследуемых гликополимеров не носил характера гиперпродукции. Данный факт имеет важное значение в перспективе использования препаратов в качестве антагонистов классических эндотоксинов при серьезных грамотрицательных инфекциях, так как зачастую именно ЛПС, умеренно стимулирующие индукцию провоспалительных цитокинов, нивелируют гиперпродукцию этих медиаторов и, следовательно, препятствуют формированию синдрома системного воспалительного ответа и эндотоксического шока.

Установлено митогенное действие ЛПС$Р245 в концентрации 1 мкг/мл на уровне классического митогена ЛПСо55:В55 препараты ЛПСква и .nnCsP59b усиливали пролиферацию клеток, эффект их действия был ниже по сравнению с ЛПСо55:В5 примерно в 2-4 раза. Показанная митогенная активность препаратов ЛПС азоспирилл была пропорциональна их концентрации. Сравнительный анализ химической структуры исследованных ЛПС позволяет говорить о важной роли ОПС для проявления и степени выраженности мито-генных свойств ЛПС в отношении спленоцитов. Стимуляция ЭПС1465ГЛ и ЭПС 1б45сах пролиферации клеток была незначительной и не носила концен-трационно-зависимого характера.

При исследовании влияния 0,1 мкг/мл ЛПС8р245 in vivo на белых лабораторных мышах установлено увеличение активности АЛТ, ЩФ и КФ, концентрации общего белка, уменьшение значений ACT и КК и не изменяющаяся на этом фоне концентрация мочевины. Полученные данные по этим показателям свидетельствуют об отсутствии признаков интоксикации у животных в ответ на введение J11JLC. Одновременное изучение макрофагов, выделенных у мышей, показало их высокую способность стимулировать образование NO к 1 сут после введения JmCSp245 и увеличение активности АФК и МПО — позже, к 3-м и 5-м сут. Результаты, полученные в ходе исследований jmCSp245 in vivo и in vitro свидетельствуют о высокой перспективности изучения данного препарата для использования в качестве природного иммуностимулятора.

В результате проведения скринингового исследования биологической активности бактериальных гликополимеров в отношении факторов естественной клеточной резистентности выявлены препараты (JmCsP245> ЛПСква и ЛПС8р59ь), проявляющие активность в ряде тестов на уровне коммерческих иммунотропных препаратов. В дальнейшем исследуемые J11JLC могут быть использованы для химической модификации для нивелирования их токсичности и пирогенности. Снижение эффективности использования традиционных методов лечения и профилактики бактериальных инфекций в связи с генетической изменчивостью бактерий в антропогенно-изменяющихся условиях окружающей среды обуславливает поиск новых природных и малотоксичных иммуномодуляторов. Появление препаратов на основе полисахаридов непатогенных бактерий может помочь решить эту проблемы, а также гарантировать безопасность их промышленного производства.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Фомина, Алла Анатольевна, Саратов

1. Авдеева М.Г, Шубин М.Г. Патогенетические механизмы инициации синдрома системного воспалительного ответа // Клиническая лабораторная диагностика. — 2003. — № 6. С. 3-9.

2. Апринян B.C., Михайлова A.A., Петров Р.В. Миелопептид-3 повышает интенсивность фагоцитоза Salmonella typhimurium мышиными перитонеальными макрофагами // Иммунология. 2001. - №2. - С. 20-22.

3. Арнхольд Ю. Свойства, функции и секреция миелопероксидазы человека // Биохимия.-2004.-Т.69.-№ 1.-С. 8-15.

4. Асадов Ч.Д., Нумерова JI.C., Мирзоева М.Э. Связь между фагоцитарной функцией и цитохимическими показателями нейтрофилов крови // Лабораторное дело. — 1990. — № 11.-С. 19-21.

5. Афонская C.B., Колесова Э.А. Профилактическое действие экстрацеллюлярых полисахаридов некоторых видов рода Bacillus при стафилококковом сепсисе у мышей // V съезд Украинского Микробиол. общества, Днептопетровск. — Киев: Наукова думка. -1980.-С. 166-167.

6. Ашмарин И.П., Васильев H.H., Амбросов В.А. Быстрые методы статистической обработки и планирование экспериментов. — Л.: Ленинград. Ун-т, 1974. — 76 с.

7. Баканчикова Т.И., Лобанок Е.В., Павлова-Иванова Л.К., Редькина Т.В., Нагап-стян Ж.А., Майсурян А.Н. Подавление процесса опухолеобразования у двудольных растений штаммами Azospirillum brasilense II Микробиология. 1993. - T. 62. - С. 515-523.

8. Бакуев М.М., Саидов М.З., Бутаков A.A. Особенности секреции миелопероксидазы и хемигаоминесцентного ответа нейтрофилов человека при контакте со стимуляторами различной природы // Иммунология. 1991. - № 1. - С. 15-16.

9. Берлов М.Н., Кораблева Е.С., Андреева Ю.В. Лактоферрин из нейтрофилов собаки: выделение, физико-химические и антимикробные свойства // Биохимия. — Т. 72. — №4.-С. 551-559.

10. Беседнова H.H., Запорожец Т.С. Фундаментальные и прикладные аспекты изучения биополимеров их гидробионтов Тихого океана // Бюллетень СО РАМН. 2008. - № 4(132).-С. 16-21.

11. Беседнова H.H., Иванушко Л.А., Звягинцева Т.Н., Елякова Л.А. Иммунотроп-ные свойства 1—>3;1—►6-рТ)-глюканов // Антибиотики и химиотерапия. 2000. - № 2. - С. 37^44.

12. Беспалова И.А., Васильева Г.И., Гончарова JI.A., Мишанысин Б.Н., Дорошенко Е.П., Иванова И.А. Влияние ферментативного дефосфорилирования липополисахарида Yersiniapestis на его токсичность in vivo и in vitro II Биотехнология. — 2006. № 3. - С. 42— 46.

13. Бойко А.С. Структурные особенности липополисахаридов азоспирилл в связи с их участием в коммуникации микроорганизмов в ризосфере: Дис. канд. биол. наук. Саратов, 2009. -127 с.

14. Бондаренко В.М., Рябиченко Е.В., Веткина Л.Г. Молекулярные аспекты повреждающего действия бактериальных липополисахаридов // Журнал микробиологии. — 2004. -№ 3. С. 98-105.

15. Борисова Е.В. Роль структурных частей бактериального лтпополисахаридв в его прямой иммуносупрессивной активности // Журнал микробиологии. 1999. — № 2. — С. 22-25.

16. Борисова Е.В., Борисов В.А. Липополисахариды Shigella sonnei И Прикладная биохимия и микробиология. — 2000. Т. 36. - № 5. — С. 597-602.

17. Вараскин Н.А., Рябичева Т.Г., Тимофеева Т.Н. и др. Испытания иммуномодуля-торов в системе ex vivo II Новости «Вектор-Бест». — 2006. №4. — С. 42-46.

18. Варбанец Л.Д., Винарская Н.В. Биологическая активность липополисахаридов (эндотоксинов) Ralstonia solanacearum II Токсины микроорганизмов. — 2004. — № 1. http://www.medved.kiev.ua/arhivmg/st2004/04l7.htm

19. Варбанец Л.Д., Сейфуллина И.И., Рыбалко С.Л. и др. Биологическая активность липополисахарида Rastonia solanacearum ICMP 7859 и его модифицированного производного // Микробиологический журнал. — 1998. Т. 60. - № 4. — С. 80-87.

20. Васильев Н.В., Луцук Н.Б., Палий Г.К., Смирнова О.В. Биохимия и иммунология микробных полисахаридов. — Томск: Изд-во Томского университета, 1984. 304 с.

21. Васильева Г.И., Иванова И.А., Беспалова И.А., Киселева А.К. Сравнительная оценка монокинсинтезирующей активности липополисахаридов Yersenia pestis и Escherichia coli // Иммунология. № 6. - 2000. - С. 27-29.

22. Васильева Г.И., Иванова И.А., Киселева А.К. и др. Изучение гетерогенности перитонеальных макрофагов по их способности продуцировать монокины, регулирующие функциональную активность нейтрофилов // Биотехнология. — 2004. — № 1. С.13-19.

23. Васильева Г.И., Пустовалов B.JL, Дорошенко Е.П., Киселева А.К. Оценка вирулентности штаммов чумного микроба по индексу завершенности фагоцитоза // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунологии. — 1987. — № 6. — С.117—118.

24. Веремейченко С.Н., Водяник М.А., Здоровенко Г.М. Особенности строения и биологические свойства липополисахаридов Pseudomonas fluorescens II Прикладная биохимия и микробиология. 2005. - Т. 41. -№ 4. - С. 414--421.

25. Виноградов H.A. Антимикробные свойства окиси азота и регуляция ее биосинтеза в макроорганизме // Антибиотики и химиотерапия. — 1998. — № 2. — С. 24—29.

26. Галактионов В.Г. Иммунология. М.: Издат. центр «Академия», 2004. - 528 с.

27. Геннис Р. Биомембраны: молекулярная структура и функции. М.: Мир, 1997. - 624 с.

28. Глухова Е.В., Яроцкий C.B., Дерябин В.В., Шендеров Б.А., Игнатов В.В. Внеклеточные полисахариды почвенной бактерии Bacilluspolymyxa и ее мутантного штамма // Антибиотики и медицинская биотехнология. 1986. - № 9. - С. 669-674.

29. Горбач В.И., Красикова И.Н. Липид А как центр эндотоксической активности грамотрицательных бактерий. Структура, свойства, синтез аналогов // Успехи в изучении природных соединений / Под ред. В.А. Стоник. Владивосток: Дальнаука, 1999. - 222 с.

30. Гордиенко С.М. Сравнительная оценка результатов восстановления нитросине-го тетразолия при микроскопическом и спектрофотометрическом вариантах метода с различными солями тетразолия // Лабораторное дело. 1983. — № 2. — С. 21—24.

31. Гордонова И.К., Никитина З.К., Быков В.А. Сравнительное изучение ЛПС Sac-charomyces cerevisiae II Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. — 2002. — Т. 134.-№ 10. С.430-434.

32. Горельникова Е.А., Полукарпов Е.В., Карпунина Л.В., Тихомирова Е.И. Влияние экзополисахаридов Lactobacillus delbrueckii spp. bulgaricus на цитокиновый статус лабораторных мышей // Медицинская иммунология. — 2009. Т. 11. — № 4-5. - С. 309-310.

33. Громыхина Н.Ю., Орловская И.А., Дубинина Л.В., Козлов В.А. Участие стволовой кроветворной клетки в механизмах иммуностимулирующего эффекта интерлейки-на-1 у мышей // Иммунология. 1995. - № 2. - С. 29-33.

34. Турина C.B., Федорова Л.Г. Влияние гликанов дрожжей при экспериментальном эндотоксикозе, вызванном ЛПС // Журн. микробиол. — 2000. — №1. — С. 68-71.

35. Гюнтер Е.А., Оводов Ю.С. Полисахариды клеточных культур Silene vulgaris II Прикладная биохимия и микробиология. — 2007. — Т. 43. — № 1. С. 94—101.

36. Дамбаева C.B., Мазуров Д.В., Голубева Н.М., Пинегин Б.В. Влияние некоторых иммуномодуляторов на функциональную активность фагоцитарных клеток периферической крови доноров // Иммунология. — 2000. — № 6. С. 15—20.

37. Дергунова М.А., Жанаева С.Я., Филюшина Е.Е., Бузеева И.И., Колесникова О.П., Коган Г., Короленко Т.А. Характеристика новых химически модифицированных ß-1,3-0-гликаиов как стимуляторов макрофагов // Бюллетень СО РАМН. 2006. - № 1. — С. 77-81.

38. Долгушин И.И., Бухарин О.В. Нейтрофилы и гомеостаз. — Екатеринбург: УрО РАН, 2001.-277 с.

39. Блинов Н.П. Химическая микробиология. — М.: Высшая школа, 1989. — 448 с.

40. Ермак И.М. Взаимодействие бактериальных липополисахаридов с белками и полисахаридами. Модификация физиологической активности липополисахаридов: Авто-реф. дис. . докт. хим. наук. — Владивосток. — 2006. — 47 с.

41. Ермолаева В.В., Вайсберг Г.Е Стимуляция неспецифической резистентности организма и бактериальные полисахариды. — М.: Медицина, 1976. — 184 с.

42. Звягинцева Т.Н., Елякова JI.A., Исаков В.В. Ферментативное превращение ла-минарана в 1—>3;1—>6-ß-D-nnoKaHbi, обладающие иммуностимулирующим действием // Биоорганическая химия. 1995. - Т. 21. -№ 3. - С. 218-225.

43. Здоровенко Г.М. Внеклеточный липополисахарид грамотрицательных бактерий // Микробиологический журнал. 1988. - Т. 50. - № 4. - С. 98-107.

44. Здоровенко Г.М., Здоровенко Э.Л., Варбанец Л.Д. Особенности состава, строения и биологические свойства липополисахаридов из различных штаммов Pseudomonas syringae pv. atrofaciens II Микробиология. — 2007. — T. 76. — № 6. — C.774—789.

45. Игнатов В.В., Коннова О.Н., Бойко А.С. и др. Характеристика состава жирных кислот липидов А липополисахаридов бактерий рода Azospirillum // Известия Саратовского университета. — 2009. — Т. 9. Вып. 1. — С. 36-41.

46. Кадагидзе З.Г. Цитокины // Практическая онкология. — 2003. — Т. 4. № 3. - С. 131-139.

47. Камышников B.C. Справочник по клинико-биохимической лабораторной диагностике: в 2 т. Минск: Беларусь, 2000. — Т. 1. — 495 с.

48. Кацы Е.И. Свойства и функции плазмид ассоциированных с растениями бактерий рода Azospirillum // Успехи соврем, биол. 2002. - Т. 12. - № 4. - С. 353-364.

49. Кетлинский С.А., Калинина Н.М. Цитокины мононуклеарных фагоцитов в регуляции реакции воспаления и иммунитета // Иммунология. — 1995. — № 3. — С. 30 44.

50. Климов А.Н., Никульчева Н.Г. Обмен липидов и липопротеидов и его нарушения. Спб.: Питер, 1999. 512 с.

51. Книрель Ю.А. Липополисахариды грамотрицательных бактерий // Прогресс химии углеводов / Под ред. И.В. Торгова. — М.: Наука, 1985. — С. 54 — 76.

52. Книрель Ю.А., Кочетков Н.К. Строение липополисахаридов грамотрицательных бактерий I. Общая характеристика липополисахаридов и структура липида А. (Обзор) // Биохимия. 1994. - Т. 58. - С. 166 - 181.

53. Книрель Ю.А., Кочетков Н.К. Строение липополисахаридов грамотрицательных бактерий. II. Структура кора // Биохимия. 1993. - Т. 58. - вып. 2. - С. 182 - 201.

54. Ковальчук Л.В., Ганковская Л. В. Иммуноцитокины и локальная иммунокор-рекция. // Иммунология. 1995. - № 1. — С. 4 - 7.

55. Ковальчук Л.В., Хараева З.Ф. Роль оксида азота в иммунопатогенезе стафилококковых инфекций // Иммунология. 2003. - Т.24 - № 3. — С. 186—188.

56. Козлов В.А. Некоторые аспекты проблемы цитокинов // Цитокины и воспаление. 2002. - № 1. - С. 5-8.

57. Козлов В.А., Громыхина Н.Ю. Интерейкин-1: роль в эксперименте // Иммунология. 1987. -№ 5. - С. 24 - 29.

58. Коннова О.Н. Сравнительное исследование липополисахаридов и структуры О-специфических полисахаридов бактерий рода Azospirillum: Дис. канд. биол. наук. — Саратов, 2006.-164 с.

59. Кулинский В.И. Биохимические аспекты воспаления // Биохимия. 2007. - Т. 72. - вып. 6. - С. 733-746.

60. Лабораторная гематология / Под ред. С.А. Луговской и др. — М.:Юнимед-пресс, 2002.-115 с.

61. Лабораторные методы исследования в клинике / Под ред. В.В. Меншикова. — М.: Медицина, 1987.-365 с.

62. Лазарева Е.Б., Меньшиков Д.Д. Опыт и перспективы использования пектинов в лечебной практике // Антибиотики и химиотерапия. — 1999. № 2. - С. 37-40.

63. Лимфоциты: методы / Под ред. Дж. Клауса. М.: Мир, 1990. - 393с.

64. Ляшенко В.А. Макрофаги в инфекционном процессе // Иммунология. 1995. -№ 4. - С. 48 - 52.

65. Мазуров Д.В., Дамбаева С.В., Пинегин Б.В. Оценка внутриклеточного киллинга стафилококка фагоцитами периферической крови с помощью проточной цитометрии // Иммунология. 2000. - №2. - С. 57-59.

66. Маслова H.H., Павлович Н.В. Иммуномодулирующие и антитоксические свойства препаратов липополисахаридов представителей рода Francisella II Журн. микробиол. 1999. - №4. - С. 50-53.

67. Матора Л.Ю., Шварцбург Б.И. Щеголев С.Ю. Иммунохимический анализ О-специфических полисахаридов почвенных азотофиксирующих бактерий Azospirillum brasilense II Микробиология. 1998. - Т. 67, № 6. - С.815-820.

68. Маянский А.Н., Маянский Д.Н. Очерки о нейтрофиле и макрофаге. Новосибирск: Наука, Сиб. Отд-ние, 1989. - 344 с.

69. Макаренкова И.Д., Компанец Г.Г. Запорожец Т.С. Ингибирование адгезии патогенных микроорганизмов на эукариотических клетках // Журнал микробиологии. -2006.-№3.-С. 121-125.

70. Малинин М.Л. Метод определения общего белка // Журнал современного естествознания. 2007. - № 12. - С. 34.

71. Малов В.А., Пак С.Г. Эволюция взгляда на роль бактериальных липополисахаридов в патологии человека // Вестник РАМН». 1997. - № 8. - С. 33-38.

72. Медведева С.А., Александрова Г.П., Сайботалов М.Ю. и др. Арабиногалактан лиственницы сибирской природный иммуностимулятор // Актуальные проблемы создания новых лекарственных препаратов растительного происхождения. - Спб: Петродворец, 2001.-С. 104-106.

73. Методы определения токсичности. Госстандарт РФ 13496.7-97. ИПК Издательство стандартов, 2000. 11 с.

74. Нагоев Б.С. Значение теста восстановления нитросинего тетразолия для изучения функциональной активности лейкоцитов // Лабораторное дело. — 1983. № 8. - С.7-11.

75. Назарова И.В., Хотимченко Ю.С., Шевченко Н.М. Влияние ионных углеводсо-держащих полимеров на активирование комплемента // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 2001. - Т. 131. - № 3. - С. 290-292.

76. Оводов Ю.С., Оводова Р.Г., Лоэнко Ю.И. Биогликаны-иммуностимуляторы // Химия природных соединений. — 1983. — № 6. С. 675-694.

77. Оводов Ю.С. Полисахариды цветковых растений: структура и физиологическая активность // Биоорганическая химия. 1998. - Т. 24. - № 7. - С. 483-501.

78. Оводов Ю.С. Полисахариды грибов, мхов и лишайников, структура и физиологическая активность // Проблема химии древесины и лесохимии. Тр. Коми НЦ УрО РАН. Сыктывкар, 1997. Вып. № 156. - С. 21-30.

79. Оводова Р.Г., Головченко В.В., Попов C.B., Шашков A.C., Попов C.B., Оводов Ю.С. Структурное исследование и физиологическая активность лемнана, пектина из Lem-па Minor L. И Биоорганическая химия. 2000. — Т. 26. - № 10. — С. 743- 751.

80. Оводова Р.Г., Кушникова Е.А., Попов C.B. и др. Выделение, характеристика и физиологическая активность полисахаридов из хвои // Проблема химии древесины и лесохимии. Тр. Коми НЦ УрО РАН. Сыктывкар, 1997. Вып. № 156. - С. 15-20.

81. О'Нилл Л. Врожденный иммунитет: система раннего оповещения // В мире науки. 2005. - № 4. - С. 33 - 39.

82. Оноприенко H.H., Павлович Н.В. Взаимодействие S- и R-липополисахаридов Francisella tularensis с липополисахаридсвязывающим белком сыворотки крови человека // Журн. микробиол. 2008. - №4. - С. 16-21.

83. Пинегин Б.В., Саидов М.З., Ольков И.Г. Простой метод оценки хемотаксиса и ингибиции хемотаксиса лейкоцитов периферической крови человека // Иммунология. -1994.-№1.-С. 58-59.

84. Пирог Т.П., Слабоспицкая А.Т., Воцелко С.К., Мохаммед эль Сайд, Афонская C.B., Гринберг Т.А. Образование и физико-химические характеристики экзополисахари-дов некоторых бактерий рода Bacillus II Микробиол. журн. — 1985. Т. 47, № 6. - С. 27-32.

85. Плехова Н.Г. Бактерицидная активность фагоцитов // Журн. микробиол. 2006.- №6. С. 89-96.

86. Плехова Н.Г., Сомова JI.M., Дробот Е.И. и др. Изменение метаболической активности макрофагов под влиянием вируса клещевого энцефалита // Биохимия. — 2007. — Т. 72, №2. С. 236-246.

87. Плешков Б.П. Практикум по биохимии растений. — М., 1976. — С. 109-141.

88. Попов С.В., Оводова Р.Г., Попова Г.Ю. и др. Ингибирующее действие кома-румана-пектина сабельника болотного Comarum palustre L. и его фрагментов на адгезию нейтрофилов человеку к фибронектину // Биохимия. — 2005. — Т. 70. — вып. 1. С. 133—138.

89. Потапнев М.П. B-лимфоциты. Цитокинобразующая функция // Иммунология. -1994.-№4.-С. 4-8.

90. Практикум по иммунологии / Под ред. И.А. Кондратьевой, В.Д. Самуилова. — М.: МГУ, 2001.-224 с.

91. Прозоровский В.Б., Прозоровская М.П., Демченко В.М. Экспресс-метод определения средней эффективной дозы и ее ошибки // Фармакология и токсикология. — 1978. № 4. - С. 497-502.

92. Проскуряков С.Я., Бикетов С.И., Иванников А.И., Скворцов В.Г. Оксид азота в механизмах патогенеза внутриклеточных инфекций // Иммунология. — 2000. — № 4. — С. 9-20.

93. Птичкин И.И., Птичкина Н.М. Пищевые полисахариды: структурные уровни и функциональность / ФГОУ ВПО «Саратовский ГАУ». Саратов, 2005. - 164 с.

94. Розе Л.В., Закенфельд Г.К., Лайвениекс М.Г. Беккер М.Е. Биологические эффекты левана // Изв. АН Латв ССР. 1990. - Т. 2. - С. 56-64.

95. Ройт А., Бростофф Дж., Мейл Д. Иммунология. М.: Мир, 2002. - 580 с.

96. Рябичева Т.Г., Вараксин H.A., Тимофеева Н.В. и др. Испытания иммуномоду-ляторов в системе ex vivo // Новости «Вектор-Бест». 2006. - №4(42). http://vector-best.mhost.ru/nvb/n42/st425 .htm

97. Рябиченко Е.В., Бондаренко В.М., Рябиченко В.В. Роль активных форм кислорода, генерируемых фагоцитами, в патогенезе заболеваний // Журнал микробиологии. -2000,-№4.-С. 65-71.

98. Саидов М.З., Пинегин Б.В. Спектрофотометрический способ определения активности миелопероксидазы в фагоцитирующих клетках // Лабораторное дело. 1991. -№3.-С. 56-60.

99. Саникидзе Т.В., Тхилава Н.Г., Папава М.Б. и др. Роль свободных радикалов азота и кислорода в патогенезе ЛПС-индуцированной эндотоксемии // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. — Т. 141. —№ 2. — 2006. — С. 172—176.

100. Сахно Л.В., Леплина О.Ю., Норкин М.Н. и др. Роль оксида азота в процессе активации Т-лимфоцитов человека, индуцированной бактериальным суперантигеном //

101. Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. — 2000. — Т. 130. — № 10. — С. 402406.

102. Свараль A.B., Ценева Г.Я., Шендерович O.A. Липополисахарид иерсений и его биологическая активность // Журн. микробиол. 2006. - № 3. - С. 100-104.

103. Сельникова О.П., Полищук Е.И., Васюренко З.П. Отсутствие различий в жир-нокислотном составе клеток и липополисахаридов иерсений разных видов в условиях роста при низкой температуре // Журн. микробиол. —2005. — № 6. С. 10-14.

104. Серегина М.В., Михайлова Л.П. Выявление фармакологических свойств новых препаратов наружного применения с помощью метода биоиндикации клеточного монослоя // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. — 2002. Т. 133. — № 4. — С. 474-476.

105. Симбирцев A.C. Толл-белки: специфические рецепторы неспецифического иммунитета // Иммунология. — 2005. — № 6. — С. 368-377.

106. Симбирцев A.C. Цитокины: классификация и биологические функции // Ци-токины и воспаление. 2004. - Т. 3. - № 2. - С. 16-22.

107. Симбирцев A.C. Цитокины новая система регуляции защитных реакций организма // Цитокины и воспаление. - 2002. - Т. 1. - № 1. - С. 9-17.

108. Смирнов В. С., Малинин В. В., Кетлинский С. А. Иммунодефицитные состояния. СПб.: Фолиант, 2000. - 568 с.

109. Соловьева Т.Ф., Оводов Ю.С. Физические свойства липополисахаридов гра-мотрицательных бактерий // Биологические мембраны. — 1992. — Т. 9. — № 3. С. 245-258.

110. Сомова Л.М., Плехова Н.Г., Гончарук Ю.Н. и др. Кислородзависимая и нит-роксизависимая ферментные системы макрофагов при стафилококковой и листериозной инфекциях // Журн. микробиол. 2006. - № 3. - С. 39-43.

111. Суслов А.П., Головин В.П., Скворцов В.Т., Коронцвит Т.А. Скрининговыи тест клеточной миграции из микрокультур in vitro // Иммунология. 1989. - № 2. - С. 7377.

112. Сюч Н.И., Бейлина В.Б. Сравнительная оценка использования бактериальных и латексных объектов фагоцитоза для изучения фагоцитарной активности нейтрофилов периферической крови // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунологии. 1995. - №6. - С. 70-71.

113. Ткаченко A.A., Севрюгина T.B. Биосинтез левана Bacillus polymyxa II Микробиология. 1989. - T. 58. - Вып. 3. - С. 457-461.

114. Тотолян A.A., Балдуева И.А., Бубнова JI.H. и др. Стандартизация методов им-мунофенотипирования клеток крови и костного мозга человека // Клиническая лабораторная диагностика. 2001. — № 8. — С.38—45.

115. Тотолян A.A., Фрейдлин И.С. Клетки иммунной системы. Т. 1-2. СПб.: Наука, 2000.-231 с.

116. Турова А.Д., Гладких A.C. Биологическая активность полисахаридов растительного происхождения // Фармакология и токсикология. — 1965. —№ 4. — С. 498-504.

117. Тынянова В.И., Зюзина В.П., Демидова Г.В. и др. Токсичность препаратов липополисахаридов из культуры Yersinia pestis EV 76, выращенной при 28° и 37° // Биотехнология. -2003. — № 6. С. 10-16.

118. Федоненко Ю.П. Липополисахариды азоспирилл структура, участие во взаимодействии с корнями пшеницы: Дис. канд. биол. наук. — Саратов, 2003. - 129 с.

119. Федоненко Ю.П., Егоренкова И.В., Коннова С.А., Игнатов В.В. Участие липополисахаридов азоспирилл во взаимодействии с поверхностью корней пшеницы // Микробиология. 2001. - Т. 70, № 3. - С. 384-390.

120. Фрейдлин И.С. Система мононуклеарных фагоцитов. — М.: «Медицина», 1984. -272 с.

121. Фрейдлин И.С. Ключевая позиция макрофагов в цитокиповой регуляторной сети. // Иммунология. 1995. - № 3. - С. 44-48.

122. Цавкелова Е.В., Климова С.Ю., Чердынцева Т.А. и др. Микроорганизмы -продуценты стимуляторов роста растений и их практическое применение // Прикладная биохимия и микробиология. -2006. Т. 42. - № 2. - С. 133-143.

123. Хаитов P.M., Игнатьева Г.А., Сидорович И.Г. Иммунология. М.: Медицина, 2000. - 432 с.

124. Хаитов P.M., Пинегин Б.В. Иммуномодуляторы: классификация, фармакологическое действие, клиническое применив // Журнал последипломного образования для провизоров. 2004. - Т. 3. - № 4. - С. 4-10.

125. Хаитов P.M., Пинегин Б.В. Современные подходы к оценке основных этапов фагоцитарного процесса // Иммунология. 1995. - № 4. - С. 3-8.

126. Хасина Э.И., Сгребнева М.Н., Ермак И.М., Малеев В.В. Влияние каррагинана на неспецифическую резистентность мышей при ЛПС-индуцированной эндотоксемии // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2007. — № 2. - С. 57-60.

127. Хейфец Л.Б., Абалакина В.А. Разделение форменных элементов крови человека в градиенте плотности фиколл-верографин // Лабораторное дело. — 1973. № 10. — С. 579-581.

128. Чередеев А.Н. Fc-рецепторы на фагоцитирующих клетках // Иммунология. -1995. -№3.- С. 21-26.

129. Шандула И., Коган Г., Маслер Л. Структура и некоторые характеристики дрожжевых (3-гликанов // Бюллетень экспериментальной биологии. — 1990. № 7. - С. 3942.

130. Шевченко Н.М. Строение, биологическая активность полисахаридов некоторых бурых водорослей и продуктов их ферментативной трансформации: Автореф. дис. . канд. хим. наук. — Владивосток. — 2001. — 93 с.

131. Шичкин В.П. Патогенетическое значение цитокинов и перспективы цитоки-новой/антицитокиновой терапии // Иммунология. 1998. - № 2. - С. 9 - 13.

132. Шубич М.Г., Нагоев Б.С. Щелочная фосфатаза лейкоцитов в норме и патологии. М.: Медицина, 1980. - 41 с.

133. Шубич М.Г., Нестерова И.В. О специфичности цитохимического выявления кислой фосфатазы в нейтрофильных лейкоцитах // Лабораторное дело. — 1980. — № 3. — С. 150-154.

134. Ярилин А.А. Основы иммунологии М.: Медицина, 1999. - 409 с.

135. Alexander С., Rietschel Е.Т. Bacterial polysaccharides and innate immunity // J. Endotoxin Res. 2001. - V. 7, № 3. - P. 167-198.

136. Babson A.L., Read P.A. A new assay for prostatic acid phosphatase in serum // Amer. J. Clin. Pathol. 1959. -V. 32(1). - P. 88-91.

137. Bazil V., Horejsi V., Baudys M. ets. Structure relationship between the soluble and membrane-bound forms of human monocyte surface glycoprotein CD 14 // Mol. Immunol. — 1989.-V. 26.-P. 657-662.

138. Bazil V., Horejsi V., Baudys M. ets. Biochemical characterization of a soluble form of the 53-kDa monocyte surface antigen // Eur. J. Immunol. 1986. - V. 16. - P. 1583 - 1589.

139. Bik W., Wolinska-Witort E., Chmielowska M. et al. Vasoactive intestinal peptide can modulate immune and endocrine responses during lipopolysaccharide-induced acute inflammation // Neuroimmunomodulation. — 2004. V. 11. - P. 358-364.

140. Bishop C.T., Jennings H.J. Immunology of polysaccharides // Ed. G.O. Aspinall «The polysaccharides». — New-York: Academia Press, 1982. V. 1. - P. 292—330.

141. Bodansky A. Phospatase studies // J. Biol. Chem. 1933. - V. 101. - P. 93.

142. Branderburg K., Mayer H., Koch M.H.K. et al. Influense of the super molecular structure of free lipid A on its biological activity // Eur. J. Biochem. — 1993. — V. 218. P. 555563.

143. Brandenburg K, Wiese A. Endotoxins: relationships between structure, function, and activity // Curr. Top. Med. Chem. 2004. - V. 4(11). - P. 1127-1146.

144. Brubaker J. O., Li Q., Tzianabos A. O. et al. Mitogenic activity of purified capsular polysaccharide A from Bacteroides fragilis: differential stimulatory effect on mouse and rat lymphocytes in vitro // J. Immunol. 1999. - V. 162. - P. 2235-2242.

145. Burger R.A., Torres A.R., Warren R.P., Caldwell V.D., Hughes B.G. Echinacea-induced cytokine production by human macrophages // Int. J. Immunopharmacol. 1997. — V 19(7).-P. 371-379.

146. Butler A.R. The Jaff reaction: identification of the colored species Clin. Chim. Acta. 1976. - V. 59. - P. 227-232.

147. Cadenas S., Cadenas A. Fighting the stranger — antioxidant protection against endotoxin toxicity // Toxicology. 2002. - V. 180. - P. 45-63.

148. Caroff M., Karibian D. Structure of bacterial lipopolysaccharides // Carbohydr. Res.- 2003. V. 338. - P. 2431-2447.

149. Chellat F., Tabrizian M., Dumitriu S. et al. In vitro and in vivo biocompatibility of chitosan-xanthan polyionic complex // Journal of biomedical materials research. — 2000. — V. 51.- l.-P. 107-116.

150. Choma A., Komaniecka I. Characterization of novel lipid A structure isolated from Azospirillum lipoferum lipopolysaccharide // Carbohydr. Res. 2008. - V. 343. - P. 799-804.

151. Choma A., Russa R., Lorkiewicz Z. Chemical composition of lipopolysaccharide from Azospirillum lipoferum // FEMS Microbiol. Lett. 1984. - V. 22. - P. 245-248.

152. Chow J.C., Young D.W., Golenbock D.T. et al. Toll-like receptor-4 mediates lipo-polysaccharide-induced signal transduction // J. Biol. Chem. 1999. - V. 274. - P. 1068910692.

153. Cuscheeri J., Maier R.V. Oxidative stress, lipid rafts and macrophage reprogramming // Antioxidants and redox signaling. 2007. - V. 9. - № 9. - P. 1485-1498.

154. Day J.M., Dobereiner J. Phyziological aspects of N2-fixation by Spirillum from di-gitaria roots // Biol. chem. 1976. - V. 8. - P. 46 - 60.

155. De Baetselier P., Schram E. Luminescent bioassays based on macrophage cell lines //In.: Methods in enzymology. New York: Academic Press, 1986. -V.133. - P. 507-530.

156. Demchenko A.V., Wolfert M.A., Santhanam B., Moore J.N., Boons G.J. Synthesis and biological evaluation of Rhizobium sin-1 lipid A derivatives // J. Am. Chem. Soc. 2003. -V. 125(20).-P. 6103-6112.

157. Feizi T. Carbohydrate-mediated recognition systems in innate immunity // Immunological reviews 2000. - V. 173. - P. 79-88.

158. Fedonenko Yu.P., Konnova O.N., Zatonsky G.V., Konnova S.A., Kocharova N.A., Zdorovenko E.L., Ignatov V.V. Structure of the O-polysaccharide from the Azospirillum lipoferum Sp59b lipopolysaccharide // Carbohydr. Res. 2005. - V. 340. - P. 1259-1263.

159. Fedonenko Yu.P., Zatonsky G.V., Konnova S.A., Zdorovenko E.L., Ignatov V.V. Structure of the O-specific polysaccharide of the lipopolysaccharide of Azospirillum brasilense Sp245 // Carbohydr. Res. 2002. - V. 337. - P. 869-872.

160. Fukui H., Tanaka M., Misaki A. Structure of a physiologically active polysaccharide produced by Bacillus polymyxa S-4 // Agric. Biol. Chem. 1985. - V. 49. - P. 2343-2349.

161. Ganz T, Selsted M.E, Lehrer R.I. Defensins // Europ. J. Haematol. 1990. - V. 44. -№ l.-P. 1-8.

162. Golenbock D.T., Fenton M.J. Extolling the diversity of bacterial endotoxins // Nature immunology. 2001. - V. 2 no 4. - P. 286-288.

163. Green D.R. Overview: apoptotic signaling pathways in the immune system // Immunological reviews. 2003. - V. 193. — P. 5-9.

164. Green L.C., Wagner D.A., Glogowski J. et al. Analysis of nitrate, nitrite, and (15N) nitrate in biological fluids // Analyt Biochem. 1982. - № 8. - P. 126-131.

165. Gentle T.A., Thompson R.A. Neutrophil function tests in clinical immunology // Clinical Immunology A Practical Approach / eds. Gooi H.G., Chapel H. New York, 1990. — P. 57-59.

166. Iman G.M., Abd-Allah N.M. Fructosan, a new soil conditishing polysaccharide isolated from the methabolites of Bacillus polymyxa AS-1 and its clinical application // Egipt. J. Botan. — 1974. — V. 17. -№ 1.-P.19-26.

167. Harris H.W., Gosnell J.E., Kumwenda Z.L. The lipemia of sepsis: triglyceride-rich lipoproteins as agents of innate immunity // J. Endotox. Res. — 2000. V. 6. - № 6. - P. 421430.

168. Heidelberger M. Lectures in Immunochemistry. — New-York: Academia Press, 1956.-113 p.

169. Hinshaw L.B. Cellular and molecular aspects of endotoxin reactions /ed. A. Nowotny. Elsevier Sci. Publ., 1990. - 509 p.

170. Hoist O., Ulmer H., Flad H.D., Rietschel E.T. Biochemistry and cell biology of bacterial endotoxins // FEMS Immunol. Med. Microbiol. 1996. - V. 16. - P. 83-104.

171. Hynes R.O. Integrins: A Family of Cell Surface Receptors // Cell. 1987. - V. 48. -P. 549-554.

172. Jung H-K, Hong J-H, Park S-C. et al. Production and physicochemical characterization of P-glucan produced by Paenibacillus polymyxa JB115 // Biotechnology and bioprocess engineering.-2007.-V. 12.-P. 713-719.

173. Kirschning C.J., Wesche H., Merrill Ayres T., Rothe M. Human toll-like receptor 2 confers responsiveness to bacterial lipopolysaccharide // J. Exs. Med. — 1998. — V. 188. — P. 2091-2097.

174. Kittakoop P., Wanasith S., Watts P., Kramyu J., Tanticharoen M., Thebtaranonth Y. Potent antiviral potamogetonyde and potamogetonol, new furanoid labdane diterpenes from Potamogeton malaianus II J. Nat. Prod. 2001. -V. 64. - P. 385-388.

175. Lebar S., Cavaillon I., Caroff M. Molecular reguirements for interleukin induced by lipopolysaccharide stimulated human monocytes: involvement of the heptosyl-2-keto-3-deoxyoctulosonate region // Eur. J. Immunol. - 1986. - V. 16. - № 1. - P. 87-91.

176. Lee I.Y., Seo W.T., Kim G.J., Kim M.K., Ahn S.G., Kwon G.S., Park Y.H. Optimization of fermentation conditions for production of exopolysaccharide by Bacillus polymyxa //Bioprocess Engineering. 1997. - № 16. - P.71-75.

177. Lehrer RI, Lichtenstein AK, Ganz T. Defensins: antimicrobial and cytotoxic peptides of mammalian cells // Annual Review of Immunology. — 1993. — V. 11. — P. 105-128.

178. Lerouge I, Vanderleyden J. O-antigen structural variation: mechanisms and possible roles in animal/plant-microbe interactions // FEMS Microbiol Rev. 2002. - V. 26(1). P. 17-47.

179. Liu A.H., Redmon A.H. Endotoxin: friend or foe? // Allergy and Astma Proc. — 2001. V. 22(6). - P. 337-340.

180. Luderitz O. Freudenberg M. A., Galanos C., Zehmann K., Rietschel E. T., Shaw D. H. Lipopolysaccharide of gram-negative bacteria // Curr. Top. Membr. Transport. 1982. - V. 17.-P. 79-134.

181. Lucy M., Reed E., Glik R. Applications of free living plant growth-promoting rhi-zobacteria // Ant.van Leeuwenhoek. 2004. -V.86. - P. 1-25.

182. Matora L.Y., Serebrennikova O.B., Shchygolev S.Yu. Structural effects of the Azospirillum lipopolysaccharides in cell suspensions // Biomacromolecules 2001. - V. 2. - № 2.-P. 402-406.

183. Marshell E.K., And J.R., Davis D.M. Urea: its distribution in and elimination from the animal body J. Biol. Chem. 1914. - V. 18. - P. 53-80.

184. Medzitov R., Preston-Hurlburt P., Kopp E. et al. MyD88 is an adaptor protein in the hToll/IL-1 reseptor family signaling pathways // Mol. Cell. 1998. - 2. - P. 253-258.

185. Medzhitov R., Janeway C. Jr. Innate immune recognition: mechanisms and pathways // Immunol. Rev. 2000. - V. 173. - P 89-97.

186. Mirelman D., Altman G. and Eshdat Y. Screening of bacteria isolates for marinóse specific lectin activity by agglutination of yeasts // J. Clin. Microbiol. Lett. 1980. - V. 11. - P. 328-331.

187. Morikawa K., Taceda R., Yamazaki M. et al. Induction of tumoricidal activity of polymorphonuclear leukocytesby liner ß-l,3-D-glucan and other immunomodulators in murine cells // Cancer Res. 1985. - V. 45. - P. 1496-1501.

188. Murakami A. Chemoprevention with phytochemicals targeting inducible nitric oxide synthase // Food factors for health promotion / ed. Yoshikawa T. Karger, 2009. V. 61. -P. 193-203.

189. Mitsuda C., Miyata N., Hirota T., Kikuchi T. High-viscosity polysaccharide by Bacilluspolymyxa II Hakko Kogaku Zasshi. 1981. - V. 59. - P. 303-309.

190. Janssens S., Beyart R. Role of Toll-like receptors in Patogen Recognition // Clin. Microbiol. Rev. 2003. - V. 16. - P. 1-19.

191. Ofek I., Goldhar J., Keisari Y. and Sharon N. Nonopsonic Phagocytosis of Microorganisms // Annual Review of Microbiology. 1995. - V. 49. - № 10. - P. 239 - 276.

192. Omura T., Sato R. The carbon monoxide-binding pigment of liver microsomes // J. Biol. Chem. 1964. -№ 239. - P. 2370-2377.

193. Ovodova R.G., Golovchenko V.V., Shashkov A.S., Popov S.V., Ovodov I.S. Structure and physiological activity of lemnan, Lemna minor L. pectin // Bioorg.Khim. — 2000. V. 26(10).-P. 743-751.

194. Pereira B.M.R., da Silva B.P., Pereira N.A., Parenta J.P. Antiinflammatory and immunologically active polysaccharides of Periandra mediterránea // Phytochemistry. 2000. -V. 54.-P. 409-413.

195. Popov S.V., Ovodova R.G., Ovodov Yu.S. Effect of lemnan, pectin from Lemna minor L., and its fragments on inflammatory reaction // Phytotherapy research. 2006. — V. 20. -P. 403—407.

196. Popov S.V., Popova G.Yu., Paderin N.M., Koval O.A., Ovodova R.G., Ovodov Yu.S. Preventative anti-inflammatory effect of potamogetonan, a pectin from the common pondweed Potamogeton natans L. H Phytotherapy research. 2007. - V. 21. - P. 609-614.

197. Popov S.V., Popova G.Yu., Nikolaeva Yu.S., Golovchenko V.V., Ovodova R.G. Immunostimulating activity of pectic polysaccharide from Bergenia crassifolia (I.) Fritsch // Phytotherapy research. 2005. - V. 19. - P. 1052-1056.

198. Popov S.V., Popova G.Yu., Ovodova R.G., Bushneva O.A., Ovodov Yu.S. Effects of polysaccharides from Silene vulgaris on phagocytes // International Journal of Immunophar-macology. 1999. -V. 21. - P. 617-624.

199. Poltorak A., He X., Smirnova I. et al. Defective LPS signaling in C3H/HeJ and C57BL/10ScCr mice: mutations in Tlr4 gene // Science. 1998. - V. 282. - P. 2085-2088.

200. Prokesova L., Mickova P., Stankova I. et al. Immunostimulatory effect of Bacillus firmus on mouse lymphocytes // Folia microbial. — 2002. — V. 47. — № 2. — P. 193—197.

201. Raetz S.R. Bacterial endotoxins: extraordinary lipids that activate eukaryotic signal transduction // J. Bacteriol. 1993. - V. 175. - P. 5745-5753.

202. Raichvarg D., Marchand E., Sarfait G. et al. A colorimetric method for the evaluation of phagocytosis by mouse peritoneal macrophages // Ann. Immunol. (Inst. Pasteur, Paris) -1980.-V. 131D.-№1.-P. 71-78.

203. Rietschel E., Brade H. Bacterial endotoxins // Scientif. Am. 1992. - V. 267. - P.54.61.

204. Rietschel E., Kikikae T., Schade et al. Bacterial endotoxin molecular relationships of structure to activity and function // FASEB J. 1994. - V. 8. - P. 217-225.

205. Roe A.L., Warren C., Hou G. et al. The effect of high dose endotoxin on CYP3A2 expression in the rat // Pharmaceutical research. 1998. - V. 15. - № 10. - P. 1603-1608.

206. Ruiz-Bravo R., Jimenez-Valera M., Moreno E. Biological response modifier activity of an exopolysaccharide from Paenibacillus jamilae CP-7 // Clinical and diagnostic laboratory immunology. 2001. - V. 8. - № 4. - P. 706-710.

207. Ryan E., Daly L.M., Mills K.H.G. Immunomodulators and delivery systems for vaccination by mucosal routes // TRENDS in Biotechnology. 2001. - № 8. - P. 293-304.

208. Schletter J., Holger H., Ulmer A.J. ets. Molecular mechanisms of endotoxin activity // Arch Microbiol. 1995. - V. 164. - P. 383-389.

209. Schramm A.B., Brandenburg K., Loppnow H., Moran A.P., Koch M.H.J., Rietschel E.T.H., Seydel U. Biological activities of lipopolysaccharides are determined by the shape of their lipid A portion // Eur. J. Biochem. 2000. - V. 267. - P. 2008-2013.

210. Sebbane F., Gardner D., Long D. et al. Kinetics of disease progression and host response in rat model of bybonic plague // Immunipathology and infectious disease. 2005. - V. 166.-№5.-P. 1427-1439.

211. Seydel U., Schramm A.B., Brade L. et al. Physicochemical characterization of car-boxymethyl lipid A derivatives in relation to biological activity // FEBS Journal. — 2005. — V. 272. P. 327-340.

212. Shin Jae-Yong, Song Ji-Young, Yun Yeon-Soon et al. Immunostimulation effects of acidic polysaccharides extract of Panax ginseng on macrophage function // Immunopharma-cology and Immunotoxicology. 2002. - V. 24. - P. 469^182.

213. Sladowski D., Kinsner A., Langezaal I. et al. Activation of the complement system as an indicator of pyrogenic reaction to lipopolysaccharide (LPS) // Toxicology in Vitro. 2001. -15.-P. 339-342.

214. Soldatos A.N., Metheniti A., Mamali I. et al. Distinct LPS-induced signals regulate LPS uptake and morphololgical changes in medfly hemocytes // Insect Biochemistry and Molecular Biology. 2003. - V. 33. - P. 1075-1084.

215. Southwick J. G., Lee H., Jameson A. M., Blackwell J. Self-Association of xanthan in aqeous solvent-systems // Carbohydrate Research. — 1980. V. 84. - P. 287-295.

216. Stenger S., Rollinghoff M. Role of cytokines in the innate immune response to intracellular pathogens // Annals of the Rheumatic Deseases through the ages. — 2005. — V. 60. — P. 43-46.

217. Taylor P.R., Brown D., Reid M. et al. The p-glucan receptor, dectin-1, is predominantly expressed on the surface of the monocyte/macrophage and neutrophil lineages // J. Immunol. 2002. - V. 169. - P. 3876-3882.

218. Tlaskalova-Hogenova H, Stepankova R, Hudcovic T. et al. Commensal bacteria (normal microflora), mucosal immunity and chronic inflammatory and autoimmune diseases // Immunol. Lett. 2004. - V. 93. - № 2-3. - P. 97-108.

219. Tobias P.S., Soldau K., Schumann R.R. ets. Lipopolisaccharide binding protein (abstract) // J. Cell. Biochem. 1992. - V. 16. - P. 144 - 151.

220. Toman R., Garidel P., Andra J. et al. Physicochemical characterization of the endotoxins from Coxiella burnetii strain Priscilla in relation to the bioactivities // BMC Bichemistry. 2004. - № 5. http:/www.biomedcentral.com/1471-2091/5/l

221. Trinder P. Determination of glucose in blood using glucose oxidase with an alternative oxygen acceptor // Ann. Clin. Biochem. — 1969. — V. 6. — P. 24.

222. Tzianabos A.O. Polysaccharide immunomodulators as therapeutic agents: structural aspects and biologic function // Clinical microbiology reviews. — 2000. — V. 13. № 4. - P. 523— 533.

223. UK Pat. № 2080818. Microbial process for the production of a polysaccharide and its kationic salt and their use in depressing serum and liver cholesterol level and thachogenic index / Tanaka M., Machida Y., Tanaka S., Okamatsu H., Yatake T. 1982.

224. Ulevitch R.J., Tobias P.R. Reseptor-dependent mechanisms of cell stimulation by bacterial endotoxin // Annu. Rev. Immunol. 1995. - V. 13. - P. 437-457.

225. Ulmer A.J., Flad H., Rietschel T.et al. Induction of proliferation and cytokine production in human T lymphocytes by lipopolysaccharide (LPS) // Toxicology. 2000. - V. 152(1-3).-P. 37-45.

226. Valiante N.M., O'Hagan D., Ulmer J. Innate immunity and biodefence vaccines // Cell. Microbiol. 2003. - V. 5. - P. 755-766.

227. Van Amersfoort E.S., Van Berkel T.J., Kuiper J. Receptors, mediators, and mechanisms involves in bacterial sepsis and septic shock // Clinical microbiology reviews. 2003. - V. 16. -№ 3. - P. 379^414.

228. Vasan M., Wolfert M.A., Boons G-J. Agonictic and antagonictic properties of a Rhizibium sin-1 lipid A modified by an ether-linked lipid // Org. Biomol. Chem. 2007. - V. 5. -P. 2087-2097.

229. Vinderola G., Perdigón G., Duarte J., Farnworth E., Matar C. Effects of the oral administration of the exopolysaccharide produced by Lactobacillus kefiranofaciens on the gut mucosal immunity // Cytokine. 2007. - V. 36. - № 5-6. - P. 254-260.

230. Wagner H. Immunostimulants of plant organ // Croatica Chem. Acta. 1995. - V. 68.-P. 615-626.

231. Wagner H., Jurcic K. Immunologic studies of plant combination preparations. In-vitro and in-vivo studies on the stimulation of phagocytosis // Arzneimittelforschung. 1991. — V. 41(10).-P. 1072-1076.

232. Wang P.-L., Ohura K. Porphyromonas gingivalis lipopolysaccharide signaling in gingival fibroblasts CD14 and Toll-like receptors // Crit. Rev. Oral. Biol. Med. 2002. - V. 13(2).-P. 132-142.

233. Westphal O., Luderitz O., Biater F. Uber die Extraction von Bacterien mit PhenolWasser // Z. Naturforsch: Anorg. Chem., Org. Chem., Biochem., Biophys., Biol. 1952. - Bd. 78. - P. 148- 155.

234. Wu C.H., Chen T.L., Chen T.G. et al. Nitric oxide modulates pro- and antiinflammatory cytokines in lipopolysaccharide-activated macrophages // The Journal of Trauma. 2003. - V. 55. - P. 540-545.

235. Yadomae T. Immunopharmacologital activity of p-glucan: structure-activity relationship in relation to various conformations // Jpn. J. Med. Mycol. 1992. - V. 33. - P. 267277.

Информация о работе

Фомина, Алла Анатольевна
кандидата биологических наук
Саратов, 2010
ВАК 03.00.04

Диссертация

Влияние бактериальных гликополимеров на функционально-метаболический статус лейкоцитов и активность ключевых ферментов метаболизма мышей - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы