Включение антигенов и ДНК в биосовместимые полимерные микросферы для применения в биомедицине

Селина, Оксана Евгеньевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Включение антигенов и ДНК в биосовместимые полимерные микросферы для применения в биомедицине
ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Включение антигенов и ДНК в биосовместимые полимерные микросферы для применения в биомедицине"

Учреждение Российской академии наук ИНСТИТУТ БИООРГАНИЧЕСКОЙ ХИМИИ

им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН

На правах рукописи

Селина Оксана Евгеньевна

ВКЛЮЧЕНИЕ АНТИГЕНОВ И ДНК В БИОСОВМЕСТИМЫЕ ПОЛИМЕРНЫЕ МИКРО СФЕРЫ ДЛЯ ПРИМЕНЕНИЯ В БИОМЕДИЦИНЕ

03.00.23 - Биотехнология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

3 0

ДПР коз

Москва 2009

003468557

Работа выполнена в лаборатории Полимеры для биологии Институ биоорганической химии имени академиков М.МШемякина и Ю .А.Овчинникова РА

Научный руководитель:

доктор химических наук

Официальные оппоненты:

доктор химических наук, проф. кандидат биологических наук, вед.н.с.

Марквичёва Елена Арнольдовна

Штильман Михаил Исаакович Афанасьева Ольга Ильинична

Ведущая организация: Центр "Биоинженерия" РАН

Защита состоится «10 » мая 2009г. в /0часов на заседании диссертационно совета Д 002.019.01 при Институте биоорганической химии имени академик М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова РАН по адресу: 117997, г. Москва, ул. Миклух Маклая, д.16/10.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биоорганическо химии имени академиков М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова РАН.

Автореферат разослан «/•£» апреля 2009 года.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор физико-математических наук,

В.А.Олейнико

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы Включение различных биоактивных макромолекул (белков, ДНК, олигонуклеотидов и др.) в биосовместимые полимерные матрицы (в нано- и микрочастицы, нано- и микрокапсулы) является одним из перспективных направлений биотехнологии и биомедицины. Спектр областей применения таких носителей постоянно расширяется и включает в себя разработку новых эффективных систем доставки лекарств с их контролируемым высвобождением, новых методов диагностики рака и других заболеваний, новых способов доставки в клетки ДНК для разработки вакцин, соматической-генной терапии и др. В данной работе рассматриваются две области возможного применения иммобилизованных в биосовместимые полиэлектролитные (ПЭ) микросферы макромолекул-синтетических антигенов (гликоконъюгатов) и ДНК:

• создание новых биосовместимых иммуносорбентов (на основе микрокапсул и микрочастиц размером 700-900 мкм);

• разработка новых ДНК-вакцин с использованием инкапсулированных плазмидных ДНК (размер микрокапсул 1-3 мкм).

Стоит особо отметить, что, несмотря на разные области применения микросфер, задача иммобилизации (включения) биоактивных молекул решается с использованием одних и тех же подходов и биоматериалов. Создание новых иммуносорбентов является перспективным подходом для решения ряда медицинских проблем, связанных с заболеваниями и осложнениями, провоцируемыми антиуглеводными антителами [Galili U.// Transplantation, 78 (2004) 1093]. Особое внимание в данном случае уделяется методам, основанным на специфической сорбции антител соответствующим сорбентом, представляющем собой матрицу с ковалентно пришитым антигеном. В качестве матрицы (носителя антигена) традиционно используют сефарозу [Leventhal J.K, et.al. // Transplantation, 59 (1995) 294], агарозу [Holgersson J„ WO 98/42750], силикагель [Watts A., et.al. // Xenotransplantation, 7 (2000) 181]. Применение таких сорбентов требует предварительной процедуры разделения крови на плазму и форменные элементы, во избежание контакта клеток крови с сорбентом, а затем пропускание плазмы через сорбент с последующим возвращением клеток и плазмы в кровоток. Такая необходимость обусловлена тем, что при пропускании цельной крови через колонку с сорбентом, из-за малого размера частиц последнего, происходит повреждение тромбоцитов, эритроцитов и других клеток крови. Существенный недостаток такого

подхода сопряжен еще и с потерями в объеме крови. Более привлекательным представляется метод удаления патогенных антител непосредственно из цельной крови (гемосорбция). При этом особую значимость приобретает задача создания биосовместимой полимерной матрицы (носителя антигена), которая бы позволила сохранить сорбционную емкость традиционных сорбентов или даже увеличить ее и при этом не травмировать клетки крови за счет применения частиц большего размера, по сравнению с традиционными иммуносорбентами.

Разработка новых методов доставки ДНК в клетки является одним из перспективных подходов к созданию новых ДНК-вакцин. Идея конструирования ДНК-вакцины основана на том, что определенный ген или участок генома патогена встраивается в бактериальные или вирусные векторы. Созданная таким образом ДНК-вакцина потенциально способна индуцировать клеточный и гуморальный иммунный ответ [Encke J., et al. //J. Immunol., 161 (1998) 4917; Higgins T.J., et al. //J. Infect. Diseases., 182 (2000) 1311]. Микрокапсулирование ДНК позволяет не только защитить ДНК от быстрого разрушения в организме нуклеазами, но также обеспечить адресную доставку и взаимодействие с клеточными рецепторами. В настоящее время ДНК предлагают включать в микрочастицы на основе полимолочной (PLA) или полигликолевой (PGA) кислот или сополимеров на их основе (PLGA) [Oster C.G., et.al. //J. of Microencapsulation, 22 (2005) 235; Zhang Xue-Qing et.al. //J. of Microencapsulation, 25 (2008) 1]. Как правило, при этом используют два подхода: 1) метод распылительной сушки; 2) метод двойной эмульсии (Bi/M/B2). Эффективность включения ДНК методом двойной эмульсии, как правило, не превышает 30-50%. Метод распылительной сушки более эффективен, однако, использование органических растворителей (например, дихлорметана, диметилсульфоксида), а также различных ПАВ может снижать биологическую активность инкапсулированных биоактивных молекул [МокК, et.al. //Eur. J. Pharm. Biopharm., 68 (2008) 105]. Кроме этого, второй метод требует наличия специального дорогостоящего оборудования. Поэтому актуальной задачей является разработка новых простых и универсальных методов включения ДНК в микрокапсулы для ее доставки в клетки в условиях in vivo.

Целью настоящей работы являлось включение синтетических антигенов (гликоконъюгатов) и ДНК, кодирующих белок-антиген, в биосовместимые полимерные микросферы на основе природных полисахаридов, исследование свойств полученных микросфер и возможности их применения в биомедицине для создания новых биосовместимых иммуносорбентов и ДНК-вакцин.

Для достижения поставленной цели предстояло решить следующие задачи:

1. Выбрать биодеградируемыс полиэлектролиты для получения микросфер.

2. Разработать и оптимизировать методы включения синтетических антигенов (гликоконъюгатов) и ДНК в полиэлектролитные микросферы (микрочастицы и микрокапсулы) различного композиционного состава.

3. Исследовать способность полученных микросфер с включенными антигенами сорбировать антиуглеводные антитела.

4. Сравнить сорбционные свойства полученных микросфер и сефарозы,

5. Изучить гемосовместимость матрицы-носителя антигена на примере пустых полиэлектролитных микросфер различного композиционного состава.

6. Изучить эффективность доставки в клетки микрокапсулированной вирусной ДНК в условиях in vitro и in vivo.

7. Исследовать в модели in vivo индукцию антител на введение микрокапсулированных плазмидных ДНК двух типов, изучить влияние различного композиционного состава микросфер на иммунный ответ. Научная новизна Впервые получены и исследованы принципиально новые

гемосовместимые иммуносорбенты, представляющие собой гидрогелевые микросферы на основе природных полисахаридов, покрытые полупроницаемой полиэлектролитной мембраной, с включенными в них синтетическими антигенами (гликоконъюгатами). Впервые предложен и оптимизирован метод включения плазмидной ДНК (эффективность включения более 90%) в мультислойные биодеградируемые микрокапсулы на основе природных и модифицированных полисахаридов. Впервые продемонстрировано, что полиэлектролитные микрокапсулы с включенной в них плазмидной ДНК индуцировали иммунный ответ в модели in vivo (на мышах).

Практическая значимость работы. Полученные в работе гидрогелевые микросферы с включенными в них синтетическими гликоконъюгатами могут быть использованы для разработки принципиально новых высокоэффективных иммуносорбентов. Разработанный простой и универсальный метод включения ДНК, кодирующих соответствующие белки-антигены, может найти применение в биомедицине, в частности, для получения новых ДНК-вакцин.

Апробация работы. Результаты работы были представлены на следующих конференциях: XVI, XVII, XVIII зимние молодежные научные школы «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» (Москва, 2004, 2005, 2006), The XII International Workshop on Bioencapsulation

(Vitoria, Spain, 2004), 1st South East European Congress of Chemical Engineering (Belgrade, Serbia and Montenegro, 2005), XX Международный конгресс химических технологий (Москва, 2006), XV International Workshop on Bioencapsulation (Vienna, 2007), III International conference on Colloid Chemistry and Physicochemical Mechanics (Moscow, 2008), XVI International Conference on Bioencapsulation (Dublin, 2008).

Публикации. По материалам диссертационной работы было опубликовано 16 печатных работ, в том числе 3 статьи из списка журналов, рекомендованных ВАК, получен 1 патент РФ на изобретение и 1 одно положительное решение о выдаче патента РФ на изобретение.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы из 180 наименований. Работа изложена на 128 страницах машинописного текста, содержит 39 рисунков и 16 таблиц.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. Выбор полимеров для получения полиэлектролитных биосовместимых

микросфер

При выборе материалов к полимерам предъявлялись следующие требования:

- биосовместимость;

- гидрофильность;

- способность к образованию стабильного полиэлектролитного комплекса (ПЭК);

Для получения полимерных микросфер были выбраны следующие водорастворимые полиэлектролиты (ПЭ) уже нашедшие применение в медицине и отвечающие вышеуказанным требованиям: природные полисахариды - альгинат (AJIF, вязкость 2% водного раствора при 25°С ~3,5000 сп, Sigma), к-каррагинан (КАР, ММ 50000, Sigma), олигохитозаны (ХИТ с ММ 3700 СД 87% и ММ 5700 СД 89%), производные хитозана (четвертичные аммониевые основания ХИТ-1М с ММ 6500 и ХИТ-2М с ММ 9000); полипептид поли-А-лизин гидробромид (ПЛ с ММ 15000-30000, Sigma). Кроме этого, в рамках международного сотрудничества в лаборатории проф. А. Бартковиака (Западнопомеранский университет, г. Щецин, Польша) автором была синтезирована серия новых поликатионов -модифицированных декстранов (ДМ), характеризующихся наличием значительного положительного заряда в своей структуре. Предположительно, использование таких полимеров позволит повысить устойчивость полиэлектролитного комплекса при получении полиэлектролитных микросфер. Модификацию декстрана (ММ 1000004

200000) проводили путем его взаимодействия с различными хлораминами (рис. 1). Было получено 12 образцов модифицированных декстранов с различной степенью замещения. Выход конечного продукта составлял не менее 70%. Характеристики хлорамннов, использованных в данной работе, и полученных образцов модифицированных декстранов представлены в табл. 1.

Рис.1. Реакция модификации декстрана с использованием 2-хлор-Ы,М-диэтилэтиламин

гидрохлорида.

Таблица 1. Характеристики модифицированных декстранов и хлораминов.

Образец ДМ Название модифицирующего агента ММ хлорамина, г/моль Содержание хлорамина в реакционной смеси, г Степень замещения, мол.% ММ ДМ, г/моль

1 2-Хтор-М,М-диэтилэтиламин гидрохлорид 172,10 10 14 86100

2 20 26 98100

3 З-хлорпропиламин гидрохлорид 130,02 7,55 4 76900

4 15,1 7 61600

5 2-хлорэтиламин гидрохлорид 115,99 6,74 4 35400

6 13,5 15 101500

7 З-хлор-НК-диметил-пропиламнн гидрохлорид 158,07 9,2 9 47500

8 18,36 14 90900

9 2-хлор-М,К-д1[метил-пропиламин гидрохлорид 158,07 9,2 8 92500

10 18,36 14 92500

11 2-хлор-Ы,К-диизопропил-этиламин гидрохлорид 200,15 11,63 11 61900

12 23,25 21 114000

Степень замещения при модификации декстрана зависела от природы хлорамина и его исходного количества в реакционной смеси (табл. 1). Можно предположить, что наличие донорных алкильных групп у атома азота приводило к увеличению степени замещения, максимальное значение которой наблюдали в случае декстрана, модифицированного 2-хлор-М,М-диэтилэтиламином. Именно этот

модифицированный декстран (ДЭАЭ-декстран) далее был использован нами в качестве одного из поликатионов для получения полиэлектролитной мембраны микросфер.

2. Включение антигенов в биосовместимые альгинат-хитозановые микросферы для специфического удаления антиуглеводных антител 2.1. Выбор антигенов

Антигены (гликоконъюгаты) представляли собой высокомолекулярные водорастворимые конъюгаты полимера полиакриламида (РАА = (-СН2-СН-)П) с олигосахаридами группы крови А (А^) и В (Вд) (рис.2).

^ОН

Степень замещения олигосахаридами мономерных звеньев полимера в гликоконъюгате составляла от 1 до 20 мол.%. Гликоконъюгаты были получены в лаборатории химии углеводов ИБХ РАН по методике, описанной ранее \Shilova КУ., е1а\. // САусосощи^сЛе А, 22 (2005) 43] из одной партии полимера-предшественника (РАА) и имели примерно одинаковую ММ ~ 2000 кДа.

Метод, предложенный нами для включения антигенов (гликоконъюгатов) в полимерные микросферы, основан на свойстве альгината (полианиона) формировать Са-альгинатные гидрогели при замене ионов натрия в растворимой соли альгината натрия на ионы кальция. Для получения полупроницаемой полиэлектролитной мембраны на поверхности гидрогелевых носителей, стабилизации последних в физиологических условиях и предотвращения выхода из них гликоконъюгатов использовали различные поликатионы (ХИТ, ХИТ-1М, ДЭАЭ-декстран, и др.). Полупроницаемая мембрана играла роль барьера, не давая включенным в микросферы антигенам (гликоконъюгатам) выходить наружу, в то же время, позволяя антиуглеводным антителам (АТ) свободно проникать внутрь и специфически связываться с гликоконъюгатами.

Рис.2. Структурные формулы Аы и олигосахаридов.

2.2. Выбор метода иммобилизации антигенов

Включение гликоконъюгатов проводили в два типа АЛГ-поликатионных микросфер: микрочастицы (МЧ), представляющие собой гидрогелевое ядро на основе альгината кальция, покрытое полупроницаемой полиэлектролитной мембраной, и микрокапсулы (МК), полученные обработкой микрочастиц хелатирующим агентом для удаления ионов кальция и растворения ядра. Получение АЛГ-поликатионных микрочастиц проводили в 2 стадии: 1) формирование Са-альгинатных (Са-АЛГ) гранул правильной сферической формы при диспергировании сжатым воздухом 2% раствора альгината натрия, содержащего Ваг РАА или А^-РАА (0,5-2,5 мг/мл) и подаваемого перистальтическим насосом в 2% раствор хлорида кальция (рис. 3); 2) получение полупроницаемой мембраны на поверхности Са-АЛГ гранул путем их инкубирования в 0,2-0,4% растворе поликатиона. Микрокапсулы получали при последующем растворении гидрогелевого ядра с помощью 0,1М раствора ЭДТА.

1—[~г~|— Раствор альгината с В1гРААЛА«-РАА

г—л

сжатый „ воздух

о»

Рис.3. Экспериментальная установка для получения Са-АЛГ гранул: 1 - перистальтический насос, 2 -прибор, снабженный иглой, 3 - компрессор.

| — раствор ClCl;

2.3. Характеристика альгинат-хитозановых носителей

Размер и форма АЛГ-ХИТ микросфер определялись совокупностью различных параметров, а именно, скоростью подачи полимерной смеси в раствор хлорида кальция, ее вязкостью, диаметром иглы и др. Были найдены оптимальные условия (концентрация раствора АЛГ - 2 масс.%, скорость подачи полимерного раствора - 0,28 мл/мин, давление сжатого воздуха - 5 атм) для формирования микросфер правильной сферической формы (рис. 4) и узким распределением по размерам в интервале от 700 до 900 мкм.

Рис.4. Фотография альгинат-хитозановых микросфер. Использован хитозан с ММ 3700.

Рис.5. Фотография альгинат-хитозановой микрокапсулы с мембраной. Использован хитозан с ММ 3700.

Толщину полиэлектролитной мембраны микросфер (рис.5) можно регулировать, меняя молекулярную массу хитозана, концентрацию и рН его раствора, время инкубации Са-АЛГ гранул в растворе хитозана (табл.2). Толщина мембраны должна быть такой, чтобы не затруднять диффузию антител внутрь микросфер, но в тоже время достаточной для обеспечения их механической прочности.

Таблица 2. Зависимость толщины полиэлектролитной мембраны альгинат-хитозановых

ММ рН Концентрация Время инкубирования Толщина

хит раствора ХИТ, Са-АЛГ гранул в мембраны,

ХИТ % растворе ХИТ, мин мкм

3700 4,5 0,2 2 20±5

3700 4,5 0,2 5 40±5

3700 4,5 0,4 5 115±5

3700 6 0,2 5 53±5

5700 4,5 0,2 2 20±5

5700 4,5 0,2 5 35±5

5700 4,5 0,4 5 100±5

5700 6 0,2 5 48±5

5700 6 0,4 5 120±5

Для лучшей визуализации мембраны использовали суспензию латексных частиц (диаметр 600 нм), которую добавляли к раствору альгината натрия при приготовлении микрокапсул. Для осаждения латексных частиц на внутреннюю поверхность мембраны микрокапсулы центрифугировали (10000 об/мин, 10 мин). Было показано, что для формирования устойчивой мембраны среднего размера 40±5 мкм (рис. 5) оптимальное время инкубации Са-АЛГ гранул в растворе хитозана с ММ 3700 составляло 5 минут при рН 4,5.

2.4. Изучение эффективности включения гликоконъюгатов в микросферы

Эффективность включения гликоконъюгатов в микросферы (МЧ и МК) определяли спектрофотометрически с помощью флуоресцентно меченного РГГС гликоконъюгата (А„-РАА-Р[ТС). Полученные результаты показали, что наибольшие потери гликоконъюгата происходили на первой стадии получения микросфер - при формировании гидрогелевых Са-АЛГ гранул в растворе СаС12. При различных исходных количествах включаемого Ат-РАА-Р1ТС (0,5 и 2,2 мг) около 45%, по-видимому, низкомолекулярных фракций гликоконъюгата было обнаружено в растворе СаС12. На следующих стадиях получения МЧ - промывке 0,9% ЫаС1 и инкубации в растворе хитозана - потери гликоконъюгата составили около 15% и увеличились еще на 15% после растворения гидрогелевого ядра с помощью ЭДТА. Можно предположить, что удаление катионов Са2+ из полимерной мембраны приводило к увеличению сё проницаемости и, как следствие, к дополнительному выходу низкомолекулярных фракций гликоконъюгата. При хранении МЧ в течение 16 дней выход А,„-РАА-Р1ТС из них не превышал 3,5%, а в случае МК десорбция гликоконъюгата в супернатант и вовсе не наблюдалась. Это говорит о том, что нам удалось найти желаемое соответствие проницаемости мембраны и размера гликоконъюгата, при котором последний удерживался в микросферах.

Таким образом, степень включения А,„-РАА-Р1ТС в АЛГ-ХИТ микросферы составила не менее 40% от исходного количества иммобилизуемого гликоконъюгата для МЧ и не менее 25% для МК. Так как молекулярная масса является основным параметром при иммобилизации данных антигенов, и для всех использованных нами гликоконъюгатов она примерно одинакова, то можно было предположить, что степень их включения мало отличается от величины, полученной для А^-РАА-ИТС. Поэтому в дальнейших опытах количество включенных в микросферы гликоконъюгатов рассчитывали, исходя из результатов, полученных для А^-РАА-1ЧТС.

2.5. Изучение эффективности сорбции антител микросферами

Для инкубации с АТ были приготовлены несколько серий микросфер с включенным В^-РАА, которые имели толщину мембраны 20±5 (МЧю и МКю)> 40±5 (МЧад и МК40) и 115±5 (МЧц5 и МКи5) мкм. Эффективность сорбции АТ микросферами изучалась при 24 и 37°С в течение 1,3 и 24 часов. Для инкубации использовали поликлональные анти-В^ антитела (^в + 1§М, 254 мкг/мл).

Таблица 3. Зависимость сорбции антител АЛГ-ХИТ носителями от условий инкубации и толщины их мембраны.

Образец Толщина Количество Количество связавшихся

мембраны, ВЛ-РАА, в поликлональных анти-В^

мкм микросферах антител(^СН-^М) (%) после

мкг/мкл инкубации в течение

1ч Зч 24 ч

при и °С при Ъ °С при % °С

24 37 24 37 24 37

мч20 20±5 1 87 95 95 100 - -

мк20 2 0±5 0,6 72 75 75 75 - -

МЧ40 40±5 1 60 62 60 63 100 100

МКю 40±5 0,6 38 46 40 46 66 68

МЧ„5 115±5 1 20 20 20 20 27 27

*МЧ20 - нижний индекс показывает толщину мембраны в мкм.

Количество сорбировавшихся антител (%) определяли, как разность величины оптического поглощения раствора антител до и после инкубации с микросферами.

После инкубации в течение 1 ч при 24 и 37°С МЧ40 связывали не менее 62% антител, а через 24 часа эта величина достигала 100% (табл. 3). В случае МКю количество сорбирующихся АТ после 1 и 3 ч как при 24°С, так и при 37°С составило 38-40 и 46%, соответственно, что было почти в 1,5 раза ниже, чем для МЧ40 (6063%). Максимальная доля АТ, сорбированных МК40, составила 68% через 24 часа при 37°С. По-видимому, лимитирующей стадией процесса сорбции является не транспорт АТ к носителю, а их проникновение через полимерную мембрану. Поэтому уменьшение толщины мембраны должно было способствовать повышению величины сорбции АТ микросферами. Действительно, при использовании образцов МЧ20 и МК2о доля сорбировавшихся АТ значительно возросла, по сравнению с МЧ40 и МКю. Однако через 24 ч инкубации оба образца (МК20 и МЧ2о) теряли свою исходную сферическую форму и растворялись. Известно, что гидрогели не стабильны в присутствии фосфат- или цитрат-ионов, которые замещают Видимо, слишком тонкая мембрана (20 мкм) была недостаточно стабильной и растворялась при инкубации микросфер в растворе антител, который содержал фосфат-ионы. В свою очередь, увеличение толщины мембраны способствовало большей стабильности микросфер при их инкубации с антителами, но снижало величину сорбции антител. Во всех экспериментах неспецифическая сорбция антител МЧ и МК, не содержащими антиген, составляла менее 5%.

Таким образом, оптимальными микросферами как с точки зрения Стабильности, так и с точки зрения максимально возможной сорбции антител, были «40 И МК40.

Следующим этапом работы было сравнение способности разработанных

чикросфер и традиционно используемого сорбента сефарозы специфически

связывать антитела.

2.6. Сравнение способности альгинат-хитозановых микрочастиц и сефарозы специфически связывать антиуглеводные антитела

Нами было проведено сравнение эффективности сорбции МЧ40 с наиболее тасто используемым сорбентом - модифицированной сефарозой, содержащей тот ре антиген А(п и в том же количестве (0,6 мкмоль/мл), что и в случае МЧ40, но .<овалентно связанный с матрицей. Для сорбции использовали моноклональные мышиные анти-А1г;(1§М)-антитела в виде неочищенной асцитной жидкости.

№

б 100 90 -

70 -

г 60 §50 "§.40 -5 30 -20 10 -0

о мнкрочасттщы(24ч) о сефароза(2-И)

Г+А

гН*!

1:10000 1:20000 1:40000 1:60000 1:800001:100000 Разведеяне антител

1:10000 1:20000 1:40000 1:60000 1:800001:100000 Разведение антител

ис. 6. Сорбция моноклональных анти-А1гГантител (1дМ) микрочастицами МЧ40 и сефарозой.

нкубация в течение 1 ч (а) и 24 ч (б).

I Специфическая сорбция антител МЧ40 в течение 1 ч инкубации при малых разведениях асцита протекала медленнее, чем в случае сефарозы (рис.ба). р Небольшую разницу в пользу сефарозы можно объяснить более быстрой диффузией антител к антигену в связи с отсутствием необходимости преодоления антителами мембраны, так как антиген ковалентно пришит на внешней поверхности сефарозы. днако через 24 ч эффективность сорбции обоих сорбентов сравнялась (рис.66).

Традиционные сорбенты имеют высокоразвитую поверхность, на которой ловалентно пришиты антигены, что приводит к их высокой эффективности. Однако количество мест связывания антигена с полимерной матрицей ограничено количеством функциональных групп сорбента, которые можно использовать для

иммобилизации антигена. В предложенном нами подходе сравнимая эффективность связывания антител достигается не за счет увеличения поверхности, которое ведёт к снижению размера частиц сорбента и, как следствие, к увеличению его травматичности для клеток крови, а за счёт физической иммобилизации (включения) антигена в микросферы и может быть повышена при увеличении концентрации включённого в микросферы антигена.

Далее представляло интерес изучить гемосовместимость разработанных микросфер.

2.7. Изучение гемосовместимости микросфер

Изучение гемосовместимости предложенного нами носителя антигена проводилось на серии пустых микрочастиц различного полимерного состава (табл. 4) в рамках совместного проекта с Центром биоматериалов университета г. Льеж (Бельгия). После инкубации МЧ с цельной человеческой кровью, проводили исследование последней по нескольким параметрам:

- морфология (форма, размер) и концентрация форменных элементов крови;

- гемолиз эритроцитов;

- активация системы комплемента.

Система комплемента представляет собой комплекс защитных белков крови, участвующих в иммунных реакциях. Расщепление ферментным комплексом (СЗ-конвертаза) центрального компонента СЗ протеолитического каскада является главной реакцией всей цепи активации комплемента. СЗ-конвертаза расщепляет СЗ на два фрагмента СЗа и СЗЬ, имеющих различные функции. В работе определяли наличие фрагмента СЗа, который принимает участие в развитии воспалительного процесса, индуцируя хемотаксис лейкоцитов к очагу воспаления. Таблица 4. Микрочастицы, использованные для изучения гемосовместимости.

Образец № Полимерный состав МЧ

1 АЛГ/ХИТ

2 АЛГ/ХИТ-1М

3 АЛГ/ДЭАЭ-декстран

4 АЛ Г/ХИТ/АЛ Г

5 АЛГ/ХИТ-1М/АЛГ

6 АЛГ/ДЭАЭ-декстран/АЛГ

2.7.1. Изучение морфологии и концентрации форменных элементов крови

Так как основную часть клеток крови составляют красные кровяные клетки (эритроциты), нами было проведено изучение их формы методом световой

микроскопии мазка крови. На рис. 7 представлены фотографии эритроцитов после инкубации крови с микрочастицами и в контрольном образце.

Рис.7. Фотографии эритроцитов после инкубации цельной крови с микрочастицами (образцы 1-3 в табл. 4) и в контрольном образце.

Как видно из представленных фотографий, инкубация крови с микрочастицами не привела к деформации эритроцитов.

Рис.8. Распределение эритроцитов (а) и тромбоцитов (б) по размерам в 0,5 мл крови после инкубации цельной крови с микрочастицами.

Результаты изучения распределения эритроцитов и тромбоцитов по размерам и изменения их концентрации после инкубации цельной крови с микрочастицами (образцы 1-6) и в контрольном образце, полученные с помощью Coulter Counter, представлены на рис.8 (а, б) и рис.9 (а, б), соответственно.

СИ 5000000 Л ш 120000 ^

° 4500000 -ля т М ¡If °

llllllr llllill

1 2 3 4 5 6 Контроль 1 2 3 4 5 6 Контроль

Номер образца Номер образца

Рис.9. Количество эритроцитов (а) и тромбоцитов (б) в 0,5 мл крови после инкубации цельной крови с микрочастицами.

После инкубации цельной крови с МЧ изменения размеров и концентрации форменных элементов крови (эритроцитов и тромбоцитов) не происходило.

2.7.2. Исследование гемолиза эритроцитов

Для измерения гемоглобина в крови до и после ее инкубации с микрочастицами использовали гемиглобинцианидный метод Драбкина.

Рис.10. Выход гемоглобина после инкубации цельной крови с МЧ различного полимерного состава и в контрольных образцах. Контроль "-": цельная кровь + фосфатно-солевой буфер (ФСБ) (разрушение эритроцитов не происходит). Контроль "+": цельная кровь + 0.2%-ный раствор сапонина (разрушение эритроцитов происходит).

1 2 3 4 5 6 контр.- контр.-ь

Номер образца

Уровень гемолиза эритроцитов после инкубации цельной крови с микрочастицами (рис.10) различного полимерного состава не превышал значение, полученное для отрицательного контроля, и лежал в интервале от 0,45 до 0,7% (1,37% для образца 6). В соответствии со стандартом А8ТМ (Б 726-00), вещества не

обладают гемолитическими свойствами, если степень гемолиза не превышает 2%. Для "положительного" контроля уровень гемолиза составил более 10%.

2.7.3. Определение фрагмента СЗа

Для определения способности активировать систему комплемента микрочастицы инкубировали с цельной кровью и методом ИФА определяли концентрацию фрагмента СЗа.

Рис.11. Концентрация фрагмента СЗа в крови после инкубации в ней МЧ и в контрольных образцах. Контроль "-" цельная кровь + ФСБ (активация системы комплемента не происходит). Контроль "+" цельная кровь + зимозан (суспензия полисахаридов из культуры дрожжей ЗассЬаготусеэ сегеу^ае, обладающая способностью активировать систему комплемента).

Концентрация СЗа в исследуемых образцах крови (рис. 11), инкубированных с МЧ различного полимерного состава, соответствовала величине, полученной для "отрицательного" контроля, и варьировалась в пределах от 1300 до 1800 нг/мл. Для "положительного" контроля концентрация СЗа составила 9000 нг/мл.

Таким образом, комплексное исследование гемосовместимости всех 6 образцов микросфер, показало, что они не вызывают повреждений форменных элементов крови (тромбоцитов и эритроцитов) и не активируют систему комплемента.

Вторым направлением работы являлась разработка подхода, который можно было бы использовать при создании новых ДНК-вакцин с использованием инкапсулированных плазмидных ДНК (размер микрокапсул 1-3 мкм).

3. Включение ДНК в биосовместимые полимерные микрокапсулы 3.1. Выбор материалов и метода для включения ДНК

Метод послойной адсорбции полиэлектролитов (1ауег-Ьу-1ауег) был выбран нами для включения ДНК в микрокапсулы в рамках совместной работы с институтом Макса Планка (Институт коллоидов и химии поверхностей, г. Гольм, Германия). Метод предполагает сорбцию макромолекул в макропористые

10000

9000

* 8000 (о

т 7000 и

« 6000 X

я 5000 а

ь 4000 а

и 3000 г

о 2000 1000 -1

3 4 5 6 контр,- КОКТР.+

Номер образца

неорганические микрочастицы, на поверхности которых далее можно сформировать полиэлектролитные мембраны путем последовательной адсорбции противоположно заряженных полиэлектролитов с последующим растворением неорганического ядра и получением полых ПЭ МК [Sukhorukov G.B. et al. // Polym. Adv. Technol., 9 (1998) 759].

В качестве неорганического ядра для сорбции плазмидной и вирусной ДНК нами были выбраны микрочастицы СаС03. Выбор был обусловлен двумя важными факторами:

- биосовместимостью микрочастиц карбоната кальция и возможностью работать с ними в физиологических условиях;

- макропористостью структуры микрочастиц (размер пор 20-60 нм), которая позволяет включать значительные количества ДНК [Volodkin D. V., et.al .// Biomacromolecules, 5 (2004) 1962].

Процесс получения МК с включенной ДНК (плазмидной или вирусной) состоял из трех основных стадий (рис. 12):

1) Сорбция ДНК в макропористые микрочастицы карбоната кальция.

2) Формирование мультислойной мембраны на поверхности микрочастиц, содержащих ДНК. Для получения стабильных МК процедуру, адсорбции ПЭ на поверхности микрочастиц СаС03 повторяли минимум 6 раз, то есть получали 6 ПЭ слоев: (поликатион/полианион)3. В работе использовали следующие комбинации ПЭ: (ПЛ/АЛГ)з, (ДЭАЭ-декстран/КАР)3, (ХИТ-2М/1САР):1.

3) Получение полых МК путем растворения ядра из карбоната кальция обработкой 0,1М раствором ЭДТА.

Микрофотографии микрочастиц СаС03, а также полученных на их основе мультислойных полых микрокапсул представлены на рис.13.

СяСОз • .•¿V»"

СаСОз микрочастица, Пол»а 113 мнкрокапсуда,

содержании ДНК содержащая ДНК

Рис. 12. Схема процесса получения полых микрокапсул с включенной в них ДНК.

Сорбция ДНК -а-

*днк

Адсорбште ПЭ

• Полнакион ^Полвкатпон

Рис.13. Микрофотографии макропористых микрочастиц карбоната кальция и микрокапсул, полученных на их основе: (а) - микрочастицы СаС03, (б) - микрочастица СаС03 в разрезе, (в) - микрочастицы СаС03, покрытые полиэлектролитной мембраной, (г) - ПЭ микрокапсулы, полученные после растворения карбонатного ядра; (а,б) - электронная сканирующая микроскопия, (в,г) - световая микроскопия.

3.2. Исследование доставки вирусной ДНК, включённой в (ПЛ/АЛГ)3 микрокапсулы, в клетки в модели in vitro и in vivo.

Возможность адресной доставки ДНК в клетки in vitro и in vivo была продемонстрирована с использованием модельной ДНК вируса болезни Ауески (ВБА) в сотрудничестве с ГНУ ВНИИ ветеринарной вирусологии и микробиологии (г. Покров, Владимирской обл.). О размножении вирусов в культуре клеток почки сибирского горного козерога (ПСГК - 60) можно было судить по цитопатическому действию (ЦПД), которое заключалось в изменении морфологии клеток, образовании включений, не свойственных нормальным клеткам, и деструкции клеток. Ежедневно клеточную культуру просматривали под микроскопом, отмечая появление или отсутствие характерного для ВБА цитопатического действия. Сравнение эффективности трансфекции клеток с помощью ДНК ВБА, включённой в (ПЛ/АЛГ)3 микрокапсулы, и традиционных методов (ДЭАЭ-декстрановый и с использованием липофектамина) представлено в табл.5.

Таблица 5. Сравнение методов введения ДНК в клетки в модели in vitro.

Метод введения Время Количество Время Титр вируса на 5

Днк адсорбции, вводимой проявления сутки после

ч ДНК, ЦПД, трансфекции

мкг сутки

ДЭАЭ- 2 5-10 - -

декстрановыи

с использованием 5 5-10 4 1,5

липофектамина

МК (ПЛЛ/АЛГЬ 1 5-10 2 3,5

На культуре клеток с ДЭАЭ-декетраном ЦПД не проявлялось в течение всего срока наблюдения (6 дней). Развитие ЦПД в случае использования (ПЛ/АЛГ)3 микрокапсул обнаружили уже на вторые сутки, в то время как в варианте трансфекции липофектамином ЦПД наблюдали только на четвертые сутки. Таким образом, было показано, что эффективность введения микрокапсулированной ДНК ВБА в клетки in vitro выше, чем в случае традиционных методов трансфекции.

Поскольку ДНК этого вируса является инфекционной, то при проникновении в клетки животных организмов она должна вызвать инфекционный процесс, который проявляется в характерных для заболевания легко идентифицируемых признаках (поражении центральной нервной системы, органов дыхания). Животным вводили ДНК в (ПЛ/АЛГ)з микрокапсулах в количестве 6 мкг ДНК/особь для кроликов и 0,6 мкг ДНК/особь для мышей. Два кролика и две мыши пали на 4-5 сутки после введения ДНК. У двух других кроликов на 6-7 сутки развилась респираторная форма болезни, которая проявилась в чихании, кашле и слизистых выделениях из носа, на 21 сутки кролики пали. Контрольные животные, которым вводили нативную ДНК в том же количестве, не проявляли никаких признаков заболевания в течение всего срока наблюдения (21 сутки).

Для определения эффективности переноса в клетки ДНК ВБА клеточную культуру ПСГК - 60, в которую добавляли по 1 мл 10%-ной суспензии, приготовленной из проб органов павших животных, ежедневно просматривали под микроскопом. На 4-5 сутки было обнаружено появление характерного для ВБА ЦПД в культуре клеток, в которую вносили суспензию печени и мозга павших животных. Дополнительно проводили исследования 10%-ной суспензии органов кроликов, павших на 4-5 сутки, методом ПЦР со специфическими праймерами, которые подтвердили наличие в печени и мозге ДНК ВБА.

Таким образом, было показано, что ДНК ВБА, включённая в (ПЛ/АЛГ)3 микрокапсулы, была защищена от расщепления нуклеазами и успешно доставлена в чувствительные клетки, о чем свидетельствовало развитие инфекционного процесса у животных.

3.3. Исследование доставки плазмидных ДНК, включённых в микрокапсулы различного полимерного состава, в модели in vivo

В данной работе для включения в микрокапсулы различного полимерного состава использовали:

- плазмиду pTKShi (6841 п.о.), имеющую в своем составе участок генома,

кодирующий полипептид Е2 вируса классической чумы свиней (КЧС); - плазмиду, экспрессирующую нуклеопротеин р1п!№ (5185 п.о.) вируса гриппа птиц А (ВГП).

После проведения оптимизации было обнаружено, что сорбция плазмидных ДНК в микрочастицы карбоната кальция, близкая к 100%, достигалась при массовом соотношение ДНК/СаС03, равном 3 мкг/мг. При этом общие потери ДНК в процессе получения микрокапсул не превышали 5-10 %.

Для определения оптимального количества плазмидной ДНК, вызывающей максимальную индукцию антител в крови мышей, последних иммунизировали препаратами, содержащими различные количества плазмиды рТКБЫ в (ПЛ/АЛГ)3 микрокапсулах, нативной плазмиды рТКБЫ (табл.6) и плазмиды р1пЮТ в (ПЛ/АЛГ)3 в микрокапсулах (табл.7). Препараты вводили внутримышечно в область бедра. Для проведения исследований кровь отбирали на 14 и 35 сутки (табл.6) и на 21 сутки (табл.7), а далее определяли титры ^С и 1§М антител методом непрямого твердофазного ИФА.

Таблица 6. Титры антител (1дС и 1дМ) в сыворотках крови мышей, иммунизированных нативной плазмидой рТКЭЫ и плазмидой рТКБМ в (ПП/АЛГ)э микрокапсулах.

Кол-во плазмиды, Отбор крови, Титр антител у Титр антител у

вводимой мышам, сутки мышеи, мышеи,

мкг иммунизированных нативной ДНК иммунизированных ДНК в МК

6,3 14 1:100-1:400 1:200-1:800

20 14 1:3200-1:6400 1:3200-1:6400

43 35 1:3200-1:6400 1:3200-1:6400

Примечание: Титр нормальной сыворотки белой мыши 1:50.

Таблица 7. Титры антител в сыворотках крови мышей, иммунизированных (ПЛ/АЛГ)з микрокапсулами, в зависимости от количества вводимой плазмиды р!гМР.

Кол-во плазмиды в Титры антител

МК, вводимой к антигену ВГП (подтип Н7) к антигену ВГП (подтип Н5)

мышам,

мкг

5 1:1600 1:400

10 1:2260 1:400

20 1:3200 1:2600

30 1:3200 1:2660

40 1:3200 1:3200

Примечание: Титр нормальной сыворотки белой мыши 1:50.

Введение мышам как плазмиды рТКвЫ, так и плазмиды р1пЮТ в (ПЛ/АЛГ)3 микрокапсулах приводило к индукции антител. При увеличении дозы вводимой микрокапсулированной плазмиды от 6,3 до 20 мкг на мышь для плазмиды рТКБЫ и от 5 до 20 мкг на мышь для плазмиды р1пМР наблюдали повышение титра антител в исследуемых сыворотках крови на 14 и 21 сутки, соответственно (табл. 6 и 7). Дальнейшее увеличение количества вводимых микрокапсулированных плазмид рТКБЫ и рГпШР от 20 до 40 мкг в обоих случаях не влияло на индукцию антител. Таким образом, оптимальная доза плазмидной ДНК для иммунизации мышей составила 20 мкг на особь.

Так как существенных различий в титрах антител при иммунизации нативной ДНК и плазмидой рТКБЫ, включенной в (ПЛ/АЛГ)3 микрокапсулы, не наблюдали, далее была исследована индукция антител у мышей в ответ на введение плазмиды рТКБЫ в микрокапсулах с другими полимерными композициями, а именно: (ХИТ-2М/КАР)з, (ДЭАЭ-декстран/КАР)3. Выбор этих полимеров был обусловлен тем, что нам удалось получить на их основе наиболее механически стабильные микрокапсулы. Три группы опытных белых беспородных мышей (по 12 мышей в группе) были иммунизированы внутримышечно по 20 мкг препарата плазмиды на мышь. Определение титра антител сывороток крови мышей, иммунизированных плазмидой рТКБЫ, проводили методом непрямого твердофазного ИФА.

Таблица 8. Титры антител при иммунизации мышей нативной плазмидой рТКЭЫ и плазмидой рТКвЫ, включенной в микрокапсулы различного полимерного состава.

Отбор крови, сутки Титр антител

нативная плазмида (ПЛ/АЛГ)з (ХИТ-2М/КАР)3 (ДЭАЭ-декстран/КАР)3

14 1:100-1:400 1:800-1:1600 1:6400-1:25600 1:6400-1:12800

21 1:3200-1:6400 1:3200-1:6400 1:12800-1:25600 1:12800-1:25600

Как видно из табл. 8, при введении одинакового количества микрокапсулированной плазмидной ДНК, индукция антител зависела от композиционного состава микрокапсул. Самый высокий титр антител наблюдался на 14-е сутки в сыворотках крови мышей, иммунизированных микрокапсулами

(ХИТ-2М/КАР)3. На 21-е сутки титры антител сывороток крови при иммунизации микрокапсулами (ДЭАЭ-декстран/КАР)3 и (ХИТ-2М/КАР)3 сравнялись и были в 3-4 раза выше, чем в случае иммунизации нативной плазмидой pTKShi или плазмидой pTKShi в (ПЛ/АЛГ)з микрокапсулах. Следует отметить, что в случае (ХИТ-2МЛСАР)3 микрокапсул хитозан мог способствовать активации макрофагов, описанной ранее [Petronio M.G, et.al. II Chemotherapy, 43 (1997) 211] и, как следствие, приводить к более высокому уровню индукции антител.

Таким образом, был разработан подход для доставки в клетку плазмидных ДНК, в частности плазмиды pTKShi и плазмиды plnfNP, включенных в биодеградируемые микрокапсулы различного композиционного состава. На основе предложенного подхода для доставки ДНК в клетку могут быть разработаны эффективные вакцины нового поколения (ДНК-вакцины).

ВЫВОДЫ

1. Предложены и оптимизированы метод экструзии для включения антигенов (синтетических гликоконъюгатов, содержащих олигосахариды Am и Вд) и метод послойной адсорбции полиэлектролитов для включения плазмидных ДНК (плазмиды pTKShi и plnfNP) в полиэлектролитные микрокапсулы различного размера и полимерного состава.

2. Методом экструзии получены АЛГ/ХИТ микросферы со средним размером 900 мкм (микрочастицы и микрокапсулы, покрытые полупроницаемой полиэлектролитной мембраной), с включенными в них гликоконъюпшши Atn- РАА и Bdi-PAA. Показано, что разработанный метод позволяет включать не менее 45% гликоконъюгатов в микрочастицы и не менее 25% в микрокапсулы.

3. Изучена способность АЛГ/ХИТ микросфер, содержащих синтетические антигены (гликоконъюгаты), специфически связывать IgG и IgM антитела. Показано, что полученные носители по сорбционной емкости не уступают традиционному сорбенту - сефарозе, модифицированной теми же олигосахаридами.

4. Комплексное исследование гемосовместимости полученных микросфер (на основе альгината натрия, хитозана, ДЭАЭ-декстрана и четвертичного аммониевого основания хитозана) показало, что они не вызывают повреждений тромбоцитов и эритроцитов и не активируют систему комплемента.

plnfNP) и вирусной ДНК (вирус болезни Ауески). Показано, что эффективность включения ДНК в микрокапсулы составляет более 90 %.

6. На примере вируса болезни Ауески показана эффективность доставки ДНК, включенной в (ПЛ/АЛГ)3 микрокапсулы, в модели in vitro (культура клеток почки сибирского горного козерога ПСГК - 60) и в модели in vivo (на мышах и кроликах).

7. Показано, что введение мышам (ПЛ/АЛГ)з микрокапсул с включенными плазмидными ДНК (плазмида pTKShi или плазмида plnfNP) индуцировало иммунный ответ. При этом оптимальная доза плазмидной ДНК для иммунизации мышей составила 20 мкг на особь.

8. Исследована зависимость индукции антител у мышей в ответ на введение микрокапсулированной плазмиды pTKShi от полимерного состава микрокапсул. Самые высокие титры антител сыворотки крови были получены при иммунизации микрокапсулами (ХИТ-2М/КАР)3 и (ДЭАЭ-дскстран/КАР)3 и были в 3-4 раза выше, чем в случае иммунизации нативной плазмидой pTKShi или плазмидой pTKShi, включенной в (ПЛ/АЛГ)3 микрокапсулы.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Селина O.E., Белов С.Ю., Власова H.H., Балышева В.И., Чурин А.И., Бартковиак А., Сухоруков Г.Б., Марквичева Е.А. Биодеградирусмые микрокапсулы с включенной в них ДНК для создания новых ДНК-вакцин // Биоорганическая химия. - 2009.-Т. 35, № 1,-С.113-121.

2. Балышева В.И., Марквичева Е.А., Власова H.H., Сухоруков Г.Б., Селина O.E. Способ доставки ДНК в макроорганизм для разработки вакцин и соматической генной терапии // Патент RU 2336090С2, бюллетень №29 от 20.10.2008.

3. Бовин Н.В, Марквичева Е.А, Селина O.E. Сорбент для удаления антител из цельной крови и способ его получения. Положительное решение о выдаче патента РФ на изобретение от 28.01.2009 г. (заявка № 2008108187).

4. Селина O.E., Марквичева ЕА., Чинарев АЛ., Обухова П.С., Бартковиак А., Бовин Н.В. Альгинат-хитозановые микросферы для специфической сорбции антител // Биоорганическая химия. - 2008 - Т. 34, № 4,- С. 522-529.

5. Markvicheva Е., Selina О., Bartkowiak A., Bovin N. Alginate-chitosan microbeads/microcapsules with entrapped synthetic antigen for antibody removal // Proceedings of XVI International Conference on Bioencapsulation. - Dublin, 4-6 Sept. 2008.-P. 44 (4 pages).

6. Balysheva V.I., Vlasova N.N., Markvicheva E.A., Belov S.Yu., Kapoustina O.V., Selina O. Effect of microcapsule upon specific antibody induction // Proceedings of XVI International Conference on Bioencapsulation. - Dublin, 4-6 Sept. 2008 - P-45 (4 pages).

7. Selina O.E., Chinarev A.A., Bartkowiak A., Bovin N.V., Markvicheva E.A. Bioencapsulation of antigens in biocompatible microspheres based on alginate and chitosan // Book of abstracts of III International conference on Colloid Chemistry and Physicochemical Mechanics. - Moscow, 24-26 June, 2008. - EP 21, P.56.

8. Belov S.Yu., Selina O.E., Balysheva V.I.., Vlasova N.N., Markvicheva E.A. Usage of microencapsulation to prolong the immune response at DNA vaccination. // Book of abstracts of III International conference on Colloid Chemistry and Physicochemical Mechanics. - Moscow, 24-26 June, 2008. - EP30, P.57.

9. Балышева В.И., Власова H.H., Селина O.E., Белов С.Ю., Марквичева ЕЛ., Сухорукое Г.Б. Микрокапсулирование ДНК как способ доставки ДНК-вакцин // Российский ветеринарный журнал: мелкие домашние и дикие животные. - 2007. -№1.- С 25-26.

10. Balysheva V., Vlasova N.N., Markvicheva Е.А., Belov S.Yu., Selina O., Sukhorukov G.B. Microencapsulated DNA as a DNA-vaccine delivery system // Proceedings of XV International Workshop on Bioencapsulation. - Vienna, 6-8 Sept. 2007. - P.2-10.

11. Селина O.E., Марквичева E.A., Марквичев H.C. Инкапсулирование белков на основе микрочастиц карбоната кальция // Тезисы докладов XX Международного конгресса химических технологий. - Москва, 25-27 октября, 2006. - Т.ХХ (№ 6). -С.34-40.

12. Селина О.Е., Марквичева Е.А. Получение и исследование новых биосовместимых микрокапсул с иммобилизованными в них биополимерами для использования в иммунологии // Тезисы стендовых сообщений XVIII зимней молодежной научной школы «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии». - Москва, 7-10 февраля, 2006. - С.94-95.

13. Markvicheva Е.А., Selina О., Stashevskaya K.S., Svirshchevskaya E.Y., Grandfils Ch., Suhkorukov G. Microcapsules/Microparticles loaded with biologically active molecules for medicine // Proceedings of 1st South East European Congress of Chemical Engineering. - Belgrade, Serbia and Montenegro, Sept 25-28,2005. - P.170.

14. Селина O.E., Марквичева E.A., Свирщевская Е.Ю. Инкапсулирование антигенов для разработки новых вакцин // Тезисы докладов XVII зимней молодежной научной школы «Перспективные Направления Физико-Химической Биологии и Биотехнологии». - Москва, 7-10 февраля, 2005. - С.25.

15. Markvicheva E., Svirshchevskaya E., Volodkin D., Selina O., Gerstenberger M., Bartkowiak A., Sukhorukov G. Encapsulated protein and DNA delivery system for the development of vaccines against intracellular pathogens // Proceedings of The XII International Workshop on Bioencapsulation.-Vitoria, Spain, Sept 24-26,2004-P.89-92.

16. Селина O.E., Обухова П.С. Полимерные микросферы на основе природных полисахаридов для специфического связывания антиуглеводных антител // Тезисы стендовых сообщений XVI зимней молодежной научной школы «Перспективные Направления Физико-Химической Биологии и Биотехнологии». - Москва, 9-12 февраля, 2004. - С.68.

Подписано в печать: 16.04.2009

Заказ № 1874 Тираж -100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

Содержание диссертации, кандидата химических наук, Селина, Оксана Евгеньевна

Оглавление.

Список сокращений.

Введение.

Глава 1. Обзор литературы.

1.1. Способы удаления антиуглеводных антител.

1.1.1. Лекарственная терапия.

1.1.2. Инфузия анти-aGal антител.

1.1.3. Экстракорпоральная терапия.

1.1.4. Поиск новых аффинных сорбентов.

1.2. Способы доставки ДНК в клетку для разработки ДНК-вакцин.

1.2.1. Электропорация.

1.2.2. Введение ДНК с помощью микроинъекции.

1.2.3. Метод "генной пушки".

1.2.4. Введение нативной ДНК с помощью прямых инъекций.

1.2.5. Введение ДНК с помощью различных транспортных систем.

1.2.5.1. Вирусные векторы.

1.2.5.2. Белковые и пептидные векторы.

1.2.5.3. Введение ДНК с использованием липосом.

1.2.5.4. Введение ДНК, включенной в полимерных микрочастицы и микрокапсулы.

1.3.Капсулировани е.

1.3.1. Микрокапсулы.

1.3.2. Полимерные носители.

1.3.2.1. Природные полисахариды.

1.3.3. Методы микрокапсулирования.

1.3.3.1. Химические методы микрокапсулирования.

1.3.3.2. Физические методы микрокапсулирования.

1.3.3.3. Физико-механические методы микрокапсулирования.

1.3.4. Полиэлекролитные микрокапсулы.

1.3.4.1. Метод послойной адсорбции полиэлектролитов.

1.3.4.2. Получение микрокапсул с помощью гелеобразования.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Включение антигенов и ДНК в биосовместимые полимерные микросферы для применения в биомедицине"

Включение различных биоактивных макромолекул (белков, ДНК, олигонуклеотидов и др.) в биосовместимые полимерные матрицы (в нано- и микрочастицы, нано- и микрокапсулы) является одним из перспективных направлений биотехнологии и биомедицины. Спектр областей применения таких носителей постоянно расширяется и включает в себя разработку новых эффективных систем доставки лекарств с их контролируемым высвобождением, новых методов диагностики рака и других заболеваний, новых способов доставки в клетки ДНК для разработки вакцин, соматической генной терапии и др. [1]. В данной работе рассматриваются две области возможного применения иммобилизованных в биосовместимые полиэлектролитные (ПЭ) микросферы макромолекул - синтетических антигенов (гликоконъюгатов) и ДНК:

• создание новых биосовместимых иммуносорбентов (на основе микрокапсул и микрочастиц размером 700-900 мкм);

Создание новых иммуносорбентов является перспективным подходом для решения ряда медицинских проблем, связанных с заболеваниями и осложнениями, провоцируемых антиуглеводными антителами [2-4]. Существуют различные специфические и неспецифические способы решения проблемы удаления из крови патологических антител [5]. К последним относится гемодиализ, при проведение которого вместе с патологическими антителами из крови тотально удаляются все белки. Недостатком этого подхода, кроме потери пациентом важнейших для его здоровья белков, также является высокая стоимость метода.

Среди прочих способов удаления из крови патологических антител особое внимание уделяется специфической сорбции антител на соответствующем сорбенте, представляющем собой антиген, ковалентно пришитый к твердой фазе (сефарозе, агарозе, силикагелю). Применение таких сорбентов требует предварительной процедуры разделения крови на плазму и клетки крови (плазмаферез), во избежание контакта клеток крови с сорбентом, а затем пропускание плазмы через сорбент (плазмосорбция) с последующим возвращением клеток и плазмы в кровоток. Такая необходимость обусловлена тем, что при пропускании через колонку с сорбентом цельной крови, взаимодействие частиц сорбента, с клетками, сопоставимыми с ними по размерам, приводит к повреждению тромбоцитов, эритроцитов и других клеток крови. Существенным недостатком такого подхода являются еще и потери в объеме крови, что требует заместительной терапии. Поэтому более привлекательным представляется метод удаления патогенных антител непосредственно из цельной крови (гемосорбция). При этом особую значимость приобретает задача создания биосовместимой полимерной матрицы (носителя антигена), которая бы позволила сохранить сорбционную емкость традиционных сорбентов или даже увеличить ее и при этом не травмировать клетки крови за счет применения частиц большего размера.

Разработка новых методов доставки ДНК в клетки является одним из актуальных направлений в биотехнологии и основной предпосылкой для создания новых ДНК-вакцин. Для разработки эффективных вакцин требуется доставка белков антигена в цитоплазму антигенпредставляющих клеток (АПК), к которым относятся дендритные клетки (ДК), а также макрофаги и моноциты. В этом случае АПК способны индуцировать не только гуморальный иммунный ответ, то есть продукцию антител, но и цитотоксический клеточный ответ, необходимый для элиминации зараженных патогеном клеток организма.

Идея конструирования ДНК-вакцины основана на том, что определенный ген или участок генома патогена встраивается в бактериальные или вирусные 8 векторы. Созданная таким образом ДНК-вакцина потенциально способна индуцировать клеточный и гуморальный иммунный ответ [6]. Если рассматривать существующие способы введения ДНК в клетки, то большинство из них применимо только в условиях in vitro, например, метод электропорации и метод "генной пушки". В условиях in vivo пригодными остаются только липид-опосредованное введение ДНК и иммунизация нативной ДНК. Эффективность таких методов остается крайне невысокой, так как количество введенной ДНК, попадающее в АПК клетки, оказывается слишком низким для индукции иммунного ответа. Микрокапсулирование ДНК позволяет не только защитить ДНК от быстрого разрушения в организме нуклеазами, но также обеспечить адресную доставку и взаимодействие с клеточными рецепторами. Как правило, для микрокапсулирования ДНК используют метод распылительной сушки и метод двойной эмульсии (вода/масло/вода). Эффективность включения ДНК последним методом обычно не превышает 30-50%. Метод распылительной сушки более эффективен, однако, использование органических растворителей (например, дихлорметана, диметилсульфоксида), а также различных ПАВ может снижать биологическую активность инкапсулированных биоактивных молекул. Кроме этого метод распылительной сушки требует наличия специального дорогостоящего оборудования. Поэтому актуальной задачей является разработка новых простых и универсальных методов включения ДНК в микрокапсулы для ее доставки в клетки в условиях in vivo.

Целью настоящей работы являлось включение синтетических антигенов (гликоконъюгатов) и ДНК, кодирующих белок-антиген, в биосовместимые полимерные микросферы на основе природных полисахаридов; исследование свойств полученных микросфер и возможности их применения в биомедицине для создания новых биосовместимых иммуносорбентов и ДНК-вакцин.

Для достижения поставленной цели предстояло решить следующие задачи: 1. Выбрать биодеградируемые полиэлектролиты для получения микросфер.

4. Сравнить сорбционные свойства полученных микросфер и сефарозы.

6. Изучить эффективность доставки в клетки микрокапсулированной вирусной ДНК в условиях in vitro и in vivo.

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология", Селина, Оксана Евгеньевна

Выводы

1. Предложены и оптимизированы метод экструзии для включения антигенов (синтетических гликоконъюгатов, содержащих олигосахариды Atri и Bdi) и метод послойной адсорбции полиэлектролитов для включения плазмидных ДНК (плазмиды pTKShi и plnfNP) в полиэлектролитные микрокапсулы различного размера и полимерного состава.

2. Методом экструзии получены АЛГ/ХИТ микросферы со средним размером 900 мкм (микрочастицы и микрокапсулы, покрытые полупроницаемой полиэлектролитной мембраной), с включенными в них гликоконъюгатами Atri-РАА и Bdi-PAA. Показано, что разработанный метод позволяет включать не менее 45% гликоконъюгатов в микрочастицы и не менее 25% в микрокапсулы.

5. Методом послойной адсорбции полиэлектролитов получены мультислойные биодеградируемые микрокапсулы различного полимерного состава (со средним диаметром 1 -3 мкм) с включенными в них плазмидными ДНК (плазмида pTKShi и plnfNP) и вирусной ДНК (вирус болезни Ауески). Показано, что эффективность включения ДНК в микрокапсулы составляет более 90 %.

7. Показано, что введение мышам (ПЛ/АЛГ)3 микрокапсул с включенными плазмидными ДНК (плазмида pTKShi или плазмида plnfNP) индуцировало иммунный ответ. При этом оптимальная доза плазмидной ДНК для иммунизации мышей составила 20 мкг на особь.

8. Исследована зависимость индукции антител у мышей в ответ на введение микрокапсулированной плазмиды pTKShi от полимерного состава микрокапсул. Самые высокие титры антител сыворотки крови были получены при иммунизации микрокапсулами (ХИТ-2М/КАР)з и (ДЭАЭ-декстран/КАР)3 и были в 3-4 раза выше, чем в случае иммунизации нативной плазмидой pTKShi или плазмидой pTKShi, включенной в (ПЛ/АЛГ)3 микрокапсулы.

Благодарности

Автор выражает благодарность проф. Бартковиаку А. (Западнопомеранский университет, г. Щецин, Польша) за предоставленную возможность выполнения части экспериментальной работы в его лаборатории, проф. Кристиану Грандфису (Университет г. Льеж, Бельгия) за помощь в проведении исследования гемосовместимости образцов микрокапсул, проф. Г. Сухорукову (университет Королевы Марии, Лондон) за сотрудничество и помощь в освоении метода послойной адсорбции электролитов, д.х.н. Балышевой В.И и аспиранту Белову С. (ГНУ ВНИИ ветеринарной вирусологии и микробиологии, г. Покров) за помощь в проведении иммунологических исследований, проф. Бовину Н.В., м.н.с. Чинареву А.А. и м.н.с. Обуховой П.С. (ИБХ РАН, г. Москва) за предоставление гликоконъюгатов, плодотворное сотрудничество и постоянную помощь в обсуждении результатов работы, (ИБХ РАН, г. Москва), также руководителю диссертанционной работы д.х.н. Марквичевой Е.А. за постоянную поддержку и помощь.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата химических наук, Селина, Оксана Евгеньевна, Москва

1. Markvicheva Е. Bioencapsulation in polmer micro- and nanocarriers and applications in biomedical fields, In: Finely dispersed particles: micro-, nano-, and atto-engineering (Eds. Spasic A., Hsu J-P.) New-York: Marcel Dekker Inc., 2005. -P.853-868.

2. Galili U. Immune response, accommodation, and tolerance to transplantation carbohydrate antigens // Transplantation. 2004. - V.78. - P. 1093-1098.

3. Hughes R.A.C. Pathogenesis of Guillain-Barre syndrome / Hughes R.A.C., Hadden R.D.M., Gregson N.A., Smith K.J. // Journal of Neuroimmunology. 1999. - V.100. -P.74-97.

4. Лопаткин H.A., Лопухин Ю.М. Эфферентные методы в медицине. М.: Медицина, 1989.-352с.

5. Encke J. Genetic immunization generates cellular and humoral immune responses against the nonstructural protein of the hepatitis С virus in murine model / Encke J., Putlitz J., Geissler M. //Journal of Immunology. 1998. - V.161. - P.4917-4923.

6. Неотложная медицинская помощь / Под ред. Тинтиналли Дж.Э., Кроума Р.Л., Руиза Э. -М.: Медицина, 2001. 1016 с.

7. Ройт А., Бростофф Дж., Мейл Д. Иммунология. М.:Мир, 2000. - 529 с.

8. Малая медицинская энциклопедия / Под ред. Покровского В.И. М.: Медицина, 1996. - Т.4. - С.576.

9. Пирадов M.A. Синдром Гийена-Барре. M.: Интермедика, 2003. - 240 с.

10. Неврология / Под ред. Самуэльса М. М.: Практика, 1997. - 640 с.

11. Romano E.L. Neutralization of ABO blood group antibodies by specific oligosaccharides / Romano E.L., Soyano A., Linares J., Lauzon G.J. // Transplantation Proceedings. 1987. - V.19. - P.4426.

12. Neethling F.A. Delay of antibody-mediated rejection of pig heart transplants in baboons by continuos intravenous infusion with a-galactosyl oligosaccharide /

13. Neethling F.A., Simon P. M., Zopf D., Cooper D.K.C. // The Journal of Heart and Lung Transplantation. 1997. - V. 16. - P.59.

14. Koren E. Monoclonal anti-idiotypic antibodies neutralize cytotoxic effects of anti-aGal antibodies / Koren E., Milotec F., Neethling F.A., Koscec M., Fei D., Kobayashi Т., Taniguchi S., Cooper D.K.C. // Transplantation. 1996. - V.62. -P.837.

15. Abel J.J. On the removal of diffusible substances from the circulating blood living animals by dialysis / Abel J.J., Rowntree L.G., Turner B.B. // Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 1913-1914. - V.5 - P.275.

16. Abel J.J. Plasma removal with return of corpuscles (plasmapheresis) / Abel J.J., Rowntree L.G., Turner B.B. // Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 1913-1914. - Vol.5 -P.625.

17. Кирковский B.B., Мерзляков A.E., Ровдо И.М., Лабань Ф.Н. и др. Экстра- и интракорпоральные методы коррекции гомеостаза в клинической практике. Методические рекомендации. Минск, 1999. - 32 с.

18. М. Schneider. Plasmapheresis and immunoadsorption: Different techniq ies and their current role in medical therapy // Kidney International. Supplement. 1998. - V.64. -P.61-65

19. Chang T.M.S. Artificial Cells: Biotechnology, Nanomedicine, Regenerative Medicine, Blood Substitutes, Bioencapsulation, and Cell/Stem Cell Therapy. New Jersey: World Scientific, 2007. - 455 p.

20. Лопухин Ю.М., Молоденков M.H. Гемосорбция. М.: Медицина, 1978. - 288 с.

21. Костюченко А.Л. Эфферентная терапия. СПб.: ИКФ "Фолиант", 2000. - 432 с.

22. Chang T.M.S . Blood compatible coating of synthetic immunoadsorbents. Trans Am Soc Artif Intern Organs 1980, 26:546-549

23. Kupin W.L. Removal of lymphocytotoxic antibodies by pretransplant immunoadsorption therapy in highly sensitized renal transplant recipients / Kupin W.1., Venka К. К., Hayashi H., Mozes M.F., OH H.K.,Watt R. // Transplantation. -1991. V.51. - P.324-329.

24. Rieben R. Xenotransplantation: in vitro analysis of synthetic a-galactosyl inhibitors of human anti-Gala l—>3 Gal IgM and IgG antibodies / Rieben R., Bovin N.V., ICorchagina E.Y., Oriol. R. // Glycobiology. 2000. - V. 10. - P. 141-148.

25. WO 9842750. Antigenic fusionprotein carrying Galal,3Gal epitopes / Holgersson J. 1999.

26. Дин П., Джонсон У., Мидл Ф. Аффинная хроматография. Методы. М.: Мир, 1988.-278 с.

27. Коршак В.В., Штильман М.И. Полимеры в процессах иммобилизации и модификации природных соединений. М.: Наука, 1998. - 281 с.

28. М.И. Штильман. Полимеры медико-биологического назначения. М.: ИКЦ «Академкнига», 2006. - 400 с.

29. Peppas N.A., Moyniham H.J. Structure and Physical Properties of Poly(2-Hydroxyethyl Methacrylate) Hydrogels, In: Hydrogels in Medicine and Pharmacy (Ed. Peppas N.A.). Boca Raton, Florida: CRC Press, 1987. - V.3. - P.49-64.

30. Mack E.J., Okano Т., Kim Sung Wan. In: Hydrogels in Medicine and Pharmacy (Ed. Peppas N.A.). Boca Raton, Florida: CRC Press, 1987. - V.3. - P.65-93.

31. Alarcon J.B. DNA vaccines: technology and application as anti-parasite and antimicrobial agents / Alarcon J.B., Waine G.W., McManus D.P. // Advances in Parasitology. 1999. - V.42. - P.343-410.

32. Вакцинопрофилактика. Справочник для врачей / Под ред. В.К. Таточенко, Н.А. Озерецковского. -М.: Арико, 1994. 184 с.

33. Гендон Ю.З. Молекулярная генетика вирусов человека и животных. М.: Наука, 1975.-303 с.

34. Медуницын Н.В. Побочное действие вакцин // Иммунология. 1995. - №2. - С. 6-8.

35. Ulmer J.B. Vaccine manufacturing: challenges and solutions / Ulmer J.B., Valley U., Rappuoli R. // Nature Biotechnology. 2006. - V.24. - P. 1377-1383.

36. Robinson H.L. DNA vaccines for viral infections: basic studies and applications / Robinson H.L., Pertmer T.M. // Advances In Virus Research.- 2000.- V.55 P. 1-74.

37. Tang D. Genetic immunization is a simple method for eliciting an immune response / Tang D., Devit M., Johnston S.A. // Nature. 1992. - V.356. - P. 152-154.

38. Stiive O. DNA Plasmid Vaccination for Multiple Sclerosis / Sttive O., Eagar T.N., Frohman E.M., Cravens P.D. // Archives of Neurology. 2007. - V.64. - P.1385-1386.

39. Birnboim H.C. A rapid alkaline extraction procedure for screening recombinant plasmid DNA / Birnboim H.C., Doly J. // Nucleic Acids Research. 1979. - V.7. -P.1513-1523.

40. Birnboim, H.C. A rapid alkaline extraction method for the isolation of plasmid DNA // Methods in Enzymology. 1983. - V. 100. - P.243-255.

41. Paster W. In vivo plasmid DNA electroporation generates exceptionally high levels of epitope-specific CD8+ T-cell responses / Paster W., Zehetner M., Kalat M., Schuller S., Schweighoffer T. // Gene Therapy. 2003. - V.10. - P.717-724.

42. Weaver J.C. Theory of electroporation: A review Weaver J.C., Chizmadzhev Y. // Bioelectrochemistry and Bioenergetics. 1996. - V.41. - P.135-160.

43. Chang D.C. Changes in membrane structure induced by electroporation as revealed by rapid-freezing electron microscopy // Chang D.C., Reese T.S. // Biophysical Journal.-1990.-V.58.-P.1-12.

44. Weaver J.C. Electroporation— a general phenomenon for manipulating cells and tissues//Journal of cellular biochemistry. 1993.-V.51. P.426-435.

45. Томилин H.B., Глебов O.K. Генетическая трансформация клеток млекопитающих. Молекулярные и клеточные аспекты биотехнологии. Л.: Наука, 1986. — С.62-82.

46. Анализ генома. Методы / Под ред. К. Дейвиса. М.: Мир, 1990. - 246 с.

47. Албертс Б., Брей Д., Льюис Дж. и др. Молекулярная биология клетки. Т. 1-3. — М.: Мир, 1994/

48. Weiner D.B. Genetic vaccines / Weiner D.B., Kennedy R.C. // Scientific American. 1999. - V.281(l). -P.34-41.

49. Wolff J.A. Direct gene transfer into mouse muscle in vivo / Wolff J.A., Malone R.W., Williams P., Chong W., Acsadi G., Jani A., Feigner P.L. // Science. 1990. -V. 247. - P.1465-1468.

50. Mahato R.I., Takakura Y., Hashida M. Development of targeted delivery systems for nucleic acid drugs // Journal of Drug Targeting. 1997. - V.4(6). - P.337-357.

51. Lasic D.D. Liposomes: From Physics to Applications. NewYork: Elsevier Science Publishers, 1993.-555 p.

52. Saltzman W. M., Hong Shen, Brandsma J. L. DNA Vaccines, Second Edition. Methods and Protocols. Humana Press, 2006. - 384 p.

53. Grandfils C. Optimisation of poly(2-(dimethamino)ehtyl-methacrylate)-co-(ethylenglycol)/DNA complexes designed for cell transfection / Grandfils C., Emonds-Alt J. // Minerva Biotechnology. 2005. - P.237-243.

54. Perrie Y. Liposome-entrapped plasmid DNA: characterisation studies / Perrie Y, Gregoriadis G. // Biochimica et Biophysica Acta. 2000. - V. 1475(2). - P. 125-32.

55. Perrie Y. Liposome (Lipodine)-mediated DNA vaccination by the oral route / Perrie Y, Obrenovic M, McCarthy D, Gregoriadis G. // Journal of Liposome Research. -2002. V.12(l-2). - P.185-97.

56. Curiel D.T. Adenovirus enhancement of transferrin-polylysine-mediated gene delivery / Curiel D.T., Agarwal S., Wagner E., Cotten M. // Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 1991. - V.88. - P.8850-8854.

57. Han J.S. A Method of Limited Replication for the Efficient In Vivo Delivery of Adenovirus to Cancer Cells / Han J.S., Qian D., Wicha M.S., Clarke M.F. // Human Gene Therapy. 1998. - V.9(8). - P. 1209-1216.

58. Hunter E. Retrovirus envelope glycoproteins / Hunter E., Swanstrom R. // Current Topics in Microbiology and Immunology. 1990. - V.157. - P. 187-253.

59. Vile R.G. Retroviruses as vectors / Vile R.G., Russell S.J. // British Medical Bulletin. 1995. - V.51. - P. 12-30.

60. Kremer E.J. Adenovirus and adeno-associated virus mediated gene transfer / Kremer E.J., Perricaudet M. // British Medical Bulletin. 1995. - V.51. P.31-44.

61. Glorioso J.C. Development and application, of herpes simplex virus vectors for human gene therapy / Glorioso J.C., DeLuca N.A., Fink D.J. // Annual Review of Microbiology. 1995. - V.49. -P.675-710.

62. Yeh P. Advances in adenoviral vectors: from genetic engineering to their biology / Yeh P., Perricaudet M. // Journal of the Federation of American Societies for Experimental Biology 1997. -V.l 1. -P.615-623.

63. Fominaya J. Target cell-specific DNA transfer mediated by a chimeric multidomain protein. Novel non-viral gene delivery system / Fominaya J., Wels W. // Journal of Biological Chemistry. 1996. -V.271. - P. 10560-10568.

64. Findeis M.A. Ligand-based carrier systems for delivery of DNA to hepatocytes / Findeis M.A., Wu C.H., Wu G.Y. // Methods in Enzymology. 1994. - V.247. -P.341-351.

65. Moos T. Restricted transport of anti-transferrin receptor antibody (OX26) through the blood-brain barrier in the rat / Moos Т., Morgan E.H. // Journal of Neurochemistry. 2001. - V.79. - P. 119-129

66. Cheng P.-W. Lectin conjugate-directed gene transfer to airway epithelial cells / Cheng P.-W., Yin W. // Biochemical and Biophysical Research Communications. -1994. V.205. - P826-833.

67. Fisher K.J. The transmembrane domain of diphtheria toxin improves molecular conjugate gene transfer Fisher K.J., Wilson J.M. // Biochemical Journal. 1997. V.321. -P.49-58.

68. Morris M.C. A novel potent strategy for gene delivery using a single peptide vector as a carrier / Morris M.C., Chaloin Mery, J., Heitz F., Divita G. // Nucleic Acids Research. 1999. - V.27. P.3510-3517.

69. Budker V.G. Cell membranes as barriers for antisense constructions / Budker V.G., Knorre D.G., Vlassov V.V. // Antisense Research and Development. 1992. - V.2. -P.177-184.

70. Kaneda Y. Prevention of restenosis by gene therapy / Kaneda Y., Morishita R., Dzau V.J. //Annals of the New York Academy of Science. 1997. V.811. - P.299-308.

71. Jilek S. Composition and Surface Charge of DNA-Loaded Microparticles Determine Maturation and Cytokine Secretion in Human Dendritic Cells / Jilek S., Ulrich M., Merkle H.P., Walter E. // Pharmaceutical research. 2004. - V.21,№7. -P. 12401247.

72. Mok H. Direct plasmid DNA encapsulation within PLGA nanospheres by single oil-in-water emulsion method / Мок H, Park TG. // European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 2008. - V.68(l). - P. 105-111.

73. Atuah K.N. Encapsulation of plasmid DNA in PLGA-stearylamine microspheres: a comparison of solvent evaporation and spray-drying methods / Atuah K.N., Walter E. Merkle H.P., Alpar H.O. // Journal of microencapsulation. 2003. - V.20, №3. -P387-399.

74. US Patent 2730456. / Schleicher L., Green B.K., 1956.

75. Seiller M., Martini M.-C., Benita S. Cosmetic applications of vesicular delivery systems, In: Microencapsulation, Methods and Industrial Applications (Ed. Benita S.). New York: Marcel Dekker Inc., 1996- Chap. 18. - P587-632.

76. Functional Coatings by Polymer Microencapsulation / Edited by Ghosh S.K. -Weinheim: WILEY-VCH Verlag GmbH & Co, 2006. 357 p.

77. Dutta, P.K. Chitin and chitosan: Chemistry, properties and applications / Dutta, P.K., Dutta, J., Tripathi, V.S. // Journal of Scientific and Industrial Research. 2004. - V.63. P.20-31.

78. Хитин и хитозан. Получение, свойства и применение / Под ред. Скрябина К.Г., Вихоревой Г.А., Варламова В.П. -М.: Наука, 2002. 368 с.

79. Марквичева Е.А. Хитозан и его производные в биокапсулировании, Глава 6, В кн: Хитин и хитозан: получение, свойства и применение (Под ред. Скрябина К.Г., Вихоревой Г.А., Варламова В.П.). М: Наука, 2002. - С.315-326.

80. Nigalaye A.G. Investigation of prolonged drug release from matrix formulations of chitosan / Nigalaye A.G., Adusumilli P., Bolton A. // Drug Development and Industrial Pharmacy. 1990. - V.16. -P.449-67.

81. Chandy T. Chitosan matrix for oral sustained delivery of ampicillin / Chandy Т., Sharma C.P. // Biomaterials. 1993. - V14. -P.939-44.

82. Shu X.Z. A novel approach to prepare tripolyphosphate/chitosan complex beads for controlled release drug delivery / Shu X.Z., Zhu K.J. // International Journal of Pharmaceutics. 2000. - V.201. - P.51-8.

83. Марквичева Е.А. Культивирование клеток-продуцентов эндостатина в микрокапсулах на основе природных полисахаридов / Марквичева Е.А., Купцова С.В., Яровинский Ф.О., Суровой А.Ю. // Цитология. Т.43(9). -С.876-877.

84. Chang P.L. The in vivo delivery of heterologous proteins by microencapsulated recombinant cells / Chang P.L., Van Raamsdonk J.M., Hortelano G., Barsoum S.C., MacDonald N.C., Stockle T.L. // Trends in Biotechnology. 1999. - V. 2. - P. 7883.

85. Draget K.I. Alginate based new materials /Draget K.I., Skjak-Braek G., Smidsrod O. // International Journal of Biological Macromolecules- 1997 V.21. - P.47-55.

86. Glicklis R. Hepatocyte behavior within three-dimensional porous alginate scaffolds / Glicklis R., Shapiro L., Agbaria R., Merchuk J.C., Cohen S. // Biotechnology & Bioengineering. 2000. - V.67. - P.344-353.

87. Smidsrod O. Alginate as immobilization matrix for cells/ Smidsrod O., Skja'k-Вггек S. // Trends in Biotechnology. 1990. - V.8. - P.71-78.

88. Poncelet D., Markvicheva E. Microencapsuation and alginate. In: Microencapsulation of Food Ingredients (Ed. Per Vilstrup). London: Leatherhead Publishing Food RA, 2001. - P.215-223.

89. Draet K.I. Alginic acid gels-the effect of alginate chemical-composition and molecular weight/ Draet K.I., Brae G.S., Smidsrod O. // Carbohydrate Polymers. -1994.-V.25.-P.31-38.

90. Seo S.-J. Alginate microcapsules prepared with xyloglucan as a synthetic extracellular matrix for hepatocyte attachment // Seo S.-J., Akaike Т., Choi Y.-J., Shirakawa. M., Kang I.-K., Cho C.-S. // Biomaterials.- 2005.- V.26. P.3607-3615.

91. Madziva H. Alginate-pectin microcapsules as a potential for folic acid delivery in foods / Madziva H., Kailasapathy K., Phillips M. // Journal of Microencapsulation. -2005. V.22(4). - P.343-51.

92. Kulseng B. Transplantation of alginate microcapsules / Kulseng В., Skjak-Brask G., Ryan L., Andersson A., King A., Faxvaag A., Espevik T. // Transplantation. -1999.-V.67.-P.978-984.

93. George M. pH sensitive alginate-guar gum hydrogel for the controlled delivery of protein drugs / George M., Abraham Т.Е. // International Journal of Pharmaceutics. — 2007. V.335. -P.123-129.

94. Rastogi R. Alginate microspheres of isoniazid for oral sustained drug delivery / Rastogi R., Sultana Y., Aqil M., AH A., Kumar S., Chuttani K., Mishra A.K. // International Journal of Pharmaceutics. 2007. - V.334. - P.71-77.

95. Greer C.W. Enzymatic analysis of carrageenans: Structure of carrageenan from Eucheuma nudum / Greer C.W., Yaphe W. // Hydrobiologia. 1984. - V.116-117(1).-P.563-567.

96. Villanueva R.D. Fine chemical structure of carrageenan from the commercially cultivated kappaphycus striatum (sacol variety) (solieriaceae, gigartinales, rhodophyta) / Villanueva R.D., Montano M.N.E. // Journal of Phycology. 2003. -V.39. -P.513 -518.

97. Cote G.L., Ahlgren J.A. Kirk-Othmer encyclopedia of chemical technology. -New York: John Wiley & Sons, Inc., 1995 4th ed., V.16. - P.578-611.

98. Misaki A. Structure of the dextran of Leuconostoc mesenteroides B-1355 / Misaki A., Torii M., Sawai Т., Goldstein I. // Carbohydrate Research. 1980. -V.84. - P.272—285.

99. Jorgensen P.S. The Use of Dextran 70 as a Plasma Expander Increases the Intraoperative Bleeding in Total Hip Replacement // Clinical and Applied Thrombosis/Hemostasis. 1997. - V.3, №4, P.267-269.

100. Kapitulnik J. Clinical evaluation of Sephadex gel filtration in estimation of bilirubin binding in serum in neonatal jaundice / Kapitulnik J., Valaes Т., Kaufmann N.A., Blondheim S.H. // Archives Disease Child. 1974. - V.49(l 1). - P.886-894.

101. Elaine Т. Schenborn, Goiffon V. DEAE-Dextran Transfection of Mammalian Cultured Cells. In: Transcription Factor Protocols (Methods in Molecular Biology) (Ed. Tymms M.J.). New Jersey: Humana Press, 2008. - V. 130. - P. 147-153.

102. Benoit J.-P., Marchais H., Rolland H., Velde, V.V. Biodegradable microspheres, In: Advances in production technology (Eds. Benita S.). New York: Marcel Dekker, Inc., 1996. - P.35-72.

103. Thies C. A survey of microencapsulation processes, In: Advances in production technology (Eds. Benita S.). New York: Marcel Dekker, Inc., 1996. - P. 1-19.

104. Arshady R. Microspheres, microcapsules and liposomes, In: General concepts and criteria (Eds. Arshady R.). London: Citrus Books, 1999. - P.l 1-45.

105. Zyl A.J.P. Core/Shell particles containing liquid cores: Morphology prediction, synthesis and characterization / Zyl A.J.P., Sanderson R.D., de Wet-Roos D., Klumperman B. // Macromolecules. 2003. - V.36(23). - P.8621-8629.

106. Chambard G. Peculiarities in atom transfer radical copolymerization / Chambard G., Klumperman В., Brinkhuis R.H.G. // ACS Symposium Series. 2003. - V.854. P.180-192.

107. Chang T.M.S. Enzymes immobilized by microencapsulation: preparation and biomedical applications, In: Insolubilized Enzymes (Eds. Salmona M., Saronio C., Garattini S.). New York: Raven Press, 1974. - P.l5-27.

108. Bungenberg de Jong H.G. Crystallisation-coacervation-flocculation, In: Colloid Science, (Ed. Kruyt H.R.). Elsevier, 1949. - P.232-258.

109. De Kruif C.G. Complex coacervation of proteins and anionic polysaccharides / De Kruif C.G., Weinbreck F., de Vries R. // Current Opinion in Colloid & Interface Science . 2004. - V.9. - P.340-349.

110. Benoit J.-P. Method for encapsulating active substances by coacervation of polymers in non-chlorinated organic solvent / Benoit J.-P., Richard J., Fournier E., Liu S. // PCT Internatinal Application. 0,115,799. 2001.

111. Winters M.A. Precipitation of Proteins in Supercritical Carbon Dioxide / Winters M.A., Knutson B.L., Debenedetti P.G., Sparks H.G., Przybycien T.M., Stevenson C.L., Prestrelski S.J. // Journal of Pharmaceutical Sciences. 1996. - V.85. - P.586.

112. Brandenberger Н. Monodisperse particle production: a method to prevent dropcoalescence using electrostatic forces / Brandenberger H., Nussli D., Piech V., Widmer F. // Journal of Electrostatics. 1999. - V.45. - P.227-238.

113. Mumenthaler M. Feasibility study on spray-drying protein pharmaceuticals: Rhgh and t-pa / Mumenthaler M., Hsu C.C., Pearlman R. // Pharmaceutical Research. -1994. — V.l 1. — P.12-20.

114. Maa Y.-F. Spray-drying of air-liquid interface sensitive recombinant human growth hormone / Maa Y.-F., Nguyen P.-A.T., Hsu S.W. // Journal of Pharmaceutical Sciences. 1998. - V.87. - P. 152-159.

115. Lehmann K. In: Microcapsules and Nanoparticles in Medicine and Pharmacy (Ed. M. Donbrow). Boca Raton: CRC Press, 1992. -P.73-97.

116. US Patent 4,675,140. Method for coating particles or liquid droplets / Sparks R.E., Norbert M. 1987.

117. Fuoss R.M. Mutual Interaction of Polyelectrolytes / Fuoss R.M. Sadek H. // Science. 1949. - V.l 10, №2865. - P.552 - 554.

118. Michaels A.S. Polycation-polyanion complexes preparation and properties of poly-(vinylbenzyltrimethylammonium) poly-(styrenesulfonate) / Michaels A.S., Miekka R.G. //Journal of Physical Chemistry. 1961. - V.65. - P. 1765-1773.

119. Radtchenko I.L. Inorganic Particle Synthesis in Confined Micron-Sized Polyelectrolyte Capsules / Radtchenko I.L., Giersig M., Sukhorukov G.B. // Langmuir. -2002. V.l8(21). -P.8204-8202.

120. Gaponik N. Labeling of biocompatible polymer microcapsules with near-infrared emitting nanocrystals / Gaponik N., Radtchenko I.L., Gerstenberger M.R., Fedutik Y.A., Sukhorukov G.B., Rogach A.L. // Nano Letters. 2003. - V.3(3). -P.369-372.

121. Sukhorukov G.B. Stepwise polyalectrolyte assembly on particles surface: a novel approach to colloid design / Sukhorukov G.B., Donath E., Davis S., Lichtenfeld H.,

122. Caruso F., Popov V.I., Mohwald H. // Polymers for Advanced Technologies. 1998.- V.9(10-l 1). P.759-767.

123. Volodkin D.V. Matrix Polyelectrolyte Microcapsules: New System for Macromolecule Encapsulation / Volodkin D.V., Petrov A.I., Prevot M., Sukhorukov G.B. // Langmuir. 2004. - V.20. - P.3398-3406.

124. Volodkin D.V. Protein Encapsulation via Porous СаСОз Microparticles Templating / Volodkin D.V., Larionova N.I., Sukhorukov G.B. // Biomacromolecules -2004. V.5. -P.l962-1972.

125. Borodina T. Controlled Release of DNA from Self-Degrading Microcapsules / Borodina Т., Marcvicheva E., Kunizhev S., Mohwald H., Sukhorukov G., Kreft O. // Macromolecular Rapid Communications. 2007. - V.28. - P. 1894-1899.

126. Funduenanu G. Physico-chemical characterization of Ca-alginate microparticles produced by different methods / Funduenanu G, Nastruzzi C, Carpov A, Desbrieres J, Rinaudo M. // Biomaterials. 1999. - V.20. - P. 1427-35.

127. Draget K.I. Alginate based new materials / Draget K.I., Skjak-Braek G., Smidsrod O. // International Journal of Biological Macromolecules. 1997. - V.21.- P.47-55.

128. Taqieddin E. Enzyme immobilization in novel alginate-chitosan core-shell microcapsules / Taqieddin E., Amiji M. // Biomaterials. 2004. - V.25. - P.1937-1945.

129. Lee K.H. Immobilization of aminoacylase by encapsulation in poly 1-lysine-stabilized calcium alginate beads / Lee K.H., Lee P.M., Siaw Y.S. // Journal of Chemical Technology and Biotechnology. 1993. - V.57. - P.27-32.

130. Albarghouthi M. Immobilization of antibodies on alginate-chitosan beads / Albarghouthi M., Abu Fara D., Saleem M., El-Taher Т., Matalka K., Badwan A. // International Journal of Pharmaceutics. 2000. - V.206. - P.23-34.

131. Coppi G. Protein immobilization in crosslinked alginate microparticles / Coppi G., Iannuccelli V., Leo E., Bernabei M.T., Cameroni R. // Journal of Microencapsulation. 2002. - V.19. - P.37-44.

132. Smidsrod O. Alginate as immobilization matrix for cells / Smidsrod O., Skjak-Braek G. // Trends in Biotechnology. 1990. - V.8. - P.71-78.

133. Huguet M.L. Hemoglobin encapsulation in chitosan/calcium alginate beads / Huguet M.L., Groboillot A., Neufeld R.J., Poncelet D., Dellacherie E. // Journal of Applied Polymer Science. 1994. - V.51. - P. 1427-1432.

134. Rosen J.M. Preparation and preliminary characterization of purified ovalbumin messenger RNA from the hen oviduct / Rosen J.M., Woo S.L.O., Holder J.W., Means A.R., O'Malley B.W. // Biochemistry. 1975. - V. 14, № 1. -P.69-78.

135. Khraltsova L.S. An enzyme-linked lectin assay for al,3-galactosyltransferase / Khraltsova L.S., Sablina M.A., Melikhova T.D., Joziasse D.H., Gabius H.-J., Bovin N.V. // Analytical Biochemistry. 2000. - V 280. - P. 250-257.

136. Shilova N.V. High molecular weight neoglycoconjugates for solid phase assays / Shilova N.V., Galanina O.E., Pochechueva T.V., Chinarev A.A., Kadykov V.A., Tuzikov A.B., Bovin N.V. // Glycoconjugate Journal. 2005. - V.22. - P.43-51.

137. Bartkowiak A. // Hydrogel microcapsules containing natural and chemically modified oligochitosan mechanical properties and porosity / Bartkowiak A., Brylak W. // Polimery. - 2006. - V.51(7-8). - P.547-554.

138. Бовин H.B. Гликоконъюгаты на основе полиакриламида инструменты для изучения лектинов, антител, гликозилтрансфераз в гликобиологии, цитохимии и гистологии // Биоорганическая химия. - 1996. - Т.22, №9. - С.643-663.

139. Rieben R. Xenotransplantation: in vitro analysis of synthetic-galactosyl inhibitors of human anti-Gall3Gal IgM and IgG antibodies / Rieben R., Bovin N. V., Korchagina E. Y., Oriol. R. // Glycobiology. 2000. - V.10. - P. 141-148.

140. Zipfel P.F. The role of defective complement control in hemolytic uremic syndrome / Zipfel P.F., Misselwitz J., Licht C., Skerka C. // Seminars in Thrombosis and Hemostasis. 2006. - T.32, № 2. - С. 146-54.

141. ASTM: F 756-00. Standard practice for assessment of haemolytic properties of materials, American Society for Testing and Materials Designation.

142. Сюрин B.H., Б ел oy сова P.В., Фомина Н.В. Диагностика вирусных болезней животных: Справочник. — М.: Агропромиздат, 1991. 528 с.

143. Nishimura К. Immunological activity of chitin and its derivatives / Nishimura K., Nishimura S., Nishi N., Saiki I., Tokura S., Azuma I.//Vaccine.-1984.-V.2.-P.93-99.

144. Takashi M. Mechanism of macrophage activation by chitin derivatives // The Journal of veterinary medical science. 2005. — V.67. — P.51-56.

145. Chena C.-L. The effect of water-soluble chitosan on macrophage activation and the attenuation of mite allergen-induced airway inflammation / Chena C.-L., Wang Y.-M., Liu C.-F., Wang J.-Y. // Biomaterials. 2008. - V.29. - P.2173-2182.

Информация о работе

Селина, Оксана Евгеньевна
кандидата химических наук
Москва, 2009
ВАК 03.00.23

Диссертация

Включение антигенов и ДНК в биосовместимые полимерные микросферы для применения в биомедицине - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы