Вклад полиморфных вариантов генов-кандидатов сердечно-сосудистых заболеваний в фенотипическую изменчивость количественного содержания белков клеточных мембран при гипертонической болезни

Ушачёв, Дмитрий Владимирович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Вклад полиморфных вариантов генов-кандидатов сердечно-сосудистых заболеваний в фенотипическую изменчивость количественного содержания белков клеточных мембран при гипертонической болезни
ВАК РФ 03.02.07, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Вклад полиморфных вариантов генов-кандидатов сердечно-сосудистых заболеваний в фенотипическую изменчивость количественного содержания белков клеточных мембран при гипертонической болезни"

УШАЧЕВ Дмитрий Владимирович

ВКЛАД ПОЛИМОРФНЫХ ВАРИАНТОВ ГЕНОВ-КАНДИДАТОВ СЕРДЕЧНО-СОСУДИСТЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ В ФЕНОТИПИЧЕСКУЮ ИЗМЕНЧИВОСТЬ КОЛИЧЕСТВЕННОГО СОДЕРЖАНИЯ БЕЛКОВ КЛЕТОЧНЫХ МЕМБРАН ПРИ ГИПЕРТОНИЧЕСКОЙ БОЛЕЗНИ

03.02.07.-генетика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

- 1 ДЕН 2011

Белгород - 2011

Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Курский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации

Научный руководитель:

доктор медицинских наук,

профессор Полоников Алексей Валерьевич

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук,

профессор Щипков Валерий Петрович

доктор медицинских наук,

профессор Прощаев Кирилл Иванович

Ведущая организация:

Федеральное государственное учреждение «Российский кардиологический научно-производственный комплекс» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации

Защита диссертации состоится «22» декабря 2011 г. в 15.00 на заседании диссертационного совета Д 212.015.13 при ФГАОУ ВПО «Белгородский государственный национальный исследовательский университет» по адресу: 308015, г. Белгород, ул. Победы, д. 85.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Белгородского государственного университета по адресу: 308015, г. Белгород, ул. Победы,

д. 85.

Автореферат разослан « » 2011 г.

Ученый секретарь

совета по защите докторских и кандидатских диссертаций доктор биологических наук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы

1997]. У больных ГБ часто прослеживается отягощенный семейный анамнез по ССЗ, в том числе и АГ, тем самым, демонстрируя важную роль наследственных факторов в её развитии [Гинтер Е.К., 2003]. Значительную роль генетических факторов в развитии ГБ продемонстрирован и близнецовыми исследованиями [Шарандак А.П. и др., 2002].

Согласно современным представлениям, ГБ имеет многофакторную или мультифакториальную природу и относится к полигенным заболеваниям. К настоящему времени установлены уже сотни генов-кандидатов предрасположенности к ГБ, установлены многочисленные средовые факторы риска заболевания и описаны ранее неизвестные стороны его патогенеза [Бойцов, С. А. и др., 2003; Гуревич, М. А., 2009; Денисова Т.П., 2005; Елисеев А.О., 1987; Казеннов, A.M., 1990; Логинов В.А., 1990; Casari G. et al., 1995; Chowdhary S. et al., 2001; Corvol P., 2001; Siffert W. et al.,

1998]. Однако, несмотря на прогресс молекулярной генетики, по-прежнему, в мировом научно-медицинском сообществе отсутствует единое мнение о ведущих патогенетических механизмах, лежащих в основе стойкого хронического повышения уровня артериального давления.

Одной из подробно изученных и обоснованных является "мембранная концепция" этиопатогенеза ГБ, в основе которого лежат структурно-функциональные изменения плазматических мембран клеток, приводящие к нарушению трансмембранного транспорта катионов, контролирующих сосудистый тонус. "Мембранная концепция" этиопатогенеза ГБ, основные положения которой были исследованы учеными Ю.В. Постновым и С.Н. Орловым и обобщены в известной монографии [Постнов Ю.В.; Орлов С.Н.,

1987], оказалась способной объяснить многие противоречия различных точек зрения на молекулярные механизмы развития заболевания. За период с середины 70-х годов прошлого века до конца первого десятилетия 21 века проведено значительное количество исследований по изучению природы ионтранспортных нарушений при ГБ. В частности, была установлена взаимосвязь количественного содержания белков мембран эритроцитов с подверженностью гипертонической болезни [Емельянова О.Г., 1999]. Кроме того, был установлен значительный вклад генетических факторов в вариабельность белков клеточных мембран эритроцитов при ГБ [Емельянова О.Г., 1999; Ivanov V.P. et al., 2004]. Однако геномный источник "мембранных нарушений", по-прежнему, не установлен. Считается маловероятным, что при ГБ нарушения в геноме относятся к участкам, кодирующим структуру таких различных белковых молекул, как Na+/Na+- и Ма+/К+-переносчики, переносчики Са2+"АТФаза, а также мембранных белков, вовлеченных в регуляцию катион-транспортных процессов через плазматические мембраны [Котелевцев Ю.В., Постнов Ю.В., 1986].

Учитывая вышеизложенное, наиболее целесообразной является интегрированная оценка молекулярно-генетических и биохимических исследований, направленных на поиск и установление взаимосвязей между ДНК-полиморфизмом конкретных генов предрасположенности к ГБ и изменчивостью содержания белков мембран эритроцитов. Однако, до настоящего времени исследований, направленных на оценку вклада известных генов-кандидатов ССЗ в вариабельность количественного содержания основных белков мембран эритроцитов, не проводилось.

Цель исследования

Изучение вклада полиморфных вариантов генов-кандидатов сердечнососудистых заболеваний AGT, AGTR1, АСЕ, MLR, NOS3, GNB3, ADD1 и TGFB1 в фенотипическую изменчивость количественного содержания основных мембранных белков эритроцитов при гипертонической болезни.

Задачи исследования

1) Исследовать количественное содержание и характер взаимного варьирования основных мембранных белков эритроцитов в норме и при гипертонической болезни и установить факторы, определяющие совместное варьирование данного комплекса количественных признаков.

2) Проанализировать особенности количественного содержания белков мембран эритроцитов в зависимости от пола и наличия наследственной отягощенности по ГБ.

3) Изучить популяционные частоты полиморфизмов Т174М и М235Т гена AGT, 1166А/С гена AGTR1, I/D гена АСЕ, А4582С гена MLR, E298D и -786Т/С гена NOS3, G272S и С825Т гена GNB3, G460W гена ADD1 и R25P гена TGFB1 и исследовать их ассоциации с гипертонической болезнью.

4) Провести анализ взаимосвязи полиморфных вариантов генов AGT, AGTR1, АСЕ, MLR, NOS3, GNB3, ADD1 и TGFB1 и их парных сочетаний с

количественным содержанием мембранных белков эритроцитов при гипертонической болезни.

5) Оценить влияние полиморфных вариантов генов AGT, AGTR1, АСЕ, MLR, NOS3, GNB3, ADD1 и TGFB1 на вариабельность содержания основных мембранных белков эритроцитов и установить вклад исследуемых полиморфных генов в общую фенотипическую и полигенно обусловленную дисперсию количественных показателей.

6) Оценить совместное влияние основных мембранных белков эритроцитов и ДНК-полиморфизмов на риск возникновения ГБ и исследовать предиктивный потенциал исследуемых биохимических и молекулярно-генетических маркеров в отношении прогнозирования риска развития болезни.

Научная новизна исследования

В рамках исследования впервые проведен комплексный анализ влияния полиморфизма генов-кандидатов сердечно-сосудистых заболеваний AGT, AGTR1, АСЕ, MLR, NOS3, GNB3, ADD1 и TGFB1 на фенотипическую вариабельность количественного содержания основных мембранных белков эритроцитов при гипертонической болезни. Оценена степень вклада аллелей генов-кандидатов ССЗ в фенотипическую и полигенно обусловленную дисперсию мембранных белков эритроцитов при ГБ. Установлено, что исследованные гены объясняют значительную часть стенотипической изменчивости мембранных белков эритроцитов при гипертонической болезни. Впервые показано, что существенная доля вариабельности мембранных белков эритроцитов у больных ГБ обусловлена взаимодействием относительно небольшого числа факторов их совместной изменчивости, отражающих фенотипическую реализацию кодирующих их полигенных комплексов. Впервые выявлен половой диморфизм, проявляющийся не только в особенностях количественного содержания мембранных белков у мужчин и женщин, страдающих ГБ, но и значительные различия в характере генетической детерминации фенотипической изменчивости исследуемых показателен у представителей разного пола. Полученные в ходе настоящей работы результаты позволили глубже взглянуть на молекулярно-генетические механизмы, лежащие в основе мембранных нарушений при ГБ, и расширяют возможности доклинической оценки риска развития заболевания.

Научно-практическая значимость исследования

В связи с тем, что исследованные белки мембран эритроцитов и полиморфные гены оказались ценными предикторами при расчете индивидуального риска возникновения ГБ у мужчин и женщин, их совместная оценка с помощью разработанных статистических моделей может использоваться для прогнозирования вероятности развития болезни, как во

врачебной, так и в эпидемиологической практике при формировании среди населения групп повышенного риска возникновения ГБ. В этой связи результаты исследования могут быть востребованы при организации мероприятий по раннему выявлению и профилактике гипертонической болезни в популяции. Практическое использование статистических моделей дает возможность врачам-генетикам, терапевтам и кардиологам формировать группу повышенного риска ГБ, оптимизировать и индивидуализировать мероприятия по превентивной коррекции нарушений регуляции АД, что может способствовать снижению риска формирования ГБ в популяции. Результаты, полученные в ходе исследования, не только формируют представления о роли полиморфизма генов ССЗ в детерминации изменений количественного содержания белков мембран эритроцитов при ГБ, но и создают теоретическую основу для их внедрения в образовательный процесс. В частности, результаты исследования могут быть использованы при чтении специальных курсов по медицинской и клинической генетике, биохимии, патофизиологии, терапии, кардиологии в вузах медицинского профиля и на курсах повышения квалификации медицинских работников.

Положения, выносимые на защиту

1. Значительная доля вариабельности мембранных белков эритроцитов у больных ГБ обусловлена взаимодействием относительно небольшого числа факторов их совместной изменчивости, которые могут отражать феиотипическую реализацию кодирующих их полигенных комплексов, один из которых определяет почти 20% основного вектора количественных изменений белков эритроцитарных мембран при заболевании - снижение уровня аир спектринов и повышение содержания глюкозного транспортера.

2. Фенотипические эффекты аллелей исследованных полиморфизмов генов-кандидатов ССЗ в отношении изменчивости уровня основных мембранных белков эритроцитов модифицируются вследствие возможных аддитивных и эпистатических взаимодействий между исследованными локусами, а также различии в величинах их пенетрантности, и характеризуются неодинаковыми проявлениями у представителей разного пола.

3. Исследованные полиморфные варианты генов в совокупности вносили существенный вклад в феиотипическую изменчивость количественного содержания белков мембран эритроцитов при ГБ: величина вклада вариации по исследованным локусам в полигенно обусловленную дисперсию признаков достигала 64% (для глюкозного транспортера) у мужчин и 50% (для а-спектрина) у женщин, свидетельствуя о значимой роли известных кандидатных генов ССЗ в детерминации количественного дисбаланса мембранных белков эритроцитов, обнаруженных при заболевании.

4. Исследованные полиморфные гены и белки мембран эритроцитов являются ценными предикторами при расчете индивидуального риска

возникновения ГБ у мужчин и женщин и могут использоваться в качестве генетических и биохимических маркеров прогнозирования вероятности развития болезни при формировании среди населения групп повышенного риска возникновения ГБ.

Апробация работы и публикации

Материалы диссертационного исследования доложены на итоговых научных сессиях КГМУ и Центрально-Черноземного научного центра РАМН (2006, 2007, 2011), Российском национальном конгрессе кардиологов (2008), 2-ом съезде кардиологов Сибирского федерального округа (Томск, 2007), международной (российско-японо-американской) научно-практической конференции «Современные технологии и общая концепция профилактики и лечения сердечно-сосудистых заболеваний» (Хабаровск, 2007), 1-й и 2-й Российской научно-практической конференции с международным участием "Медико-биологические аспекты мультифакто-риальной патологии" (Курск, 2006, 2011), VI съезде "Российского общества медицинских генетиков" (Ростов, 2010) и ежегодной научной конференции Европейского общества генетики человека (Амстердам, 2011).

По материалы диссертации опубликовано 11 печатных работ, в т. ч. 5 - в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК Минобрнауки РФ для публикаций результатов диссертационных исследований по медицинским наукам.

Структура и объем диссертации

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, собственных результатов, обсуждения, выводов, практических рекомендаций, списка литературы и приложений. Работа изложена на 164 страницах машинописного текста, иллюстрирована 21 таблицей, 6 рисунками, содержит 9 приложений. Список литературы включает 253 источников: 88 отечественных и 165 зарубежных.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Материалом для исследования послужила популяционная выборка неродственных индивидов русской национальности, жителей Курской области, общей численностью 751 человек (371 мужчина и 380 женщин), из которых 235 пациентам с ГБ и 207 человек контрольной группы проводились молекулярно-генетические исследования. Биохимические исследования белков мембран эритроцитов проводились у всех пациентов. Диагноз ГБ подтверждался по критериям ВОЗ согласно рекомендациям ВНОК после исключения вторичных артериальных гипертензин (АГ) [Оганов Р.Г., Мамедов М.Н., 2008]. Критерием включения индивидов в контрольную группу были: систолическое АД <130 мм.рт.ст., диастолпческое

АД < 85 мм.рт.ст. при двух повторных измерениях, отсутствие стойких хронических заболеваний по данным субъективного обследования. Средний возраст больных ГБ (67 мужчин, 168 женщин) составил 47,8±9,6 лет, здоровых индивидов (75 мужчин, 132 женщин) - 45,9±11,2 лет. Группы больных ГБ и контроля были сопоставимы, как по полу, так и по возрасту (р>0.05).

Программа обследования включала в себя анкетирование по специально разработанным анкетам, включающим данные семейного анамнеза, общеклинического, лабораторно-инструментального

обследований. Для проведения молекулярно-генетических и биохимических исследований у всех обследуемых проводился забор венозной крови.

Выделение и отмывка мембран эритроцитов из цельной венозной кровн получали традиционным методом Beutler [Beutler, Е., 1985] и Dodge [Dodge, G.T. 1963]. Фракционирование мембранных белков эритроцитов проводилось с помощью электрофореза в полиакриламидном геле по методу Laemmli [Laemmli U.K, 1970] с незначительной модификацией.

Выделение геномной ДНК осуществляли из венозной крови стандартным двухэтапным методом фенольно-хлороформной экстракции [Маниатис Т. с соавт., 1984]. Пациентам проводилось генотипирование полиморфизмов генов-кандидатов ССЗ: G460W гена ADDI, G272S и С825Т гена GNB3, E298D и -786Т гена NOS3, Т174М и М235Т гена AGT, 1166А->С гена AGTR1,1/D гена АСЕ, А4582С гена MLR и R25P гена TGFfil) методами полимеразной цепной реакции (ПЦР) и рестрикционного анализа по методикам, опубликованным в литературе.

Для оценки характера взаимного варьирования количественного содержания белков мембран эритроцитов использовались методы многомерной статистики: корреляционный и кластерный анализ. Для выделения интегральных факторов, обусловливающих общую изменчивость мембранных белков эритроцитов, использовали метод главных компонент [Ким Дж.О. и др., 1989]. Генетический анализ количественных признаков включал изучение их ассоциаций с аллельными вариантами генов-кандидатов ССЗ, оценку средних эффектов аллелей в детерминации показателей, а также доли общей фенотипической и полигенной дисперсии, объясненной вариацией по исследованным локусам [Sing С., Davignon J., 1985]. Взаимосвязь между мембранными белками эритроцитов и молекулярно-генетическими маркерами изучали с помощью однофакторного и двухфакторного дисперсионного анализа, в рамках которого сравнивали средние значения количественных показателей в группах с разными генотипами и их парными сочетаниями. Для оценки соответствия распределений генотипов ожидаемым значениям при равновесии Харди-Вайнберга (РХВ) и для сравнения распределений частот генотипов и аллелей в выборках больных ГБ и контрольной группе использовали критерий х2 Пирсона [Вейр Б., 1995].

Для сравнения частот аллелей и генотипов между различными группами использовали критерий %2 с поправкой Йетса [Реброва О.Ю., 2003]. Метод бинарной логистической регрессии использовался для разработки прогностических статистических моделей для предсказания риска развития ГБ [Hosmer D.W. et al, 2000].

Проверку распределений количественных признаков на нормальность проводили с помощью критерия Колмогорова-Смирнова. Значения уровня значимости /><0,05 рассматривались как статистически значимые. Статистическая обработка данных проводилась на персональном компьютере с использованием программных пакетов Statistica 8.0 ("StatSoft") и MS Excel 2007.

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ Общая характеристика и вариабельность количественного содержания мембранных белков эритроцитов у человека в норме и при гипертонической болезни

В таблице 1 представлен сравнительный анализ количественного содержания мембранных белков эритроцитов в группах больных ГБ и контроля. Установлены статистически значимые различия между группами в количественном содержании 6 мембранных белков.

Таблица 1

Сравнительный анализ количественного содержания мембранных белков

эритроцитов в группах больных гипертонической болезнью и контроля

Мембранные белки эритроцитов Больные гипертонической болезнью (п=234) Контрольная группа (п=176) Критерий t (уровень значимости р)

X S.E. X S.E.

1 Спектрин а 106,25 1,85 119.21 2.42 4,32 (0,00002)

2 Спектрин (3 100,93 1.93 112,60 2,35 3,87 (0,0001)

3 Анкирин 2.1 31.96 0,72 31.09 1,00 0.70 (0,48)'

4 Анкирин 2.2 19,11 0,56 17.91 0,71 1.34 (0,18)

5 Анкирин 2.3 14,07 0,40 13,58 0,53 0.74 (0,46)

6 Белок п. 3 (АТБ) 199,87 1,93 196,29 2,70 1.08 (0,28)*

7 Белок п. 4.1 49,10 0,70 46,88 0,89 1,98(0,05)

8 Паллидин (п.4.2) 54,07 0,88 53,74 1,29 0,21 (0,83)'

9 Белок и. 4.5 (ГТ) 151,90 2,03 140,51 2,62 3,44 (0,001)'

10 Дематин (п.4.9) 26,54 0,52 26,96 0,65 0,51 (0.61)

И Актин (и.5) 54,80 0,80 51,80 0,91 2,47 (0,01)

12 Белок п. 6 (ГАФД) 34,80 0,66 36,92 0,88 1,92 (0,05)*

13 Тропомиозин (п.7) 42,77 0,85 43,20 1,08 0,32 (0,75)

14 Белок п. 8 (ГБТ) 23,12 0.89 24,51 0,98 1,05 (0,30)

* - представлены критерии 1 и уровень значимости р для раздельной оценки дисперсий мембранных белков вследствие их различий между группами

Так, у больных ГБ, в сравнении с контрольной группой, установлено сниженный уровень а-спектрина (/=4,32 р=0,00002), Р-спектрина (/=3,87 р=0,0001) и белка 6 (/=1,92 р=0,05), а также повышенный уровень белка 4.1 (/=1,98 р=0,05), белка 4.5 (/=3,44 р=0,001) и актина (/=2,47 р=0,01). Кроме того, между группами больных ГБ и контроля имели место различия в дисперсиях по анкирину 2.1, белку 3, паллидину, белку 4.5 и белку 6. Результаты сравнительного анализа количественного содержания мембранных белков эритроцитов в группах больных гипертонической болезнью и контроля в зависимости от пола представлены в таблице 2 (представлены только статистически значимые различия между группами).

Таблица 2

Статистически значимые различия в количественном содержании мембранных белков эритроцитов в группах больных гипертонической _болезнью и контроля в зависимости от пола _

Мембранные белки эритроцитов Больные гипертонической болезнью (п=82) Контрольная группа (п=75) Критерий / (уровень значимости р)

X Б.Е. X Б.Е.

МУЖЧИНЫ

1 Спектрин а 105,56 3,02 123,50 3,53 3,88 (0,0002)

2 Белок п. 4.5 (ГТ) 154,16 3,83 140,67 3,90 2,47(0,01)

ЖЕНЩИНЫ

1 Спектрин а 106.63 2,35 116,03 116,03 2,39 (0,02)

2 Спектрин р 100,66 2,54 114,35 114,35 3,40 (0,001)

3 Белок п. 4.5 (ГТ) 150,68 2,35 140.39 140,39 2,42 (0,02)*

4 Дематин (п.4.9) 26,17 0,61 28,26 28,26 2,00 (0,05)

5 Актин (п.5) 54.58 0,97 50.67 50,67 2,46 (0,01)

6 Белок п. 6 (ГАФД) 35,10 0,79 38,11 38,11 2,10 (0,04)*

* - представлены критерии / и уровень значимости р для раздельной оценки дисперсий мембранных белков вследствие их различий между группами

Было установлено, что у мужчин, страдающих ГБ, уровень а-спектрина (/=3,88, р=0,0002) был ниже, а белка полосы 4.5 (/=2,47 р=0,01) был выше, в сравнении с группой здоровых мужчин. У женщин, страдающих ГБ, уровни а-спектрина (/=2,39 р=0,02), р-спектрина (/=3,40 р=0,001), дематина (/=2,00 р=0,05) и белка полосы 6 (/=2,10 р=0,04), были ниже, а белка 4.5 (/=2,42 р=0,02) и актина (/=2,46 р=0,01) было выше, чем у женщин контрольной группы. Полученные данные свидетельствуют о значительной роли полового диморфизма в детерминации количественных изменений в содержании отдельных белков мембран эритроцитов при гипертонической болезни и обосновывает необходимость проведения дальнейших этапов статистического анализа раздельно у мужчин и женщин.

В рамках настоящей работы представлялось важным исследовать влияние наследственной отягощенности (НО) по гипертонической болезни на количественную представительность мембранных белков эритроцитов. Результаты сравнительного анализа количественного содержания мембранных белков эритроцитов в группах больных гипертонической болезнью и контроля в связи с наследственной отягощенностью по ГБ представлены в таблице 3. Сравнительный анализ у лиц без наследственной отягощенности по ГБ позволил выявить статистически значимые различия между группами по 3 мембранным белкам эритроцитов: у гипертоников уровень а-спектрина (7=2,80 р=0,01) был снижен в сравнении с контрольной группой, а количественное содержание белка полосы 4,5 (/=2,01 р=0,05) и тропомиознна (/=2,14 р=0,03) было повышено. У лиц с отягощенным семейным анамнезом по ГБ наблюдались различия по 6 мембранным белкам. Так, у больных ГБ количественное содержание а-спектрина (/=2,46 р=0,01), Р-спектрина (/=2,85 р=0,005) и белка полосы 6 (/=2,88 р=0,005) было снижено, в то же время, количественное содержание белков анкирина 2.2 (/=2,31 р=0,02), анкирина 2.3 (/=2,39 р=0,02) и белка полосы 4,5 (/=1,94 р=0,05) было повышено у больных ГБ в сравнении с контрольной группой. Таким образом, наследственная отягощенность по ГБ характеризуется более глубокими изменениями количественного содержания белков мембран эритроцитов у больных ГБ.

Таблица 3

Статистически значимые различия в количественном содержании мембранных белков эритроцитов в группах больных гипертонической болезнью и контроля с отягощенностью семейного анамнеза по ГБ

Мембранные белки эритроцитов Больные гипертонической болезнью (п=48) Контрольная группа (п=96) Критерий / (уровень значимости р)

X | Э.Е. X | Б.Е.

БЕЗ ОТЯГОЩЕННОГО СЕМЕЙНОГО АНАМНЕЗА

1 Спектрин а 103,52 3,85 118,49 3,25 2,80 (0,01)

7 Белок п. 4.5 (ГТ) 150,48 3.96 139,15 3,46 2,01 (0,05)

3 Тропомиозин (п.7) 47,47 2,21 42,15 1,37 2,14 (0,03)

С ОТЯГОЩЕННЫМ СЕМЕННЫМ АНАМНЕЗОМ

1 Спектрин а 107,15 2,45 118,73 4,30 2,46 (0,01)

2 Спектрин (3 100,28 2,39 112,96 3,82 2,85 (0,005)

4 Анкирин 2.2 20,10 0,68 17,00 1,28 2,31 (0,02)

5 Анкирин 2.3 15,03 0,51 12,70 0,90 2,39 (0,02)

9 Белок п. 4.5 (ГТ) 152,35 2,68 142,56 4,40 1,94 (0,05)

12 Белок п. 6 (ГАФД) 34,13 0,73 38,87 1,48 2,88 (0,005)*

С помощью факторного анализа, выполненного методом главных компонент, было установлено, что значительная доля совместного варьирования количественных характеристик мембранных белков эритроцитов (72,4% у мужчин и 71,0% у женщин) обусловлена взаимодействием пяти факторов (таблица 4). При этом структура главных компонент существенно отличалась у мужчин и женщин. В первый из 5 факторов у мужчин вошло 10 мембранных белков: 3 фракции анкиринов, аниотранспортный белок полосы 3, белок 4,1 и паллидин с большими отрицательными нагрузками, а также цитоскслетные белки актин и тропомиознн и ферменты ГАФД (белок 6) и GST (белок 8) с положительными нагрузками. Первый фактор у мужчин определял 27% изменчивости комплекса указанных выше мембранных белков эритроцитов. В первый из 5 факторов у женщин вошло 6 мембранных белков: 3 фракции анкиринов с большими отрицательными нагрузками, тропомиозин и ферменты ГАФД и GST с положительными нагрузками, аналогично обнаруженным у мужчин. Первый фактор у женщин определял около 24% изменчивости комплекса указанных выше мембранных белков эритроцитов. Структура второй главной компоненты практически не отличалась у мужчин и женщин. В данную компоненту у мужчин и женщин вошли с высокими отрицательными весами спектрины, а также с положительными нагрузками -белки 4,1 и 4,5. Примечательно, что данные мембранные белки характеризовались наибольшими отклонениями в их количественном содержании при ГБ. Второй фактор определял около 18% изменчивости комплекса указанных мембранных белков эритроцитов. Структура третьей ГК была представлена исключительно белками цитоскелета эритроцитов и принципиально отличалась у мужчин и женщин. Так, у мужчин третья компонента была обусловлена а-спектрнном и актином с отрицательными нагрузками, а также анкирин 2.3, дематином и тропомиозином с положительными весами. У женщин основной вклад в третью ГК с отрицательным знаком внесли тропомиозин и белок полосы 8, а также с высокой положительной нагрузкой - белок актин. В четвертую ГК у мужчин вошли с положительными весами паллидин, актин и белок полосы 6, у женщин - паллидин и дематин, но с отрицательными нагрузками. В структуру пятой ГК у мужчин вошли с отрицательными весами белок п. 4.1 и дематин, с положительной нагрузкой - 2.2 анкирин. У женщин в пятую ГК с высокой положительной нагрузкой вносил анионтранспортный белок (белок полосы 3).

Факторные нагрузки количественного содержания мембранных белков эритроцитов у больных ГБ

и характеристика главных компонент

Мембранные белки эритроцитов Мужчины Женщины

Фактор 1 Фактор 2 Фактор 3 Фактор 4 Фактор 5 Фактор 1 Фактор 2 Фактор 3 Фактор 4 Фактор 5

1 Спектрнн а -0,189 -0,692 -0,500 -0,109 -0,049 -0,363 -0,750 0,276 0,125 -0,048

2 Спектрин р -0,183 -0,751 0,032 -0,149 0,112 -0,315 -0,800 0,113 0,066 -0,263

3 Анкирин 2.1 -0,711 0,089 0.139 -0,277 0,178 -0,711 0,016 -0,141 0,179 -0,365

4 Анкирин 2.2 -0,676 0,124 0,384 0,122 0,440 -0,715 0,332 -0,383 -0,110 -0,076

5 Анкнрин 2.3 -0,723 0,256 0,450 0,030 0,204 -0,717 0,303 -0,328 -0,205 -0,073

6 Белок п. 3 (АТБ) -0,601 -0,297 -0,272 0,134 -0,115 -0,316 -0,017 0,059 0,117 0,875

7 Белок п. 4.1 -0,509 0,472 -0,148 0,108 -0,449 -0,353 0,467 0,361 0,005 -0,029

8 Паллидин (п.4.2) -0,576 -0,056 0,133 0,600 -0,158 -0,349 0,214 0,357 -0,643 0,006

9 Белок п. 4.5 (ГТ) 0,396 0,819 -0,044 -0,124 -0,068 0,362 0,774 -0,084 0,114 -0,071

10 Дематии (и.4.9) 0,171 -0,365 0,559 0,201 -0,520 0,096 -0,227 0,111 -0,798 0,095

11 Актин (п.5) 0,501 0,250 -0,424 0,437 0,348 0,317 0,315 0,638 0,306 -0,097

12 Белок- п. 6 (ГАФД) 0,467 -0,154 0,178 0,596 0,123 0,572 0,047 0,254 -0,3 и -0,252

13 Тропомиозин (п.7) 0,566 0,010 0,540 -0,258 -0,110 0,642 0,005 -0,480 -0,099 -0,111

14 Белок п. 8 (ГЭТ) 0,552 -0,412 0,323 0,006 0,255 0,540 -0,393 -0,411 -0,071 0,118

Собственное значение ГК 3,785 2,506 1,657 1,185 1,009 3,379 2,575 1,515 1,388 1,096

Доля объясненной общей вариации,% 27,0 17,9 11,8 8,5 7,2 24,1 18,4 10,8 9,9 7,8

Серые ячейки - выделены значения нагрузок более 0,400 - принятый в исследовании критерий для включения признака в интерпретацию ГК

Анализ взаимосвязи полиморфизма генов-кандидатов сердечнососудистых заболеваний с количественным содержанием мембранных белков эритроцитов при гипертонической болезни

Частоты аллелей полиморфизмов изученных генов-кандидатов сердечнососудистых заболеваний представлены в таблице 5.

Таблица 5

Частоты аллелей полиморфизмов генов-кандидатов ССЗ в исследованных группах

Ген Полиморфизм Аллели Частоты аллелей

Больные ГБ (п=205) Контрольная группа (п=207)

общ. муж. жен. общ. муж. жен.

ЛШ/ в460\У 460в 0,822 0,791 0,837 0,838 0,873 0,818

460\\' 0,178 0.209 0,163 0,162 0,127 0,182

ОМВЗ 02728 П2Ъ 0,963 0,948 0,971 0,942 0,947 0,939

272Б 0,037 0,052 0,029 0,058 0,053 0,061

С825Т 825С 0,666 0,672 0,663 0,705 0,653 0,735

825Т 0,334 0,328 0,337 0,295 0,347 0,265

МОБЗ Е2980 298Е 0,707 0,679 0,721 0,715 0,733 0,705

2980 0,293 0,321 0,279 0,285 0,267 0,295

-786Т/С -786Т 0,571 0,575 0,569 0,585 0,640 0,553

-786С 0,429 0,425 0,431 0,415 0,360 0,447

АвТ Т174М 174Т 0,844 0,806 0,862 0,845 0,867 0,833

174М 0,156 0,194 0,138 0,155 0,133 0,167

М235Т 235М 0,473 0,455 0,482 0,517 0,540 0,504

235Т 0,527 0,545 0,518 0,483 0,460 0,496

АвТЫ 1166 А—» С 1166А 0,725 0,776 0,701 0,768 0,820 0,739

1166С 0,275 0,224 0,299 0,232 0,180 0,261

АСЕ 1/0 I 0.505 0,545 0,486 0,490 0,533 0,466

0 0,495 0,455 0,514 0,510 0,467 0,534

КИЯ А4582С 4582А 0,402 0,409 0,399 0,449 0,420 0,466

4582С 0,598 0,591 0,601 0,551 0,580 0,534

ТОР(31 1125Р 25Я 0,941 0,955 0,934 0,932 0,900 0,951

25Р 0,059 0,045 0,066 0,068 0,100 0,049

При сравнении общих групп нами были выявлены статистически значимые различия между группами больных ГБ и контроля по двум полиморфизмам генов-кандидатов. Сравнительный анализ частот генотипов между контрольной группой и группой больных ГБ мужчин позволил установить, что генотип 235ТТ гена АСТ ассоциируется с повышенным риском развития ГБ у мужчин (011=2,33; 95%С1 1,06-5,12; р=0,03). Кроме того, носительство вариантных генотипов 460GW+460WW ассоциировалось с повышенным риском развития ГБ у мужчин (011=1,99; 95%С1 0,97-4,06; р=0,057). Генотип 1166АС гена АСТК! ассоциировался с повышенным

риском возникновения ГБ у женщин (СЖ=1,66; 95%С1 1,02-2,69; р=0,04). Таким образом, наблюдался отчетливый половой диморфизм в ассоциациях генов-кандидатов ССЗ с риском развития ГБ: у мужчин специфичность ассоциаций с предрасположенностью к ГБ проявлялась в отношении полиморфизмов в460\У гена Л1Ю1 и М235Т гена А ОТ, тогда как у женщин половой диморфизм характеризовался ассоциациями генотипа 1166А/С гена

лвтт.

Расчет эффектов аллелей генов-кандидатов ССЗ на количественные характеристики мембранных белков эритроцитов показал, что практически все исследованные нами гены в той или иной степени влияют на варьирование данных биохимических показателен. Однако в большинстве случаев эффекты аллелей анализируемых генов для количественных показателей мембранных белков эритроцитов были относительно невысокими, о чем свидетельствовала степень отклонения величин признаков в группах носителей определенного аллеля от среднего в популяции значения. Практически во всех случаях имели место различающиеся влияния аллелей на вариабельность количественного содержания мембранных белков эритроцитов у мужчин н женщин. В качестве примера можно привести расчеты средних эффектов аллелей полиморфизмов генов ЛШ/ и ЖШ на вариабельность количественного содержания мембранных белков эритроцитов у больных ГБ (рисунок 1). Наиболее выраженные эффекты вариантного аллеля 460\У гена А001 установлены в отношении изменчивости количественного содержания спектринов, анкирина 2.1, белка п. 4.5, дематина и белка п. 8 у мужчин и спектринов, анкирина 2.2, белка п. 3, белка п. 4.5, актина, дематина и белка п. 8 у женщин. Обнаружены также различия в направленности эффектов аллеля 460\¥ гена уШ£>7 в отношении отдельных мембранных белков эритроцитов между мужчинами и женщинами: аллель 4600 у мужчин повышала, а аллель 460понижала количественное содержание спектринов от среднепопуляционного значения, в то время как у женщин аллель 460\У усиливала фенотипическое выражение признака, а аллель 460в ослабляла. Разнонаправленность влияния аллельных вариантов полиморфизма С460\У гена АВП1 обнаружена также в отношении вариабельности белка п. 4.5 (глюкозный транспортер). Так, аллель 460\¥ у мужчин повышала, а аллель 460в понижала количественное содержание белка п. 4.5 от среднепопуляционного значения, в то время как у женщин аллель 460\¥ ослабляла фенотипическое выражение признака, а аллель 460й усиливала. Наиболее выраженные эффекты аллелей полиморфизма Е29Ш гена N033 установлены в отношении изменчивости количественного содержания Р-спектрина, анкирина 2.1, белка п. 3, белка п. 4.5, актина, белков полос 6 (ГАФД) и 7 (тропомиозин) у мужчин, спектринов и белка п. 4.5 у женщин. У мужчин аллель 298Е повышала количественное содержание а-спектрина относительно его среднепопуляционного значения, в то время как аллель 2980 практически нейтрален в отношении фенотипического эффекта на

выражение данного показателя. У женщин аллель 298Е снижала, а аллель 2980 повышала количественное содержание обеих субъединиц спектринов. Кроме того, у мужчин оба аллельных варианта 298Е и 2980 гена N083 снижали количественное содержание глюкозного транспортера; у женщин аллель 298Е усиливала, аллель 2980 ослабляла фенотипнческое выражение данного признака. У мужчин аллели 298Е и 2980 повышали количественное содержание анионтранспортного белка п. 3, а у женщин такие эффекты отмечены не были. Разнонаправленные эффекты аллелей 298Е и 2980 наблюдались у мужчин в отношении вариабельности актина, глицеральдегид-фосфатдегидрогеназы и тропомиозина. У женщин, за исключением спектринов и белка п. 4.5, аллельные варианты 298Е и 2980 гена N033 не оказывали ощутимого влияния на количественное содержание белков мембран эритроцитов у больных ГБ.

Рисунок 1

Средние эффекты аллелей полиморфизмов генов ADDI и N0S3 в детерминации межиндивидуальной вариабельности количественного содержания мембранных белков эритроцитов у больных ГБ

Средние эффекты аллелей - степень обусловленного носнтельством определенного аллеля отклонения величины количественного содержания мембранных белков эритроцитов от среднего в популяции значения, ц - средние (популяционные) значения содержания мембранных белков эритроцитов (слева представлены графики у мужчин, справа - у женщин).

Таким образом, было установлено, что полиморфные варианты генов-кандидатов ССЗ оказывали плейотропное влияние на количественное содержание мембранных белков эритроцитов у больных ГБ. Причем степень и направленность фенотипических аллелей генов ССЗ в отношении вариабельности количественного содержания мембранных белков эритроцитов у больных ГБ была неодинаковой у мужчин и женщин.

Анализ ассоциаций полиморфизмов генов-кандидатов ССЗ и их парных сочетаний с мембранными белками эритроцитов с помощью дисперсионного анализа

С помощью одно- и двухфакторного дисперсионного анализа (таблицы 6 и 7) выявлены ассоциации полиморфных вариантов генов-кандидатов ССЗ и их парных сочетаний практически со всеми мембранными белками эритроцитов у представителей различного пола. Для оценки степени полученных взаимосвязей полиморфизмов генов-кандидатов ССЗ и их сочетаний с количественной вариабельностью мембранных белков эритроцитов использовали коэффициент детерминации Я2, величина которого варьировала от 9,7% до 26,1% у мужчин и от 5,8% до 10,7% у женщин. В ряде случаев полученные ассоциации можно интерпретировать исходя из эффекта "доминирования" одного из аллелей полиморфизма. Интересным является тот факт, что в парных сочетаниях полиморфизмы влияли на количественное содержание мембранных белков эритроцитов, с которыми они не были связаны по отдельности. В то же время, в некоторых случаях эффект одного полиморфизма в сочетании с другим локусом нивелировался (феномен эпистаза). По всей видимости, эти особенности можно объяснить суммацией эффектов отдельных полиморфных генов: совпадение направлений действия аллельных вариантов усиливала их влияние на признак, разнонаправленность -нивелировала. Другими словами, фенотипические эффекты аллелей различных полиморфных генов в отношении вариабельности изучаемых количественных признаков могут варьировать по причине эпистатичесшх взаимодействий между локусами и/или различий в величинах их пенетрантности.

Вклад каждого из исследованных парных сочетаний полиморфных вариантов генов-кандидатов ССЗ в вариабельность количественного содержания белков мембран эритроцитов был неодинаков: для одних полиморфизмов установлено наибольшее число ассоциация с изучаемыми количественными признаками, для других - специфические ассоциации с определенными мембранными белками. Как видно из представленных в таблицах 6 и 7 данных, вклад парных сочетаний полиморфных генов-кандидатов ССЗ в вариабельность мембранных белков эритроцитов у мужчин превышал таковой у женщин, как по числу, так и по выраженности. Полученные данные свидетельствовали о достоверном, но сравнительно небольшом вкладе отдельных полиморфных вариантов генов-кандидатов ССЗ и их парных сочетаний в вариабельность количественного содержания мембранных белков эритроцитов при гипертонической болезни.

Таблица 6

Ассоциации полиморфизмов генов-кандидатов ССЗ и их парных сочетаний с количественными характеристиками белков мембран эритроцитов у мужчин больных гипертонической болезнью (р<0.05)

ДНК-полиморфизмы ADD1 G460W GNB3 G814S GNB3 С825Т NOS3 E298D NOS3 -786Т/С AGT Т174М AGT М235Т AGTR1 1166А/С АСЕ I/D MLR А4582С TGFB1 R25P

ADD1 G460W 4.9,5 6 4.1 4.9 2.3

GNB3 G814S 4.9,5 2.2,6 7 8

GNB3 С825Т 2.3 2.2,4.1,6 7 2, 4.5 2.2, 2.3, 5 2.1, 2.3, 4.9,6 2.3, 5 5

NOS3 E298D 6 2.2,6 2.2, 4.1,6 2.2,3. 4.1,6 2.2,6 2, 2.2, 4.1,6 2, 2.2, 6 6 2.2,6 2.2,6 2.2, 3, 6, 7

NOS3-786Т/С 7 7 2.2,6 2,3, 7 4.9 4.1

/ЮГТ174М 4.1 2, 4.5 2, 2.2, 4.1,6 2, 3,7 3,7 2,2.2, 3, 7,8 2 2.2,7 4.1 2,7

AGT М235Т 8 2.2, 2.3, 5 2, 2.2, 6 2, 2.2, 3, 7,8 2, 2.2,8 2, 2.3, 8 2.2,8 8 2, 2.2, 8

AGTR1 1 166А/С 4.9 2.1,2.3, 4.9,6 6 4.9 2 2, 2.3, 8 2.1

АСЕ I/D 2.3 2.3,5 2.2,6 2.2,7 2.2,8 6

А4582С 5 2.2,6 4.1 8 4.1

TGFB1 R25P 2.2, 3, 6, 7 4.1 2,7 2, 2.2,8 6

В центральной диагонали результаты однофакторного дисперсионного анализа, остальные ячейки - результаты двухфакторного дисперсионного анализа.

Ассоциации полиморфизмов генов-кандидатов ССЗ и их парных сочетаний с количественными характеристиками белков мембран эритроцитов у женщин больных гипертонической болезнью (р<0.05)

ДНК-полиморфизмы лэт 0460W аывз 08148 СЫВЗ С825Т N083 Е29Ш N053 -786Т/С АСТ Т174М АСТ М235Т АСТМ 1166А/С АСЕ 1Ю МШ А4582С ТСРВ1 Я25Р

АОВ1 С460\¥ 8 6 1,2

вЫВЗ 08145 8 2,4.5 1,3, 4.5 1,2,4.5, 4.9,8 1,2,3, 4.9, 7, 8 4.9 2, 4.9 8

ОЫВЗ С825Т 6 1,3,4.5 1,2.2,6 1,2, 4.5 1,2,7 1

N0.43 Е2980 1,2 1,2, 4.5, 4.9,8 1,2, 4.5 2,4.5 7 2, 4.5 2 8 2, 2.2, 4.5 4.5

те -786Т/С 1,2, 3, 4.9, 7,8 1,2,7 7 1,2,7 2 7

АСТ Т174М 2, 4.5 8

Авт М235Т 4.9 2 4.9 2.3

АСТЯ1 1166 А/С 2, 4.9 8 4.9

АСЕ 1/0 2, 2.2, 4.5 2

Ш А4582С 8 4.5 8 2.3

ТСГВ/ К25Р 1 7

В центральной диагонали результаты однофакторного дисперсионного анализа, остальные ячейки - результаты двухфакторного дис персиоиного анал иза.

Оценка общей фенотипичеекой дисперсии количественного содержания белков мембран эритроцитов, обусловленной изменчивостью комплекса полиморфных генов-кандидатов ССЗ

Доля фенотипичеекой изменчивости анализируемых количественных признаков, объясненная различиями в аллельном и генотипическом составе по каждому исследованному локусу, существенно варьировала для различных белков мембран эритроцитов. Значительный вклад (более 10% общей вариации признаков) в фенотипическое разнообразие анализируемых количественных признаков установлен для целого ряда локусов, как у мужчин, так и у женщин. Примечательно, что наиболее выраженный вклад генетической компоненты (О) по каждому исследованному генному локусу установлен в отношении вариабельности мембранных белков, характеризующихся существенными отклонениями их количественного содержания при ГБ, а именно а- и (5- спектринов, а также белка п. 4,5. Это может свидетельствовать о значимом вкладе известных кандидатных генов ССЗ в детерминацию изменений количественного содержания белков мембран эритроцитов при заболевании.

Нами были рассчитаны доли фенотипичеекой и полигенной дисперсии количественных характеристик мембранных белков эритроцитов у больных ГБ, объясненные разнообразием по совокупности исследованных полиморфных вариантов генов-кандидатов гипертонической болезни (таблица 8). Полученные по такому алгоритму оценки генетической компоненты в для отдельных признаков варьировали от 1,9% для анкирнна 2.3 до 47,6% для глюкозного транспортера у мужчин и от 0,7% для анкирина 2.3 до 27,0% для а-спектрина у женщин. Для оценки доли полигенной дисперсии количественного содержания мембранных белков эритроцитов у больных ГБ, объясненной разнообразием по совокупности исследованных локусов, использовали коэффициенты наследуемости анализируемых признаков, рассчитанные на основе усредненных коэффициентов генетических корреляций между родственниками первой степени родства в семейной выборке больных ГБ, исследованной ранее на кафедре биологии, медицинской генетики и экологии Курского государственного медицинского университета [Гуапоу У.Р. ^ а1., 2004]. Доля вклада изменчивости по анализируемым полиморфным генам-кандидатам ГБ в общей полигенной дисперсии признаков (Ср£!) составила от 3,9% для дематина до 64,4% для глюкозного транспортера у мужчин и от 1,1% для белка п.4.1 до 50,3% для а-спектрина у женщин. Как видно из таблицы 8, в подавляющем большинстве случаев средневзвешенная доля объясненной общей фенотипичеекой и полигенной дисперсии у мужчин значительно выше, чем у женщин. Причем сохранялись сходные пропорции между данными величинами внутри групп одного пола: как у мужчин, так и у женщин, максимальные значения

Доля (в %) общей фенотипической и полигенной дисперсии количественного содержания мембранных белков эритроцитов у больных ГБ, объясненная разнообразием по совокупности исследованных полиморфных вариантов генов-кандидатов ССЗ

Компоненты дисперсии Спектрин а Спектрин р Анкирин 2.1 Анкирин 2.2 Анкирин 2.3 Белок п. 3 Белок п. 4.1 | Паллидин Белок п. 4.5 Дематин Актин Белок п. 6 Тропомиозин Белок п. 8

Мужчины в 24,35 29,39 6,86 4,26 ¡,90 36,82 4,02 4,43 47,55 3,08 4,59 4,55 12,07 10,29

А 15,62 20,44 4,94 2,65 1,24 17,23 2,25 3,02 33,03 1,55 2,40 2,74 5,76 6.21

О 8,73 8,95 1,92 1,61 0,66 19,60 1,77 1,41 14,51 1,53 2,19 1,81 6,31 4,08

47,20 49,22 9,33 6,59 7,24 41,75 4,52 23,18 64,43 3,85 9,34 5,62 16,33 20,57

Женщины в 26,99 23,20 1,79 1,85 0,71 12,02 0,99 2,56 23,12 1,11 1,79 2,21 2,65 3,70

А 20,20 19,07 1,00 1,05 0,44 6,94 0,57 1,59 15,56 0,45 1,25 1,70 0,57 2,08

Э 6,79 4,13 0,79 0,80 0,26 5,08 0,42 0,97 7,57 0,66 0,54 0,51 2,09 1,62

СРв ! 50,31 38,87 2,44 2,87 2,69 13,63 1,11 13,42 31,33 1,39 3,64 2,73 3,59 7,39

Ь2, % 51,6 59,7 73,5 64,6 26,2 88,2 88,9 19,1 73,8 79,9 49,1 80,9 73,9 50,0

в - доля общей фенотипической дисперсии белков мембран эритроцитов, объясненная генотипическими различиями по исследованным локусам; А и О - аддитивная и доминантная компоненты О; ОрБ - вклад генотипической вариансы, определяемой различиями по исследованным локусам, в полигенно обусловленную дисперсию признаков, )г - коэффициент наследуемости белков мембран эритроцитов у больных ГБ, рассчитанный на основе усредненных коэффициентов генетических корреляций между различными классами родственников по исследуемым количественным признакам [К'апоу У.Р. й а!., 2004].

доли общей фенотипичеекой и полигенной дисперсии, связанной с разнообразием по исследованным генам-кандидатам ССЗ, относились к таким мембранным белкам эритроцитов как: а и ß субъединицы спектринов, анионтранспортный белок и глюкозный транспортер. Указанные мембранные белки в совокупности составляли подавляющую часть всех протеинов в структуре клеточной мембраны эритроцита. Что касается мембранных белков, количественное содержание которых претерпевало изменение при ГБ, следует отметить, что у мужчин и женщин количественное содержание спектринов и глюкозного транспортера в наибольшей степени детерминировано изменчивостью по исследованным генам-кандидатам заболевания. В то же самое время, совокупная доля генотипической дисперсии дематина, актина и белка п. 6 (их количественное содержание изменяется при ГБ), объясненная различиями по комплексу исследованных генных локусов, составляло 18,8% у мужчин и 7,8% у женщин.

Таким образом, полученные результаты свидетельствовали о том, что изученные гены-кандидаты ССЗ вносят достаточно ощутимый вклад в изменчивость количественного содержания основных мембранных белков эритроцитов. Сила этого влияния оказалась не одинаковой для различных полиморфных генов в отношении изменчивости отдельных белков мембран эритроцитов у больных ГБ. В целом, мембранные белки, претерпевающие количественные изменения при ГБ, находятся под наиболее выраженным контролем со стороны комплекса генных локусов, имеющих патогенетическое значение для развития заболевания.

Прогнозирование риска возникновения гипертонической болезни с использованием изученных биохимических и молекулярно-генетических маркеров

Влияния биохимических и молекулярно-генетических маркеров на риск развития ГБ оценивались с помощью бинарной логистической регрессии, которая позволяла построить статистическую модель для прогнозирования вероятности заболевания [Hosmer D.W., Lemeshow S., 2000]. Результатом логистического регрессионного анализа являлся расчет оценок регрессионных коэффициентов bo, bh /ъ, ...^уравнения [Реброва О.Ю., 2003]:

Y=b0+b,X1 + b2X2+...biXh где Х/...Xi - прогностически ценные независимые (объясняющие) признаки (в нашем случае это исследуемые белки мембран эритроцитов и полиморфизмы генов-кандидатов ССЗ). С использованием метода пошагового включения предикторов и расчета отношения правдоподобия были оценены все возможные сочетания биохимических и молекулярно-генетических маркеров с целью поиска наилучшей статистической модели, предсказывающей риск развития ГБ. Учитывая половой диморфизм выявленных взаимосвязей биохимических и молекулярно-генетических маркеров с развитием ГБ, моделирование проводилось раздельно у мужчин и у женщин. Среди всех оцененных моделей статистических моделей наиболее прогностически ценной в отношении риска развития ГБ у мужчин была

модель, включающая следующие предикторы: полиморфизм С460\У гена АОШ, полиморфизм М235Т гена АйТ, уровень а-спектрина и паллидина (точное значение р для модели в целом составило р=0,001). Предикторы и параметры логистической регрессионной модели представлены в таблице 9.

Таблица 9

Логистическая регрессионная модель прогнозирования риска возникновения гипертонической болезни у мужчин на основании биохимических

и молекулярно-генетических маркеров

Независимые (объясняемые) признаки (А1}) и их градации Регрессионные коэффициенты, Уровень значимости (р) для Ь

0. Интерцепт (константа) 1,824 0,29

1.Л1Ш7С460\У( 1,2,3) -1,0128 0,05

2. ¿ЮГМ235Т (1,2,3) -0,743 0,03

3. а-спектрин (количество) 0,021 0,02

4. Паллидин (количество) -0,037 0,05

Папаметоы лог-петессионной модели:

Уровень значимости модели в целом р=0,001 (%2=17,4; ¿//=4, 011-2,95); Процент правильной классификации: больные ГБ - 72,5%, здоровые -52,8%.

Как видно из таблицы 9, уровни значимости коэффициентов регрессии для всех предикторов были <0,05, т.е. каждый из них оказывал статистически значимое влияние на риск возникновения ГБ у мужчин. Величина отношения шансов для представленной регрессионной модели составила 2,95, демонстрируя, что при увеличении на единицу значения /-го признака шанс возникновения болезни у мужчин увеличивается почти в 3 раза. Указанная модель корректно предсказывала среди мужчин в 73% случаев вероятность возникновения ГБ и в 53% случаев правильно классифицировала здоровых лиц.

Параметры логистической регрессионной модели у женщин представлены в таблице 10. Среди всех оцененных статистических моделей наиболее прогностически ценной в отношении риска развития ГБ у женщин была модель, включающая только биохимические предикторы: а-спектрин, паллидин и белок п. 6 или глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназу (точное значение р для модели в целом составило р=0,0002). Величина отношения шансов для представленной регрессионной модели составляла 19,7, демонстрируя, что при увеличении на единицу значения /-го признака шанс возникновения ГБ у женщин увеличивается более чем в 7 раз. Указанная модель корректно предсказывает в 91% случаев вероятность возникновения ГБ у женщин и в 41% случаев правильно классифицирует здоровых женщин.

Таким образом, учитывая относительно высокий прогностический потенциал каждой из моделей в отношении риска развития ГБ, оцененный по значениям специфичности и чувствительности, они могут использоваться для формирования среди пациентов группы риска развития ГБ и проводить среди

них лечебно-профилактические мероприятия по предупреждению развития болезни. Разработанные модели можно использовать для выявления среди населения лиц, предрасположенных к ГБ при медико-генетическом консультировании. Кроме того, учитывая значимую роль исследованных биохимических и молекулярно-генетических маркеров в формировании предрасположенности к ГБ представляется целесообразным внедрение биохимического исследования количественного содержания белков мембран эритроцитов совместно с генетическим тестированием полиморфизма генов-кандидатов ССЗ (ЛБО! в460\У, ЛОТ М235Т) в работу врачей генетиков и кардиологов в качестве диагностического инструмента для доклинического выявления возможного риска развития гипертонической болезни.

Таблица 10

Логистическая регрессионная модель прогнозирования риска возникновения гипертонической болезни у женщин на основании биохимических и молекулярно-генетических маркеров

Независимые (объясняемые) признаки (X,) и их градации Регрессионные коэффициенты, Ь1 Уровень значимости (р) для 6,

0. Интерцепт (константа) -5,786 0,000002

1. а-спектрин (количество) 0,0169 0,003

2. Паллидин (количество) 0,0286 0,04

3. Глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа (количество) 0,050 0,004

Параметры лог-регрессионной модели: Уровень значимости модели в целом р=0,0002 (х,2=19,7; с!/=3, О[1=7.39); Процент правильной классификации: больные ГБ — 91,4%, здоровые -40,9%.

ВЫВОДЫ

1. У больных гипертонической болезнью, в отличие от здоровых индивидов, установлены отклонения в количественном содержании, а также в характере взаимного варьирования главных периферических (спектринов, актина, дематина и глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы) и интегральных белков (глюкозотранспортного белка) плазматических мембран эритроцитов, которые имели различную степень фенотипического выражения у мужчин и женщин. У женщин, страдающих ГБ, в отличие от мужчин, а также у пациентов с наследственной отягощенностыо по ГБ обнаружены наиболее глубокие изменения анализируемых показателей количественного характера.

2. С помощью факторного анализа, проведенного методом главных компонент, показано, что значительная доля совместной изменчивости мембранных белков эритроцитов у больных ГБ обусловлена действием пяти факторов. При этом, несмотря на сходные величины объясняемой влиянием данных факторов совместной изменчивости изучаемых признаков (72% у мужчин и 71% у женщин), структура и направленность фенотипических

эффектов главных компонент в отношении вариабельности мембранных белков эритроцитов существенно отличалась у мужчин и женщин.

3. Установлено, что все исследованные нами полиморфные варианты генов-кандидатов ССЗ в той или иной степени оказывали влияние на количественное содержание белков мембран-эритроцитов. В большинстве случаев фенотипические эффекты аллелей исследованных генов на вариабельность мембранных белков оказались умеренно выраженными и в ряде случаев (для С460\У гена ЛОВ1, -786Т/С гена N083, М235Т и Т174М гена ЛОТ, 1Д) гена АСЕ) характеризовались разнонаправленностыо действия у мужчин и женщин, о чем свидетельствовали степень и направление отклонений величин анализируемых признаков в группах носителей альтернативных аллелей от средних в популяции значений.

4. Применение одно- и двухфакторного дисперсионного анализа позволило выявить особенности эффектов изолированного и совместного действия аллелей исследуемых ДНК-маркеров на вариабельность белков мембран эритроцитов при ГБ. Доля дисперсии, объясненная сочетаниями полиморфных генов и оцененная величинами коэффициентов детерминации Я2, варьировала от 9.7% до 26.1% у мужчин и от 5.8% до 10.7% у женщин. В парных сочетаниях отдельные полиморфизмы оказывали влияние на содержание мембранных белков эритроцитов, с которыми они не были связаны по отдельности, а в некоторых случаях действие одного полиморфизма в сочетании с другим локусом нивелировалось

5. Было установлено, что доля общей фенотипической изменчивости белков мембран эритроцитов у больных ГБ, объясненная аллельным разнообразием комплекса изученных полиморфных генов, варьировала в широком диапазоне и составляла от 3.1% (дематин) до 47.6% (глюкозный транспортер) у мужчин и от 0.7% (анкирин 2.3) до 27.0% (а-спектрин) у женщин. Величина вклада вариации по исследованным локусам в полигенно обусловленную дисперсию признаков составляла от 3.9% (дематин) до 64,4% (глюкозный транспортер) у мужчин и от 1,1% (белок п. 4.1) до 50,3% (а-спектрин) у женщин с наибольшим вкладом исследованных ДНК-маркеров в изменчивость мембранных белков, характеризующихся отклонениями в количественном содержании при ГБ.

6. Результаты логистического регрессионного анализа показали, что исследованные полиморфные гены и мембранные белки эритроцитов являются прогностически ценными предикторами для расчета вероятности возникновения заболевания в популяции. Несмотря на определенные различия разработанных нами статистических моделей прогнозирования ГБ у мужчин и женщин, в целом, используемые в качестве предикторов болезни биохимические и генетические маркеры обладали достаточно высоким прогностическим потенциалом, о чем свидетельствовало качество классифицирования пациентов на группы риска: вероятность правильного установления возможности развития ГБ составляло 73% среди мужчин и 91% - среди женщин.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Рекомендовать для внедрения в практику Курской областной медико-генетической консультации использование биохимического исследования белкового спектра мембран эритроцитов в сочетании с генетическим тестированием генов-кандидатов ССЗ для формирования среди пациентов группы риска развития гипертонической болезни.

2. При меднко-генетнческом консультировании семей с наследственной отягощенностыо по ГБ с целью оценки вероятности развития болезни рекомендуется использовать приемы математического прогнозирования и учитывать комплекс идентифицированных биохимических и молекулярно-генетических маркеров, установленных в ходе логистического регрессионного анализа, раздельно у мужчин и женщин.

3. В клинической кардиологии пациентам с гипертонической болезнью дополнительно к комплексу общеклинического и специального кардиологического обследования представляется целесообразным включение биохимического исследования бежового спектра мембран эритроцитов в сочетании с генетическим тестированием генов-кандидатов ССЗ и последующей разработки индивидуальных превентивных лечебных мероприятий, направленных на предупреждение развития болезни и ее осложнений.

4. Рекомендовать для использования результаты о влиянии полиморфизма генов-кандидатов ССЗ на вариабельность мембранных белков при гипертонической болезни в образовательном процессе при преподавании дисциплин медицинской и клинической генетики в вузах медицинского и медико-биологического профиля.

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕННЫХ НАЗВАНИЙ

ГЕНОВ

(HUGO Gene Nomenclature Committee)

А СЕ - ангиотензинпревращающий фермент; AGTR1 - рецептор ангиотензина II1 типа: AGT-ангиотензиноген; ADD1 - а-аддуцин;

GNB3 - р-3 субъединица белка переносчика G; MLR - минералокортикоидный рецептор; NOS3 - эндотелиальная синтаза оксида азота; TGFB1 - трансформирующий фактор роста р.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Полиморфизм Arg25Pro гена трансформирующего фактора роста-В1 и его роль в патогенезе гипертонической болезни в русской популяции ЦентральноЧерноземного региона России / В. П. Иванов, М. J1. Солодилова, ... Д. В. Ушачев [и др.] // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2007. - Т. 144, № 7. -С. 72-74. (из перечня ВАК)

2. Исследование роли полиморфных вариантов G272S и С825Т гена GNB3 в развитии гипертонической болезни в Центральном Черноземье / А. М. Шестаков, А. В. Полоников, ... Д.В. Ушачев [и др.] // Кардиоваскулярная терапия и профилактика. - 2008. - Т. 7, № S22. - С. 416а-417. (из перечня ВАК)

3. Комплексная оценка влияния генов регуляторов водно-солевого обмена, сосудистого гомеостаза и сигнальной трансдукции на развитие мозгового инсульта на фоне гипертонической болезни / А. В. Полоников, А. М. Шестаков, Д. В. Ушачев [и др.] // Кардиоваскулярная терапия и профилактика. - 2008. - Т. 7, № S22 . - С. 296а-296. (из перечня ВАК)

4. Исследование роли инсерционно-делеционного полиморфизма гена ангиотензинпревращающего фермента в развитии эссенциальной гипертензии в Центральном Черноземье / Д. В. Ушачев, В. Б. Криворутченко, А. М. Шестаков [и др.] // Молодежная наука и современность : 72-я итоговая межвуз. конф. студентов н молодых ученых : в 2 ч. / КГМУ, Центр.-Чернозем. науч. центр РАЕН, РАЕН ; редкол.: А. И. Лазаренко [и др.]. - Курск, 2007. - Ч. 1. - С. 56.

5. Анализ ассоциации полиморфизма E298D гена эндотелиальной синтазы оксида азота с предрасположенностью к гипертонической болезни у русских жителей Центрально-Черноземного района России / А. М. Шестаков, Д. В. Ушачев, А. А. Гриднев [и др.] // Молодежная наука и современность : 72-я итоговая межвуз. конф. студентов и молодых ученых : в 2 ч. / КГМУ, Центр.-Чернозем. науч. центр РАЕН, РАЕН ; редкол.: А. И. Лазаренко [и др.]. - Курск, 2007. - Ч. 1. - С. 63.

6. Роль взаимодействия генов регуляторов водно-солевого обмена, сосудистого гомеостаза и сигнальной трансдукции в развитии мозгового инсульта у больных гипертонической болезнью / Д. В. Ушачев, М. А. Солодилова, А. М. Шестаков [и др.] // Молодежная наука и современность : 72-я итоговая межвуз. конф. студентов н молодых ученых : в 2 ч. / КГМУ, Центр.-Чернозем. науч. центр РАЕН, РАЕН ; редкол.: А. И. Лазаренко [и др.]. - Курск, 2007. - Ч. 1. - С. 73-74.

7. Тяжесть клинических проявлений гипертонической болезни и ее связь с количественным содержанием белков цитоскелета эритроцитов / А. В. Полоников, Д. В. Ушачев, А. М. Шестаков [и др.] // Кардиоваскулярная терапия и профилактика. - 2008. - Т. 7, № S22. - С. 296Ь-297. (из перечня ВАК).

8. Роль генетических факторов в детерминации количественных изменений мембранных белков эритроцитов при гипертонической болезни / В. П. Иванов, А. В. Полоников, ... Д. В. Ушачев [и др.] // Системные исследования в науке и образовании : сб. науч. тр. / Курский гос. ун-т [и др.]; науч. ред. В. А. Иванов. - Курск, 2007. - С. 19-20.

9. Промоторный полиморфизм -786Т/С гена NOS3 не ассоциирован с предрасположенностью к гипертонической болезни в популяции русских жителей Центрального Черноземья / В. Б. Криворутченко, А. М. Шестаков, Д. В. Ушачев [п др.] // Молодежная наука и современность : 72-я итоговая межвуз. конф. студентов и молодых ученых : в 2 ч. / КГМУ, Центр.-Чернозем. науч. центр РАЕН, РАЕН ; редкол.: А. И. Лазаренко [и др.]. - Курск, 2007. - Ч. 1. - С. 64.

10. Связь мембранных белков эритроцитов со степенью тяжести гипертонической болезни / А. М. Шестаков, А. А. Гриднев, Д. В. Ушачев |и др.] // Молодежная наука и современность : 72-я итоговая межвуз. конф. студентов и молодых ученых : в 2 ч. / КГМУ, Центр.-Чернозем. науч. центр РАЕН, РАЕН ; редкол.: А. И. Лазаренко [и др.]. -Курск, 2007. - Ч. 1,-С. 71-72.

11. Защитный эффект полиморфизма GLY272SER гена GNB3 в развитии гипертонической болезни и его взаимосвязь со средовыми факторами риска развития заболевания / А. В. Полоников, М. А. Солодилова, ... Д. В. Ушачев [и др.] // Терапевтический архив. - 2011. - Т. 83, № 4. - С. 55-60. (из перечня ВАК)

Подписано в печать 14.11.2011. Формат 60x84/16. Гарнитура Times. Усл. п. л. 1,0. Тираж 100 экз. Заказ 286. Оригинал-макет подготовлен и тиражирован в НПК НИУ «БелГУ» 308015, г. Белгород, ул. Победы. 85

Содержание диссертации, кандидата медицинских наук, Ушачёв, Дмитрий Владимирович

Список сокращений.4

ВВЕДЕНИЕ.

Глава I. Литературный обзор

1.1. Современные взгляды на этиологию и патогенез гипертонической болезни.13

1.2. Мембранная концепция гипертонической болезни.17

1.3. Белки клеточных мембран и их возможная вовлеченность в формирование патогенеза гипертонической болезни.24

1.4. Роль генетических факторов в детерминации мембранных нарушений при гипертонической болезни.35

Глава И. Материалы и методы исследования

II. 1 Общая характеристика материала исследования.40

II.2 Характеристика методов исследования.41

II.3.Статистические методы.48

Глава III. Результаты собственных исследований

III. 1 Общая характеристика и вариабельность количественного содержания мембранных белков эритроцитов у человека в норме и при гипертонической болезни.52

111.2 Изучение влияния наследственной отягощенности по гипертонической болезни на количественную представительность мембранных белков эритроцитов.59

111.3 Исследование характера взаимного варьирования количественного содержания белков мембран эритроцитов при гипертонической болезни.62

111.4 Анализ взаимосвязи полиморфизма генов-кандидатов сердечно-сосудистых заболеваний с количественным содержанием мембранных белков эритроцитов.74

Ш.5 Анализ ассоциаций полиморфизмов генов-кандидатов сердечно-сосудистых заболеваний и их парных сочетаний с мембранными белками эритроцитов с помощью дисперсионного анализа. 87

111.6 Компонентное разложение общей фенотипической дисперсии количественного содержания белков мембран эритроцитов, обусловленной изменчивостью комплекса полиморфных геновкандидатов сердечно-сосудистых заболеваний. 91

111.7 Прогнозирование риска возникновения гипертонической болезни с использованием биохимических и молекулярно-генетических маркеров. 100

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ. 106

ВЫВОДЫ. 125

Введение Диссертация по биологии, на тему "Вклад полиморфных вариантов генов-кандидатов сердечно-сосудистых заболеваний в фенотипическую изменчивость количественного содержания белков клеточных мембран при гипертонической болезни"

Гипертоническая болезнь (ГБ) в настоящее время признана пандемией, определяющей большую часть заболеваемости в большинстве стран мира [Гогин Е. Е., 2003]. По данным обследования, проведенного в рамках целевой Федеральной программы «Профилактика и лечение АГ в Российской Федерации», распространённость АГ среди населения нашей страны составляет 39,5%. По данным обследования репрезентативной выборки, стандартизированной по возрасту, распространённость АГ в России составляет среди мужчин 37,2%, а среди женщин - 40,4% [Шальнова С.А. и др., 2006]. Общеизвестно, что артериальная гипертензия (АГ) является важнейшим фактором риска распространенных сердечно-сосудистых заболеваний (ССЗ) - острого инфаркта миокарда (ОИМ) и мозгового инсульта (МИ) [Гринштейн А. В., 2002], которые определяют высокую смертность населения во всем мире. Существует прямая связь между уровнем артериального давления (АД) и риском развития инсульта [В.И.Скворцова, 2006]. Кроме того, ГБ способствует развитию атеросклероза и ишемической болезни сердца (ИБС), лежит в основе развития хронической сердечной недостаточности [Ланг Г.Ф., 1950; Мясников А. Л., 1965; Чазов Е. И., 1997]. Доказано, что опасность возникновения ИБС более велика у больных АГ, причем она увеличивается параллельно нарастанию АД. В качестве примера можно привести данные проспективного Фремингемского исследования, показавшего, что у обследованных с систолическим АД выше 180 мм.рт.ст. ИБС возникала в 8 раз чаще, чем у лиц, у которых оно было ниже 120 мм.рт.ст. [Саппе1 ег а1., 1961]. Подобная же зависимость установлена и в отношении диастолического АД. Хотя и отсутствует специфический уровень давления, выше которого резко возрастали бы показатели летальности, тем не менее, взаимосвязь уровня АД с заболеваемостью и смертностью населения фактически носит линейный характер зависимости.

У больных ГБ часто прослеживается отягощенный семейный анамнез по сердечно-сосудистым заболеваниям, в том числе и АГ, тем самым, демонстрируя важную роль наследственных факторов в её развитии [Гинтер Е.К., 2003]. Значительную роль генетических факторов в развитии ГБ продемонстрирован и близнецовыми исследованиями [Шарандак А.П. и др., 2002]. Согласно современным представлениям ГБ имеет многофакторную или мультифакториальную природу и относится к полигенным заболеваниям. К настоящему времени установлены уже сотни генов-кандидатов предрасположенности к ГБ, установлены многочисленные средовые факторы риска заболевания и описаны ранее неизвестные стороны его патогенеза [Бойцов, С. А. и др., 2003; Гуревич, М. А., 2009; Денисова Т.П., 2005; Елисеев А.О., 1987; Казеннов, A.M., 1990; Логинов В.А., 1990; Casari G. et al., 1995; Chowdhary S. et al., 2001; Corvol P., 2001; Siffert W. et al., 1998]. Однако, несмотря на прогресс молекулярной генетики, по-прежнему, в' мировом научно-медицинском сообществе отсутствует единое мнение о ведущих патогенетических механизмах, лежащих в основе стойкого хронического повышения уровня артериального давления.

Одной из подробно изученных и обоснованных является "мембранная | концепция" этиопатогенеза ГБ, в основе которого лежат структурно-функциональные изменения плазматических мембран клеток, приводящие к нарушению трансмембранного транспорта катионов, контролирующих сосудистый тонус. "Мембранная концепция" этиопатогенеза ГБ, основные положения которой были исследованы учеными Ю.В. Постновым и С.Н. Орловым и обобщены в известной монографии [Постнов Ю.В.; Орлов С.Н., 1987], оказалась способной объяснить многие противоречия различных точек зрения на молекулярные механизмы развития заболевания. За период с середины 70-х годов прошлого века до конца первого десятилетия 21 века проведено значительное количество исследований по изучению природы ионтранспортных нарушений при ГБ. В частности, была установлена взаимосвязь количественного содержания белков мембран эритроцитов с подверженностью гипертонической болезни [Емельянова О.Г., 1999]. Кроме того, было установлен значительный вклад генетических факторов в вариабельность белков клеточных мембран эритроцитов при ГБ. Однако геномный источник "мембранных нарушений", по-прежнему, не установлен. Считается маловероятным, что при ГБ нарушения в геноме относятся к участкам, кодирующим структуру таких различных белковых молекул, как Na+/Na+- и №+/К+-переносчики, переносчики Са2+"АТФаза, а также мембранных белков, вовлеченных в регуляцию катион-транспортных процессов через плазматические мембраны [Котелевцев Ю.В., Постнов Ю.В., 1986].

Учитывая вышеизложенное, наиболее целесообразной является интегрированная оценка молекулярно-генетических и биохимических исследований, направленных на поиск и установление взаимосвязей между ДНК-полиморфизмом конкретных генов предрасположенности к ГБ и изменчивостью содержания белков мембран эритроцитов. Однако, до настоящего времени исследований, направленных на оценку вклада известных генов-кандидатов4 ССЗ в вариабельность количественного содержания основных белков мембран эритроцитов, не проводилось.

Целью настоящего исследования было изучение вклада полиморфных вариантов генов-кандидатов сердечно-сосудистых заболеваний AGT, AGTR1, АСЕ, MLR, NOS3, GNB3, ADD1 и TGFB1 в фенотипическую изменчивость количественного содержания основных мембранных белков эритроцитов при гипертонической болезни.

Задачи исследования:

3) Изучить популяционные частоты полиморфизмов Т174М и М235Т гена AGT, 1166А/С гена AGTR1,1/D гена АСЕ, А4582С гена MLR, E298D и -786Т/С гена NOS3, G272S и С825Т гена GNB3, G460W гена ADD1 и R25P гена TGFB1 и исследовать их ассоциации с гипертонической болезнью.

4) Провести анализ взаимосвязи полиморфных вариантов генов AGT, AGTR1, АСЕ, MLR, NOS3, GNB3, ADD1 и TGFB1 и их парных сочетаний с количественным содержанием мембранных белков эритроцитов при гипертонической болезни.

Научная новизна. В рамках исследования впервые проведен комплексный анализ влияния полиморфизма генов-кандидатов сердечнососудистых заболеваний AGT, AGTR1, АСЕ, MLR, NOS3, GNB3, ADD1 и TGFB1 на фенотипическую вариабельность количественного содержания основных мембранных белков эритроцитов при гипертонической болезни. Оценена степень вклада аллелей генов-кандидатов ССЗ в фенотипическую и полигенно обусловленную дисперсию мембранных белков эритроцитов при ГБ. Установлено, что исследованные гены объясняют значительную часть фенотипической изменчивости мембранных белков эритроцитов при гипертонической болезни. Впервые показано, что существенная доля вариабельности мембранных белков эритроцитов у больных ГБ обусловлена взаимодействием относительно небольшого числа факторов их совместной изменчивости, отражающих фенотипическую реализацию кодирующих их полигенных комплексов. Впервые выявлен половой диморфизм, проявляющийся не только в особенностях количественного содержания мембранных белков у мужчин и женщин, страдающих ГБ, но и значительные различия в характере генетической детерминации фенотипической изменчивости исследуемых показателей у представителей разного пола. Полученные в ходе настоящей работы результаты позволяют глубже взглянуть на молекулярно-генетические механизмы, лежащие в основе мембранных нарушений при ГБ, и расширяют возможности доклинической оценки риска развития заболевания.

Научно-практическая значимость работы: в связи с тем, что исследованные белки мембран эритроцитов и полиморфные гены оказались ценными предикторами при расчете индивидуального риска возникновения ГБ у мужчин и женщин, их совместная оценка с помощью разработанных статистических моделей может использоваться для прогнозирования вероятности развития болезни, как во врачебной, так и в эпидемиологической практике при формировании среди населения групп повышенного риска возникновения ГБ. В этой связи результаты исследования могут быть востребованы при организации мероприятий по раннему выявлению и профилактике гипертонической болезни в популяции. Практическое использование статистических моделей дает возможность врачам-генетикам, терапевтам и кардиологам формировать группу повышенного риска ГБ, оптимизировать и индивидуализировать мероприятия по превентивной коррекции нарушений регуляции АД, что может способствовать снижению риска формирования ГБ в популяции. Результаты, полученные в ходе исследования, не только формируют представления о роли полиморфизма генов ССЗ в детерминации изменений количественного содержания белков мембран эритроцитов при ГБ, но и создают теоретическую основу для их внедрения в образовательный процесс. В частности, результаты исследования могут быть использованы при чтении специальных курсов по медицинской и клинической генетике, биохимии, патофизиологии, терапии, кардиологии в вузах медицинского профиля и на курсах повышения квалификации медицинских работников.

Положения, выносимые на защиту:

1. Значительная доля вариабельности мембранных белков эритроцитов у больных ГБ обусловлена взаимодействием относительно небольшого числа факторов их совместной изменчивости, которые могут отражать фенотипическую реализацию кодирующих их полигенных комплексов, один из которых определяет почти 20% основного вектора количественных изменений белков эритроцитарных мембран при заболевании - снижение уровня а и (3 спектринов и повышение содержания глюкозного транспортера.

2. Фенотипические эффекты аллелей исследованных полиморфизмов генов-кандидатов ССЗ в отношении изменчивости уровня основных мембранных белков эритроцитов модифицируются вследствие возможных аддитивных и эпистатических взаимодействий между исследованными локусами, а также различий в величинах их пенетрантности, и характеризуются неодинаковыми проявлениями у представителей разного пола.

3. Исследованные полиморфные варианты генов в совокупности вносили существенный вклад в фенотипическую изменчивость количественного содержания белков мембран эритроцитов при ГБ: величина вклада вариации по исследованным локусам в полигенно обусловленную дисперсию признаков достигала 64% (для глюкозного транспортера) у мужчин и 50% (для а-спектрина) у женщин, свидетельствуя о значимой роли известных кандидатных генов ССЗ в детерминации количественного дисбаланса мембранных белков эритроцитов, обнаруженных при заболевании.

4. Исследованные полиморфные гены и белки мембран эритроцитов являются ценными предикторами при расчете индивидуального риска возникновения ГБ у мужчин и женщин и могут использоваться в качестве генетических и биохимических маркеров прогнозирования вероятности развития болезни при формировании среди населения групп повышенного риска возникновения ГБ.

Апробация результатов работы и публикации: материалы диссертационного исследования доложены на итоговых научных сессиях КГМУ (2006, 2007, 2011), Российском национальном конгрессе кардиологов (2008), 2-ом съезде кардиологов Сибирского федерального округа (Томск, 2007), международной (российско-японо-американской) научно-практической конференции «Современные технологии и общая концепция профилактики и лечения сердечно-сосудистых заболеваний» (Хабаровск, 2007) и ежегодной научной конференции Европейского общества генетики человека (Амстердам, 2011).

По материалы диссертации опубликовано 11 печатных работ, в т. ч. 2 - в рецензируемых журналах (Бюллетень экспериментальной биологии и медицины, Терапевтический архив), рекомендованных ВАК Минобрнауки РФ для публикаций результатов диссертационных исследований по медицинским наукам.

Объем и структура диссертационной работы:

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, собственных результатов, обсуждения, выводов, практических рекомендаций, списка литературы и приложений. Работа изложена на 164 страницах машинописного текста, иллюстрирована 21 таблицей, 6 рисунками, содержит 9 приложений. Список литературы включает 253 источника: 88 отечественных и 165 зарубежных.

Заключение Диссертация по теме "Генетика", Ушачёв, Дмитрий Владимирович

ВЫВОДЫ

1. У больных гипертонической болезнью, в отличие от здоровых индивидов, установлены отклонения в количественном содержании, а также в характере взаимного варьирования главных периферических (спектринов, актина, дематина и глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы) и интегральных белков (глюкозотранспортного белка) плазматических мембран эритроцитов, которые имели различную степень фенотипического выражения у мужчин и женщин. У женщин, страдающих ГБ, в отличие от мужчин, а также у пациентов с наследственной отягощенностью по ГБ обнаружены наиболее глубокие изменения анализируемых показателей количественного характера.

3. Установлено, что все исследованные нами полиморфные варианты генов-кандидатов ССЗ в той или иной степени оказывали влияние на количественное содержание белков мембран эритроцитов. В большинстве случаев фенотипические эффекты аллелей исследованных генов на вариабельность мембранных белков оказались умеренно выраженными и в ряде случаев (для 0460\У гена АОй1, -786Т/С гена N033, М235Т и Т174М гена ЛОТ, 1/Е) гена АСЕ) характеризовались разнонаправленностью действия у мужчин и женщин, о чем свидетельствовали степень и направление отклонений величин анализируемых признаков в группах носителей альтернативных аллелей от средних в популяции значений.

4. Применение одно- и двухфакторного дисперсионного анализа позволило выявить особенности эффектов изолированного и совместного действия аллелей исследуемых ДНК-маркеров на вариабельность белков мембран эритроцитов при ГБ. Доля дисперсии, объясненная сочетаниями полиморфных генов и оцененная величинами коэффициентов детерминации В2, варьировала от 9.7% до 26.1% у мужчин и от 5.8% до 10.7% у женщин. В парных сочетаниях отдельные полиморфизмы оказывали влияние на содержание мембранных белков эритроцитов, с которыми они не были связаны по отдельности, а в некоторых случаях действие одного полиморфизма в сочетании с другим локусом нивелировалось

Информация о работе

Ушачёв, Дмитрий Владимирович
кандидата медицинских наук
Белгород, 2011
ВАК 03.02.07

Диссертация

Вклад полиморфных вариантов генов-кандидатов сердечно-сосудистых заболеваний в фенотипическую изменчивость количественного содержания белков клеточных мембран при гипертонической болезни - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы