Влияние алкилоксибензолов на ростовые и персистентные характеристики микроорганизмов

Гордеева, Светлана Валерьевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Влияние алкилоксибензолов на ростовые и персистентные характеристики микроорганизмов
ВАК РФ 03.02.03, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Влияние алкилоксибензолов на ростовые и персистентные характеристики микроорганизмов"

На правах рукописи

Гордеева Светлана Валерьевна

ВЛИЯНИЕ АЛКИЛОКСИБЕНЗОЛОВ НА РОСТОВЫЕ И ПЕРСИСТЕНТНЫЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ МИКРООРГАНИЗМОВ

03.02.03 - «Микробиология»

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

4846162

1 2 МАЙ 2011

Оренбург-2011

4846162

Работа выполнена в Учреждении Российской академии наук «Институт клеточного и внутриклеточного симбиоза» УрО РАН

Бухарин Олег Валерьевич

Научный руководитель: академик РАМН,

доктор медицинских наук, профессор

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор ГОУ ВПО Оренбургская государственная медицинская академия Министерства

здравоохранения и социального „, „ „

Усвяцов Борис Яковлевич развития РФ 1

доктор медицинских наук, профессор ГОУ ВПО Башкирский государственный медицинский университет

Министерства здравоохранения и Габидуллин Зайнулла

социального развития РФ Гайнулинович

Ведущая организация: ГОУ ВПО «Челябинская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации

Защита состоится <Д6» ^шэ^хЭ, 2011 г. в часов на заседании диссертационного совета Д. 208.066.03. при Оренбургской государственной медицинской академии по адресу: Россия, 460000, г. Оренбург, ул. Советская, д. 6, телефон: (3532) 40-35-62, факс (3532) 77-24-59, зал заседаний диссертационного совета, официальный сайт: http://www.orgma.ru/

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ОрГМА Автореферат разослан «¿]_» (л 2011 г.

Ученый секретарь диссертационного совета Л

д. м. н., профессор^.¿^¿¿/^'^ Немцева Наталия Вячеславовна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Микроорганизмы в развивающихся культурах, колониях и иных структурированных ансамблях связаны между собой сложными системами межклеточных взаимоотношений и для своего выживания широко используют преимущество коллективного поведения (QS), (Г.И. Эль-Регистан, 2006; Ю.А. Николаев, 2007; A.JL Мулюкин, 2010). Феномен «quorum sensing» бактерий осуществляется различными способами, включая: механический (контактный), (Ю.А. Николаев, 2000); коммуникативный, опосредованный физическими полями, (В.П. Казначеев, А.П. Михайлова, 1981); химический (A.C. Хохлов, 1988; A.C. Капрельянц, и др. 1993; Г.И. Эль-Регистан, 2005).

В настоящее время активно изучаются механизмы QS-взаимодействий микроорганизмов, в частности, химическая коммуникация, осуществляемая посредством низкомолекулярных соединений различной химической природы, синтезируемых и выделяемых в окружающую среду клетками микробной популяции или их частью (К. Stephens, 1986). В плане определения механизмов выживания микроорганизмов в окружающей среде, интерес представляет изучение di-факторов - алкилок-сибензолов (АОБ), контролирующих рост микроорганизмов и этапность основных стадий их онтогенетического развития. Продукция di-факторов клетками бактерий характерна для широкого круга как грамнегативных, так и грампозитивных микроорганизмов (Г.И. Эль-Регистан, 1988; Е.С. Бабусенко с соавт, 1991; A.J1. Мулюкин, 1996). Алкилоксибензолы являются адап-тогенами, проявляют антиоксидантную активность (Ю.А. Николаев и др., 2004), взаимодействуют с ДНК (O.K. Давыдова, 2006), стабилизируют и модулируют активность белков (А.И. Колпаков 2000, Е.И. Мартиросова, 2007). Однако открытым остается вопрос о влиянии алкилоксибензолов на важнейшие физиологические функции выживания бактерий - рост микроорганизмов и их персистентные характеристики, что и предопределило цель нашей работы.

Цель и задачи исследования

Цель исследования - изучение влияния алкилоксибензолов на ростовые и персистентные свойства микроорганизмов.

Для реализации этой цели были поставлены и решены следующие задачи:

1. Изучить влияние алкилоксибензолов на структуру популяции различных микроорганизмов по антилизоцимному признаку.

2. Оценить воздействие алкилоксибензолов на популяции грамнегативных и грампозитивных микроорганизмов по способности формировать биопленки.

3. Изучить влияние алкилоксибензолов на кинетику роста исследуемых микроорганизмов.

4. Выявить особенности структуры популяций условно-патогенной микрофлоры и представителей нормо-флоры по персистентным и ростовым характеристикам при влиянии на них алкилоксибензолов.

Новизна исследования

Установлено, что алкилоксибензолы - (метилрезорцин и гексилрезорцин) оказывали влияние на ростовые свойства, анти-лизоцимную активность бактерий и их способность формировать биопленки.

Предложено использование метода популяционного анализа для оценки влияния алкилоксибензолов на персистентные свойства микроорганизмов (по антилизоцимному признаку и способности образовывать биопленки), выявляющего особенности структурных перестроек популяции условно-патогенных микроорганизмов и представителей нормальной микрофлоры человека.

Установлено, что действие АОБ на популяции условно -патогенных бактерий и представителей нормофлоры по антилизоцимному признаку различалось перестройкой структуры популяции микроорганизмов - более выраженным снижением ан-тилизоцимной активности у условно-патогенных бактерий в сравнении с представителями нормальной микрофлоры.

Выявлена связь структуры алкилоксибензолов с их инги-бирующим влиянием на антилизоцимную активность бактерий. Препарат алкилоксибензола с короткой цепочкой алкильного радикала - метилрезорцин (С7-АОБ) вызывал снижение среднего уровня АЛА микроорганизмов за счет появления клонов без антилизоцимного признака и исчезновения клонов с высоким уровнем АЛА, тогда как препарат алкилоксибензола с длинной цепочкой алкильного радикала - гексилрезорцин (С12-АОБ) не изменял среднепопуляционного уровня АЛА бактерий, увеличивал долю клонов с высокой способностью ингибировать лизо-цим, наряду с сохранением числа клонов с отсутствием данного признака.

Изменения ростовых свойств аутохтонных и аллохтонных бактерий и их способности формировать биопленки под воздействием АОБ имели различия, которые характеризовались усилением изученных функций у бифидобактерий и лактобацилл и их угнетением у представителей условно-патогенных микроорганизмов (К. pneumoniae, гемолитическая Е. coli, В. cereus, S. aureus).

Практическая значимость

Полученные в работе данные расширяют теоретические представления о механизмах выживания бактерий под влиянием алкилоксибензолов.

Методика популяционного анализа для оценки влияния алкилоксибензолов на ростовые и персистентные свойства микроорганизмов пригодна для изучения механизмов «quorum sensing» в бактериальных сообществах и может быть использована для отбора и тестирования различных препаратов, в том числе син-биотиков в научно-исследовательских и производственных лабораториях.

Кроме того, полученные данные могут быть использованы для разработки ингибиторов образования биопленок УПМ и веществ, обладающих антиперсистентным действием, пригодных для борьбы с условно-патогенной персистирующей микрофлорой, что открывает перспективу для создания новых синбиоти-

ков с целью коррекции дисбиотических состояний микробиоценозов организма человека.

Положения, выносимые на защиту:

1. Алкилоксибензолы регулируют важнейшие физиологические функции выживания бактерий - ростовые и перси-стентные характеристики, проявляя выраженный дозозависимый эффект.

2. В среде культивирования алкилоксибензолы стимулируют рост и биопленкообразование аутохтонной микрофлоры, обеспечивая преимущество её развития по сравнению с аллох-тонными бактериями.

Апробация работы

Материалы диссертации доложены на:

- VI Всероссийской конференции «Персистенция микроорганизмов» (Оренбург, 2009).

- XII и XIII Всероссийских научно-практических конференциях по медицинской микологии «Кашкинские чтения» (Санкт-Петербург, 2009,2010).

Публикации

По теме диссертации опубликовано 6 научных работ, из них 3 статьи в журналах, рекомендованных ВАК.

Объем и структура диссертационной работы

Диссертация изложена на 143 страницах машинописного текста и содержит введение, обзор литературы, главу с описанием материалов и методов исследования, 3 главы собственных исследований, заключение, выводы и указатель литературы, включающий 111 отечественных и 113 зарубежных источников. Иллюстрации представлены 22 таблицами и 9 рисунками.

Связь работы с научными программами

Диссертационное исследование выполнено по открытому плану НИР, номер регистрации 0120. 0 853339. Отдельные

фрагменты исследования выполнены по программе Президиума РАН «Фундаментальные науки - медицине», в рамках проекта № 09-П-4-1007 «Механизмы формирования и регуляция ассоциативного симбиоза человека», а также в рамках целевой программы поддержки интеграционных проектов № 09-И-4-3001 «Выявление биомишеней и разработка способов регуляции персистентного потенциала микроорганизмов».

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования

Материалом для исследования послужили 6 штаммов факультативно-анаэробных и облигатно-анаэробных грампозитив-ных и грамнегативных микроорганизмов, являющихся представителями условно-патогенной и нормальной микрофлоры кишечника человека. К ним относились эталонные и производственные штаммы Bifidobacterium bifidum № 791 (препарат про-биотик «Бифидумбактерин» ЗАО «Экополис», г. Ковров); Lactobacillus acidophilus №1 (препарат пробиотик «Лактобактерин», ФГУП НПО «Микроген», г. Москва); Klebsiella pneumoniae № 278 (ГИСК им. Л.А. Тарасевича), Bacillus cereus № 279 (ГИСК им. Л.А. Тарасевича), а также клинические изоляты микроорганизмов - гемолитическая Escherichia coli № 101, Staphylococcus aureus № 104.

Клинический штамм Escherichia coli № 101 был изолирован из фекалий пациента при обследовании на дисбиоз кишечника, а культура Staphylococcus aureus № 104 из раны больного с гнойно-воспалительными заболеваниями мягких тканей. Полученные клинические изоляты идентифицированы общепринятыми бактериологическими методами по культураль-ным, морфологическим и биохимическим признакам с использованием коммерческих тест-систем ("ENTEROtest 24", "STAPHYtest 16" (LACHEMA, Чехия).

В качестве химических аналогов микробных ауторегулято-ров использовали метилрезорцин (С7-АОБ) и гексилрезорцин (С12-АОБ) из группы алкилоксибензолов, со степенью чистоты 99,9 % («Sigma-Aldrich», США). Рабочий раствор готовили растворением АОБ в этаноле с добавлением 3 % диметилсульфок-

сида («ДИА M», Испания) до конечной концентрации препарата 1 мг/мл. Из рабочего раствора готовили разведения изучаемых препаратов в LB-бульоне 0,1; 1 и 10 мкг/мл. Среду с АОБ (и без него, но с эквивалентным количеством этанола с 3% DMSO, контроль) разливали в стерильные пробирки по 9,9 мл и вносили 0,1 мл суспензии клеток 1-суточной агаровой культуры бактерий в физиологическом растворе. Конечная концентрация клеток (доводимая по стандарту мутности или по ОП) - 1*104 КОЕ/мл, конечная концентрация этанола не превышала 0,067 %. В качестве контроля использовали взвесь чистой культуры микроорганизмов на LB-бульоне, без добавления АОБ. Посевы инкубировали при температуре 37° С в шейкере-инкубаторе «BioSan» (Латвия) при высоком уровне аэрации культуры (250 об/мин) в течение 9 часов до перехода в стационарную фазу роста. Выросшие микроорганизмы осаждали центрифугированием при 3000 об/мин в течение 10 мин., отделяли надосадочную жидкость и стерилизовали её фильтрованием (0 пор 200 мкм). Выделение клонов осуществляли путем рассева суточной бульонной культуры на плотную питательную среду, с последующим определением антилизоцимной активности и способности формировать биопленки. Уровень АЛА оценивали по способности стерильного супернатанта инактивировать лизоцим («Sigma-Aldrich», США), фотометрическим методом по методике О.В. Бухарина (1999 г.). Образование биоплёнок оценивали по способности штаммов к адгезии на поверхности 96-луночных полистироловых планшет (О'Toole G., 2000). Ростовые свойства микроорганизмов изучали фотометрическим методом при помощи 8-канального фотометра Е1х 808 («Biotek», США).

Данные были подвергнуты статистической обработке в компьютерной оболочке Windows с помощью процессора электронных таблиц Microsoft Office Excel 2003 и программы «Био-стат» путем подсчета средней арифметической (М) и средней ошибки средней величины (m), вероятность значений разницы (р). Данные по определению влияния алкилоксибензолов на биологические свойства исследуемых бактерий были статистически обработаны параметрическим методом с применением t-

критерия Стьюдента. Разница между сравниваемыми величинами считалась достоверной при значении р<0,05 (Гланц С., 1999).

Результаты исследования и их обсуждение

Установлено, что препараты алкилоксибензола (С7-АОБ и С12-АОБ) изменяли популяционную структуру как условно-патогенных микроорганизмов (К. pneumoniae № 278, Е. coli № 111, В. cereus № 279, S. aureus № 104), так и представителей нормальной микрофлоры человека (L. acidophilus № 1, В. bifi-dum № 791) по антилизоцимному признаку.

Эффект влияния С7-АОБ и С12-АОБ на структуру популяции изучаемых бактерий по антилизоцимному признаку различался. Препарат С7-АОБ снижал средний уровень AJIA условно-патогенных микроорганизмов на62±2,1% (р<0,05), за счет перестройки популяции в сторону снижения (до полного исчезновения) числа клонов с высоким и средним значением изучаемого признака (рис. 1). Было отмечено увеличение доли клонов с низким значением АЛА и появление доли клонов, не обладающих способностью инактивировать лизоцим. В отличие от С7-АОБ, С12-АОБ не изменял среднепопуляционного уровня изучаемого признака у представителей условно-патогенных микроорганизмов за счет нарастания доли клонов с высоким значением AJIA, а также ростом числа клонов, не обладающих способностью ингибировать лизоцим (рис. 2).

При влиянии С7-АОБ на представителей нормальной микрофлоры были получены аналогичные изменения, но степень снижения AJlA-признака была менее выраженной, чем у представителей УПМ. Средний уровень антилизоцимной активности при влиянии С7-АОБ на представителей нормальной микрофлоры снижался на 26±1,6% (р<0,05) от исходного уровня признака. Препарат С12-АОБ, как и в случае УПМ, не изменял среднего уровня выраженности АЛА признака (рис. 3).

Возможно, что одним из механизмов действия алкилок-сибензолов на антилизоцимную активность бактерий может быть связан с изменением конформации АЛА-фактора, являющегося по химической природе анионным белком (В.Ю. Соколов, 1990). В пользу этого предположения свидетельствуют

2 ^^■■■■■■■hmmhiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiii

1 1IHIIП171 II 111 II 1111111 lllllllllllllll ЧХХЧХХХХХХХХХХХУО

1 ГНППППППЩПНПППП XXWXXXXXXXXXXXWXX'

1 nillirminrr чХХХХХХХХХХХХХХХХХХХУуХХХХУ

1 ..........44IIII

0% 20% 40% 60% 80% 100%

■ 0 мкг/мл m 0,1 -1,0 мкг/мл □ 1,1 -1,5 мкг/мл £3 >1,5 мкг/мл

Условные обозначения:

1 - контроль (без АОБ) 2 - С7-АОБ 10,0 мкг/мл

I - К. pneumoniae II - Е. coli III - В. cereus IV - S. aureus №278 №111 №279 №104

Рис. 1 - Изменение популяционной структуры УПМ по АЛА под влиянием С7-АОБ

2 1

2 |

= 2 I 1

lim..........11 II 11 II 111 II I........TT gsSS^^NS^^

vwwwxxxxwwwwwx

1 in..........и...............

OvXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXWXXXX

■Hill xxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxx'

1 ШШШШПШШ ХХ\\\\\\\\\\ХУчЧ\Х\>

0% 20% 40% 60% 80% 100%

■ 0 мкг/мл ш 0,1 -1,0 мкг/мл □ 1,1 -1,5 мкг/мл к >1,5 мкг/мл

Условные обозначения те же (рис. 1). 1 - контроль (без АОБ) 2 - С12-АОБ 10,0 мкг/мл

Рис. 2 - Изменение популяционной структуры УПМ по АЛА под влиянием С12-АОБ

Illllllllllllllllllllllllllllllllllllllinillllllllllllllllllllllll

i_.....II....................mniii.............»III

wwwvw

...............................щи........

> 2

iiiiiiiiiiiiiiiii 111[||||||||||||||||||||||шпштт

чЧЧЧЧЧЧЧУ

20%

40%

60%

80%

100%

■ Омкг/мл 1110,1-1,0 мкг/мл □ 1,1-1,5 мкг/мл н>1,5 мкг/мл

Условные обозначения:

1 - контроль (без АОБ) 2 - С7-АОБ 10,0 мкг/мл 3 - С12-АОБ мкг/мл

Рис. 3 - Изменение популяционной структуры представителей нормальной микрофлоры по по АЛА под влиянием С7-АОБ и С12-АОБ.

данные о том, что алкилоксибензолы могут функционировать как химические шапероны, стабилизируя структуру и изменяя конформацию белков, обуславливая сопряженные изменения их каталитической активности (И.Ю. Степаненко, 2005; Е.И. Мар-тиросова, 2007).

Выявлен дозозависимый эффект, характеризующийся нарастанием изменений структуры популяции исследуемых микроорганизмов по мере увеличения концентрации обоих препаратов гомологов алкилоксибензола в среде культивирования. Максимальные изменения перестройки популяции наблюдались при внесении препаратов в среду в концентрации 10,0 мкг/мл, что согласуется с данными, полученными ранее другими авторами (Г.И. Эль-Регистан и др., 1988; Е.И. Мартиросова, 2005; A.JI. Мулюкин, 2006; H.A. Голод, 2009).

Химические аналоги алкилоксибензолов (С7-АОБ и С12-АОБ) обладали видонеспецифичным действием в отноше-

V - В. bifidum № 791

VI - L. acidophilus № 1

нии АЛА микроорганизмов, изменяя структуру популяции бактерий, независимо от их видовой принадлежности, что соотносится с данными литературы (А.Л. Маргулис и др., 2001).

Принимая во внимание, что в настоящее время активно изучаются механизмы регуляции образования биопленок (У.Н. 1л. й а1. 2002; Е.Р. (ЗгеепЬегд 2003; Б. Ваквйю & а1. 2005 и др.), мы изучили влияние химических аналогов алкилоксибензола на биопленкообразование бактерий.

При изучении влияния гомологов алкилоксибензола на биопленкообразование бактерий было установлено изменение среднепопуляционного уровня данного признака и выявлена перестройка популяций грамнегативных и грампозитивных бактерий. Среди условно-патогенных микроорганизмов эффект влияния С7-АОБ и С12-АОБ различался. Присутствие С7-АОБ в среде культивирования приводило к снижению среднепопуляционного уровня биопленкообразования УПМ на 32±1,4% (р<0,05) от исходного уровня выраженности признака за счет перестройки популяции в сторону снижения доли клонов с высокими и средними значениями изучаемого признака и увеличения числа клонов с низкой способностью пленкообразования (рис. 4). В отличие от С7-АОБ, С12-АОБ не изменял среднепопуляционного уровня биопленкообразования условно-патогенных микроорганизмов, за счет того, что, наряду с увеличением доли клонов с низкими значениями свойства, нарастала численность клонов с высокими показателями биопленкообразования (рис. 5).

Напротив, препараты алкилоксибензолов у микроорганизмов, представителей нормальной микрофлоры стимулировали биопленкообразование в 2 раза. Под действием С7-АОБ и С12-АОБ популяции исследуемых штаммов перестраивалась в сторону увеличения количества клонов с высоким и средним значением изучаемого признака и снижения доли клонов с низкой способностью пленкообразования (рис. 6).

Также был выявлен дозозависимый эффект АОБ, характеризующийся нарастанием изменений структуры популяции ис-

> i— Л

2 ~ 1

I |

^^^ШПШШИШШШМ Л.ЧЧЧЧЧЧЧЧЧЧЧЧЧЧЧЧЧ'

2_ 1

[ЧЧЧЧ^ W4VV4444^44444VV^O

2__ 1 Mill кЧЧ

-1-j-

0% 20% 40% 60% 80% 100%

■0,100-0,140ед.ОП ПО,141-0,160ед.ОП 0 0,161-0,2 ед.ОП н>0,2ед.ОП

Условные обозначения:

1 - контроль (без АОБ) 2 - С7-АОБ 10,0 мкг/мл

I - К. pneumoniae II - Е. coli III - В. cereus IV - S. aureus №278 №111 №279 №104

Рис. 4 - Изменение популяционной структуры УПМ по способности формировать биопленки под влиянием С7-АОБ

■ 0,100-0,140 ед.ОП ПО,141-0,160 ед.ОП 00,161-0,2 ед.ОП я >0,2 ед.ОП

Условные обозначения те же (рис 4). 1 - контроль (без АОБ) 2 - С12-АОБ 10,0 мкг/мл

Рис. 5 - Изменение популяционной структуры УПМ по способности формировать биопленки под влиянием С12-АОБ

........Ill кч\чччч\чч\\ ч\\\\\\\\<\\\\\\\\\

MIIIIIIII """"Г"......

-1

0% 20% 40% 60% 80% 100%

■ 0,100-0,40 Оед.ОП п0,401-0,800 ед.ОП ПО,801-1,0 ед.ОП н>1,Оед.ОП

Условные обозначения:

1 - контроль (без АОБ) 2 - С7-АОБ 10,0 мкг/мл 3 - С12-АОБ мкг/мл

V - В. bifidum № 791 VI - L. acidophilus № 1

Рис. 6 - Изменение популяционной структуры представителей нормальной микрофлоры по способности формировать биопленки под влиянием С7-АОБ и С12-АОБ

следуемых микроорганизмов с увеличением концентрации препаратов в среде культивирования бактерий. Наиболее выраженные изменения структуры популяции изучаемых микроорганизмов по способности образовывать биопленки наблюдались при внесении С7-АОБ и С12-АОБ концентрации препаратов 10,0 мкг/мл.

Таким образом, действие алкилоксибензолов на популяцию условно-патогенных микроорганизмов приводило к угнетению их антилизоцимной активности и биопленкообразования, что в совокупности может способствовать ухудшению колонизации транзиторными микроорганизмами биотопов организма хозяина. Напротив, у представителей нормальной микрофлоры, наряду с незначительным снижением антилизоцимной активности отмечена стимуляция образования биопленок под воздействием обоих препаратов АОБ, что может быть одним из условий, обеспе-

чивающих индигенной микрофлоре преимущество в биотопе толстого кишечника человека.

Интенсивность роста микроорганизмов зависит от присутствия в среде различных факторов как эндо-, так и экзогенного происхождения, которые способны усиливать рост бактерий либо приводить к его угнетению. Одним из таких факторов являются сигнальные метаболиты, основная функция которых заключается в обеспечении межклеточных взаимодействий, а также во взаимодействии микроорганизмов со средой, которое направлено на успешный рост популяции и сохранение вида. В связи с этим, на следующем этапе работы было изучено модифицирующее действие алкилоксибензолов в отношении ростовых свойств аллохтонных и аутохтонных бактерий.

Установлено, что химические аналоги из группы алкилоксибензолов С7-АОБ и С12-АОБ влияют на кинетику роста грам-негативных и грампозитивных бактерий. Выявлено, что оба препарата оказывали угнетающее действие на ростовые свойства условно-патогенных микроорганизмов, которое проявлялось преждевременным выходом на стационарную фазу роста, наряду с уменьшением длительности лаг- и лог-фаз роста, а также снижением прироста биомассы исследуемых штаммов. На рисунке 7 представлен график по влиянию С7-АОБ на ростовые свойства УПМ на примере К. рпеитошае № 278. Препарат С7-АОБ в концентрациях 0,1; 1,0 и 10,0 мкг/мл угнетал ростовые свойства клебсиелл на 19±1,1%, 43±1,8% % и 70±3,4% % (р<0,05), соответственно. Препарат С12-АОБ оказывал аналогичное влияние на популяции других видов УПМ.

Полученные данные согласуются с результатами работ А.Л. Мулюкина (2006) показавшего, что внесение гомосерин-лактонов в начальные фазы роста бактериальных культур индуцировало остановку клеточного деления и ускорял их переход в стационарную фазу.

Ингибирование роста микробных культур было видоне-специфическим (бациллы, микрококки, стафилококки и др.), до-зозависимым и наблюдалось при переходе клеток в состояние покоя, это может иметь значение при расшифровке механизмов

— - -10 мкг/мл МР----1 мкг/мл МР.......0,1 мкг/мл МР-контроль (без МР)

Условные обозначения: МР - метилрезорцин (С7-АОБ)

Рис. 7 - Кинетика ростовых свойств К. pneumoniae № 278 под влиянием С7-АОБ в различных концентрациях

время, часы

---10 мкг/мл ГР----1 мкг/мл ГР .......0,1 мкг/мл ГР -контроль (без ГР)

Условные обозначения:

ГР - гексилрезорцин (С12-А0Б)

Рис. 8 - Кинетика ростовых свойств В. Ыйс1ит № 791 под влиянием С12-АОБ в различных концентрациях

формирования колонизационной резистентности биотопа кишечника человека.

Изучение влияния препаратов алкилоксибензола на рост представителей нормальной микрофлоры человека выявило преждевременный выход культур бифидобактерий и лактоба-цилл в стационарную фазу, снижение продолжительности лаг- и лог-фаз роста и увеличение прироста биомассы данных микроорганизмов, отражая стимулирующий эффект препарата.

На рисунке 8 представлены данные кинетической кривой роста В. bifidum под влиянием С12-АОБ в различных концентрациях. С12-АОБ в концентрации 0,1 мкг/мл не оказывал достоверного влияния на рост бифидобактерий в сравнении с контролем, а при увеличении концентрации до 1,0 и 10,0 мкг/мл была отмечена стимуляция ростовых свойств бифидобактерий на 18±1,1% и32±1,6% соответственно в сравнении с контролем. В отличие от гексилрезорцина, метилрезорцин вызывал незначительную стимуляцию ростовых свойств у представителей нормальной микрофлоры только при концентрации 10,0 мкг/мл.

Изменения ростовых свойств УПМ и представителей нормальной микрофлоры человека, как и в случае антилизоцимной активности и биопленкообразования бактерий, носили дозозави-симый характер: при увеличении концентрации С7-АОБ и С12-АОБ в среде культивирования нарастали изменения ростовых свойств микроорганизмов. Полученные данные согласуются и с результатами других авторов (Н.Г. Лойко, 2003; H.A. Голод, 2009).

Не исключено, что полученные данные о различном влиянии С7-АОБ и С12-АОБ на популяции представителей нормальной микрофлоры вероятно связаны с различием химической структуры гомологов алкилоксибензола, а именно с длинной цепочкой алкильного радикала молекулы алкилоксибензола, придающего препаратам антиоксидантные свойства (Н.А.Голод, 2007).

Таким образом, соинкубирование таких облигатно-анаэробных микроорганизмов, как бифидобактерии, обладающих высокой чувствительностью к действию кислорода с С12-АОБ, имеющего в сравнении с С7-АОБ более длинную цепь

алкильного радикала, способствует увеличению выживаемости аутохтонной микрофлоры в организме хозяина, что подтверждалось и материалами, полученными Н.А.Голод (2007) при моделировании стрессовых воздействий у лактобактерий.

Полученные данные можно использовать как для решения фундаментальных вопросов современной микробиологии по изучению выживаемости бактерий в организме хозяина, так и для решения прикладных биотехнологических задач, для повышения эффективности культивирования и сохранения промышленных штаммов микроорганизмов, использующихся для создания препаратов пробиотиков.

Таким образом, проведенная работа позволила выделить три основных момента:

1. Алкилоксибензолы являются регуляторами таких важнейших физиологических функций бактерий, как ростовые и персистентные характеристики, обеспечивающие выживание аутохтонных и аллохтонных микроорганизмов в биотопах организма хозяина.

2. Установлена связь химической структуры алкилоксибен-золов с их ингибирующим влиянием на антилизоцимную активность бактерий: уменьшение длины алкильной цепи АОБ способствовало усилению ингибирующего действия данных препаратов на АЛА микроорганизмов.

3. Присутствие алкилоксибензолов в среде культивирования обеспечивает преимущество роста аутохтонной микрофлоры и стимулирует ее способность к образованию биопленок, в отличие от аллохтонных бактерий, у которых отмечено угнетение роста и биопленкообразования под действием этих препаратов.

ВЫВОДЫ:

1. Химические аналоги из группы алкилоксибензолов оказывали модифицирующее влияние на антилизоцимную активность, биопленкообразование и ростовые свойства микроорганизмов.

2. При изучении влияния алкилоксибензолов на биологические свойства изучаемых бактерий был выявлен дозозависимый эффект, характеризующийся нарастанием изменений ростовых свойств и структуры популяции микроорганизмов по антилизо-цимной активности, биопленкообразованию микроорганизмов по мере увеличения концентрации препаратов в среде культивирования.

3. Препараты алкилоксибензолов способны разнонаправлено воздействовать на кинетику роста изучаемых микроорганизмов, причем эффект влияния препаратов зависит как от их дозы, так и от химического строения.

4. Изменение структуры популяции микроорганизмов по анти-лизоцимному признаку под влиянием метилрезорцина характеризовалось снижением среднего уровня АЛА, за счет перестройки популяции в сторону снижения доли клонов с высоким АЛА признаком, увеличением числа клонов с низким значением АЛА и появлением клонов, не ингибирующих лизоцим. Гексилрезорцин, не изменяя среднего уровня изучаемого признака, способствовал перестройке популяции как в сторону увеличения числа клонов с высоким значением АЛА, так и появления клонов без признака.

5. Внесение метилрезорцина в среду культивирования УПМ приводило к перестройке популяции микроорганизмов по их способности формировать биопленки, снижая среднепопуляционный уровень биопленкообразования. Гексилрезорцин не затрагивал изменений среднего уровня биопленкообразования микроорганизмов.

6. Выявлены отличия в динамике изменений роста и способности формировать биопленки аутохтонными и аллохтонными бактериями. Отмечено усиление изученных функций у бифидо-бактерий и лактобацилл и их угнетение у условно-патогенных микроорганизмов (К. pneumoniae, гемолитическая Е. coli, В. сеге-us, S. aureus).

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ:

1. Влияние химического аналога внеклеточных микробных ауто-регуляторов на антилизоцимную активность бактерий / Бухарин О.В., Перунова Н.Б., Эль-Регистан Г.И., Николаев Ю.А., Явнова С.В. (Гордеева С.В.), Молостов Е.В., Кириллов Д.А. // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. -Москва, 2007, № 6. - С. 3-6.

2. Бухарин О.В., Явнова (Гордеева С.В.), Перунова Н.Б. Модификация ростовых свойств Candida albicans под действием алки-локсибензолов // Проблемы медицинской микологии. - Санкт-Петербург, 2008. Т. 10, № 2. - С. 30.

3. Бухарин О.В., Перунова Н.Б., Явнова (Гордеева С.В.) Изменение популяционной структуры бактерий по антилизоцимному признаку под влиянием гексилрезорцина // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. - Москва, 2008, № 6.-С. 7-10.

4. Перунова Н.Б., Явнова С.В. (Гордеева С.В.) Влияние внеклеточных ауторегуляторов микробного метаболизма на ростовые свойства Candida albicans // Сборник материалов второго съезда микологов России «Современная микология в России». -Москва, 2008. - С. 282-283.

5. Гордеева С.В., Перунова Н.Б., Иванова Е.В. Образование биопленок в популяции Candida albicans под влиянием аутоин-дукторов анабиоза // Проблемы медицинской микологии. Санкт-Петербург, 2010. Т. 12, № 2. - С. 79.

6. Перунова Н.Б., Гордеева С.В., Бухарин О.В. Ростовые свойства, образование биопленок и антилизоцимная активность Bifidobacterium bifidum при воздействии химических аналогов алкилок-сибензолов // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. Москва, 2010, № 5. - С. 49-53.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

QS - quorum sensing (чувство кворума)

АОБ - алкилоксибензолы

УПМ - условно-патогенные микроорганизмы

АЛА - антилизоцимная активность

БПО - биоплёнкообразование

С7-АОБ - метилрезорцин

С12-АОБ - гексилрезорцин

ОП - оптическая плотность

Ед.ОП - единицы оптической плотности

ДЛЯ ЗАМЕТОК

ГОРДЕЕВА СВЕТЛАНА ВАЛЕРЬЕВНА

Влияния алкилоксибензолов на ростовые и персистентные характеристики микроорганизмов

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Оригинал макет подготовлен в программе Word for Windows 2003 Подписано в печать 10/03/2011 Формат 60*84/16. Усл.-печ. л. 1,0. Печать оперативная. Бумага офсетная. Гарнитура Times. Тираж 100 экз.

Содержание диссертации, кандидата медицинских наук, Гордеева, Светлана Валерьевна

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. Межмикробные коммуникации микроорганизмов (ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ)

1.1. Популяционно-коммуникативные исследования в микробиологии

1.2. Способы межклеточных взаимодействий микроорганизмов

1.3. Строение и биологические свойства алкилоксибензолов

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. Характеристика микроорганизмов, используемых в работе

2.2. Методы выделения и идентификации микроорганизмов

2.3. Характеристика препаратов алкилоксибензола

2.4. Методика соинкубирования препаратов с исследуемыми штаммами

2.5. Методика изучения клональной структуры популяции микроорганизмов

2.6. Методы изучения биологических свойств микроорганизмов

2.7. Методы статистической обработки полученных результатов

ГЛАВА 3. ИЗУЧЕНИЕ АНТИЛИЗОЦИМНОЙ АКТИВНОСТИ МИКРООРГАНИЗМОВ ПОД ВЛИЯНИЕМ АЛКИЛОКСИБЕНЗОЛОВ

3.1. Влияние алкилоксибензолов на антилизоцимную активность грамнегативных микроорганизмов

3.2. Действие алкилоксибензолов на антилизоцимную активность грампозитивных бактерий

3.3. Изменение антилизоцимной активности представителей нормальной микрофлоры человека под влиянием алкилоксибензолов.

ГЛАВА 4. ИЗУЧЕНИЕ СПОСОБНОСТИ МИКРООРГАНИЗМОВ ФОРМИРОВАТЬ БИОПЛЕНКИ ПОД ВЛИЯНИЕМ АЛКИЛОК- 66 СИБЕНЗОЛОВ

4.1.Способность грамнегативных микроорганизмов формировать биопленки под влиянием алкилоксибензолов

4.2. Биопленкообразование грампозитивных микроорганизмов под влиянием алкилоксибензолов

4.3. Действие алкилоксибензолов на биопленкообразование представителей нормальной микрофлоры

ГЛАВА 5. ИЗМЕНЕНИЕ РОСТОВЫХ СВОЙСТВ МИКРООРГАНИЗМОВ ПОД ДЕЙСТВИЕМ АЛКИЛОКСИБЕНЗОЛОВ

5.1. Изучение ростовых свойств грамнегативных микроорганизмов под влиянием алкилоксибензолов

5.2. Влияние алкилоксибензолов на кинетику роста грампозитивных микроорганизмов

5.3. Изменение ростовых свойств представителей нормальной микрофлоры человека под действием алкилоксибензолов

Введение Диссертация по биологии, на тему "Влияние алкилоксибензолов на ростовые и персистентные характеристики микроорганизмов"

В настоящее время активно изучаются механизмы

QS-взаимодействий микроорганизмов, в частности, химическая коммуникация, осуществляемая посредством низкомолекулярных соединений различной химической природы, синтезируемых и выделяемых в окружающую среду клетками микробной популяции или их частью (К. Stephens, 1986). В плане определения механизмов выживания микроорганизмов в окружающей среде, интерес представляет изучение d]-факторов — алкилоксибензолов (АОБ), контролирующих рост микроорганизмов и этапность основных стадий их онтогенетического развития. Продукция di-факторов клетками бактерий характерна для широкого круга как грамнегативных, так и грампозитив-ных микроорганизмов (Г.И. Эль-Регистан, 1988; Е.С. Бабусенко с соавт, 1991; A.JI. Мулюкин, 1996). Алкилоксибензолы являются адаптогенами, проявляют антиоксидантную активность (Ю.А. Николаев и др., 2004), взаимодействуют с ДНК (O.K. Давыдова, 2006), стабилизируют и модулируют активность белков (А.И. Колпаков 2000, Е.И. Мартиросова, 2007).

Однако открытым остается вопрос о влиянии алкилоксибензолов на важнейшие физиологические функции выживания бактерий - рост микроорганизмов и их персистентные характеристики, что и предопределило цель нашей работы.

Цель и задачи исследования

Для реализации этой цели были поставлены и решены следующие задачи:

2. Оценить воздействие алкилоксибензолов на популяции грамнега-тивных и грампозитивных микроорганизмов по способности формировать биопленки.

3. Изучить влияние алкилоксибензолов на кинетику роста исследуемых микроорганизмов.

4. Выявить особенности структуры популяций условно-патогенной микрофлоры и представителей нормофлоры по персистентным и ростовым характеристикам при влиянии на них алкилоксибензолов.

Новизна исследования

Установлено, что алкилоксибензолы — (метилрезорцин и гексилрезор-цин) оказывали влияние на ростовые свойства, антилизоцимную активность бактерий и их способность формировать биопленки.

Установлено, что действие АОБ на популяции условно - патогенных бактерий и представителей нормофлоры по антилизоцимному признаку различалось перестройкой структуры популяции микроорганизмов - более выраженным снижением антилизоцимной активности у условно-патогенных бактерий в сравнении с представителями нормальной микрофлоры.

Выявлена связь структуры алкилоксибензолов с их ингибирующим влиянием на антилизоцимную активность бактерий. Препарат алкилоксибензола с короткой цепочкой алкильного радикала — метилрезорцин (С7-АОБ) вызывал снижение среднего уровня АЛА микроорганизмов за счет появления клонов без антилизоцимного признака и исчезновения клонов с высоким уровнем АЛА, тогда как препарат алкилоксибензола с длинной цепочкой алкильного радикала - гексилрезорцин (С12-АОБ) не изменял среднепопуля-ционного уровня АЛА бактерий, увеличивал долю клонов с высокой способностью ингибировать лизоцим, наряду с нарастанием (сохранением) числа клонов с отсутствием данного признака.

Изменения ростовых свойств аутохтонных и аллохтонных бактерий и их способности формировать биопленки под воздействием АОБ имели различия, которые характеризовались усилением изученных функций у бифидо-бактерий и лактобацилл и их угнетением у представителей условно-патогенных микроорганизмов (К. pneumoniae, гемолитическая Е. coli, В. се-reus, S. aureus).

Практическая значимость

Методика популяционного анализа для оценки влияния алкилоксибензолов на ростовые и персистентные свойства микроорганизмов пригодна для изучения механизмов «quorum sensing» в бактериальных сообществах и может быть использована для отбора и тестирования различных препаратов, в том числе синбиотиков в научно-исследовательских и производственных лабораториях.

Кроме того, полученные данные могут быть использованы для разработки ингибиторов образования биопленок УПМ и веществ, обладающих анти-персистентным действием, пригодных для борьбы с условно-патогенной персистирующей микрофлорой, что открывает перспективу для создания новых синбиотиков с целью коррекции дисбиотических состояний микробиоценозов организма человека.

Положения, выносимые на защиту:

1. Алкилоксибензолы регулируют важнейшие физиологические функции выживания бактерий - ростовые и персистентные характеристики, проявляя выраженный дозозависимый эффект.

2. В среде культивирования алкилоксибензолы стимулируют рост и биопленкообразование аутохтонной микрофлоры, обеспечивая преимущество её развития по сравнению с агглохтонными бактериями.

Апробация работы

Материалы диссертации доложены на:

- VI Всероссийской конференции «Персистенция микроорганизмов» (Оренбург, 2009).

Публикации

По теме диссертации опубликовано 6 научных работ, из них 3 статьи в журналах, рекомендованных ВАК.

Объем и структура диссертационной работы

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Гордеева, Светлана Валерьевна

ВЫВОДЫ:

1. Химические аналоги из группы алкилоксибензолов оказывали модифицирующее влияние на антилизоцимную активность, бйопленкообразование и ростовые свойства микроорганизмов.

2. При изучении влияния алкилоксибензолов на биологические свойства изучаемых бактерий был выявлен дозозависимый эффект, характеризующийся нарастанием изменений ростовых свойств и структуры популяции микроорганизмов по антилизоцимной активности, биопленкообразованию микроорганизмов по мере увеличения концентрации препаратов в среде культивирования.

4. Изменение структуры популяции микроорганизмов по антилизоцимному признаку под влиянием метилрезорцина характеризовалось снижением среднего уровня АЛА, за счет перестройки популяции в сторону снижения доли клонов с высоким АЛА признаком, увеличением числа клонов с низким значением АЛА и появлением клонов, не ингибирующих лизоцим. Гексилрезорцин, не изменяя среднего уровня изучаемого признака, способствовал перестройке популяции как в сторону увеличения числа клонов с высоким значением АЛА, так и появления клонов без признака.

6. Выявлены отличия в динамике изменений роста и способности формировать биопленки аутохтонными и аллохтонными бактериями. Отмечено усиление изученных функций у бифидобактерий и лактобацилл и их угнетение у условно-патогенных микроорганизмов (К. pneumoniae, гемолитическая Е. coli, В. cereus, S. aureus).

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В настоящее время известно, что одноклеточные про - и эукариоты в развивающихся культурах, колониях и иных структурированных ансамблях связаны между собой сложными системами межклеточных взаимоотношений и для своего выживания широко используют преимущество коллективного поведения («quorum sensing») (Эль-Регистан Г.И., 2006; Николаев Ю.А., 2007).

К одним из наиболее изученных механизмов QS-взаимодействий микроорганизмов относится химическая коммуникация, осуществляемая посредством низкомолекулярных соединений различной химической природы, которые синтезируются и выделяются в окружающую среду всеми клетками микробной популяции или их частью, не используются в качестве источников конструктивного или энергетического метаболизма и действуют как индукторы специфического ответа (Stephens К., 1986). В плане определения механизмов выживания микроорганизмов в окружающей среде, интерес представляет изучение аутоиндукторов анабиоза (фё] - факторы) — алкилоксибензолов (АОБ), контролирующих рост микроорганизмов и этапность основных стадий их онтогенетического развития. Продукция фс^-факторов клетками бактерий характерна для широкого круга грамнегативных и грампозитивных микроорганизмов (Эль-Регистан Г.И., 1988; Бабусенко Е.С. с соавт, 1991; Мулюкин А.Л., 1996; Степаненко И.Ю., 2005). Установлено, что алкилоксибензолы являются адаптогенами, проявляют антиоксидантную активность (Николаев Ю.А. и др., 2004), взаимодействуют с ДНК (Давыдова O.K., 2006), стабилизируют и модулируют активность белков (Колпаков А.И., 2000; Мартиросова Е.И., 2007). Однако открытым остается вопрос о воздействии алкилрезорцинов на рост, антилизоцимную активность и биопленкообразование микроорганизмов.

Проведение такой работы могло бы способствовать раскрытию механизмов выживания микроорганизмов под влиянием мембранотропных ауторегуляторов, концентрация которых существенно увеличивается в окружающей среде при действии стрессовых факторов (изменение рН, температуры, лимит питательных веществ, действие литических ферментов и др.)- Кроме того, полученные данные могли бы способствовать поиску ингибиторов образования биопленок патогенов и веществ обладающих антиперсистентным действием, пригодных для борьбы с условно-патогенной персистирующей микрофлорой. Указанные моменты и определили цель и задачи нашего исследования.

Цель настоящей работы явилось изучение модифицирующего влияния мембранотропных ауторегуляторов (алкилоксибензолов) на ростовые свойства, антилизоцимную активность и способность к образованию биопленок микроорганизмов. Для достижения данной цели были поставлены и решены следующие задачи: изучить влияние химических аналогов алкилоксибензолов на антилизоцимную активность популяции бактерий различных таксономических групп; оценить воздействие микробных ауторегуляторов на биопленкообразование популяции грамнегативных и грампозитивных микроорганизмов; изучить влияние алкилоксибензолов на кинетику роста изучаемых штаммов; выявить особенности структуры популяций условно — патогенных бактерий и представителей нормофлоры по антилизоцимному признаку, способности к образованию биопленок и ростовым свойствам при влиянии на них алкилоксибензолов.

Материалом для исследования послужили 6 штаммов факультативно-анаэробных и облигатно-анаэробных грампозитивных и грамнегативных микроорганизмов, являющихся представителями условно-патогенной и нормальной микрофлоры человека. К ним относились производственные штаммы Bifidobacterium bifidum №791 (препаратпробиотик «Бифидумбактерин» «Экополис», г. Ковров); Lactobacillus acidophilus №1 (препарат-пробиотик «Лактобактерин», ФГУП НПО «Микроген» г. Москва), штаммы из коллекции ГИСК им. Л.А. Тарасевича (Klebsiella pneumoniae № 278, Bacillus cereus № 279), а также клинические изоляты микроорганизмов (Escherichia coli № 101, Staphylococcus aureus № 104), выделенные из фекалий пациентов при обследовании на дисбиоз кишечника и из раневого экссудата при гнойно-воспалительных заболеваниях мягких тканей. В работе использовали химические аналоги ауторегуляторных di-факгоров бактерий из группы алкилоксибензолов -метилрезорцин (С-7 АОБ) и гексилрезорцин (С-12 АОБ) (Sigma). Выделение и идентификацию микроорганизмов осуществляли общепринятыми методами на основании морфологических, тинкториальных, культуральных и биохимических свойств. Изучение биологических свойств (антилизоцимной активности, способности к образованию биопленок и ростовые свойства) проводили по стандартным методикам. Полученные результаты обработаны с помощью статистических методов.

На первом этапе исследования было изучено влияние различных концентраций химических аналогов алкилоксибензолов на антилизоцимную активность условно-патогенных бактерий и представителей нормальной микрофлоры человека.

При действии метилрезорцина наблюдалось появление клонов, не обладающих антилизоцимным признаком и исчезновение клонов с высоким уровнем АЛА, что сопровождалось снижением среднепопуляционного уровня данного свойства. Гексилрезорцин, в отличие от метилрезорцина, не изменял среднепопуляционного уровня антилизоцимной активности за счет нарастания доли клонов с высокой способностью ингибировать лизоцим, наряду с сохранением числа клонов с отсутствием данного признака.

Установлен дозозависимый характер влияния препаратов данной группы на антилизоцимную активность микроорганизмов, характеризующийся нарастанием изменений структуры популяции исследуемых микроорганизмов с увеличения концентрации АОБ в среде, что соответствует данным литературы (Эль-Регистан Г.И. и др., 1989; Мартиросова Е.И., 2004; Мулюкин A.JL, 2006; Голод Н.А. и др., 2009).

По данным литературы изменение антилизоцимной активности микроорганизмов может происходить как под влиянием различных препаратов (антибиотиков, витаминов, гормонов, иммуномодулирующих препаратов и др.) (Бухарин О.В., 1999; Кириллов Д.А., 2004), так и при взаимодействии микроорганизмов в микросимбиоценозе (Елагина Н.Н., 2000; Перунова Н.Б., 2003; Иванова Е.В., 2010). Предполагается, что изменение антилизоцимной активности может быть связано с модификацией конформации белка или его разрушением (Соколов В.Ю., 1990), изменением экспрессии генов AJIA (Deckers D. et. al., 2004; Abergel С. et. al., 2007; Callewaert L. et. al., 2008), а также сорбцией лизоцима на поверхности клеток микроорганизмов (Соколов В.Ю., 1990). Возможно, механизм действия алкилоксибензолов на антилизоцимную активность бактерий связан с изменением конформации АЛА-фактора, являющегося по химической природе анионным белком (Соколов В.Ю., 1990). В пользу этого предположения свидетельствуют данные о том, что алкилоксибензолы могут функционировать как химические шапероны, стабилизируя структуру и изменяя конформацию белков, обуславливая сопряженные изменения их каталитической активности (Карпеткина, 2003; Степаненко И.Ю., 2005; Мартиросова Е.И., 2007).

Химические аналоги алкилоксибензолов (С7- и С12-АОБ) обладали видонеспецифичным действием в отношение АЛА микроорганизмов, изменяя структуру популяции бактерий, не зависимо от их видовой принадлежности.

Полученные нами данные об ингибирующем действии алкилоксибензолов в отношение патогенов, могут быть использованы для разработки препаратов с антиперсистентными свойствами, не обладающие бактерицидным действием, но изменяющие биологические (персистентные) свойства микроорганизмов, что, как известно, способствует элиминации патогена из организма хозяина (Бухарин О.В., 1999).

Снижение антилизоцимной активности у подавляющего большинства клонов в популяции бактерий, может быть связано и с наличием других механизмов защиты патогенов, к примеру, с формированием ими биопленок. С целью подтверждения данного предположения, на следующем этапе наших исследований была изучена способность микроорганизмов к формированию биопленок под воздействием химических аналогов алкилоксибензолов.

Известно, что биопленкообразование бактерий определяет их выживание в условиях биотопа и устойчивость к воздействию неблагоприятных факторов (изменение рН, антибиотики, биоциды, литические ферменты, факторы врожденного иммунитета), а также способствует сохранению постоянства условий существования микроорганизмов (Lewis К., 2001). В связи с этим, образование микроорганизмами биопленок можно рассматривать в качестве одного из факторов персистенции микрофлоры (Иванова Е.В., 2009). Кроме того известно, что микробные биопленки содержат клетки «персистеры», которые в случае разрушения и гибели бактериальной популяции способны возобновить их рост (Bigger J.W., 1944; Lewis К., 2005).

Проведенные исследования позволили определить, что алкилоксибензолы влияют на способность к образованию биопленок грампозитивных и грамнегативных бактерий.

Присутствие алкилоксибензолов в среде культивирования приводило к угнетению биопленкообразования популяции условно-патогенных бактерий, а внутрипопуляционная перестройка микроорганизмов характеризовалась снижения числа клонов с высокой способностью биопленкообразования и нарастания доли клонов с низким уровнем свойства. Напротив, у микроорганизмов, представителей нормальной микрофлоры препараты алкилоксибензолов стимулировали биопленкообразование: под действием обоих препаратов (метил- и гексилрезорцина) происходило увеличением числа клонов бифидобактерий и лактобацилл с высоким и средним значением изучаемого признака и снижения доли клонов с низкими значениями биопленкообразованием в популяции.

Установлен дозозависимый характер влияния алкилрезорцинов на способность микроорганизмов формировать биопленки, характеризующийся нарастанием изменений структуры популяции исследуемых микроорганизмов с увеличения концентрации препаратов в среде культивирования.

В настоящее время активно изучаются механизмы регуляции образования биопленок (Li Y.H. et al. 2001,2002; Greenberg E.P. 2003; Balestino D. et al. 2005 и др.). Известно, что механизмы реакции «quorum sensing» и поддержание плотности бактериальных популяций имеют ряд отличительных признаков у разных типов бактерий: для грампозитивных микроорганизмов характерны олигопептидные сигнальные молекулы, а для грампозитивных бактерий - медиаторами чаще являются гомосеринлактоны (Schauder S., Bassler B.L., 2001; Ahmer B.M., 2004; Petrsen F.С. et al. 2004, 2005 и др.). Очевидно, что выделяемые клетками продукты, активно влияют на состояние соседних микроорганизмов (Revenchon S. et al., 1998; Frais J. et al., 2001). Под контролем феномена кооперативной чувствительности находится и образование самой биопленки (Dong Y., et al., 2001; Miller S.T., Blassler B.L., 2001). Межклеточные сигналы могут изменять распределение видов в биопленки, белковую экспрессию в соседних клетках, притягивать и присоединять бактерии к биопленки для последующего их использования (Miller S.T., Blassler B.L., 2001; Tomlin K.L. et al., 2005). Особенно это касается многовидовых биопленок, где существуют различные типы специфических сигналов, чье влияние на бактерии может быть и полезным, а в определенных случаях губительным (Federle M.J, Blassler B.L., 2003; Greenberg E.P., 2003).

Таким образом, действие алкилрезорцинов на популяцию условно-патогенных микроорганизмов приводило к угнетению их антилизоцимной активности и биопленкообразования, что может способствовать ухудшению колонизации патогенами биотопов организма хозяина. Напротив, у представителей нормальной микрофлоры, наряду со снижением антилизоцимной активности отмечена стимуляция образования биопленок под воздействием обоих препаратов алкилрезорцинов, что может быть одним из условий обеспечивающих индигенной микрофлоре преимущество в биотопе дистального отдела толстого кишечника человека.

Интенсивность роста микроорганизмов зависит от присутствия в среде различных факторов как эндо- так и экзогенного происхождения, которые способны либо усиливать рост бактерий либо приводить к его угнетению. Одним из таких факторов являются сигнальные метаболиты, основная функция которых, заключается обеспечение межклеточных взаимодействий, а также взаимодействие микроорганизмов со средой, которые направлены на успешный рост популяции и сохранение вида (Бухарин О.В., Гинцбург A.JI. и др., 2005). В связи с этим, на следующем этапе работы было изучено модифицирующее действие мембранотропных метаболитов (АОБ) в отношении ростовых свойств грампозитивных и грамнегативных ауто- и аллохтонных бактерий.

Установлено, что химические аналоги из группы алкилоксибензолов метилрезорцин и гексилрезорцин влияют на кинетику роста грамнегативных и грампозитивных бактерий. Данные изменения, как и в случае антилизоцимной активности и биопленкообразования бактерий, имели дозозависимый характер влияния: при увеличении концентрации С7-АОБ и С12-АОБ в среде культивирования нарастали изменения ростовых свойств микроорганизмов. Полученные данные соотносится с результатами, полученными в исследованиях на модели лактобацилл и азотобактеров (Лойко Н.Г., 2003; Голод H.A., 2009).

Выявлено, что у аутохтонных бактерий (бифидобактерий и лактобацилл), гексилрезорцин стимулировал ростовые свойства в различных концентрациях (0,1; 1,0 и 10,0 мкг/мл), а метилрезорцин i оказывал влияния на кинетику роста исследуемых штаммов только в концентрации 10,0 мкг/мл. Не исключено, что полученные данные о различном влиянии метил- и гексилрезорцина на популяцию нормальной микрофлоры, связаны с различием химической структуры мембранотропных метаболитов, а именно с длиной алкильного радикала, придающего препаратам антиоксидантные свойства. Таким образом, соинкубирование таких облигатно-анаэробных микроорганизмов, как бифидобактерии, обладающих высокой чувствительностью к действию кислорода, с С12-АОБ, имеющего и более длинную алкильную цепь, в сравнении с С7-АОБ, способствует увеличению выживаемости аутохтонной микрофлоры в организме хозяина. Сходные данные о возможной роли АОБ, в качестве препаратов-антиоксидантов, были получены ранее на примере моделирования стрессовых воздействий у лактобактерий (Лойко Н.Г., 2003).

Противоположный эффект оказывали препараты алкилоксибензолов на кинетику роста условно-патогенной аллохтонной микрофлоры. Отмечено угнетение ростовых свойств грампозитивных и грамнегативных УПБ при действии обоих химических аналогов фф-факторов. В работах Мулюкина А.Л. (2006) показано, что внесение гомосеринлактонов и алкилоксибезолов в начальные фазы роста бактериальных культур, индуцировало остановку клеточного деления и ускорение перехода культур в стационарную фазу. Ингибирование роста микробных культур, были видонеспецифическими (бациллы, микрококки, стафилококки и др.), контрационно-зависимыми и наблюдались при переходе клеток в состояние покоя (Мулюкин А.Л., 2006). Это не противоречит ранее обнаруженным данным о снижении персистентного потенциала и биопленкообразования условно-патогенных бактерий и, в конечном итоге, способствует расшифровке механизмов формирования колонизационной резистентности биотопа толстого кишечника человека. Полученные данные можно использовать как для решения фундаментальных вопросов современной микробиологии, касающихся изучения выживаемости бактерий в организме хозяина, так и для решения прикладных задач биотехнологии, с целью повышения эффективности культивирования и сохранения промышленных штаммов микроорганизмов пробиотических видов.

Таким образом, проведенная работа позволила выделить три основных момента:

1. Алкилоксибензолы выступают в качестве регуляторов ростовых и персистентных свойств (антилизоцимная активность, биопленкообразование) бактерий, которые являются одними из важнейших физиологических функций микроорганизмов.

2. Установлена связь химической структуры алкилоксибензолов с их ингибирующим влиянием на антилизоцимную активность бактерий: уменьшение длины алкильной цепи АОБ способствовало увеличению ингибирующего действия данных препаратов на АЛА микроорганизмов.

3. Алкилоксибензолы стимулировали ростовые свойства и способность к образованию биопленок у представителей нормофлоры, в отличие от условно-патогенных бактерий, у которых было отмечено угнетение данных свойств под действием метил- и гексилрезорцина.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата медицинских наук, Гордеева, Светлана Валерьевна, Оренбург

1. Aaroson S. Chemical communication at the microbial level. Boca Raton: CRC Press Inc., 1981. V. 1. P. 189. V.2. P. 203.

2. Abergel C., Monchois V., Byrne D. et al. Structure and evolution of the Ivy protein family, unexpected lysozyme inhibitors in gram-negative bacteria // Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2007. V.104, P. 6394 6399.

3. Ahmer B.M. Cell to cell signaling in Escherichia coli and Salmonella enterica // Molec. Microbiol. 2004.V.52. № 4.P. 933-941.

4. Alloing G., Martin В., Granadel C., Claveris J.P. Developmet of competence in Streptococcus pneumoniae: pheromone autoinduction and control of quorum sensing by the oligopeptide permiase // Mol. Microbiol. 1998. V. 21. № l.P. 75-83.

5. Bacillus carbonifilius cell respond to growth-promoting physical signals from cell of gomologous and heterologus bacteria // J.Gen. Appl. Microbil. 1996. V. 42. P. 315-323.

6. Balestrino D., Haagensen J.A., Rich C., et al. Characterization of Type 2 Quorum sensing in Klebsiella pneumoniae and relationship with biofilms formation // J. Bacteriol. 2005. V. 187. P. 2870-2880.

7. Bassler B. L. Interspecies communication in bacteria. 2003. J. Clin. Invest. V. 112. P. 1291-1299.

8. Bassler B.L., Losick R. Bacterially speaking // Cell. 2006. V. 125. P. 237246.

9. Bigger J.W. Treatment of staphylococcal infections with penicillin // Lancet, 1944. V. 244, P. 497-500.

10. Callewaert L., Vanderkelen L., Deckers D. et al. Detection of a lysozyme inhibitor in Proteus mirabilis by a new reverse zymogram method // Appl. Environ. Microbiol., 2008. V. 74, No. 15. P. 4978 4981.

11. Camilli A., Bassler B.L. Bacterial small-molecule signaling pathways // Science. 2006. V. 311. P. 1113-1116.

12. Cheigh C.I., Pyun Y.R. Nisin biosynthesis and its properties // Biotechnol. Lett. 2005. V. 27. P. 1641 -1648.

13. Chen X., Schauder S., Potier N., Van Dorsselaer A., Pelczer J., Bassler B.L., Hughson F.M. Structural identification of a bacterial quorum-sensing signal containing boron//Nature. 2002. V. 415. P. 545-549.

14. Clarke M.B., Hughes D.T., Zhu C., Boedeker E.C., Sperandio V. The QseC sensor kinase: a bacterial adrenergic receptor // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2006. V. 103. P. 10420-10425.

15. Dao D.N., Kessin R.H., Ennis H.L. Developmental cheating and the evolutionary biology of Dictyostelium and Myxococcus // Comment Microbiology. 2000. V. 146. P. 1505 1512.

16. Deckers D., Masschalck B., Aertsen A. et. al. Periplasmic lysozyme inhibitor contributes to lysozyme resistance in Escherichia coli // Cell Mol. Life Sci., 2004. V. 61, No. 10. P. 1229 1237.

17. Devreotes P. Dictiostellium discoideum: a model system for cell to cell interactions in development // Science. 1989. V. 245. P. 1054-1058.

18. Dong Y., Wang L., Xu J. Quenching quorum sensing dependent bacterial infection by an N-acyl homoserine lactonase // Nature. 2001. № 411. P. 813817.

19. Dong Y., Xu J., Zhang L. AiiA, a enzyme that inactivate the acylhomoserine lactone guorum sensing signal and attenuates the virulence of Erwinia carotovora. Prot. Natl. Acad. Sci. 2000.V. 97. №. 7. P. 3526 -3531.

20. Drider D. Fimland G., Hechard Y., McMullen L.M., Prevost H. The continuing stoiy of class II a bacteriocins // Microbiol. Mol. Biol. Rev. 2006. V. 70. P. 564-582.

21. Dunny G.M., Leonard B.A.B. Cell to cell communication in gram-positive bacteria. //Annu. Rev. Microbiol. 1997. V. 51. P. 527-564.

22. Dworkin M. Recent advances in the social developmental biolology of the Myxobacteria// Microbiol. Rev., 1996. V. 60. P. 70-102.

23. Dworkin M.Recent advances in the social in developmental biology of the myxobacteria // Microbiol. Rev. 1996. V. 60. C. 70-102.

24. Federle M.J., Blassler B.L. Interspecies communication in bacteria // J. Clin. Invest 2003. Vol. 112. P. 1291-1299.

25. Forsyth M., Cover T. Intercellular communication in Helicobacter pylori: luxS is essential for the production of an extracellular signaling molecule // Infect. Immun. 2000. V. 68. P. 3193-3199.

26. Fuqua W.C., Winans S., Greenberg E. Quorum sensing in bacteria: the Lux R Lux I family of cell density-responsive transcriptional regulators. J. Bacteriol. 1994. V. 176. №. 2. P. 269-275.

27. Gasiorowski K., Brocos B. DNA repair of hydrogen peroxide-induced damage in human lymphocytes in the presence of four antimutagens. A study with alkaline single cell gel electrophoresis (comet assay) // Cell. Moll. Biol. Lett. 2001. V. 6. P. 897-911.

28. Gasiorowski K., Brocos B. DNA repair of hydrogen peroxide-induced damage in human lymphocytes in the presence of four antimutagens. A study with alkaline single cell gel electrophoresis (comet assay) // Cell. Moll. Biol. Lett. 2001. V. 6. P. 897-911.

29. Gasiorowski K., Szyba K., Brokos B., Kozubek A. Antimutagenic activity of alkylresorcinols from cereal grains. 1996. Cancer Letters. V. 106. P. 109-115.

30. Gray K.M. Intercellular communication and group behavior in bacteria // Trends Microbiol. 1997. V.5. N 5. P.184-188.

31. Green D.R Apoptotic pathways: the roads to ruin // Cell. 1998. V. 94. P. 695-698.

32. Greenberg E.P. Bacterial communication: tiny teamwork // Nature. 2003. Vol. 424. P. 134.

33. Greenberg E.P., Winans S., Faqua C. Qurom sensing by bacteria. // Ann. Rev. Microbiol. 1996. V. 50. P. 727-751.

34. Hallet B., Sherratt D.J1. Transposition and site-specific recombination: adaptating DNA cut and paste mechanism to a variety of genetic rearrangements // FEMS Microbiol. Rev. 1997. V. 21. P. 157-178.

35. Hammer B.K., Bassler B.L. Regulatory small RNAs circumvent the conventional quorum sensing pathway in pandemic Vibrio cholera // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2007.V. 104. P. 11145-11149.

36. Hecht S.M. Naturals products that cleave DNA // Pure & Appl. Chem. 1989. V. 61. №3. P. 577-580.

37. Higgins D.A., Pomianek M.E., Kraml C.M., Taylor R.K., Semmelhack M.F., Bassler B.L. The major Vibrio cholerae autoinducer and its role in virulence factor production // Nature. 2007. V. 450. P. 883-886.

38. Huisman G.W., Kotler R. Sensing starvation: a homoserine lactone — dependent signaling pathway in Escherichia coli// Science. 1994. V. 265. P. 537-539.

39. Jayaraman A., Wood T.K. Bacterial quorum sensing: signals, circuits, and implications for biofilms and disease // Annu. Rev. Biomed. Eng. 2008. V. 10. P. 145-167.

40. Ji G., Beavis R., Novick R.P. Bacterial interference caused by autoinducing peptide variants // Science. 1997. V. 276. P. 2027-2030.

41. Kaiser D. Control of multicellular development: Dictyostelium and Myxococus // Annu. Rev. Gene. 1986. V. 20. C. 539-566.

42. Kaiser D., Losik R. How and why bacteria alk to each other // Cell. 1993. V. 79. P. 873-885.

43. Kaprelyants A.S., Kell D.G. Do bacteria need to communicate with each other for growth? // Trends microbiol. 1996. V. 4. № 6. P. 237-242.

44. Kell D.G., Kaprelyants A.S., Grafen A. Pheromones, social behavior and the functions of secondary metabolism in bacteria // Trends Ecol. Evol. 1995. V. 10. P. 126-129.

45. Kendall M.M., Rasko D.A., Sperandio V. Global effects of the cell-to-cell signaling molecules autoinducer-2, autoinducer-3, and epinephrine in a luxS mutant of enterohemorrhagic Escherichia coli // Infect. Immun. 2007. V. 75. P. 4875-4884.

46. Kennedy B.K., Guartente L. Genetic analysis of aging in Saccharomyces cerevisiae // Trends Gen. 1996. V. 12. P. 355-359.

47. Konisky J. Colicins and other bacteriocins with established modes of action // Annu. Rev. Microbiol. 1982. V. 36. P. 125-144.

48. Kozubek A. Interaction of alky 1 resorcinols with proteins // Acta Biochim Pol. 1995. V. 42. №2. P. 241-246.

49. Kozubek A., Tuman N. Resorcinol lipids, the natural non-isoprenoid phenolic amphiphiles and their biological activity // Chem. Rev., 1999. V. 99, №1. P. 1-31.

50. Lee J., Jayaraman A., Wood T.K. Indole is an interspecies biofilm signal mediated by Sdi A // BMC Microbiology. 2007. V. 7. P. 42.

51. Lewis K. Persister cell and riddle of biofilm survival. // Biochemistry. 2005. № 70. P. 267-274.

52. Lewis K. Persister Cells and the Riddle of Biofilm survival // Biochemistry, 2005. V.70, No. 2. P. 267 274.

53. Lewis K. Riddel of biofilms resistance // Antimicrob. Agents Chemother. 2001. Vol. 45. P. 999-1007.

54. Lewis K. Riddle of biofilm resistance // Antimicrob. Agents. Chemmother., 2001. V. 45, P. 999- 1007.

55. Li J., Wang L., Hashimoto Y., Tsao C.-Y., Wood T.K., Valdes J. J., Zafiriou E., Bentley W.E. A stochastic model of Escherichia coli AI-2 quorumsignal circuit reveals alternative synthesis pathways // Mol. Systems Biol. 2006. V. 2. P. 67.

56. Li Y.-H., Lau P.C., Lee J.H., Ellen R.P., Cviikovitch D.G. Natural genetic transformation of Streptococcus mutans growing in biofilms //J. Bacteriol. 2001. V. 183. P. 897-908.

57. Li Y.H., Tang N., Aspiras N.B. et al. A quorum sensing signaling system essential for genetic competence in Streptococcus mutans in involed in biofilm formation // J. Bacteriol. 2002. V. 184. P. 2699 2708.

58. Llamas I., Keshavan N., Gonzales J.E. Use of Sinorhizobium meliloti as an indicator for specific detection of long-chain N-acyl homoserine lactones // Appl. Environ. Microbiol. 2004. V. 70. P. 3715-3723.

59. Manefield M., Rasmussen B., Henzter M., Andersen J.B., Steinberg P., Kjelleberg S., Givskov M. Halogenated furanones inhibit quorum sensing through accelerated LuxR turnover // Microbiology. 2002. V. 148. P.-1119-1127.

60. Maqueda M., Sanchez-Hidalgo M., Fernandez M., Montal-ban-Lopez M., Valdivia E., Matinez-Bueno M. Genetic features of circular bacteriocins produced by Gram-positive bacteria//FEMS Microbiol. Rev. 2008. V. 32. P. 2-22.

61. Merritt J., Qi F., Goodman S., Anderson M., Shi W. Mutation in luxS affects biofilm formation in Streptococcus mutans // Med. Immun. 2003. V. 71. P. 1972-1979.

62. Miller M., Bassler B. Quorum sensing in bacteria // Annu Rev. Microbiol. 2001. №. 55. P. 165-199.

63. Miller S.T., Xavier K.B., Campagna S.R., Taga M.E., Semmelhack M.F., Bassler B.L., Hughson F.M. Salmonella typhimurium recognizes a chemically distinct from of the bacterial quorum-sensing signal AI-2 // Mol. Cell. 2004. V. 15. P. 677-687.

64. Nakimbugwe D., Masschalck B., Deckers D. et. al. Cell wall substrate specificity of six different lysozymes and lysozyme inhibitory activity of bacterial extracts // FEMS Microbiol. Lett., 2006. V.259, No. 1. P. 41 46.

65. Nealson, K. H., Piatt, T. and Hastings, J.W. 1970 J. Bacteriol. V. 104. P. 313-322.

66. Nes I.F., Diep D.B. Holo H. Bacteriocin diversity in Streptococcus and Enlerococus // J. Bacteriol. 2007. V. 189. P. 1189-1198.77.01eskin A.V. Social behaviour of microbial populations // J. Basic Microbiol. 1994.V.34.N6.P.425-439.

67. O'Toole G. Microbiology and Molecular Biology Reviews / G.O'Toole, M. Davey // Microbial Biofilms: from Ecology to Molecular Genetics, 2000. Vol. 64, № 4. P. 847-867.

68. Pesci E.C., Milbank J.B.J., Pearson J.P., McKnight. S., J Kende A.S., Greenberg E.P., Oglewski B.H. Quinolone signaling in the cell-to-cell communication system of Pseudomonas aeruginosa // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1999. V. 96. P. 11229-11234.

69. Pestova E., Havarstein L., Morrison D. Regulation of competence for genetic transformation in Streptococcus pneumoniae by an auto-indused peptide pheromones and two-component regulatory systems. Mol. Microbiol. 1996. V. 21. № 4. P. 853-862.

70. Petersen F.C., Tao L., Scheie A.A. Binding uptake system: a link between cell to cell commutation and biofilm formation // J. Bacteriol. 2005. V. 187. № 13. P. 4392-4400.

71. RaffM. Cell suicide for beginners //Nature. 1998. V. 396. P. 119-122

72. Reading N.C., Sperandio V. Quorum sensing: the many languages of bacteria // FEMS Microbiol. Lett. 2006. V.254.P. 1-11.

73. Reusch R.N., Sadoff H.L. 5-n-Alkylresorcinols from encysting Azotobacter vinelandii: isolation and characterization. // J. Bacteriol. 1979. V. 139. P. 448453.

74. Reusch R.N., Sadoff H.L. Novel lipid components of the Azotobacter vinelandii cyst membrane//Nature. 1983. V. 302. № 5905. P. 1407-1418.

75. Revenchon S., Bouillant M., Salmond G. et al. Integration of the quorum sensing system in the regulatory network controlling virulence factor synthesis in Erwinia chrysanthemii // Mol. Microbiol. 1998. №29. P. 14071418.

76. Rezzonico F., Duffy B. Lack of genomic evidence of AI-2 receptors suggests a non-quorum sensing role for luxS in most bacteria // BMC Microbiology 2008. V. 8. P. 154.

77. Rice S.A., McDougald D., Givskov M., Kjelleberg S. Detection and inhibition of bacterial cell-cell communication // Meth. Mol. Boil. 2008. V. 431. P. 55 -68.

78. Salmond G.P.S., Bycroft B.W., Stewart C.S.A.B., Williams P. The bacteria «enigma»: cracking the code of cell-cell communication // Mol. Microbiol. 1995. V. 16. №4. P. 615-624.

79. Schaefer A.L., Taylor T.A., Beatty J.T., Greenberg E.P. Long-chain acyl-homoserine lactone quorum-sensing regulation of Rhodobacter capsulatus gene transfer agent production //J. Bacteriol. 2002. V. 184. P. 6515-6521.

80. Schauder S., Bassler B.L. The languages of bacteria // Genes and Dev. 2001. V. 15. 1468-1480.

81. Shapiro J.A. The significances of bacterial colony patterns // BioEssays. 1995. V. 17. N7. P. 597-607.

82. Sheetal R., De Vizio D., Odell M., Clements M., Vanhulle S., Keshavarz T. Microbial quorum sensing: a tool or a target for antimicrobial therapy? // Biotechnol. Appl. Biochem. 2009. V.54. P. 65-84.

83. Shpakov A.O., Pertseva M.N. Signaling systems of lower eukaryotes and their evolution.//Int. Rev. Cell Mol. Biol. 2008. V. 269. P. 151-282.

84. Sperandio V., Torres A.G., Jarvis B;, Nataro J.P., Kaper J.B. Bacteria-host communication: the language of hormones // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2003. V. 100. P. 8951-8956.

85. Starck S.R., Deng J.Z., Hecht S.M. Naturally occurring alkylresorcinols that mediate DNA damage and inhibit its repair // Biochemistry. 2000. V. 39. №9. P. 2413-2419.

86. Starck S.R., Deng J.Z., Hecht S.M. Naturally occurring alkylresorcinols that mediate DNA damage and inhibit its repair // Biochemistry. 2000. V. 39. №9. P. 2413-2419.

87. Stasiuk M, Kozubek A. Modulation of 5-n-alkylresorcinol hemolytic properties by divalent cations. Dependence of the effect of cations on alkylresorci-nol structure // Cellular & Molecular Biology Letters. 1997. V. 2. P. 77-87.

88. Stephens K. Pheromones among procaryotes // CRC Crit. Rev. Microbiol., 1986. V. 13. №4. P. 308-344.

89. Swift, S., Downie, J. A., Whitehead, N. A., Barnard, A. M. L., Salmond, G. P. C. and Williams, P. 2001. Adv. Microb. Physiol. V. 45. P. 199-270.

90. Tomlin K.L., Malott R.J., Ramage G. et al. Quorum sensing mutations affect attachment and stability of Burkholderia cenicepecia biofilms // Appl. Environ. Microbiol. 2005. № 71. P. 5208-5218.

91. Van Houdt R., Givskov M., Michiels C. W. Quorum sensing in Serratia // FEMS Microbiol. Rev. 2007. V. 31. P. 407-424.

92. Waldburger C., Gonzalez D., Chambliss G.N. Characterization of a new sporulation factor in Bacillus subtilis. J. Bacteriol. 1993. V. 175. P.6321 -6327.

93. Waters C.M., Bassler B.L. The Vibrio harveyi quorum-sensing system uses shared regulatory components to discriminate between multiple autoinducers // Genes Dev. 2006. V. 20. P. 2754-2767.

94. Waters C.M., Bassler B.L. Quorum sensing: cell-to-cell communication in bacteria // Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 2005. V. 21. P 319 346.

95. Wen Z.T., Burne R.A. LuxS-mediated signaling in Streptococcus mutans is involved in regulation of acid and oxidative stress tolerance and biofilm formation//J. Bacteriol. 2004. V. 186. P. 2682-2691.

96. Whittaker R. H, Feeny P. P. Allelochemics: chemical interactions between species//Science. 1971. V. 171. P. 757—770

97. Winans S. C., Bassler B.L. Mob. Psychology. J. Bacteriol. 2002; V. 184. № 4. P. 873-883.

98. Wireman J.W., Dworkin M. Developmentally induced autolysis during fruiting body formations by Myxococcus xanthus // J.Bacteriol. 1977. V. 129. №3. P. 798-802.

99. Wirth R., Muschall A., Wanner G. The role of pheromones in bacterial interaction // Trends Microbiol. 1996. V. 4. № 3. P. 96-103.

100. Yarmolinsky M.D. Programmed cell deaph in bacteria population // Science. 1995. V. 267. P. 836-837.

101. Акайзин E.O., Воскун C.E., Панова JI.A., Смирнов С.Г. Гетерогенность популяции Escherichia coli в процессе индуцированного автолиза // Микробиология. 1990. Т. 59. С. 283-288.

102. Антонов В.П. Липидные поры: стабильность и проницаемость мембран//Соровский образовательный журнал. 1998. № 10. Cl 10-17.

103. Бабусенко Е.С., Эль-Регистан Г.И., Градова Н.Б., Козлова А.Н., Осипов Г.А. Исследование мембранотропных ауторегуляторных факторов метанокисляющих бактерий // Успехи химии, 1991, Том 60, № 11, с. 2362-2372.

104. Батраков С.Г., Эль-Регистан Г.И., Придачина Н.Н. и др. Тирозол -ауторегуляторный фактор di Saccharomyces serevisiae // Микробиология. 1993. Т. 62. вып. 4. С. 633-638.

105. Белоусов JI.B., Воейков В.А., Попп Ф.А, Митогенетические лучи Гурвича. //Природа, 1997, № 3, с.64-80.

106. Бухарин О.В. Персистенция патогенных бактерий. М.: Медицина, 1999. С. 367.

107. Бухарин О.В., Гинзбург А.Л., Романова Ю.М. и др. Механизмы выживания бактерий. М. Медицина. 2005. 367 с.

108. Варфоломеев С.Д., Калюжный С.В. Кинетические основы микробиологических процессов. М.: Высшая школа, 1990. С. 296.

109. Вахитов Т.Я., Петров Л.Н. Регуляторные функции экзометаболитов бактерий. Микробиология, 2006, Т. 75, №4. С.483-488.

110. Вахитов Т.Я., Протасов Е.А, Виснольд Н.В, Толпаров Ю.Н., Петров Л.Н. Выделение и идентификация аутостимуляторов роста Escherichia coli. II Журн. микробиол. 2003. №2. С.7-12.

111. Волошин С.А., Капрельянц А.С. Межклеточные взаимодействия в бактериальных популяциях//Биохимия. 2004. Т.69. № 1. С. 1555—1564.

112. Вострокнутова Г.Н., Капрельянц А.С., Светличный В.В. и др. Мембраноактивные свойства препарата из культуральной жидкостибактерий, обладающего ауторегуляторным действием // Прикл. микробиология и биохимия, 1983. Т. 19, вып. 4. С. 547 551.

113. Высоцкий В.В., Котлярова Г.А. Поли(гетеро)морфные формы патогенных бактерий в инфекционной патологии // Журн. Микробиол. 1999. №2. С. 100—104.

114. Гиляров A.M. Популяционная экология. М. Издательство МГУ. 1990. С. 38.

115. Гланц С. Медико-биологическая статистика. / С. Гланц // М.: Практика, 1999. 459 с.

116. Головлев E.JI. Метастабильность фенотипа у бактерий // Микробиология. 1998. Т. 59. №2. С. 149-155.

117. Голод H.A., Лойко Н.Г., Лобанов К.В. и др. Роль микробных ауторегуляторов алкилоксибензолов, у контроле экспрессии стрессовых регулонов // Микробиолгия. 2009. Т. 79. № 6. С. 731-741.

118. Голод H.A., Лойко Н.Г., Лобанов К.В., Миронов A.C., Воейкова Т.А., Гальченко В.Ф., Эль-Регистан Г.И. Роль микробных ауторегуляторов — алкилоксибензолов, в контроле экспрессии стрессовых регулонов // Микробиология. 2009. - Т. 78, № 6. - С. 731-741.

119. Голод H.A., Лойко Н.Г., Мулюкин А.Л., Нейматов А.Л., Воробьева Л.И., Сузина Н.Е., Шаненко Е.Ф., Гальченко В.Ф., Эль-Регистан Г.И. Адаптация молочнокислых бактерий к неблагоприятным для роста условиям // Микробиология. 2009. - Т. 78, № 3. - С. 317-335.

120. Гордеев К.Ю. Битков В.В., Придачина H.H. и др. Бактериальные 5-я-алкил-(С19-С25)резорцины — неконкурентные ингибиторы фосфолипазы А2 // Биоорг. химия. 1991. Т. 17. № 10. С. 128-134.

121. Грузина В.Д. Коммуникативные сигналы бактерий. Антибиотики и химиотер., 2003, 48; 10, с. 32 39.

122. Грязнова М.Н. / М.Н. Грязнова, Г.И. Эль-Регистан, А.Н. Козлова и др. // Микроорганизмы, их роль в плодородии почвы иохранеокружающей среды. M.: ТСХА им. К.А. Тимирязева. 1985. 8893.

123. Гурвич А.Г., Гурвич А.Д. Митогенетическое излучение: физико-химические основы и приложения в биологии и медицине // М. Медгиз.1945.

124. Давыдова O.K. Взаимодействие алкилоксибензолов -ауторегуляторных di факторов микроорганизмов с ДНК. Дисс.на соис.уч.ст. к.б.н., М. 2006.

125. Давыдова O.K., Дерябин Д.Г., Никиян А.Н., Эль-Регистан Г.И. О механизмах взаимодействия ДНК с химическими аналогами микробных аутоиндукторов анабиоза // Микробиология. 2005. - Т.74. -№5.-С. 616-625.

126. Демкина Е.В., Соина B.C., Звягинцев Д.Г., Эль-Регистан Г.И. Репродуктивные покоящиеся формы Arthrobacter globiformis // Микробиология. 2000. Том 69. №3. С. 377-382

127. Демкина Е.В., Соина B.C., Эль-Регистан Г.И. Образование покоящихся форм Arthrobacter globiformis в автолизирующихся суспензиях. //Микробиология. 2000. Т.69. Вып. 3. С. 383-388

128. Демкина Е.В., Соина B.C., Эль-Регистан Г.И., Звягинцев Д.Г. Репродуктивные покоящиеся формы Arthrobacter globiformis // Микробиология. 2000. Т. 69. №3. С 377-382.

129. Демкина Е.В., Соина B.C., Эль-Регистан Г.И. Образование покоящихся форм Arthrobacter globiformis в автолизирующихся суспензиях // Микробиология. 2000. Т.69. № 3. С.383—388.

130. Дорошенко Е.В., Лойко Н.Г., Ильинская О.Н., Колпаков А.И., Горнова И.В., Эль-Регистан Г.И. Характеристика диссоциантов Bacillus cereus штамм 504 // Микробиология. 2001. Т.70. № 6. С.811—819.

131. Дуда В.И., Пронин C.B., Эль-Регистан Г.И., Капрельянц A.C., Митюшин Л.Л. Образование покоящихся рефрактильных клеток у

132. Bacillus cereus под влиянием ауторегуляторного фактора // Микробиология. 1982. Т.51. № 1. С.77-81.

133. Дуда В.И., Пронин C.B., Эль-Регистан Г.И., Капрельянц A.C., Митюшин

134. Елагина H.H. Факторы персистенции неспорообразующей анаэробной микрофлоры кишечника человека / H.H. Елагина // Автореф. Дис. канд. мед. наук. Оренбург, 2001. — 128 с.

135. Запрометов М.Н. Фенольные соединения: распространение, метаболизм и функции в растениях. М.: Наука. 1993. С. 272.

136. Иванова Е.В Биологические свойства бифидобактерий и их взаимодействие с микросимбионтами кишечной микрофлоры. / Е.В. Иванова // Автореф. Дис. канд. мед. наук. Оренбург, 2010. - 149 с.

137. Иерусалимский Н.Д. О физиологических стадиях в развитии бактерий//Микробиология. 1946. Т. 15. С. 405-416.

138. Иерусалимский Н.Д. Онтогенетическое развитие культур маслянокислых бактерий//Микробиология 1951а. Т.20. С. 205-216.

139. Иерусалимский Н.Д. Проблема онтогенеза бактерий и пути к ее разрешению // Тр. ИНМИ АН СССР. 19516. С. 5-43.

140. Иерусалимский Н.Д. Физиология развития чистых бактериальных культур. Диссертация на соискание степени доктора биологических наук. М.: Институт микробиологии АН СССР. 1952а.

141. Иерусалимский Н.Д. Физиология развития чистых бактериальных культур. Автореферат диссертация на соискание степени доктора биологических наук. М.: Институт микробиологии АН СССР. 19526.

142. Ильинская О.Н., Колпаков А.И., Зеленихин П.В., Круглова З.Ф., Чойдаш Б., Дорошенко Е.В., Мулюкин A.JL, Эль-Регистан Г.И. Влияние аутоиндукторов анабиоза бактерий на геном микробной клетки // Микробиология. 2002. Т.71. № 2. С.194—199.

143. Казначеев В.П., Михайлова Л.П. Биоинформационная функция естественных электромагнитных полей. Новосибирск: Наука. 1985.

144. Капрельянц A.C., Сулейманов М.К., Сорокина А.Д. и др. Структурно-функциональные изменения в бактериальных и модельных мембранах под действием фенольных липидов // Биол. мембраны. 1987. Т. 4. вып. 3. С. 254261.

145. Карпеткина Т.А. Ауторегуляция автолитических процессов и интенсификация автолиза дрожжей // Автореф. Дис. канд. биол. Наук. Москва. 2003.

146. Кириллов Д.А. Лекарственная регуляция персистентных свойств микроорганизмов.//// Дисс. канд. ме. наук, Оренбург, 2004. С. 147.

147. Колпаков А.И., Ильинская А.Н., Беспалов М.И. и др. Стабилизация ферментов аутоиндукторами анабиоза как один из механизмов устойчивости покоящихся форм микроорганизмов // Микробиология, 2000. Т. 69, №2. С. 224 230.

148. Коновалова Е.Ю., Эль-Регистан Г.И., Бабьева И.П. Динамика и накопление ауторегуляторных факторов d. и d2 дрожжами Rhodosporidium toruloides // Биотехнология. 1985. № 3. С. 71-74.

149. Красильников H.A., Дуда В.И. Общая характеристика бактерий и актиномицетов // Жизнь растений / Под ред. H.A. Красильникова, A.A. Уранова. М.: Просвещение. 1974.

150. Кузин A.M. Электромагнитная информация в феномене жизни. // Биофизика, 2000, т.41, с. 144-147.

151. Кузин A.M. Вторичные биогенные излучения — лучи жизни. Пущино: ОНТИ ПНЦ РАН. 1997.

152. JI.JI. Образование покоящихся рефрактильных клеток у Bacillus cereus под влиянием ауторегуляторного фактора // Микробиология.1982. Т.51. № 1.С. 77-81.

153. Лойко Н.Г. Ауторегуляторные факторы развития бактериальных культур. // Дисс.на соис.уч.ст. к.б.н., Москва. 2003.

154. Марголис А.Л., Шерстюк С.Ф., Изумрудов В.А. Швядас В.Ю., Зезин А.Б., Кабанов В.А. Фазовые превращения в растворах полиэлектроли-товых комплексов как модель спорообразования // Доклады АН СССР.1983. Т. 272. №1. С. 230-233.

155. Маргулис А.Б. Низкомолекулярные ауторегуляторные соединения как тригтерные молекулы стресса у бактерий. Автореф. дис. . канд. биол. наук. Казань: КГУ, 2005.

156. Мартиросова Е.И. Изучение роли алкилоксибензолов в стабилизации и модуляции активности ферментных белков. Дисс.на соис.уч.ст. к.б.н., М. 2007.

157. Мартиросова Е.И., Карпекина ТА., Эль-Регистан Г.И. Модификация ферментов естественными химическими шаперонами микроорганизмов // Микробиология. 2004. Т. 73. № 5. С. 708-715.

158. Милько Е.С., Егоров Н.С. Гетерогенность популяции бактерий и процесс диссоциации. М.: Изд-во МГУ, 1991. С. 143.

159. Мулюкин А.Л., Луста К А., Грязнова М.Н., Козлова А.Н., Дужа М.В., Дуда В.И., Эль-Регистан Г.И. Образование покоящихся форм Bacillus cereus и Micrococcus luteus // Микробиология. 1996. Т. 65. № 6. С. 782789.

160. Мулюкин А.Л., Луста К.А., Грязнова М.Н. и др.Обнаружение и изучение динамики накопления ауторегуляторного di фактора в культуральной жидкости и клетках Micrococcus luteus // Микробиология. 1996. Т.65. № 6. С. 782-789.

161. Мулюкин A.JI., Луста К.А., Грязнова М.Н. Образование покоящихся форм в автолизирующихся суспензиях // Микробиология, 1996. Т.66, № 1. С 42-49.

162. Мулюкин А.Л., Филлипова С.Н., Козлова А.Н. и др. Видонеспецифичность действия низкомолекулярных ауторегуляторов — неацилированного лактона гомосерина и гексилрезорцина на рост и развитие бактерий. Микробиология., 2006, Т.75, №4.- С. 472-482.

163. Николаев Ю. А., Плакунов В. К. Биопленка- "город микробов " или аналог многоклеточного организма? // Микробиология, 2007. Т.76, № 2. С. 140-163.

164. Николаев Ю.А. Внеклеточные факторы адаптации бактерий к неблагоприятным условиям среды // Прикл. биохим. микробиол. 2004. Т.40. № 4. С.387—397.

165. Николаев Ю.А. Дистантные взаимодействия между клетками бактерий. //Микробиология, 1992, т.61, №16, с. 1065-1071.

166. Николаев Ю.А. Дистантные информационные взаимодействия у бактерий //Микробиология. 2000. Т. 69. № 5. С. 597-605.

167. Николаев Ю.А., Воронина H.A. Перекрестное действие внеклеточных факторов адаптации к стрессу у микроорганизмов // Микробиология. 1999. Т.68. № 1. С.45-50.

168. Николаев Ю.А., Мулюкин А.Л., Степаненко И.Ю. и др. Ауторегуляция стрессового ответа микроорганизмов. Микробиология., 2006, Т.75, №4. С.489-496.

169. Олескин A.B. Надорганизмепный уровень взаимодействия в микробных популяциях//Микробиология. 1993. Т.62. № 3. С.З89-403.

170. Олескин A.B. Популяционная организация и межклеточная коммуникация у микроорганизмов. М. Издательство МГУ. 2006. С. 190.

171. Олескин A.B. Экологически важные свойства популяций микроорганизмов // Соросовский образовательный журнал. 2001. Т.7. № 8. С. 7-12.

172. Олескин A.B., Ботвинко И.В., Цавкелова Е.А. Колониальная организация и межклеточная коммуникация у микроорганизмов // Микробиология. 2000. Т.69. № 3. С.309—327.

173. Осипов Г.А., Эль-Регистан Г.И., Светличный В.А., Козлова А.Н., Дуда В.И., Капрельянц A.C., Помазанов В.В. Химическая природа ауторегу-ляторного фактора dl в Pseudomonas carboxydoflava // Микробиология.1985. Т. 54. С. 186-190.

174. Перунова Н.Б. Характеристика биологических свойств микроорганизмов в бактериально-грибковых ассоциациях кишечника / Н.Б. Перунова//Автореф. Дис. канд. мед. наук. Оренбург, 2003.

175. Пирт С.Дж. Основы культивирования микроорганизмов и клеток. М.: Мир. 1978. С. 331.

176. Прозоров A.A. Рекомбинантные перестройки генома бактерий, и адаптация к среде обитания // Микробиология. 2001. Т. 70. № 5. С.581-594.

177. Прозоров A.A. Феромоны компетентности у бактерий // Микробиология. 2001. Т. 70. № 1. С. 5-14.

178. Рогинский В.А. Фенольные антиоксид анты: реакционная способность и эффективность. М.: Наука. 1988. С. 247.

179. Светличный В.А., Романова А.К, Эль-Регистан Г.И. Изучение количественного содержания мембраноактивных ауторегуляторов при литоавтотрофном росте Pseudomonas carboxydoflava!7 Микробиология.1986. Т.55. С.55-59.

180. Светличный В.А., Эль-Регистан Г.И., Романова А.К., Дуда В.И. Характеристики ауторегуляторного фактора d2, вызывающего автолизклеток Pseudomonas carboxydo/Java и Bacillus cereus II Микробиология. 1983. T.52. № 1. C.33-38.

181. Смирнов С.Г. Этология бактерий новое направление в исследовании прокариотов // Физико-химические исследования патогенных энтеробактерий в процессе культивирования. Иваново. ИвГУ. 1985. С.5-10.

182. Смирнов С.Г. Этология бактерий — новое направление в исследовании прокариотов // Физико-химические исследования патогенных энтеробактерий в процессе культивирования. Иваново: Ивановский государственный медицинский институт. 1985. С.5-10.

183. Смирнов С.Г. Этология бактерий. Иваново: Ивановская государственная медицинская академия. 2004.

184. Соколов В.Ю. Механизм антилизоцимной активности бактерий // Автореф. дисс. канд. мед. наук. Челябинск. 1989.

185. Степаненко И.Ю. Изучение роли алкилоксибензолов в стрессовом ответе микроорганизмов. Автореф. дис. . канд. биол. наук. М.: ИНМИ РАН, 2005.

186. Степаненко И.Ю., Мулюкин А.Л., Козлова А.Н., Николаев Ю.А., Эль-Регистан Г.И. Роль алкилоксибензолов в адаптации Micrococcus luteus к температурному шоку // Микробиология. 2005. Т. 54. № 1. С. 26-33.

187. Хмель И.A. Quorum-sensing регуляция экспрессии генов: фундаментальные и прикладные аспекты, роль в коммуникации бактерий. Микробиология, 2006, Т. 75, №4. С.457-464.

188. Хохлов A.C. Низкомолекулярные микробные ауторегуляторы. М. Наука. 1988, С. 270.

189. Шапиро Дж.А. Бактерии как многоклеточные организмы //В мире науки. 1988. № 8. С.46-54.

190. Шпаков А.О. Пептидные аутоиндукторы бактерий. Микробиология. 2009, Т. 78, № 3, с. 291 303.

191. Шпаков А.О. Сигнальные молекулы бактерий непептидной природы QS-типа. Микробиология. 2009, Т. 78, № 2, с. 163 175.

192. Шпаков А.О., Перцева М.Л. Системы сигнальной трансдукции прокариот//Журн. эвол. биохим. физиол. 2008. Т. 44. С. 113-130.

193. Экология микроорганизмов человека / О.В. Бухарин, A.B. Валышев, Ф.Г. Гильмутдинова, В.А. Гриценко и др. // Екатеринбург: УрО РАН. 2006. - 480 с.

194. Эль-Регистан Г.И. Роль мембранотропных ауторегуляторных факторов в процессе роста и развития микроорганизмов // Дисс. докт. биол. наук, Москва, 1988. С. 507.

195. Эль-Регистан Г.И., Дуда В.И., Светличный В.А. и др. Динамика ауторегуляторных факторов d в периодических культурах Pseudomonas carboxydoflava и Bacillus cereus // Микробиология. 1983. T. 52. вып. 2. С. 238-243.

196. Эль-Регистан Г.И., Козлова А.Н., Комарова Г.В., Дужа М.В., Конова И.В., Красильников H.A. Биология лучистых грибков. М.: «Наука». 1975.С.130.

197. Эль-Регистан Г.И., Мулюкин A.JL, Николаев Ю.А., Сузина Н.Е., Гальченко В.Ф., Дуда В.И. Адаптогенные функции внеклеточных ауторегуляторов микроорганизмов. Микробиология, 2006. Т. 75. №4. С. 446-456.

198. Эль-Регистан Г.И. Роль мембранотропных ауторегуляторных факторов в процессе роста и развития микроорганизмов // Диссер. Доктор биологических наук, Москава, 1988, М, С. — 508.

Информация о работе

Гордеева, Светлана Валерьевна
кандидата медицинских наук
Оренбург, 2011
ВАК 03.02.03

Диссертация

Влияние алкилоксибензолов на ростовые и персистентные характеристики микроорганизмов - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы