Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Визуализация биологических материалов методами сканирующей туннельной и атомно-силовой микроскопии

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Визуализация биологических материалов методами сканирующей туннельной и атомно-силовой микроскопии"

МОСКОВСКИЙ ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ФИЗИКО-ТЕХНИЧЕСКИЙ ИНСТИТУТ

Р Г Б ОД

На правах рукописи

ТУЗОВ Игорь Викторович

ВИЗУАЛИЗАЦИЯ БИОЛОГИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ МЕТОДАМИ СКАНИРУЮЩЕЙ ТУННЕЛЬНОЙ И АТОМНО-СИЛОВОЙ МИКРОСКОПИИ

03.00.02-Биофизика

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук

Москва-1994 г.

Работа выполнена в Институте биоорганической химии им. Шемякина и Овчинникова Российской академии наук.

Научный руководитель:

кандидат биологических наук В.В. Демин

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук В.Б. Григорьев кандидат физико-математических наук A.B. Степанов

Ведущая организация: Институт молекулярной биологии РАН

Защита состоится //. 1994 года в / ^ "^часов

на заседании Специализированного ученого совета К.063.91.10 при Московском физико-техническом институте по адресу: 141700, Московская область, г. Долгопрудный, Институтский пер., 9, МФТИ, аудитория //Г

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке МФТИ Автореферат разослан

Ученый секретарь

Специализированного ученого совета кандидат физико-математических наук

В.Б. Киреев

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Методы структурного исследования, основанные на использовании зондовых сканирующих микроскопий (СЗМ), стали бурно развиваться с начала 80-х годов. Их исключительной особенностью является сверхвысокое пространственное разрешение. Основным направлением развития этой новой области исследования является физика поверхностей твердых тел.

Не разрушающая природа этих методов и их способность работать в различных средах открыла путь для исследования биологических материалов, практически не разрушая их структуры. Появилась уникальная возможность изучения биологических объектов таких как клетки, вирусные частицы, бактериофаги и т.д. с высоким разрешением in vivo.

Несмотря на впечатляющие первые результаты, СЗМ до настоящего времени является молодым методом, т.е. не существует отработанных технологий позволяющих использовать СЗМ для структурных исследований биологических объектов и материалов. В большинстве областей СЗМ развитие теоретических основ находится на начальном этапе.

Основным препятствием при использовании этих методов для изучения биологических материалов в условиях отличных от сверхвысокого вакуума является латеральная подвижность образца. Поэтому для надежной визуализации объектов необходима их фиксация на поверхности используемой подложки.

Данная работа является частью проводимой в Институте биоорганической химии им М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова комплексной международной программы "Геном человека", одним из аспектов которой является разработка методов физического картирования ДНК с использованием СЗМ.

На момент начала работ по данной теме не существовало методов для визуализации ДНК и других биоматериалов в СЗМ. Поэтому работа по изучению процессов адсорбции биоматериалов и разработка методов их поверхностной фиксации является актуальной и крайне важной для решения задач структурных исследований биообъектов.

Цель работы состояла в изучении процессов адсорбции различных классов биоматериалов на нескольких типах субстратов, разработке методов увеличения энергии связывания и уменьшения воздействия зонда

на объект, а также методов позволяющих получать СЗМ изображения с высоким контрастом и требуемым разрешением таких объектов как ДНК и ДНК-белковые комплексы.

Научная новизна. Впервые разработаны методы СЗМ визуализации макромолекул и их комплексов, позволяющие получать изображения с минимальным искажениями их размерных параметров и высоким соотношением сигнал/шум при атмосферных условиях.

Применение разработанных методов было показано на кристаллах ДНК-recA белковых комплексов, полученные при этом изображения имеют пространственное разрешение значительно превышающее достигнутое на подобных объектах при использовании других структурных методов и методов подготовки образца. В частности, показано что спираль гесА-белка вокруг ДНК образована 6-ю белковыми глобулами на один виток.

Разработан принципиально новый метод позволяющий значительно уменьшить деформации молекул ДНК при АСМ исследовании, показана его применимость для решения задач связанных с физическим картированием ДНК.

Проведено исследование процессов самоорганизации в двухкомпонентных LB-пленках и показана применимость разработанных подходов для изучения процессов реконструкции мембран.

Практическая ценность. Результаты работы содержат ряя оригинальных опробированных методов, что делает СЗМ методом пригодным для рутинного структурного анализа широкого спектра биологических материалов. Разработанные методы имеют существенное преимущество над традиционными методами структурных исследований такими как электронная микроскопия и рентгеноструктурный анализ Они позволяют проводить исследования образцов без предварительного контрастирования и в условиях отличных от вакуума. Кроме того, метох более доступен в использовании и позволяет проводить непосредственные измерения таких характеристик объекта как высота (толщина) i упругость.

Апробация работы. Основные результаты работы докладывались нг на научной конференции в МФТИ (1993), на международном симпозиум« STM-93 в Пекине (1993), на международном симпозиуме Nanostructures-9^ в С-Петербурге (1994), на международном конгрессе ISEM-13 в Париж! (1994) и на международной конференции MICRO-94 в Лондоне (1994).

Публикации. По материалам диссертации сделано 6 публикаций. Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, четырех глав, заключения и выводов. В первой главе приведен обзор литературных данных по теории СЗМ и _ее применениям в биотехнологии. Диссертация изложена на /SC .страницах, содержит таблиц ¿> . рисунков в£> Библиография включает 230 наименований.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Глава 1. Физические принципы и применение сканирующих зондовых микроскопий

В литературном обзоре рассмотрены следующие вопросы:

1. Физические принципы сканирующей туннельной микроскопии и спектроскопии;

2. Физические принципы сканирующей атомно-силовой микроскопии;

3. Аппаратное обеспечение зондовой микроскопии;

4. Применение зондовых микроскопий в биоструктурных исследованиях

Основное внимание уделяется физике процессов происходящих в динамической системе зонд-окружающая среда-объект исследования-поверхность подложки. Отмечается сильное влияние адсорбатов, особенно воды, на механизм формирования изображения и принципиальную возможность получения изображения биообъектов. Разбираются вопросы идентификации биоматериалов среди прочих объемных примесей, адсорбатов и дефектов поверхности подложки. Глава 2. Экспериментальная установка и методы

Проведено краткое описание структурной организации установки Nanoscope II (Digital Instrument, Са, USA) и ее конструкции. Приведены характеристики прибора при работе в различных режимах при использовании зондов с различными частотно-размерными характеристиками и манипуляторов разных типов.

При проведении СЗМ исследований в условиях воздушного окружения адсорбированная вода играет существенную роль. Количественные данные по влиянию атмосферной влажности на качество СЗМ изображений приведены во многих исследованиях (e.g. Tuzov et al., 1994; Wen-Ling et al., 1993). Наилучшее качество изображений достигается при минимальном содержании адсорбированной воды, поэтому оптимальными условиями можно считать работу при нулевой влажности

воздуха. В главе приведено описание и принцип действия системы поддержания "нулевой" влажности при проведении АСМ и СТМ исследований.

Большое влияние на качество изображений и саму возможность их получения оказывают приборные и внешние шумы. Для достижения наилучшего качества изображений была создана система сейсмической и аккустической изоляции прибора.

В разделе "Методы" данной главы приведена краткая сводка все* применяемых в последующих главах методов. Большая часть методов используемых для модификации поверхностных свойств и приготовления образцов биологических объектов для СЗМ исследований была разработана в ходе проведения работ по теме диссертации. Е последующих главах проводится обсуждение принципов действия этил методов в СЗМ.

Глава 3. Морфология и свойства поверхностей подложек

3.1 Структура поверхностей подложек. В этом разделе проведенс исследование топографических характеристик поверхностей тверды> материалов, использование которых в качестве подложек для СЗМ предполагалось возможным. Было проведено отдельное исследованш характерных дефектов и артефактов представленных на поверхности эти> материалов.

Проведенное исследование поверхности ВОПГ показало, чтс получаемая при скалывании поверхность, в основном, обладает атомно{ ровностью на макроскопических участках и вполне пригодна дл5 проведения АСМ и СТМ исследований биологических веществ с малы!*» размерными параметрами. Однако исследование особенностей данно1 поверхности показало наличие трех наиболее встечаемых типов дефекто! (линейные дислокации, области с гиперрешеткой, точечные дефекты) структура которых сходна с некоторыми видами биологически; препаратов ( ДНК, белковые агрегаты), что налагает определенны! ограничения на использование его поверхности в качестве подложки.

Поверхность слюды, полученная при скалывании, так же обладас атомной ровностью на макроскопических участках. Проведенно' исследование дефектов такой поверхности показало, что за исключениен нескольких специальных случаев, их наличие можно не принимать в< внимание, так как их поверхностная плотность крайне мала.

Рассмотрение поверхностей других материалов показало ограниченность их применений для структурных исследований, связанную, прежде всего, с отсутствием достаточно больших равных участков.

3.2 Поверхностные свойства подложек. В разделе проведено рассмотрение некоторых свойств поверхностей ВОПГ и разных видов слюд. Показана сильная зависимость взаимодействий, возникающих между зондом и поверхностью, при изменении внешних условий. Проведено сравнение поверхностных свойств белой и мускавитой слюд. Показано наличие больших не компенсированных зарядов на поверхности последней, что было использовано в дальнейшем для нанесения и визуализации LB-пленок экосиламина и докосанэдиола.

3.3 Модификация поверхностных свойств подложек. В разделе рассмотрены процессы протекающие при использовании некоторых методов обработки поверхности и приводящие к изменению поверхностных свойств используемых подложек. Проведен анализ применимости методов при нанесении различных биообъектов. Описан оригинальный метод гетерогенного катализа позволяющий производить модификацию поверхности ВОПГ для придания ей большей химической активности.

Глава 4. Изучение препаратов биологических объектов методами АСМ и

стм

4.1 Визуализация_микробиологических_объектов.

Микробиологические объекты, таких как клетки, вирусы и т.п. приспособлены к нахождению в водном окружении, поэтому большая часть их наружных мембран и стенок гидрофильна. Размеры этих объектов достаточно велики (0.1+100 мкм).

При использовании слюды в качестве подложки сила воздействия зонда на объект составляет 30-100 нН, поэтому в ряде случаев происходит деформация формы объекта, а в случае достаточно мягких образцов зонд может нарушать структуру самого образца.

Одним из таких примеров является внутренний капсид ротавируса. Его ЕМ изображение представлено на рис. 1а. На рис. 16 показано АСМ изображение тех же частиц полученное при простом нанесении препарата на поверхность свежесколотой слюды. В процессе наблюдения происходит деформация частиц и они приобретаю характерный удлиненный вид и ориентацию. Такая деформация достаточно

характерна для объектов сходных по своей организации с вирусным! частицами и объясняется тангенциальным давлением зонда пр1 латеральном движении вдоль поверхности.

Устранение подобных деформаций достигается либо уменьшение\ давления зонда на образец, либо увеличением его связывания <

Рис. 1. Изображения внутреннего капсида ротавируса полученные методами ЕМ (а), АСМ при высокой влажности (б), АСМ в атмосфере азота (в). Типичные сечения АСМ изображений покрытых Pi (г) и фосфатом натрия (д).

субстратом. В ходе проведенных исследований разработаны метод! позволяющие использовать оба этих подхода. Основной вклад тангенциальное давление зонда вносят капилярные силы адсорбат атмосферной влаги, перемещающиеся вместе с зондом. Для и уменьшения необходимо использовать систему поддержани

влажностного режима. На рисуике 1в приведено АСМ изображение того же препарата, но полученное в сухой атмосфере, что позволило устранить деформации объекта. При этом размеры частиц на АСМ изображениях совпадают с их реальным размером 60 нм.

Однако в ряде случаев уменьшить силу давления зонда таким образом не удается. Такой эффект объясняется наличием на поверхности образца адсорбатов другого рода (более подробно этот вопрос рассмотрен в разделе 4.6). В подавляющем большинстве случаев, современные исследователи, работающие с биологическими материалами, используют химические реактивы с категорией чистоты Ч., Х.Ч. и Ч.Д.А., как показано в разделе 4.6. в таких реактивах присутствует достаточно большое колличесгво примесей. Состав примесей разнороден, поэтому на поверхности препаратов, приготовленных для СЗМ исследований, присутствует адсорбат способный перемещаться вместе с зондом, что приводит к увеличению силы его взаимодействия с субстратом независимо от окружающей влажности.

В таких случаях необходимо использовать другие методы подготовки образца и визуализации. Как показали эксперименты, проведенные на препаратах ротавируса имеющих меньшую степень очистки, хорошие результаты может дать покрытие образца тонкой пленкой Pt, углерода или низкомолекулярной соли. При такой подготовке образца проявляется только внешний вид объекта. Кроме того, зернистость пленки ухудшает точность определения размеров объекта исследования.

При использовании солевых покрытий не требуется использование вакуумной установки. Такой метод намного технологичнее и позволяет получать хорошие результаты. Неровности поверхности образца при этом как правило меньше и обычно не превосходят 1 нм. Однако следует учитывать возможное воздействие на состояние образца высокой ионной силы во время высушивания препарата. Из сравнения АСМ изображений препаратов, покрытых Pt и солевой пленками соответственно, видно что происходит значительное увеличение размера частиц при использовании)) метода рокрытия Pt пленкой (рис. 1г), в то время как размеры частиц покрытых солевой пленкой претерпели лишь незначительные изменения (рис. 1д).

4.2 Визуализация макромолекулярных комплексов и агрегатов.

Размеры макромолекулярных комплексов находятся в пределах от единиц

нанометров до сотен микрометров. Кроме того нельзя, как в случае микробиологических объектов, выделить какое-то одно, общее для всех объектов этого класса свойство, позволяющее обеспечить их уверенную визуализацию. Такое различие свойств и параметров этих объектов следует из их функциональных различий. При визуализации макромолекулярных комплексов и агрегатов, как правило, требуется получение данных об их макроскопическом поведении и организации комплекса, а так же о его субструктуре.

Такая постановка задач предъявляет определенные требования и к методам подготовки образцов. Так применяемая для фиксации образца поверхностная обработка не должна скрывать рельеф поверхности макромолекулярного комплекса. Для получения данных о внутренней организации комплекса требуется высокоэффективная фиксация ш только комплекса в целом, но и каждой его части в отдельности.

Поэтому методы основанные на интегральном взаимодействии ( низкой энергией, например методы фиксации на основе ВДВ сил, не дают хороших результатов. Однако в случаях, когда жескосп межсубъединичных связей достаточно высока, большое значение имеет кооперативный эффект, и для фиксации объектов можно использоват! менее сильное связывание. Так для получения АСМ изображений бляше} бактериородопсина на поверхности слюды оказывается достаточнык связывание за счет ВДВ сил. Но при использовании подложки из ВОП1 эффект ВДВ связывания практически отсутствует и для получени: изображений бляшек оказывается необходимым модификация свойсп поверхности напылением тонкого слоя углерода. Напыленный аморфньп углерод химически достаточно активен и в окисленной форме способе! образовывать химические связи с объектом, плотность таких связе! достаточно мала ~1018 м-2, но этого оказывается вполне достаточно дл: надежной фиксации бляшек и их устойчивой визуализации.

Таким образом удается получить препарат содержащий фрагменть бактериальных мембран с фотоактивным белком на проводящел субстрате, что может применяться при изучении функционально! активности бактериородопсина в различных биофизических опытах, ; так же для калибровки АСМ по толщине бляшек.

Изучение ДНК-recA белок комплексов в двумерных кристаллах.

Белок гесА катализирует некоторые этапы общей генетическо! рекомбинации в E.coli, включая поиск гомологии и обмен нитей межд;

молекулами ДНК. Эти уникальные свойства связаны с образованием спирального комплекса гесА-ДНК двунитевой гетеродуплексной ДНК-продуктом реакции обмена нитей.

Для сравнительного структурного исследования гесА-ДНК комплексов методами АСМ и ЭМ были подобраны условия кристаллизации нитевидных комплексов и получены кристаллические структуры (рис. 2а). Чувствительность кристаллов к концентрации соли (при повышении концентрации NaCI более 10 мМ происходит распад кристаллов на отдельные нити) указывает на электростатический характер взаимодействия между нитями. Кристаллы имеют сильно вытянутую форму: максимальный продольный размер составляет 10 мкм, поперечный-0,5 мкм. Были получены данные подстверждающие, что кристалл гесА-ДНК комплексов образован ориентированными в одном направлении и плотно прилегающими друг к другу спиральными нитями.

Фильтрованное от статистических шумов изображение участка негативно-контрастированного кристалла гесА-ДНК комплексов представлено на рис. 26. По данным фурье-анализа элементарная ячейка имеет следующие кристаллографические параметры: а=8,0 нм, Ь=7,6 нм, gamma=85. Это изображение представляет собой двумерную проекцию, показывающую расположение областей белковой плотности внутри кристалла.

Сходство параметров элементарной ячейки кристалла с параметрами одиночной нити (диаметр-10 нм, параметр спиральности-7,7 нм) свидетельствует о том, что при формировании кристаллов структура спиралей мало изменяется. Более детальную структурную информацию можно получить, только исследуя кристаллы гесА другими методами, обеспечивающими лучшее разрешение, например, рентгеноструктурным анализом или зондовой микроскопией. К сожалению, полученные кристаллы не пригодны для рентгеноструктурных исследований, поскольку их размеры в поперечном направлении ограничиваются 0,5 мкм, но они вполне пригодны для АСМ исследований (рис. 2в).

Проведенные исследования показали, что кристаллы гесА-ДНК хорошо адсорбируются на поверхности пирографита, но плохо на поверхность слюды, это по-видимому объясняется большим количеством гидрофобных участков на поверхности комплекса.

Для успешной визуализации кристаллов методом АСМ был применен метод модификации поверхности ВОПГ напылением 0.5 нм углеродного покрытия, что позволило существенно увеличить силу взаимодействия образца с подложкой (до 10-15 нН/нм2) и избежать

Рис. 2. АСМ изображение двумерных кристаллов гесА-ДНК (а). Поверхность кристалла выглядит как набор упакованых нитей (в). После РТ-фильтрации на свободном от статистических шумов изображении (г) видно, что каждая нить оплетена спиралью с 6-ю глобулами на виток. Фильтрованое ЕМ изображение не содержит

столь детальной информации (б)._

смещения образца при сканировании.

Исключая некоторые отличия, а также не рассматривая изображения отдельных мономеров белка, можно сделать заключение о совпадении длин и поперечных размеров кристаллов, визуализированных АСМ и ЕМ методами.

Рассчитанная на ЭВМ двумерное РТ изображения, полученного на атомно-силовом микроскопе, существенно отличается от ИТ с электронно-микроскопического изображения и дает следующие параметры элементарной ячейки кристалла: а=10,1 нм, Ь=7,7 нм, gamma=84. Это объясняется тем, что электронно-микроскопическое изображение представляет собой проекцию объемного распределения контрастирующего вещества по кристаллу, а атомно-силовое изображение-только проекцию поверхностного слоя кристалла. Наиболее важным представляется тот факт, что параметр спиральности нитей, составляющих кристалд (7,7 нм), сохраняется во всех трех случаях (отдельная нить, кристалл в электронном микроскопе, кристалл в атомно-силовом микроскопе). На рисунке 2г приведено АСМ-изображение поверхности кристаллической решётки. В отличие от ЭМ-изображений, видны отдельные нити, образующие кристалл.

Поданным фурье-анализа разрешение на изображениях кристаллов гесА-ДНК комплексов, полученных на атомно-силовом микроскопе, составляет около 1,1 нм, что значительно превышает разрешение на ЕМ изображениях. Это позволяет достоверно установить, что в кристалле каждая нить представляет собой спираль, на один виток которой приходится 6 субъединиц гесА. Таким образом, исследование кристаллов гесА на атомно-силовом микроскопе позволило получить изображения, адекватные электронно-микроскопическим, но со значительно более высоким разрешением.

Исследования при помощи СТМ комплексов гесА-белок-ДНК показали, что проводимость образца недостаточна для получения воспроизводимых СТМ-изображений. Туннелирование через многослойные белковые системы до сих пор остаётся открытым вопросом.

4.3 Визуализация макромолекул. Визуализация макромолекул в зондовой микроскопии является одной из наиболее сложных задач. Сложность задачи состоит в том, что исследователя, в большинстве случаев, интересует информация о структуре макромолекулы для получения которой требуется наиболее высокое разрешение. Однако достигнуть высокого разрешения на отдельной молекуле практически невозможно. Даже в том случае когда макромолекулы прочно фиксированы на подложке их большие размеры, тепловая и индуцируемая зондом подвижность приводят к потере разрешения.

Видимо по этой причине, до сих пор не опубликовано ни одной достоверной работы о получении изображений макромолекул с разрешением лучшим чем разрешение на уровне глобул.

Как показали наши исследования гесА белок, при тех же условиях что описаны в предыдущем разделе, способен в отсутствии ДНК сам агрегировать с образованием кристаллических структур. Кристаллические параметры .полученные на основе ЕМ изображений таких кристаллов (а= 5.4 нм Ь=5.8 нм §атта=89), а также амплитуды и фазы рассчитанных рефлексов, вычисленные на основе численной фурье обработки указывают, повидимому, на кубическую структуру кристалла. Эти данные находятся в соответствии с данными получаемыми из АСМ изображения такого кристалла. Метод подготовки образца и подложки используемый для визуализации этого препарата в АСМ тот же, что использовался для нанесения кристаллов ДНК-гесА белок комплексов.

Тот факт что белковый кристалл по прежнему хорошо сорбируется на неполярный субстрат свидетельствует о наличии снаружи белковых глобул достаточно большого колличества неполярных аминокислот. Разрешение АСМ изображений полученное в данном случае оказывается значительно ниже ЕМ. Это объясняется тем, что кристалл имеет трехмерную упаковку (ДНК-гесА комплексы образовывали двумерные кристаллы с толщиной в 10 нм) и значительную толщину, что приводит к сильным деформациям кристалла в процессе сканирования и как следствие к потере разрешения.

В ряде задач по изучению структуры макромолекул исследователю вполне достаточно информации о внешних размерах макромолекулы. Одной из таких задач является задача по картированию длин ДНК. Одна из проблем состоит в том, что ДНК недостаточно прочно связывается с подложками, что затрудняет ее наблюдение в СЗМ.

Предложенные нами два относительно простых метода подготовки образцов ДНК на слюде позволяют устойчиво получать изображение молекулы на воздухе с использованием коммерческих зондов при относительно высокой влажности. К достоинствам предлагаемых методов следует отнести их простоту, а также отсутствие этапов химической модификации подложки, требующих использования высокочистых и следовательно дорогих реагентов, что делает их конкурентными по сравнению с классической электронной микроскопией.

При нанесении ДНК на поверхность свежесколотой слюды из буфера, не содержащего двухвалентных ионов, прочность посадки недостаточна для АСМ исследования. Присутствие ионов магния упрочняет взаимодействие молекул ДНК со слюдой. Однако приемлимое качество их изображений достигается лишь при низкой влажности

Рис. 3. АСМ изображения ДНК Р770 (производная рИС19) на поверхности слюды при различных методах визуализации (а-в).

Поперечное сечение изображения с профилем ДНК (г)._

воздуха (<40%). Требование поддержания пониженной влажности воздуха ограничивает использование этого метода.

При использовании первого (из рассматриваемых) метода увеличение позиционной стабильности молекулы достигалось нанесением тонкого сдоя РьС смеси на поверхность скола слюды с

адсорбированной на ней ДНК, аналогично тому как это делается при оттенении препаратов для электронно-микроскопического исследования. Оказалось, что напыление Р(УС слоя толщиной 0.5 им является достаточным для получения стабильных изображений (рис.За).

Во втором методе усиление связывания ДНК с подложкой достигалось изменением свойств последней, за счет предварительного напыления 0.5 нм слоя углерода. Такая предварительная обработка дает возможность наносить ДНК на подложку даже в отсутствие ионов

Параметры изображений ДНК полученных Таблица 1.

различными методами. Все значения получены

усреднением по случайным выборкам (п—10)._

Метод приготовления образцов. Длина ДНК [нм] Ширина молекулы у основания пика [нм] Ширина молекулы на 1/2 высоты пика [им| Высота молекулы [нм] Уровень шума г 1** [нм] Контраст

А - 21.6±3.3 11 ±0.4 0.45±0.08 0.14 2.7

Б 937±82 31.8±4.7 14±1.7 2.7±0.4 0.46 5.8

В 1012±94 30.2±1.8 14±1.4 2.2±0.3 0.42 5.2

А-метод ионной обработки слюды

Б-метод напыления Pt слоя

B-метод модификации углеродным покрытием.

■"-Погрешность вычислялась как среднеквадратичный разброс значений длин ♦♦-Приведенные значения уровня шума вычислялись как среднестатистический шум по участку поверхности 1000x1000 нм2 '"'Приведенные значения контраста вычислялись как отношение высоты молекулы к уровню шума_

Изображения, полученные методом атомно-силовой микроскопии с препаратов, приготовленных такими способами, представлены на рис. 36, Зв, соответственно. В обоих случаях наблюдение проводили на воздухе при влажности около 80%. Полученные изображения стабильны и не меняются при сканировании в течение по крайней мере 20 мин. Изображения ДНК имеют вид, сходный с типичным для электронной микроскопии и молекулы хорошо прослеживаются по всей своей длине. Определенные по ним геометрические параметры молекул представлены в табл. 7.1.

Ширина изображений ДНК, измеренная у основания соответствующего пика профиля рельефа (рис. Зг) примерно одинакова для всех трех методов приготовления образцов, и значительно превышает реальный диаметр молекулы ДНК, равный 2 нм. В значительной мере такое уширение может быть объяснено геометрией зонда.

Для учета этого эффекта обычно используется простая геометрическая модель, предполагающая, что зонд представляет собой сферу радиусом Я, а исследуемая молекула ДНК-цилиндр радиусом г. В ходе съемки регестрируется не сама молекула, а кривая ее огибания зондом. Реальный размер молекулы ДНК в такой модели определяют из соотношения: IV = \4яг ■ С учетом того, что диаметр промышленных зондов составляет 30-50 нм, расчет по данной формуле дает , исходя из данных таблицы 1, диаметры молекулы ДНК 2.3-3.9 нм, 5.1-8.4 нм и 4.67.6 нм для методов А, В и С соответственно, что превышает её реальный размер и сильно разниться от метода к методу.

Нами предложен другой способ интерпретации этих изображений. В предположении что объект в сечении может быть представлен эллипсом, кривая огибания зонда может быть описана следующим уравнением:

СЩ= + мгь - 2Л - Л) (1)

где Ь-высота зонда над поверхностью, О-расстояние его до середины нити молекулы, II-радиус зонда, Ь- и а- полувысота и полуширина молекулы соответственно. Из уравнения (1) следует, что измеряемое значение ширины пика равно диаметру молекулы, то есть 0(Ь)=а, только тогда, когда измерение проводится на высоте

и= й + +К2 +Л-Л (2).

Я + а

В идеальном случае, когда зонд гораздо тоньше чем ширина молекулы, из (2) получаем что реальную ширину молекулы даст измерение, проведенное на высоте равной половине высоты пика Ь=Ь. Однако, зонд имеет размеры значительно превосходящие диаметр молекулы ДНК, и высота Ь из (2) зависит от соотношения размеров зонда и молекулы. В этом случае, оценка реальной ширины молекулы может быть сделана по следующей формуле, получаемой из (1):

I) = ,//>;,+4Я:-2К (3),

рет VI». V />

где /), ,-измеренная ширина молекулы по профилю на половине ее высоты соответствующего пика, О -реальная ширина молекулы.

реал г г

В наших экспериментах оценка по данной формуле с учетом того, ч!о диамеф используемого промышленного зонда составляет 30-50 нм, дас!. исходя из данных таблицы 1, ширину молекул ДНК 1.9-3.1 нм в методах В и С. и 1.2-2.0 в методе А. Таким образом, использование этого

способа расчета позволяет получить значение искомого параметра более близкое к ожидаемому и значительно меньше зависящее от используемого метода.

Известно, что в условиях с пониженной влажностью измеренная высота ДНК составляет 1.3-1.4 нм, тогда как в обычных условиях 0.20.4 нм.

В проведенных исследованиях препаратов, преготовленных по методу А, и проведенных во влажных условиях (70%) получены аналогичные результаты: высота молекулы составляет 0.38 нм, в тоже время напыление Pt или углерода на поверхность слюды (методы Б и В) позволило получить значение высоты 2.2-2.7 нм, близкое к реальному диаметру молекулы ДНК (модель объясняющая эффект уменьшения деформаций объекта описана в разделе 4.5).

Длину молекулы ДНК обычно рассчитывают исходя из величины 0.26 нмДпара оснований) для дегидратированной формы А или 0.34 нмДпара оснований) для гидратированной формы В. Длина молекул, измеренная по изображениям с препаратов, приготовленных методами Б и В (табл. 1) согласуется с точностью 9% с расчетной длиной гидратированной формы, что, по-видимому, отражает её конформационное состояние на подложке в условиях повышенной влажности.

Таким образом, предлагаемые методы подготовки образцов ДНК пригодны для ее визуализации методом атомно-силовой микроскопии, имеют низкую трудоемкость и пригодны для решения таких задач как определение длин ресгриктных фрагментов или физического картирования ДНК.

4.4 Визуализация LB-пленок. В настоящее время большое внимание уделяется изучению процессов самосборки и структурной организации мембран, протекающих на молекулярном уровне. Этот интерес связан с выяснением механизмов биогенеза и процессов протекающих в мембранах на молекулярном уровне при реконструкции мембранных компонентов. До настоящего времени многие свойства мембранных систем и особенности их поведения еще недостаточно изучены. Поэтому большую роль при проведении исследований в этой области могут сыграть такие новые методы прямого структурного исследования как АСМ и СТМ.

При проведении исследований мембранных систем широкое распространение получила технология LB-пленок. Однако несмотря на их кажущуюся стабильность, оказалось, что при проведении зондовых исследований целостность и однородность покрытий нарушаются.

При АСМ и СТМ исследовании монослоя октадециламина на поверхности ВОПГ инертность и химическая однородность его поверхности препятствуют надежной фиксации монослоя и в ряде случаев наносимая пленка в атмосферных условиях коллапсирует и через некоторое время образует отдельные сгустки.

При удалении растворителя с поверхности происходит уменьшение взаимодействия монослоя с ВОПГ и формируется большое число микрокапель на поверхности монослоя. В большинстве случаев сродство к растворителю у внешней поверхности монослоя выше чем у внутренней. Поэтому образующиеся микрокапли действуют как дестабилизирующий фактор, приводящий к нарушениям его однородности. Моносой октадециламина наносился по Блоджету на обработанную поверхность ВОПР. Полученные изображения свидетельствуют что поверхность слоя неоднородна и на ней присутствуют дефекты в виде разрывов. Такие дефекты нельзя объяснить неоднородностью свойств подложки, вызванной модификацией, так как размеры и площадь дефектов монослоя весьма значительны (100-300 нм).

Бислой октадециламина стабилизированный отрицательным противоионом (в качестве такого противоиона в эксперименте использовалась ДНК линеаризованной pBR322)(pHC. 4а) нанесенный на подложку, так же как в предыдущем случае, образует однородное покрытие. При этом полярные группировки молекул ориентированы во внутрислоевое пространство и наличие отрицательно заряженного противоиона стабилизирует межслоевое взаимодействие.

Как показали проведенные исследования поверхность такой системы достаточно стабильна и может быть исследована при достаточно высокой (до 80%) влажности воздуха как в СТМ так и в АСМ режиме. Такое повышение стабильности бислоя в сравнении с монослоем повидимому связано с уменьшением энергии неполярных частей молекул внешнего слоя с водой, а также с дополительным стабилизирующим эффектом противоионов. В результате СТМ исследования удалось добиться молекулярного разрешения и установить что упаковка молекул

- 18в бислое кристаллическая с параметрами решетки а=0.35 нм, Ь=0.4 нм gamma= 114°.

Для исследования механизмов структурной организации мембран и их реконструкции может быть использован подход, позволяющий получать информацию об структурной организации и взаимодействии различных компонентов мембран. Этот подход заключается в использовании слюды в качестве подложки и АСМ в качестве метода исследования.

Несмотря на меньшее чем в СТМ разрешение и несколько большее воздействие на образец, этот подход имеет существенные преимущества над использованием ВОПГ в качестве подложки. Поверхность слюды сильно полярна, поэтому препараты мембран и LB-пленок наносимые на ее поверхность могут находиться в том же структурном состоянии что и в водном окружении. Кроме того энергия взаимодействия полярных компонентов мембран с такой поверхностью значительно выше, поэтому визуализация объектов существенно облегчена.

В ходе работ, проводимых совместно с Департаментом физической химии (Royal Inst, of Technology, Sweden), исследовалась самосборка двухкомпонентных пленок с соотношением компонент от 5% докосанэдиола [НО(СН2>220Н] 95% экосиламина [CH3(CH2)l9NH2] до 50% наносимых методом Лэнгмюра-Блоджета на поверхность мускавитой слюды.

Проведенные АСМ исследования показали, что в отличии от ожидаемого результата (предполагалось получить равномерное распределение компонентов в слое и тем самым добиться их более плотной упаковки на поверхности) происходит агрегация докосанэдиола с образованием изолированых областей рис. 46.

При проведении исследования обнаружилось, что на изображениях присутствуют поверхности трех уровней с разницей высот 6.3 нм и 4.2 нм (рис. 4г и 4в). Изучение зависимостей соотношения площадей поверхностей с разными уровнями высот от соотношения компонентов пленки показало хорошее совпадение с прямой зависимостью. На основании этих данных можно сделать вывод что участки пленки с высотой 6.3 нм состоят более чем на 95% из докосанэдиола, а остальная площадь поверхности с высотой 4.2 нм состоит из экосиламина. Столь значительное различие в толщинах (2.1 нм) определяется, повидимому,

различной упругостью пленок этих двух компонент, деформируемых под воздействием зонда.

Таким образом была исследована структура двухкомпонентных ЬВ-пленок и показано что используемые компоненты имеют низкое взаимное

Г s

Рис. 4. Филътрованое от статистических шумов СТМ изображение октадециламина (а). А СМ изображение двухкомпонентной системы на поверхности мускавитой слюды (б). Гис тог рама распределения высот вблизи дефекта монослоя жосиламина (в). Гистограма распределения высот на границе монослоев докосанэдиола и жосиламина (г).

сродство, а также обнаружено различие в механических характеристиках монослоев образованых этими компонентами.

4.5 Улучшение АСМ изображения на гетерогенных подложках. В этом раделе описывается модель объясняющая процессы происходящие при движении зонда вместе с адсорбатом вдоль поверхности с сильно

гетерогенными, по отношению к адсорбату, свойствами. В процессе такого движения энергия адсорбата часто и значительно изменяется, что неизбежно вызывает избыточную диссипацию энергии, приводящую в конечном итоге к минимизации средней энергии взаимодействия адсорбата с поверхностью.

Для более точного описания процессов происходящих в такой системе на реальной поверхности требуются значительные вычислительные мощности. Однако суть явления достаточно ясна.

Применение этого эффекта в зондовой микроскопии биологических метериалов является оригинальной разработкой. Проявление эффекта особенно заметно на объектах с малыми поперечными размерами (см. раздел 4.3), на объектах со средними размерами (10-100 нм) влияние эффекта уменьшается, поскольку зонд большее время находится над объектом свойства которого достаточно однородны.

4.6 Наблюдение процессов адсорбции из жидких сред методом сканирующей силовой микроскопии. При исследованиях в жидкостях важным моментом является контроль чистоты как исследуемой подложки, так и самой жидкости. Наличие незначительных примесей может (вследствие их адсорбции на подложке или исследуемом объекте) оказывать радикальное влияние на поверхностные процессы. Появление адсорбата на твердой поверхности может приводить к изменению адгезии между твердыми телами, изменять проницаемость фильтров, в том числе биологических мембран.

Адсорбция играет важную роль в процессах образования дисперсных систем, разделения жидких смесей, в биохимических системах. Изучение начальных стадий осаждения растворенного или взвешенного вещества из жидкой среды на чистой поверхности твердого тела представляет значительный интерес для определения кинетики адсорбции.

В разделе описан примененный нами метод локального исследования с субнанометровым пространственным разрешением адсорбции примесей из чистых растворов. Показано, что применение этих методов дает уникальную информацию о начальных стадиях адсорбции примесей и позволяет качественно определять степень загрязненности чистых жидкостей.

Один из проведенных экспрериментов был посвящен изучению процессов адсорбции примесей из дистиллированой воды на различные поверхности (см. рис. 5).

В разделе

продемонстрирована возможность применения сканирующего силового микроскопа для наблюдения начальных этапов адсорбции из чистых жидкостей. Показано, что "мягкий" адсорбат при

визуализации с помощью силового микроскопа может проявляться на изображениях с отрицательным контрастом. Под воздействием зонда может происходить механическая очистка поверхности.

ВЫВОДЫ

1. Разработан метод уменьшения влияния капиллярных сил на взаимодействие зонда с объектом исследования. Как результат опробации метода предложена методика визуализации ДНК посредством АСМ и показана пригодность этого метода для решения задач связанных с картированием ДНК.

2. Предложен метод иммобилизации макромолекулярных комплексов и агрегатов. В качестве опробации метода проведены сравнительные СЗМ и ЕМ исследования кристаллов гесА белка. Показано хорошее совпадение кристалографических данных получаемых обоими методами, что указывает на приемлемость данного метода для проведения структурных исследований белков.

3. Используя разработанные методы проведено сравнительное исследование методами ЕМ и АСМ кристаллов комплексов ДНК-гесА белок. Результаты АСМ исследования показали разрешение значительно превышающее разрешение ЕМ изображений. Полученные результаты показали, что полученные двумерные кристаллы образованы спиральными нитевидными комплексами и на один виток спирали приходится 6 глобул белка.

Рис. 5. Изображение границы области сканирования. Многократное сканирование осуществлялось по поверхности слюды, расположенной слева на изображении._

-224. Проведены исследования адсорбции разных классов объектов (внутренний капсид ротавируса, бляшки пурпурных мембран, LB-пленки октадециламина, экосиламина и докосанэдиола) и разработаны методы их визуализации в СЗМ. На примере исследования процессов самосборки и самоорганизации двухкомпонентных пленок докосанэдиола и экосиламина показана применимость разработанных методов для изучения структурной организации мембран и процессов их реконструкции.

5. Проведено исследование структуры и свойств поверхностей различных метериалов, таких как ВОПГ, слюды, стекла, хлорида натрия, никеля, титана. Показана применимость различных поверхностей в качестве подложек для СЗМ.

6. Разработаны простые и эффективные методы уменьшающие влияние атмосферной влажности и внешних шумов на процесс получения СЗМ изображений.

Основные материалы диссертации изложены в следующие

публикациях:

1. Тузов И.В., Клинов Д.В., Демин В.В. Каталитический метох модификации поверхности пиролитического графита. Извести; Академии наук. Серия химическая, 1994, №7, 1194-1197.

2. Тузов И.В., Юркова Е.В., Клинов Д.В., Демин В.В. Нехимически« методы модификации подложек для исследований биополимеро! методами атомно-силовой микроскопии. Биоорганическая химия 1995, №1, (в печати).

3. Tuzov I.V., Klinov D.V., Demin V.V. Investigation of two helical DN/ by scanning tunneling microscopy and spectroscopy, STM-93, PO\BI05.

4. Tuzov I.V., Klinov D.V., Demin V.V. STM and STS observation о electronic and topographical surface peculiarities near artificially induce« defects in HOPG, Nanostructures-94, 168-170.

5. Tuzov I.V., Klinov D.V., Demin V.V. Reduction of capillary force improves AFM image of soft materials. ISEM-13, 939-940.

6. Tuzov I.V., Demin V.V.,Yaminsky I.V. Ex-situ observation о contaminants adsorbed on cleaved mica and graphite in liquid medi using atomic force microscopy. MICRO-94, 1994.

Список сокращений

СЗМ-сканирующая зондовая микроскопия

-23 -

АСМ-атомно силовая микроскопия СТМ-сканирующая туннельная микроскопия ЬВ-Лэнгмюр-Блоджет

ВОПГ-высокоорненгированный пиролитический графит

.9Л

У*

5съ>