Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Вирусоподобные наноразмерные частицы - носители антигенов вирусов гриппа и краснухи

ВАК РФ 03.01.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Вирусоподобные наноразмерные частицы - носители антигенов вирусов гриппа и краснухи"

На правах рукописи

КОТЛЯРОВ РОМАН ЮРЬЕВИЧ

Вирусоподобные наноразмериые частицы - носители антигенов вирусов гриппа и краснухи

(03.01.03 - молекулярная биология)

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

МОСКВА-2010

17 июнт

004605224

Работа выполнена в лаборатории молекулярного клонирования Учреждения Российской академии наук Центр «Биоинженерия» РАН

Научный руководитель: доктор биологических наук

Равин Николай Викторович

Официальные оппоненты: доктор биологических наук

Аграновский Алексей Анатольевич

Ведущая организация:

Научно-исследовательский институт гриппа Северо-Западного отделения

Защита диссертации состоится «25» июня 2010 г. в_часов на заседании

Совета Д 501.001.76 по защите докторских и кандидатских диссертаций при Московском государстветюм университете имени М. В. Ломоносова по адресу: 119992, Москва, Ленинские горы, МГУ, НИИ физико-химической биологии имени А. Н. Белозерского, ауд. 536.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МГУ имени М. В. Ломоносова.

Автореферат разослан «_» мая 2010г.

доктор биологических наук Николаева Людмила Ивановна

РАМН

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук

И.А. Крашенинников

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы

Вакцинация является одним из основных способов профилактики инфекционных заболеваний. Первым прототипом вакцины было использование ослабленной формы возбудителя заболевания, позднее были разработаны способы инактивации возбудителей, позволяющие сохранить их иммуногенные свойства. Следующим этапом явилось создание субъединичных вакцин, использующих один или несколько белков патогенного организма или даже их отдельных фрагментов-эпитопов. Этот подход позволяет создавать полностью безопасные вакцины, однако подобные вакцины могут вызывать гораздо менее выраженный иммунный ответ, чем в случае использования аттенуированных или инактивированных возбудителей.

Решением этой проблемы может являться направленное конструирование наноструктур, имитирующих патоген и содержащих отдельные белки патогена на поверхности частицы-носителя. Данный подход позволяет использовать преимущества белковых вакцин и нивелировать их недостатки, имитируя взаимодействие вируса с иммунной системой. Способность биологических макромолекул к самосборке и самоорганизации является одной из отличительных черт живых систем и предоставляет поистине неисчерпаемые возможности для использования биомолекул в качестве строительных блоков «молекулярного конструктора» для направленного создания новых наноархитектур с заданными пространственными и функциональными свойствами. Одним из наиболее ярких примеров таких структур, обладающих четкой симметрией, обширными возможностями направленной модификации современными методами генной инженерии являются вирусные частицы и имеющие сходную структуру вирусоподобные частицы, образуемые в результате самособорки капсидных белков вирусов. В отличие от вирусов, такие вирусоподобные частицы не содержат генетического материала и

являются полностью безопасными. С использованием методов генетической инженерии можно получить «химерные» капсидные белки, к которым присоединен целевой антиген, а в результате самосборки таких гибридных белков могут быть получены рекомбинантные вирусоподобные частицы, на поверхности которых представлен целевой антиген. Представление антигенных детерминант на поверхности ВПЧ обеспечивает их высокую иммуногенность в сочетании с высоким выходом, легкостью очистки и стабильностью при хранении.

Рекомбинантные ВПЧ - вакцины могут быть получены в различных системах экспрессии, включая бактерии, дрожжи, клетки животных и растения. Растения могут стать недорогой и эффективной «биофабрикой» для получения таких вакцин. Важными преимуществами растительных систем экспрессии являются безопасность продукта и возможность получения больших объемов биомассы. Традиционные методы получения рекомбинантных белков в растениях предполагают проведение генетической трансформации ядерного или хлоропластного генома, однако, обычной проблемой является низкий выход рекомбинантного белка, обусловленная им высокая стоимость очистки, а также длительное время, необходимое для создания растений-продуцентов. Альтернативой являются вирусные системы транзиентной экспрессии. Амплификация целевого гена при репликации вируса-вектора в клетке растения обеспечивает высокий уровень экспрессии в течение нескольких дней.

Предметом настоящей работы является дизайн и получение рекомбинантных вирусоподобных частиц - носителей антигенов возбудителей двух социально-значимых заболеваний, - гриппа и краснухи. В качестве основы для создания рекомбинантных ВПЧ мы использовали ядерный антиген вируса гепатита В (НВс - антиген), мономеры которого собираются в наноразмерные вирусоподобные НВс-частицы.

Современные противогриппозные вакцины основаны на получаемом в куриных эмбрионах вирусе гриппа или его компонентах. Изменчивость

высокоиммуногенных поверхностных белков вируса гриппа гемагглютинина и нейраминидазы - требует практически ежегодного создания вакцин, соответствующих новым штаммам вируса. Поэтому актуальной является задача создания рекомбинантных противогриппозных вакцин «универсального» действия, основанных на отдельных высококонсервативных белках вируса гриппа, иммуногенность которых может быть повышена за счет присоединения к наночастице - носителю. Для решения этой задачи мы сконструировали НВс-частицы, представляющие внеклеточный домен М2 белка вируса гриппа и разработали методы их получения в бактериях и растениях.

В настоящее время иммунопрофилактики краснухи используется живая вакцина, разработанная более 30 лет назад. Задача создания рекомбинантной вакцины против краснухи, не проявляющей негативных эффектов, обусловленных использованием живого вируса, является актуальной. Одним из путей ее решения является создание нановакцин, в которых в иммуногенной форме представлены основные эпитопы поверхностного белка Е1 вируса краснухи.

В целом, разработка новых методов создания рекомбинантных вакцин с использованием достижений нанотехнологий и получения вакцинных препаратов в растениях-биофабриках является основой создания новых недорогих и эффективных препаратов для иммунопрофилактики социально-значимых заболеваний населения Российской Федерации. Цель и задачи исследования

Целью настоящей работы является конструирование вирусоподобных наноразмерных частиц - носителей вакцинных белков вирусов гриппа и краснухи, и разработка методов их продукции в бактериях и растениях.

Для этого в работе решались следующие задачи:

1. Создание систем экспрессии в клетках Escherichia coli вакцинных белков вируса краснухи и рекомбинантных НВс-частиц - носителей иммунодоминантных эпитопов белка El.

2. Получение рекомбинантных НВс-частиц, несущих М2е пептид вируса гриппа, в клетках Escherichia coli.

3. Конструирование самореплицирующихся вирусных векторов для экспрессии целевых белков в растениях.

4. Создание систем экспрессии вакцинных белков вируса краснухи и гриппа в растениях Nicotiana benthamiana с помощью вирусных векторов.

Научная новизна

Впервые получены рекомбинантные вирусоподобные частицы -носители иммунодоминантных эпитопов гликопротеина El вируса краснухи, которые могут быть использованы как основа рекомбинантной вакцины против краснухи. Разработаны методы конструирования, получения в бактериальной системе экспрессии, выделения и очистки вирусоподобных НВс-частиц - носителей М2е пептида вируса пандемического штамма «свиного» гриппа HlNlv-2009. Показано, что иммунизация лабораторных животных полученным препаратом обеспечивает их защиту от летальной гриппозной инфекции.

Сконструированы вирусные векторы, обеспечивающие высокоэффективную экспрессию целевых белков в растениях за счет повышения эффективности трансляции РНК вируса-вектора благодаря использованию трансляционного энхансера.

Впервые продемонстрирована возможность экспрессии в растениях белка El вируса краснухи и продукции НВс-частиц - носителей эпитопов этого белка. Впервые создана система продукции в растениях вирусоподобных НВс-частиц, представляющих М2е пептид вируса гриппа на своей поверхности, что открывает возможность получения «универсальных» противогриппозных вакцин в растениях-биофабриках.

Практическая значимость

Разработанные методы конструирования и получения рекомбинантных вирусоподобных частиц - носителей антигенов вирусов гриппа и краснухи могут быть использованы для создания новых недорогих и эффективных рекомбинантных вакцин для профилактики этих заболеваний. В частности, НВс частицы - носители внеклеточного домена М2 белка вируса гриппа являются основой «универсальной» противогриппозной вакцины, эффективной в отношении различных штаммов вируса гриппа типа А, в том числе новых потенциально пандемических штаммов птичьего и свиного гриппа. Апробация работы

Полученные в диссертации результаты были представлены автором на следующих международных и российских конференциях: международном симпозиуме «От экспериментальной биологии к превентивной и интегративной медицине» (Судак, Украина, 2008), 12-ой международной Пущинской школы-конференции молодых ученых (Пущино, 2008г.), V съезде ВОГИС (Москва, 2009), The 1st Workshop on Plant Molecular Biotechnology - XV Biotechnology Summer School (Гданьск, Польша, 2009), конференции «Горизонты нанобиотехнологии» (Звенигород, 2009).

Личный вклад автора заключается в проведении экспериментальных и теоретических исследований. Основные результаты работы получены лично автором, под его непосредственным руководством или при его непосредственном участии в планировании и проведении экспериментов. Имена соавторов указаны в соответствующих публикациях. Публикации

По материалам диссертации опубликовано 9 печатных работ, в том числе 2 статьи в журналах, входящих в перечень ВАК. Получен патент на изобретение РФ.

Объем и структура диссертации

Материалы диссертации изложены на -1 i 2-странице машинописного текста и включают рисунков и L таблиц. Диссертация состоит из разделов: "Введение", "Цель и задачи работы", "Обзор литературы", "Материалы и методы", "Результаты", "Обсуждение", "Выводы", "Список публикаций по теме диссертации", "Список цитируемой литературы", который содержит 3 отечественных и l^S иностранных источника.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 1. Продукция вакцинных белков El н Е12 вируса краснухи в клетках бактерий Escherichia coli.

В качестве основы для создания рекомбинантной вакцины против краснухи мы использовали поверхностный вирусный гликопротеин El и полипептид Е12, представляющий собой фрагмент белка El с 154 по 239 аминокислоту. Полипептид Е12 содержит участок (199-239 а.о.), отвечающий за выработку вирус-нейтрализующих антител. Были сконструированы штаммы Е. coli - продуценты полипептида Е12 и полноразмерного белка El. Системы экспрессии были созданы на базе вектора pQE30 (Qiagen), обеспечивающего продукцию рекомбинантного белка с 6-гистидиновым N-концевым «тагом». Уровни экспрессии целевых белков определяли с помощью SDS-PAGE и Вестерн-блоттинга. Очистку рекомбинантного полипептида 6HIS-E12 проводили с помощью металл-афинной хроматографии. Как следует из полученных данных, полипептид Е12 экспрессируется в клетках Е. coli на уровне 5-10% общего растворимого белка. Полученный препарат использовался в дальнейших экспериментах в качестве контрольного. Полноразмерный белков El экспрессируется в Е. coli на низком уровне (менее 3% общего белка) и подвергается протеолизу, что не позволяет получить препараты полноразмерного белка. Для продукции El более перспективной является растительная система экспрессии.

2. Конструирование вирусоподобных НВс-частнц, представляющих на своей поверхности эпитопы El белка вируса краснухи и их получение в Е. coli.

В качестве основы для создания вирусоподобных частиц - носителей эпитопов El белка был использован ядерный антиген вируса гепатита В (НВс — антиген). Мономеры этого белка, состоящие из 183 а.о., собираются в икосаэдрические частицы диаметром 34 нм, состоящие из 240 субъединиц, организованных в димерные блоки. Последовательность НВс содержит аргинин-богатый С-концевой домен, связывающий вирусную ДНК при сборке вириона, при экспрессии в Е. coli этот домен связывает бактериальную РНК, наличие которой в вакцинном препарате нежелательно. Поскольку С-концевой домен (а.о. 150-183) не требуется для сборки частиц, он был удален и заменен остатком цистеина, введение которого повышает стабильность НВс частиц. Два района НВс могут быть использованы для презентации чужеродных пептидов на поверхности НВс частиц, - N конец белка и иммунодоминантная петля, расположенная между 75 и 85 аминокислотными остатками белка. Поэтому для презентации Е1-эпитопов было сконструировано две серии рекомбинантных генов, кодирующих гибридные НВс белки, содержащие вставку эпитопа либо на N-конце, либо в иммунодоминантной петле.

В качестве эпитопов белка El, которые должны быть представлены на поверхности НВс частиц, использовали полноразмерный пептид Е12 (199-239 а.о.) либо его укороченные производные, Е12_199 (199-239 а.о.) и Е12_209 (209-239 а.о. белка El), которые, тем не менее, содержат основной иммунодоминантный эпитоп El белка. Эти фрагменты клонировали как на N конец НВс, так и в район иммунодоминантной петли, гибридные белки экспрессировали в Е. coli с использованием вектора pQE60. Уровни экспрессии целевых белков определяли с помощью SDS-PAGE. Было установлено, что уровень экспрессии гибридных белков, содержащих

эпитоп Е12 как на N конце, так и в иммунодоминантной петле НВс антигена, крайне низкий (целевой продукт не детектируется). Аналогичные белки, содержащие фрагменты Е12_199, Е12_209 вируса краснухи в районе иммунодоминантной петли, синтезируются в Е. coli, но нерастворимы в неденатурирующих условиях. Крайне низким оказался и уровень экспрессии гибридного белка, содержащего эпитоп Е12_199 на N конце НВс. Только гибридный белок Е209НВс, содержащий на N-конце НВс антигена короткий эпитоп Е12_209, хорошо экспрессируется в Е. coli и в значительной степени находится в растворимой фракции (Рис. 1).

Рисунок 1. SDS-PAGE анализ белковых препаратов, выделенных из штамма-продуцента Е209НВс и препарата очищенных Е209НВс частиц.

1, - маркер мол. веса (отмечено положение маркеров 18 и 26 кД),

2, - белковый препарат из штамма-продуцента Е209НВс до индукции,

3, - белковый препарат из штамма-продуцента Е209НВс после индукции,

4, - белковый препарат из штамма-продуцента Е209НВс после индукции, растворимая фракция,

5, - препарат очищенных Е209НЬс частиц.

Положение Е209НВс указано стрелкой

Синтезированный в Е. coli и других системах экспрессии НВс антиген может собираться in vivo в вирусоподобные частицы. Поскольку гибридный белок Е209НВс экспрессировался в Е. coli и присутствовал в растворимой фракции, то можно было ожидать, что он образует рекомбинантные НВс-частицы в клетках штамма-продуцента. Поэтому были проведены эксперименты по выделению и очистке рекомбинатных НВс-частиц методом осаждения сульфатом аммония (патент РФ №2312146), в результате чего был получен препарат очищенных Е209НЬс - частиц. Структуру выделенных частиц анализировали с помощью электронной микроскопии. Проведенный анализ подтвердил факт сборки

1 2 3 4 5

Две?®?» iv ЩШШыШ;:

«»WV

. &

. :: .... : • - : '.х : .. •

I ',.,. j!

Щ.......

Г.

1 .. ■ .

■нив ШШШШшЁшШ Я1

гибридных белков Е12_209_НВс в наноразмерные частицы, сходные с частицами, образуемыми нативным НВс антигеном (Рис. 2). Таким образом включение Е12_209 пептида в Ы-конец НВс не вызывает нарушения сборки гибридных субъединиц НВс в вирусоподобные частицы или их агрегации.

Е209НВС НВс

Рисунок 2. Электронно-микроскопический анализ препаратов Е209НВс частиц (слева) и немодифицированных НВс частиц (справа).

Иммунологические характеристики препарата Е209НВс частиц в опытах на лабораторных животных были определены совместно с лабораторией П.Г. Свешникова (ОАО «ВНЦМДЛ»). Иммунизацию мышей препаратом Е209НВс наночастиц проводили двухкратно внутрибрюшинно (дозы по 20 мкг), без адъюванта Фрейнда и с адъювантом. В качестве отрицательного контроля использовали сыворотку здоровой мыши. Титры антител у иммунизированных животных определяли в ИФА, в качестве антигенов тестировали вирусоподобные частицы вируса краснухи, Е209НВс и немодифицированный НВс антиген. Как и следовало ожидать, Е209НВс частицы являются сильным иммуногеном, титр антител, связывающихся с сорбированным Е209НВс составлял более 1:800000. Титр антител, связывающихся с немодифицированным НВс, был примерно в 10 раз ниже, что свидетельствует о том, что включение эпитопа заметно

меняет иммунологические характеристики и, вероятно, структуру НВс частиц. Титр антител, связывающихся с ВПЧ вируса краснухи, составлял 1:10000, причем антитела иммунизированных мышей специфически связывались с Е1 белком в Вестерн-блоте. Титр антител не менялся в зависимости от наличия/отсутствия адъюванта, что свидетельствует о том, что НВс - наночастицы сами по себе являются эффективным адъювантом. Корректность выбора Е209 в качестве иммунодоминантного эпитопа белка Е1 подтверждается тем, что полученное против ВПЧ краснухи моноклональное антитело Ыиб, связывающееся с Е1, также специфически связывалось и с НВс частицами - носителями Е209 пептида, но не с немодифицированными НВс частицами. Таким образом, можно сделать вывод о том, что иммунизация животных сконструированными Е209НВс наночастицами приводит к активации иммунного ответа против Е1 белка вируса краснухи. Полученные результаты дают основания полагать, что Е209НВс частицы могут быть основой новой рекомбинантной вакцины против краснухи.

3. Конструирование вирусоподобных НВс-частиц, представляющих на своей поверхности внеклеточный домен М2 белка вируса «свиного» гриппа и их получение в Е. соН.

Одним из перспективных направлением разработки новых противогриппозных вакцин является использование в качестве их основы внеклеточного домена высококонсервативного мембранного белка М2 вируса гриппа, присоединенного к вирусоподобной частице - носителю. В качестве носителя, как и в предыдущем разделе работы, мы использовали НВс антиген.

Последовательность М2е высококонсервативна у всех «человеческих» штаммов вируса гриппа типа А, однако, у штаммов животного происхождения она существенно отличается. Так, М2е вируса «свиного» гриппа А/СаП&гша/04/2009(Н1Ш), вызвавшего пандемию

2009г., по 4 из 23 аминокислотных остатков отличается от консенсусной последовательности М2е «человеческих» штаммов (Рис. 3). Такие различия могут определять специфичность вакцин на основе М2е. Поэтому в этой части работы мы сконструировали рекомбинантные М2еНВс частицы, представляющие на своей поверхности М2е пептид вируса «свиного» гриппа А/СаИй>гша/04/2009(ШЫ1). Поскольку полученные в предыдущих разделах результаты показывают, что введение чужеродных последовательностей в иммунодоминантную петлю нарушает экспрессию и/или растворимость частиц, для конструирования химерных НВс-частиц в качестве места вставки М2е пептида был использован К'-копец белка.

хозяин штамм последовательность М2е пептида

свинья/ человек человек человек птица птица A/Califomia/04/2009 консенсусная последовательность A/PR/8/34 A/Chicken/Kurgany05/2005 А/Duck/ Potsdaml402-6/1986 SLLTEVETPTRSEWECRCSDSSD SLLTEVETPIRNEWGCRCNDSSD SLLTEVETPIRNEWGCRCNGS SD SLLTEVETPTRNEWECRCSDSSD SLLTEVETPTRNGWECKC SD S SD

Рисунок 3. Сравнение аминокислотных последовательностей внеклеточных доменов М2 белков различных штаммов вируса гриппа человека и животных. Отличия от консенсусной последовательности М2е «человеческого» вируса гриппа типа А выделены серым.

Синтезированый ген, кодирующий гибридный белкок М2еНВс со «свиным» М2е (далее - M2sHBc), клонировали в экспрессионном векторе pQE60. Гибридный белок хорошо экспрессируется в Е. coli (Рис. 4А) и в основном содержится в растворимой фракции. Далее были проведены эксперименты по выделению и очистке M2sHBc частиц из штамма-продуцента. Сборка М2еНВс в вирусоподобные наночастицы была подтверждена электронно-микроскопическим анализом очищенного препарата (Рис. 4В).

(А)

(В)

2 3 4

19 -

Рисунок 4. Получение и очистка М2еНВс частиц.

(A) Результаты анализа белковых препаратов с помощью SDS-PAGE.

1, - маркер молекулярной массы (показаны положения маркеров 19 и 26 кДа)

2, - белковый препарат из штамма DLT1270/ pQE-M2sHBc до индукции экспрессии M2sHBc

3, - то же, но через 16 часов после индукции экспрессии М2еНВс

4, - очищенный препарат М2еНВс частиц

(B) Электронно-микроскопический анализ препаратов M2sHBc - частиц.

Эффективность полученных препаратов в качестве кандидатных вакцин была исследована в ГУ НИИ гриппа СЗО РАМН на лабораторных животных. Мышей иммунизировали с применением для первого введения вакцины адъюванта TiterMax Gold Adjuvant (Sigma), а для двух последующих иммунизаций - неполного адъюванта Фрейнда. Для определения иммуногенности кандидатной вакцины были исследованы сыворотки мышей через 2 недели после 1-ой и после 3-ей иммунизации, для проведения ИФА использовали два синтетических пептида, последовательности которых соответствовали М2е вируса свиного гриппа A/California/04/2009 и вируса «птичьего» штамма A/Duck/Potsdam/1402-6/1986. Полученные результаты показывают, что после 3-х кратной иммунизации в высоких титрах (более 1:50.000) образуются сывороточные антитела изотипа IgG, связывающиеся как с синтетическим пептидом G-26 «свиного» гриппа A/California/7/2009, последовательность которого соответствовала использованному для иммунизации М2еНВс, так и с

синтетическим пептидом G-19, последовательность которого соответствуют М2е гетерологичного штамма «птичьего» гриппа.

Динамика гибели мышей после заражения адаптированными к мышам штаммами свиного и птичьего гриппа представлена на Рис. 5. Полученные данные свидетельствуют о 100% протективном действии M2sHBc в отношении свиного гриппа после трехкратной иммунизации. Частичная защита от инфекции (60% выживаемость в опытной группе против 13% в контрольной), наблюдалась и в отношении «птичьего» штамма А/Duck/ Potsdam/1402-6/1986, у которого аминокислотная последовательность М2е пептида отличается от таковой у «свиного» штамма. Таким образом, полученные M2sHBc частицы могут являться основой создания рекомбинантной вакцины против" современного пандемического «свиного» гриппа H1N1.

Заражение вирусом А/ С a lifo rn i aí4/200Э (H1N1) Заражнии» вирусом A;t'<ick;pot5rtam/1»i02-6/19fl6 (И5№) .....------............

ч

\ 1 \

-«- Контроль \ -«■■■мгашс ...............1 '"•■■■

\

■ЛСГк-Нйс

12)4 ■ 1} " S Л 10 11 i: 13 11

О 1 I Í 4 5 Г S 5 11! 11 U О 14

Дни поел* мраж»н*я Дни поел» )аро*»ния

Рисунок 5. Динамика гибели мышей, иммунизированных М2зНВс частицами, после заражения различными штаммами вируса гриппа (доза 5 Ы)/5о).

Консервативность аминокислотной последовательности М2 белка стала основой разработки противогриппозных вакцин «универсального» действия на его основе. Поскольку практически все выделенные из человеческой популяции вирусы гриппа типа А имеют одинаковую последовательность М2е, перспектива создания такой вакцины является реальной. Однако, появившиеся в последние годы штаммы животного происхождения, в частности вирус «свиного» гриппа, имеют отличия в

последовательности М2е пептида и, как показывают полученные нами результаты, эффективность М2е-вакцин в отношении гетерологичных штаммов гриппа является более низкой. Одним из путей создания М2е вакцин, эффективных в отношении широкого спектра штаммов гриппа, как человеческих, так и животных, может стать включение в состав М2еНВс частиц нескольких копий М2е пептида, последовательности которых соответствуют различным штаммам гриппа человека и животных.

4. Конструирование самореплицнругощихся вирусных векторов для экспрессии целевых белков в растениях

Целью этой части работы было конструирование фитовирусных векторов для последующей продукции в растениях вакцинных белков вирусов краснухи и гриппа. Ряд таких экспрессионных векторов на основе геномов Х-вируса картофеля, был сконструирован на Кафедре Вирусологии Биологического факультета МГУ и в Центре «Биоинженерия» РАН.

В качестве основы для создания новых вирусных векторов был использован описанный в работе (Комарова и др. 2006) вирусный вектор рА7248 (PVXdt_GFP), основанный на геноме вируса X картофеля (ХВК). Этот вектор включает 5'-нетранслирумый участок генома ХВК, ген полимеразы, первый промотор субгеномной РНК, целевой ген gfp, последние 60 нуклеотидов гена белка оболочки и З'-нетранслируемый участок генома ХВК. Вся эта конструкция помещена между 35S промотором и 35S терминатором и клонирована в бинарном векторе pBIN19. При доставке в клетки с помощью агроинфильтрации листьев происходит заражение большей части клеток листа в инфицированной области, репликация вирусного вектора в отдельных клетках, синтез субгеномных РНК и экспрессия целевого гена на высоком уровне.

Эффективность вирусного вектора определяется как уровнем накопления мРНК вектора в инфицированных клетках, так и

эффективностью ее трансляции. Примером трансляционного энхансера, повышающего эффективность трансляции мРНК в растениях является 5'-нетранслируемая (лидерная) последовательность РНК 4 вируса мозаики люцерны, далее именуемая AMV. Однако, влияние этой последовательности, равно как и других трансляционных энхансеров, на эффективность фитовирусных векторов не исследовалось. Поэтому была поставлена задача конструирования нового фитовирусного вектора на основе генома X вируса картофеля, содержащего непосредственно перед целевым геном последовательность трансляционного энхансера AMV, что в соответствии с нашим предположением могло повысить продуктивность вирусной системы экспрессии в несколько раз за счет повышения эффективности трансляции содержащей целевой ген субгеномной РНК.

На первом этапе на основе вектора рА7248 был создан вектор рА7248Т, содержащий на месте гена gfp ген устойчивости к тетрациклину (tet). Этот вектор дает возможность осуществлять клонирование целевого гена в один этап, с использованием уникальных сайтов рестриктаз Asel (ggcgcgcc) и Smal (cccggg). На следующем этапе перед геном tet была клонирована последовательность трансляционного энхансера AMV, в результате чего был создан вектор pA7248amvT, который в дальнейшем использовали для экспрессии целевых белков в растениях.

Для определения влияния трансляционного энхансера AMV на уровень продукции целевого белка вирусом-вектором, было сконструировано два репортерных вирусных вектора, в которых ген tet был заменен на репортерный ген gfp, - pA7248GFP и pA7248amvGFP, отличающиеся отсутствием или наличием последовательности AMV между точкой начала субгеномной РНК и геном gfp (Рис. 5).

pA7248amv-GFP

ЧпП1 Xbal Asel Smal BsrGI

Рисунок 5. Схемы вирусных векторов

F

цз Векторы рА7248Т и рА7248атуТ имеют такие же структуры, но содержат ген вместо гена ^р.

pA7248-GFP.

pA7248AMV-GFP и

7СМСЛ Я ГТТАТГГГТААТТПСТТТСААЛТЛСПгСАТОА CSCSCCCCATQ

PA7248-GFP

Xbal Asel Smal BsrGI

üHb-i—i-

35S-T Lß

TCTAGA GGCGCGCC filfi

Показаны области Т-ДНК вирусных векторов. 5' и 3' - нетранслируемые области генома ХВК; RDRP - РНК зависимая РНК иолимераза ХВК; Sgpl - первый субгеномный промотор ХВК. 3SS - промотор, 35S-T - терминатор РНК вируса мозаики цветной капусты. LB и RB - левая и правая границы Т-ДНК. Первый кодон гена gfp подчеркнут, нуклеотидкая последовательность AMV выделена серым, последовательности сайтов рестрикции Xbal и Asel выделены курсивом.

Для сравнения эффективности сконструированных нами векторов проводили эксперимент по транзиентной экспрессии гена gfp. Для этого агробактерии, содержащие экспрессионные векторы, вводили в клетки N. benthamiana с помощью агроинфильтрации. Через 3 суток из зон агроинфильтрации отбирали пробы растительной ткани и проводили количественное определение белка GFP. Было установлено, что уровень синтеза GFP при использовании вектора pA7248amvGFP примерно в 4 раза (3,6±0,4) выше, чем для аналогичного вектора без AMV. Общее количество синтезируемого GFP отражает как процессы трансляции мРНК, так и ее содержание в клетке, обусловленное уровнем ее синтеза и/или стабильностью. Поэтому для определения того, какой из этих факторов определяет обнаруженные нами различия в содержании GFP, был проведен эксперимент по сравнению концентраций мРНК gfp в растениях-продуцентах. С помощью количественной ОТ-ПЦР было установлено, что наличие AMV не влияет содержание мРНК gfp в клетке. Таким образом, повышенный уровень синтеза GFP в случае использования вируса-вектора pA7248-AMVGFP, обусловлен именно более эффективной трансляцией субгеномной РНК.

5. Экспрессия в растениях белка Е1 вируса краснухи и рекомбинантных НВс частиц, несуших эпитопы этого белка.

Для экспрессии в растениях вакцинных белков вируса краснухи было применено два подхода. Во-первых, экспрессия полноразмерного белка Е1, который может являться основой создания рекомбинантной вакцины. Во-вторых, были разработаны системы экспрессии вирусоподобных частиц на основе НВс антигена, содержащих эпитопы белка Е1.

Для экспрессии в растениях к полноразмерному гену Е1 белка были присоединены последовательности, кодирующие Ы-концевой полигистидиновый «таг» и С- концевую последовательность сигнала локализации в эндоплазматическом ретикулуме, БЕКОЕЕ. Синтетический ген Е1 клонировали в вирусном векторе рА7248атуТ (Рис. 6) и экспрессировали в растениях N. Ьешкат1апа с помощью агроинфильтрации.

рА7248агшТ

35S

,35S-T

6Hisr

Е12

,SEKDEL

Hbc

pA7248amvE1 pA7248amvE12

pA7248amvHBc

pA7248E12HBc

Рисунок 6. Вирусные векторы, обеспечивающие продукцию НВс антигена и вакцинных белков вируса краснухи в растениях.

Продукцию белка El анализировали методом Вестерн-блоттинга с использованием антител, полученных к экспрессированному в Е. coli

пептиду Е12. В результате было установлено, что полноразмерный белок El хорошо экспрессируется в растениях, но нерастворим в неденатурирующих условиях. Уровень экспрессии составлял 3-5% общего белка. В отличие от экспрессии в Е. coli, в клетках растений не наблюдалось протеолиза El белка (Рис. 7). В делом полученные данные позволяют сделать заключение о том, что растительная система экспрессии может быть использована для получения El белка в практически-значимых количествах.

Рисунок 7. Вестерн-блот анализ белковых препаратов, выделенных из растений-продуцентов Е1 белка (слева) и Е12НВс частиц (справа).

1. Маркер молекулярного веса, размеры полос указаны в килодальтонах

2. Неинокулированные листья N. ЬеШкат'шпа - нерастворимая фракция

3.Листья N. ЬепЛттапа, инокулированные вирусом-вектором рА7248атуЕ1 (слева) или рА7248атуЕ12НВс (справа) - нерастворимая фракция.

В растворимой фракции белки Е1 и Е12НВс не обнаружены.

Поскольку НВс антиген используется в качестве белка-носителя для создания вирусоподобных частиц, содержащих эпитопы вирусов краснухи и гриппа, нами была поставлена задача создания эффективной системы получения НВс-частиц в растениях. Известно, что природный НВс антиген плохо экспрессируется в растениях, возможно, вследствие неоптимального для растений кодонового состава природного гена НВс. Поэтому, прежде всего был проведен дизайн и синтез искусственного гена НВс, последовательность которого была оптимизирована по кодоновому составу для экспрессии в растениях. Синтетический ген НВс клонировали в векторе рА7248атуТ. Для экспрессии НВс в растениях созданный вирусный вектор рА7248атуНВс вводили в клетки N. ЬепЛат1апа с

1 г з

1 2 з

помощью агроинфильтрации. Продукцию НВс анализировали с помощью электрофореза в ДСН-ПААГ и Вестерн-блоттиига. Было установлено, что НВс экспрессируется в растениях на уровне 1-2% общего белка и находится в растворимой фракции.

Два эпитопа Е1 белка были использованы в экспериментах по продукции в растениях рекомбинантных НВс-частиц, - эпитоп Е12 (154 -239 а.о. белка Е1) и его укороченный вариант Е12гс1 (165-239 а.о. белка Е1). Эпитоп Е12 присоединяли к И-концу НВс (гибридный белок Е12НВс), а в случае эпитопа Е12гс1 были созданы химерные гены, обеспечивающие экспрессию эпитопа как N конце НВс (ген Е12г(1НВс), так и в районе иммунодоминантной петли (ген НВс/Е12пЗ). Синтетические гены Е12НВс, Е12г<ШВс и НВс/Е12гс1 клонировали в вирусном векторе "рА7248ашуТ и экспрессировали в растениях N. ЬепЛатгапа. Анализ белковых препаратов, выделенных из растений-продуцентов, показал, что гибридный белок Е12НВс синтезируется в растениях, но находится в нерастворимой фракции, уровень экспрессии составляет 0.9%. Напротив, гибридные белки Е12гсШВс и НВС/Е12г<1 синтезируются в клетках N. Ьеп1кат1апа и в основном присутствуют в растворимой фракции. Однако уровень экспрессии этих белков не превышает 0.1% общего белка.

5. Создание систем экспрессии в растениях вирусоподобных НВс-частиц, представляющих на своей поверхности внеклеточный домен М2 белка вируса гриппа.

Полученные результаты показывают, что искусственный ген НВс, может эффективно экспрессироваться в растениях N. ЬепЛштапа с помощью вирусного вектора рА7248атуТ, причем синтезированный НВс присутствует во фракции растворимых белков. Поэтому аналогичный подход был использован для экспрессии в растениях химерного НВс с присоединенным М2е пептидом.

Мы синтезировали искусственный ген М2ерНВс, кодирующий гибридный белок, содержащий М2е пептид вируса гриппа на N-конце НВс антигена. Последовательность М2е соответствует штамму вируса гриппа птиц A/Duck/Potsdam/1402-6/1986 (H5N2).

Для создание вирусного вектора - продуцента М2еНВс белка последовательность М2ерНВс клонировали в pA7248AMV в результате чего был сконструирован рекомбинантный вектор pA7248amvM2epHBc. Вектор вводили в штамм A. tumefaciens GV3101, рекомбинантные белки экспрессировали в листьях N. benthamiana используя методику агроинокуляции. Для подавления пост-транскрипционного ген-сайленсинга одновременно в листья растений инфильтрировали агробактерии, содержащие вектор-продуцент белка Р19. Через 6-10 суток выделяли препараты белков из зон агроинфильтрации. Для определения выхода целевого белка М2ерНВс полученные препараты анализировали с помощью Вестерн-блот анализа. Результаты анализа белковых препаратов, выделенных из растений - продуцентов представлены на Рис. 8. Из полученных результатов следует, что белок М2ерНВс эффективно экспрессируется в клетках N. benthamiana, причем является растворимым. Выход М2ерНВс составляет 1-2% от фракции растворимых белков.

На следующем этапе вирусоподобные частицы, образованные М2ерНВс, очищали разработанным нами методом осаждения сульфатом аммония, а затем дифференциальным центрифугированием в градиенте сахарозы и хлористого цезия, что позволило получить препарат чистотой более 90%. Электронно-микроскопический препаратов анализ подтвердил сборку гибридных белков М2ерНВс в наноразмерные частицы (Рис. 9).

(А)

3 4

(В)

2 3

(С)

Рисунок 8. Вестерн-блот (А, В) и электрофоретический (С) анализ белковых препаратов, выделенных из растений-продуцентов рекомбинантных вирусоподобных НВс- частиц.

(A) Детекция моноклональными антителами против НВс.

(B) Детекция моноклональными антителами против М2е пептида.

(C) Белковый препарат М2ерНВс, выделенный из N. ЬепЛат1апа, дважды осажденный сульфатом аммония. Положение М2ерНВс указано стрелкой.

1, - маркер молекулярного веса, размеры полос указаны в килодальтонах,

2, - растворимые белки из неинокулированных листьев N. Ьеп1Иат!апа,

3, - растворимые белки из листьев N. ЬепЛат1апа, инокулированных вирусом-вектором рА7248ашуМ2ерНВс,

4, - растворимые белки из листьев N. Ъешкат'шпа, инокулированных вирусом-вектором рА7248атуНВс.

Проведенные в НИИ гриппа СЗО РАМН на лабораторных животных эксперименты показали, что полученные в растениях М2ерНВс частицы являются высокоиммуногенными, а иммунизация ими мышей обеспечивает защиту от летальной гриппозной инфекции.

IV" 1 шш

шГгтш

А«

м

" * V РУЯг!

■р

Рисунок 9. Электронно-микроскопический анализ полученных в растениях М2ерНВс частиц, очищенных с помощью осаждения сульфатом аммония и ультрацентрифугирования.

выводы

1. Сконструированы и получены в клетках Escherichia coli рекомбинантные вирусоподобные частицы на основе НВс антигена вируса гепатита В, содержащие эпитоп белка El вируса краснухи.

2. Сконструированы и получены в клетках Escherichia coli рекомбинантные вирусоподобные частицы на основе НВс антигена вируса гепатита В, содержащие внеклеточный домен М2 белка вируса гриппа.

3. На основе генома X вируса картофеля создан вирусный вектор для продукции рекомбинантных белков в растениях, содержащий перед целевым геном последовательность 5'-нетранслируемого района РНК 4 вируса мозаики люцерны. Введение этой последовательности в вирус-вектор позволяет повысить уровень продукции целевого белка в растениях в 3-4 раза за счет повышения эффективности трансляции содержащей целевой ген субгеномной РНК.

4. Созданы фитовирусные системы продукции в растениях белка El вируса краснухи и рекомбинантных вирусоподобных частицы на основе НВс антигена вируса гепатита В, содержащих эпитоп белка El.

5. Созданы фитовирусные системы продукции в растениях рекомбинантных вирусоподобных частиц на основе НВс антигена вируса гепатита В, содержащих внеклеточный домен М2 белка вируса гриппа.

СПИСОК РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Равин Н.В., Марданова Е.С., Котляров Р.Ю., Новиков В.К., Атабеков И.Г., Скрябин К.Г. Определение полной нуклеотидной последовательности генома нового штамма X вируса картофеля и создание на его основе вирусного вектора для продукции целевых белков в растениях. // Биохимия. -2008 - Т.73, - С. 54 - 61.

2. Марданова Е.С., Котляров Р.Ю., Равин Н.В. Повышение эффективности продукции рекомбинантных белков в растениях за счет оптимизации трансляции РНК вируса-вектора. // Молекулярная биология. - 2009 - Т.43, №3, - С. 568-571.

3. Котляров Р.Ю., Марданова Е.С. Расшифровка генома нового высокопатогенного штамма Х-вируса картофела «Ока-2» и клонирование кДНК копии его генома. // XIV Международная Конференция студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов 2007», Россия, Москва. - Т.1.-С. 14.

4. Котляров Р.Ю., Марданова Е.С. Продукция вакцинных белков вируса краснухи в растениях. // Международный симпозиум «От экспериментальной биологии к превентивной и интегративной медицине», Украина, Крым, Судак. - 2008 - С. 76.

5. Котляров Р.Ю., Марданова Е.С. Конструирование вирусных векторов для продукции рекомбинантных белков в растениях. // «12-ая международная Пущинская школа-конференция молодых ученых», Россия, Пущино. - 2008 - С. 210.

6. Котляров Р.Ю., Марданова Е.С. Конструирование рекомбинантных вирусоподобных наночастиц — носителей эпитопов вирусов краснухи и гриппа. // V съезд ВОГИС, Россия, Москва. - 2009 - Т.2, С. 376

7. Kotlyarov R.Y., Mardanova E.S. Construction of recombinant virus-like nanoparticles carrying epitopes of rubella and influenza viruses. //The Г1 Workshop on Plant Molecular Biotechnology - XV Biotechnology Summer School, Gdansk, Poland, - 2009 - P. 61.

8. Котляров Р.Ю., Марданова Е.С. Создание систем экспрессии в растениях вакцинных белков краснухи и гриппа. // «Горизонты нанобиотехнологии», Россия, Звенигород. -2009-С. 51.

9. Ravin N.V., Kotlyarov R.Y., Kuprianov V.V., Mardanova E.S., Dykov M., Grudinin M.P., Kiselev O.I., Skryabin K.G. (2010) Development of plant viral

expression systems for production of influenza virus vaccine proteins in plants. // X European congress of virology, Cernobbio, Italy, - 2010 -P. 282.

По результатам работы получен патент РФ на изобретение (№ 2390563). Котляров Р.Ю., Марданова Е.С., Равин Н.В., Свешников П.Г., Скрябин К.Г. Рекомбинантный вирусный вектор для продукции в растениях белка Е1 вируса краснухи (варианты) и система экспрессии белка Е1 вируса краснухи в клетках растения (варианты).

Подписано в печать:

19.05.2010

Заказ №3770 Тираж-75 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Котляров, Роман Юрьевич

ВВЕДЕНИЕ

ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ РАБОТЫ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1. Вирусоподобные частицы как основа создания новых вакцин

2. Конструирование вирусоподобных частиц на основе ядерного антигена вируса 12 гепатита В

3. Перспективы создания рекомбинантных вакцин против краснухи

4. Перспективы создания противогриппозных вакцин

5. Растения как «биофабрики»

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

РЕЗУЛЬТАТЫ

1. Продукция вакцинных белков El и El2 вируса краснухи в клетках Е. coli.

2. Конструирование вирусоподобных НВс-частиц, представляющих на своей поверхности эпитопы El белка вируса краснухи и их получение в Е. coli.

3. Конструирование вирусоподобных НВс-частиц, представляющих на своей поверхности внеклеточный домен М2 белка вируса «свиного» гриппа и их получение в Е. coli.

4. Создание самореплицирующихся вирусных векторов для экспрессии целевых белков в растениях

5. Создание фитовирусных систем экспрессии вакцинных белков вирусов краснухи и гриппа в растениях. "

ОБСУЖДЕНИЕ

1. Конструирование вирусоподобных частиц на основе НВс-антигена — носителей эпитопов.

2. Оптимизация вирусных систем экспрессии рекомбинантных белков в растениях

3. Функциональные характеристики вирусоподобных НВс частиц - носителей эпитопов вирусов краснухи и гриппа.

ВЫВОДЫ

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Введение Диссертация по биологии, на тему "Вирусоподобные наноразмерные частицы - носители антигенов вирусов гриппа и краснухи"

Человечество использует вакцины на протяжении многих веков. Однако в современном понимании, первая вакцина и процедура вакцинации была изобретена в конце 18 века, а термин «вакцина» появился еще век спустя. Самым первым прототипом вакцины было использование ослабленной формы возбудителя заболевания. Позднее были разработаны способы химической и физической обработки микроорганизмов, позволяющие их обезвредить, но сохранить иммуногенные свойства. Следующим этапом явилось создание белковых вакцин, то есть вакцин, использующих один или несколько белков или даже их отдельных фрагментов-эпитопов патогенного организма. Этот подход позволяет создавать безопасные вакцины, так как риск реверсии к патогенной форме сводится к нулю. Однако вследствие значительных отличий в генерации иммунного ответа против целого патогена и против отдельных белков, подобные вакцины могут вызывать гораздо менее выраженный иммунный ответ, чем в случае использования аттенуированных или инакти-вированных возбудителей.

Решением этой проблемы может являться направленное конструирование наноструктур, имитирующих патоген и содержащих отдельные белки патогена на поверхности частицы-носителя. Данный подход позволяет использовать преимущества белковых вакцин и нивелировать их недостатки, имитируя взаимодействие вируса с иммунной системой.

В качестве носителей антигенов могут быть использованы как искусственные структуры, так и объекты биологического происхождения. Способность биологических макромолекул к самосборке и самоорганизации является одной из отличительных черт живых систем и предоставляет поистине неисчерпаемые возможности для использования биомолекул в качестве «строительных» блоков «молекулярного конструктора» для направленного создания новых наноархитектур с заданными пространственными и функциональными свойствами. Одним из наиболее ярких примеров таких структур, обладающих четкой симметрией, обширными возможностями направленной модификации современными методами генной инженерии являются вирусные частицы и имеющие сходную структуру вирусоподобные частицы (ВПЧ), образуемые в результате самособорки кап-сидных белков вирусов. В отличие от вирусов, такие вирусоподобные частицы не содержат генетического материала и являются полностью безопасными. С использованием методов генетической инженерии можно получить «химерные» капсидные белки, к которым присоединен целевой антиген, в результате самосборки таких гибридных белков могут быть получены рекомбинантные ВПЧ, на поверхности которых представлен целевой антиген. Представление антигенных детерминант на поверхности ВПЧ обеспечивает их высокую иммуногенность в сочетании с высоким выходом, легкостью очистки и стабильностью при хранении. Эффективность такого подхода иллюстрируется многочисленными примерами создания ВПЧ для борьбы с такими инфекционными заболеваниями, как малярия, бешенство, вирусные гепатиты и т.д.

Рекомбинантные ВПЧ - вакцины могут быть получены в различных системах гете-рологичной экспрессии, включая бактерии, дрожжи, клетки животных и растения. Растения могут стать недорогой и эффективной «биофабрикой» для получения таких вакцин, поскольку для роста растений требуется лишь почва, вода и солнечный свет. Важными преимуществами растительных систем экспрессии являются безопасность продукта (растения и человека не имеют общих патогенов), возможность получения больших объемов биомассы и наличие у растений многих систем посттрансляционных модификаций белков, характерных для млекопитающих. Традиционные методы получения рекомбинант-ных белков в растениях предполагают проведение генетической трансформации ядерного или хлоропластного генома, однако, обычной проблемой являете я низкий выход рском-бинантного белка, обусловленная им высокая стоимость очистки, а также длительное время, необходимое для создания растений-продуцентов и ограничения их культивирования. Альтернативой являются вирусные системы транзиентной экспрессии. Амплификация целевого гена при репликации вируса-вектора в клетке растения обеспечивает высокий уровень экспрессии в течение нескольких дней.

Предметом настоящей работы является дизайн и получение рекомбинантных вирусоподобных частиц - носителей антигенов возбудителей двух социально-значимых заболеваний, - гриппа и краснухи. В качестве основы для создания рекомбинантных ВПЧ мы использовали ядерный антиген вируса гепатита В (НВс - антиген), мономеры которого самособираются в наноразмерные вирусоподобные НВс-частицы. Мы сконструировали рекомбинантные НВс-частицы, представляющие на своей поверхности эпитопы белка El вируса краснухи и М2 белка вируса гриппа, и разработали методы их получения в бактериях Escherichia coli и в растениях Nicotiana benthamiana с помощью вирусных векторов на основе вируса X картофеля. Иммунологические характеристики рекомбинантных НВс-частиц были определены в экспериментах на лабораторных животных.

ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ РАБОТЫ

Целью работы является конструирование вирусоподобных наноразмерных частиц -носителей вакцинных белков вирусов гриппа и краснухи, и разработка методов их продукции в бактериях и растениях.

При этом были поставлены следующие основные задачи:

1. Создание систем экспрессии в клетках Escherichia coli вакцинных белков вируса краснухи и рекомбинантных НВс-частиц - носителей иммунодоминантных эпитопов белка El.

2. Получение рекомбинантных НВс-частиц, несущих М2е пептид вируса гриппа, в клетках Escherichia coli.

3. Конструирование самореплицирующихся вирусных векторов для экспрессии целевых белков в растениях.

4. Создание систем экспрессии вакцинных белков вируса краснухи и гриппа в растениях Nicotiana benthamiana с помощью вирусных векторов.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Котляров, Роман Юрьевич

выводы

1. Сконструированы и получены в клетках Escherichia coli рекомбинантные вирусоподобные частицы на основе НВс антигена вируса гепатита В, содержащие эпитоп белка El вируса краснухи.

2. Сконструированы и получены в клетках Escherichia coli рекомбинантные вирусоподобные частицы на основе НВс антигена вируса гепатита В, содержащие внеклеточный домен М2 белка вируса гриппа.

3. На основе генома X вируса картофеля создан вирусный вектор для продукции рекомби-нантных белков в растениях, содержащий перед целевым геном последовательность 5'-нетранслируемого района РНК 4 вируса мозаики люцерны. Введение этой последовательности в вирус-вектор позволяет повысить уровень продукции целевого белка в растениях в 3-4 раза за счет повышения эффективности трансляции содержащей целевой ген субгеномной РНК.

4. Созданы фитовирусные системы продукции в растениях белка El вируса краснухи и рекомбинантных вирусоподобных частицы на основе НВс антигена вируса гепатита В, содержащих эпитоп белка El.

5. Созданы фитовирусные системы продукции в растениях рекомбинантных вирусоподобных частиц на основе НВс антигена вируса гепатита В, содержащих внеклеточный домен М2 белка вируса гриппа.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Равин Н.В., Марданова Е.С., Котляров Р.Ю., Новиков В.К., Атабеков И.Г., Скрябин К.Г. (2008). Определение полной нуклеотидной последовательности генома нового штамма X вируса картофеля и создание на его основе вирусного вектора для продукции целевых белков в растениях. Биохимия т.73, стр. 54 — 61.

2. Марданова Е.С., Котляров Р.Ю., Равин Н.В. (2009) Повышение эффективности продукции рекомбинантных белков в растениях за счет оптимизации трансляции РНК вируса-вектора. Молекулярная биология т. 43, №3, стр. 568—571.

3. Котляров Р.Ю., Марданова Е.С. (2007) Расшифровка генома нового высокопатогенного штамма Х-вируса картофеля «Ока-2» и клонирование кДНК копии его генома. Тезисы XIV Международной Конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов 2007», т.1., стр. 14, Россия, Москва.

4. Котляров Р.Ю., Марданова Е.С. (2008) Продукция вакцинных белков вируса краснухи в растениях. Тезисы международного симпозиума «От экспериментальной биологии к превентивной и интегративной медицине», стр. 76, Украина, Крым, Судак.

5. Котляров Р.Ю., Марданова Е.С. (2008) Конструирование вирусных векторов для продукции рекомбинантных белков в растениях. Тезисы «12-ой международной Пущинской школы-конференции молодых ученых», стр. 210, Россия, Пущино.

6. Котляров Р.Ю., Марданова Е.С. (2009) Конструирование рекомбинантных вирусоподобных наночастиц - носителей эпитопов вирусов краснухи и гриппа. Тезисы V съезда ВОГИС, т.2, стр. 376, Россия, Москва.

7. Kotlyarov R.Y., Mardanova E.S. (2009) Construction of recombinant virus-like nanoparticles carrying epitopes of rubella and influenza viruses. Abstracts of The 1st Workshop on Plant Molecular Biotechnology - XV Biotechnology Summer School, Gdansk, Poland, p. 61.

8. Котляров Р.Ю., Марданова Е.С. (2009) Создание систем экспрессии в растениях вакцинных белков краснухи и гриппа. Тезисы конференции «Горизонты нанобиотехноло-гии», стр. 51, Россия, Звенигород.

9. Ravin N.V., Kotlyarov R.Y., Kuprianov V.V., Mardanova E.S., Dykov M., Grudinin M.P., Kiselev O.I., Skryabin K.G. (2010) Development of plant viral expression systems for production of influenza virus vaccine proteins in plants. Abstracts of the X European congress of virology, p. 282, Cernobbio, Italy.

По результатам работы получен патент РФ на изобретение № 2390563 (заявка № 2008141402 от 21.10.2008г.):

Котляров Р.Ю., Марданова Е.С., Равин Н.В., Свешников П.Г., Скрябин К.Г. Рекомби-нантный вирусный вектор для продукции в растениях белка Е1 вируса краснухи (варианты) и система экспрессии белка Е1 вируса краснухи в клетках растения (варианты).

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Котляров, Роман Юрьевич, Москва

1. Гендон Ю.З. (2001) Живые холодоадаптированные реассортантные гриппозные вакцины //Вопр. вирусологии, Т.З, с. 5-12.

2. Гендон Ю.З. (2002) Культуральные гриппозные вакцины // Вопр. Вирусологии, Т.6, с.4-11.

3. Гендон Ю.З. (2007) Вакцины и химиопрепараты для профилактики гриппа // Вопр. Вирусологии, Т.1, с.4-10.

4. Киселев О.И., Цыбалова Л.М., Покровский В.И. (2006) Состояние разработки вакцин против вируса гриппа H5N1 в мире и России. // Журнал микробиол. эпидемиол. имму-нобиол, № 5., С. 28-38.

5. Комарова Т.В., Скулачев М.В., Зверева A.C., Шварц А.М., Дорохов Ю.Л., Атабеков И.Г. (2006) Новый вирус-вектор для эффективной продукции целевых белков в растениях. // Биохимия, т.71(8), с. 1043-1049.

6. Муррей Р. (1969) Производство и испытание в США гриппозной вакцины, приготовленной из вируса гриппа Гонконг в 1968/1969 г. // Бюлл. ВОЗ. Грипп Гонконг, Т.41, с. 509-511.

7. Покровский В.И., Киселев О.И. (2005) Грипп птиц: происхождение инфекционных биокатастроф. // СПб., Изд-во «Росток», с. 376.

8. Покровский В.И., Киселев О.И. (2009) Пандемия 2009. Новый вирус H1N1 .// СПб.: Изд-во «Росток», с.210.

9. Равин Н.В., Киселев О.И., Скрябин К.Г. (2009) Универсальная вакцина против гриппа птиц. // Патент РФ № 2358981 от 20.06.2009г.

10. Al-Mazrou A., Scheifele D.W., Soong Т., Bjornson G. (1991) Comparison of adverse reactions to whole-virion and split-virion influenza vaccines in hospital personnel. // CMAJ, V. 145(3), P.213-218.

11. Azhakanandam K., Weissinger S.M., Nicholson J.S., Qu R. Weissinger A. K. (2007) Ampli-con-plus targeting technology (APTT) for rapid production of a highly unstable vaccine protein in tobacco plants. // Plant Mol Biol, V.63, p.393-404.

12. Bachmann M.F., Rohrer U.H., Kiindig T.M., Biirki K., Hengartner H., Zinkernagel R.M. (1993) The influence of antigen organization on B cell responsiveness. // Science, V.262(5138), p. 1448-1451.

13. Bardeletti G., Kessler N., Aymard-Henry M. (1975) Morphology, biochemical analysis and neuraminidase activity of rubella virus. // Arch Virol., V.49(2-3). p. 75-86.

14. Belshe R., Lee M.S., Walker R.E., Stoddard J., Mendelman P.M. (2004) Safety, immuno-genicity and efficacy of intranasal, live attenuated influenza vaccine. // Expert Rev. Vaccines, V.3(6), p.643-654.

15. Black R.A., Rota P.A, Gorodkova N., Klenk H.D., Kendal A.P. (1993) Antibody response to the M2 protein of influenza A virus expressed in insect cells. // J. Gen. Virol., V.74(Pt 1), p.143-146.

16. Borisova G., Borschukova O., Skrastina D., Mezule G., Dislers A., Petrovskis I., Ose V., Gusars I., Pumpens P., Grens E. (1997) Display vectors. . Hepatitis B core particle as a display moiety. // Proc Latv Acad Sei., V.51, p. 1-7.

17. Böttcher B., Tsuji N., Takahashi H., Dyson M. R., Zhao S., Crowther, R. A., and Murray K. (1998) Peptides that block hepatitis B virus assembly: Analysis by cryomicroscopy, mutagenesis and transfection. // EMBO J., V.17, p.6839-6845.

18. Burreil, C.J., MacKay, P., Greenaway, P.J., Hofschneider, P.H., Murray, K. (1979) Expression in Escherichia coli of hepatitis B virus DNA sequences cloned in plasmid pBR322. // Nature, V.279, 43^8.

19. Carrington J.C., Freed D.D. (1990). Cap-independent enhancement of translation by a plant potyvirus 5'-nontranslated region. // J. Virol., V.64, p.1590-1597.

20. Chapman S., Kavanagh T., Baulcombe D. (1992). Potato virus X as a vector for gene expression in plants. // Plant J., V.2, p. 549-557.

21. Chaye H.H, Ou D., Chong P., Gillam S. (1993) Human T- and B-cell epitopes of El glycoprotein of rubella virus. // J Clin Immunol., V. 13(2), p. 93-100.

22. Chaye H.H., Mauracher C.A., Tingle A.J., Gillam S. (1992) Cellular and humoral immune responses to rubella virus structural proteins El, E2, and C. // J Clin Microbiol., V.30(9), p. 2323-2329.

23. Chen B.J., Leser G.P., Jackson D., Lamb R.A. (2008) The influenza virus M2 protein cytoplasmic tail interacts with the Ml protein and influences virus assembly at the site of virus budding. // J. Virol., V.82(20), p. 10059-10070.

24. Chen R., Holmes E.C. (2006) Avian influenza virus exhibits rapid evolutionary dynamics. // Mol. Biol. Evol., V.23(12), p.2336-2341.

25. Claas E.C., Osterhaus A.D., van Beek R., De Jong J.C., Rimmelzwaan G.F., Senne D.A., Krauss S., Shortridge K.F., Webster R.G. (1998) Human influenza A H5N1 virus related to a highly pathogenic avian influenza virus. // Lancet., V.351(9101), p. 472-477.

26. Clarke, B.E., Newton, S.E., Carroll, A.R., Francis, M.J., Appleyard, G., Syed, A.D., High-field, P.E., Rowlands, D.J., Brown, F. 1987. Improved immunogenicity of a peptide epitope after fusion to hepatitis B core protein. //Nature 330, 381-384.

27. Clarke B.E., Newton S.E., Carroll A.R., Francis M.J., Appleyard G., Syred A.D., Highfield P.E., Rowlands D.J., Brown F. (1987) Improved immunogenicity of a peptide epitope after fusion to hepatitis B core protein. // Nature, V.330, p. 381-384.

28. Cusi M.G., Valassina M., Bianchi S., Wunner W., Valensin P.E. (1995) Evaluation of rubella virus E2 and C proteins in protection against rubella virus in a mouse model. // Vims Res., V.37(3), p. 199-208.

29. De Filette M., Fiers W., Martens W., Birkett A., Ramne A., Lowenadler B., Lycke N., Jou W.M., Saelens X. (2006) Improved design and intranasal delivery of an M2e-based human influenza A vaccine. // Vaccine., V.24(44-46), p. 6597-6601.

30. De Filette M., Martens W., Roose K., Deroo T., Vervalle F., Bentahir M., Vandekerckhove J., Fiers W., Saelens X. (2008) An influenza A vaccine based on tetrameric ectodomain of matrix protein 2. // J. Biol. Chem., V.283(17), p. 11382-11387.

31. De Filette M., Min Jou W., Birkett A., Lyons K., Schultz B., Tonkyro A., Resch S., Fiers W. (2005) Universal influenza A vaccine: optimization of M2-based constructs. // Virology, V.337(1), p. 149-161.

32. De Jong J.C., Palache A.M., Beyer W.E., Rimmelzwaan G.F., Boon A.C., Osterhaus A.D.2003) Haemagglutination-inhibiting antibody to influenza virus. // Dev. Biol. (Basel), V.115, p. 63-73.

33. Del Val M., Schlicht H.J., Volkmer H., Messerle M., Reddehase M.J., Koszinowski U.H. (1991) Protection against lethal cytomegalovirus infection by a recombinant vaccine containing a single nonameric T-cell epitope. // J Virol, V.65, p. 3641-3646.

34. Feng J., Zhang M., Mozdzanowska K., Zharikova D., Hoff H., Wunner W., Couch R.B., Gerhard W. (2006) Influenza A virus infection engenders a poor antibody response against the ectodomain of matrix protein 2. // Virol. J, V.3:102.

35. Fernandez-Fernandez M.R., Martinez-Torrecuadrada J.L., Casal J.I., Garcia J.A. (1998) Development of an antigen presentation system based on plum pox potyvirus. // FEBS Lett., V.427, p. 229-235.

36. Fiers W., De Filette M., Birkett A., Neirynck S., Min Jou W. (2004) A "universal" human influenza A vaccine. // Elsevier. Virus Research, V.103, p. 173-176.

37. FreyT.K. (1994) Molecular biology of rubella virus. //Adv Virus Res., V.44, p. 69-160.

38. Gerhard W., Mozdzanowska K., Zharikova D. (2006) Prospects for universal influenza virus vaccine. // Emerg. Infect. Dis, V.12(4), p. 569-574.

39. Gerna G., Revello M.G., Dovis M., Petruzzelli E., Achilli G., Percivalle E., Torsellini M. (1987) Synergistic neutralization of rubella virus by monoclonal antibodies to viral haemag-glutinin. // J Gen Virol., V.68-7, p. 2007-2012.

40. Gils M., Kandzia R., Marillonnet S., Klimyuk V., Gleba Y. (2005) High-yield production of authentic human growth hormone using a plant virus-based expression system. // Plant Bio-technol J., V.3, p. 613-620.

41. Gleba Y., Klimyuk V., Marillonnet S. (2005) Magnifection a new platform for expressing recombinant vaccines in plants. // Vaccine, V.23, p. 2042-2048.

42. Gleba Y., Marillonnet S., Klimyuk V.: Engineering viral expression vectors for plants: the 'full virus' and the 'deconstructed virus' strategies. // Curr Opin Plant Biol, V.7, p. 182-188.

43. Govaert T.M., Thijs C.T., Masurel N., Sprenger M.J., Dinant G.J., Knottnerus J.A. (1994) The efficacy of influenza vaccination in elderly individuals. A randomized double-blind placebo-controlled trial. // JAMA, V.272(21), p. 1661-1665.

44. Grant S.G., Jessee J., Bloom F.R. and Hanahan D. (1990) Differential plasmid rescue from transgenic mouse DNAs into Escherichia coli methylation-restriction mutants. // Proc. Natl Acad. Sci. USA, V.87, p.4645-^1649.

45. Green K.Y., Dorsett P.H. (1986) Rubella virus antigens: localization of epitopes involved in hemagglutination and neutralization by using monoclonal antibodies. // J Virol., V.57(3), p. 893-898.

46. Grene E., Mezule G., Borisova G., Pumpens P., Bentwich Z., Arnon R. (1997) Relationship between antigenicity and immunogenieity of chimeric hepatitis B virus core particles carrying HIV type 1 epitopes. // AIDS Res Hum Retroviruses, V. 13, p. 41-51.

47. Harris A., Cardone G., Winkler D. C., Heymann J. B., Brecher M., White J. M., Steven A. C. (2006) Influenza virus pleiomorphy characterized by cryoelectron tomography. // Proc Natl Acad Sci U S A, V. 103(50), p. 19123-7.

48. Heermann K.H, Goldmann U., Schwartz W., Seyffarth T., Baumgarten H., Gerlich W.H. (1984) Large surface proteins of hepatitis B virus containing the Pre-S sequence. // J. Virol., V.52, p.396-402.

49. Hildich, C.M., Rogers, L.J., Bishop, D.H.L. (1990) Physicochemical analysis of the hepatitis B core antigen produced by a baculovirus expression vector. J. Gen. Virol. 71, 2755-2759.

50. Hobman T.C., Lundstrom M.L., Mauracher C.A., Woodward L., Gillam S., Farquhar M.G. (1994) Assembly of rubella virus structural proteins into virus-like particles in transfected cells. // Virology, V.202(2), p.574-585.

51. Horzinek M., Maess J., Laufs R. (1971) Studies on the substructure of togaviruses. Analysis of equine arteritis, rubella, bovine viral diarrhea, and hog cholera viruses. // Arch Gesamte Virusforsch., V.33(3), p. 306-318.

52. Jobling S.A., Gehrke L. (1987). Enhanced translation of chimaeric messenger RNAs containing a plant viral untranslated leader sequence. // Nature 1987, V.325, p. 622-625.

53. Joelson T., Akerblom L., Oxelfelt P., Strandberg B., Tomenius K„ Morris T.J. (1997) Presentation of a foreign peptide on the surface of tomato bushy stunt virus. // J Gen Virol, V.78, p. 1213-1217.

54. Johnson J., Lin T., Lomonossoff G. (1997) Presentation of heterologous peptides on plant viruses: genetics, structure, and function. // Annu Rev Phytophathol, V.35, p. 67-86.

55. Kilbourne E.D., Johansson B.E., Grajower B. (1990) Independent and disparate evolution in nature of influenza A virus hemagglutinin and neuraminidase glycoproteins. // Proc. Natl Acad. Sci. USA, V.87(2), p. 786-790.

56. Kimberly S. R., Gregory J. P. (1995) New plasmids carrying antibiotic-resistance cassettes. // Gene, V. 165, p. 141-142.

57. Kitikoon P., Strait E.L., Thacker E.L. (2008) The antibody responses to swine influenza virus (SIV) recombinant matrix 1 (rMl), matrix 2 (M2), and hemagglutinin (HA) proteins in pigs with different SIV exposure. // Vet. Microbiol, V. 126(13), p. 51-62.

58. Klimyuk V., Marillonnet S., Knaeblein J., McCaman M., Gleba Y. (2005) Production of recombinant proteins in plants. // In Modern Biopharmaceuticals. Edited by Knaeblein J. WILEY-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, p. 893-917.

59. Kratz P.A, Böttcher B., Nassal M. (1999) Native display of complete foreign protein domains on the surface of hepatitis B virus capsides. // Proc. Natl. Acad. Sei. USA Biochemistry, V.96, p. 1915-1920.

60. Lamb R.A., Choppin P.W. (1981) Identification of a second protein (M2) encoded by RNA segment 7 of influenza virus. // Virology, V.l 12(2), p. 729-737.

61. Lamb R.A., Zebedee S.L., Richardson C.D. (1985) Influenza virus M2 protein is an integral membrane protein expressed on the infected-cell surface. // Cell 1985, V.40(3), p. 627-633.

62. Larrick J.W., Thomas D.W. (2001) Producing proteins in transgenic plants and animals // Current Opinion Biotechnology, V.l2, p 411-418.

63. Lawrence S. (2004) The Biotech Drug market //Nature Biotechnology 2004, V.22(1496).

64. Liu W., Li H., Chen Y.FI. (2003) N-terminus of M2 protein could induce antibodies with inhibitory activity against influenza virus replication. // FEMS Immunol. Med. Microbiol, V.35(2), p. 141-146.

65. Lombard M., Pastoret P.P., Moulin A.M. (2007) A brief history of vaccines and vaccination // Rev Sei Tech., V.26(l), p. 29-48.

66. Lozzi L., Rustici M., Corti M., Cusi M.G., Valensin P.E., Bracci L., Santucci A., Soldani P., Spreafico A., Neri P. (1990) Structure of rubella El glycoprotein epitopes established by multiple peptide synthesis. // Arch Virol., V.l 10(3-4), p. 271-276.

67. MacDiarmid R. (2005) RNA silencing in productive virus infections. // Annu. Rev. Phytopa-thol., V.43, p. 523-544.

68. Mao C., Solis D.J., Reiss B.D., Kottmann S.T., Sweeney R.Y., Hayhurst A., Georgiou G., Iverson B, Belcher A.M. (2004) Virus-based toolkit for the directed synthesis of magnetic and semiconducting nanowires. // Science, V.303, p.213-217.

69. Marillonnet S., Thoeringer C., Kandzia R., Klimyuk V., Gleba Y. (2005) Systemic Agrobac-terium tumefaciens-mediated transfection of viral replicons for efficient transient expression in plants. // Nat Biotechnol, V.23, p. 718-723.

70. McCown M.F., Pekosz A. (2006) Distinct domains of the influenza a virus M2 protein cytoplasmic tail mediate binding to the Ml protein and facilitate infectious virus production. 11. Virol, V.80(16), p. 8178-8189.

71. Mechtcheriakova I.A., Eldarov M.A., Nicholson L., Shanks M., Skryabin K.G., Lomonossoff G.P. (2006) The use of viral vectors to produce hepatitis B virus core particles in plants. // J Virol Methods., V. 131 (1), p. 10-15.

72. Mitchell L.A., Decarie D., Tingle A.J., Zrein M., Lacroix M. (1993) Identification of immunoreactive regions of rubella virus El and E2 envelope proteins by using synthetic peptides. // Virus Res., V.29(l), p. 33-57.

73. MIV Study Group. (2005) The macro-epidemiology of influenza vaccination in 56 countries, 1997-2003. // Vaccine, V.23(44), p. 5133-5143.

74. Murray K., Shiau A.L. (1999) The core antigen of hepatitis B virus as a carrier for immunogenic peptides. // Biol Chem., V.380(3), p. 277-83.

75. Nandi S., Yalda D., Lu S., Nikolov Z., Misaki R., Fujiyama K., Huang N. (2005) Process development and economic evaluation of recombinant human lactoferrin expressed in rice grain. // Transgenic Res., V.14(3), p. 237-249.

76. Nates S.V., Mersich S.E., Damonte E.B., Zapata M.T. (1989) Comparison of immune response to rubella virus proteins in early and late natural infections. // Microbiologica, V.12, p. 335-338.

77. Natilla A., Hammond R.W., Nemchinov L.G. (2006) Epitope presentation system based on cucumber mosaic virus coat protein expressed from a potato virus X-based vector. // Arch Virol, V. 151(7), p. 1373-1386.

78. Natilla A., Piazzolla G., Nuzzaci M., Saldarelli P., Tortorella C., Antonaci S., Piazzolla P.2004) Cucumber mosaic virus as a carrier of a hepatitis C virus-derived epitope. // Arch Virol, V. 149, p. 137-154.

79. Nayak D.P., Balogun R.A., Yamada H., Zhou Z.H., Barman S. (2009) Influenza virus morphogenesis and budding. //Virus Res., V.143(2), p.147-161.

80. Neirynck S., Deroo T., Saelens X., Vanlandschoot P., Jou W.M., Fiers W. (1999) A universal influenza A vaccine based on the extracellular domain of the M2 protein. // Nat Med, V.5, p. 1157-1163.

81. Nemchinov L.G., Liang T.J., Rifaat MM., Mazyad H.M., Hadidi A., Keith J.M. (2000) Development of a plantderived subunit vaccine candidate against hepatitis C virus. // Arch Virol, V.145, p. 2557-2573.

82. Newcomb L.L., Kuo R.L., Ye Q., Jiang Y., Tao Y.J., Krug R.M. (2009) Interaction of the influenza a virus nucleocapsid protein with the viral RNA polymerase potentiates unprimed viral RNA replication. // J Virol., V.83(l), p. 29-36.

83. Newman M„ Suk F.M., Cajimat M., Chua P.K., Shih C. (2003) Stability and Morphology Comparisons of Self-Assembled Virus-Like Particles from Wild-Type and Mutant Human Hepatitis B Virus Capsid Proteins. // Journal Of Virology, V.77(24), p. 12950-12960.

84. Nicholas B.L., Brennan F.R., Martinez-Torrecuadrada J.L., Casal J.I., Hamilton W.D., Wakelin D. (2002) Characterization of the immune response to canine parvovirus induced by vaccination with chimaeric plant viruses. // Vaccine, V.20, p. 2727—2734.

85. Nicholson K.G., Wood J.M., Zambon M. (2003) Influenza // Lancet., V.362, p. 17331745.

86. Oker-Blom C., Kalkkinen N., Kaariainen L., Pettersson R.F. (1983) Rubella virus contains one capsid protein and three envelope glycoproteins, El, E2a, and E2b. // J Virol., V.46(3), p.964-973.

87. Perrenoud G., Messerli F., Thierry A.C., Beltraminelli N., Cousin P., Fasel N., Vallet V., Demotz S., Duchosal M.A., Moulon C. (2004) A recombinant rubella virus El glycoprotein as a rubella vaccine candidate. // Vaccine, V.23, p. 480-488.

88. Pinto L.H., Holsinger L.J., Lamb R.A. (1992) Influenza virus M2 protein has ion channel activity. // Cell., V.69(3), p. 517-528.

89. Plotkin J.B., Dushoff J. (2003) Codon bias and frequency-dependent selection on the hemagglutinin epitopes of influenza A virus. // Proc. Natl Acad. Sci. USA, V. 100(12), p. 71527157.

90. Porta C., Spall V.E., Loveland J., Johnson J.E., Barker P.J. (1994) Development of cow-pea mosaic virus as a highyielding system for the presentation of foreign peptides. // Virology, V.202, p. 949-955.

91. Pumpens P., Grens E. (2001) HBV core particles as a carrier for B cell/T cell epitopes. // Intervirology, V.44, p. 98-114.

92. Rudenko L.G., Lonskaya N.I, Klimov A.I., Vasilieva R.I., Ramirez A. (1996) Clinical and epidemiological evaluation of a live, cold-adapted influenza vaccine for 3-14-year-olds. //Bull. WHO, V.74(l), p. 77-74.

93. Sambrook J., Fritsch E. F., Maniatis T. (1989) Molecular cloning: a laboratory manual. Second edition// Cold Spring Harbor Laboratory Press New York USA 1989.

94. Samji T. (2009) Influenza A: understanding the viral life cycle. // Yale J Biol Med., V.82(4), p. 153-159.

95. Santi L„ Giritch A., Roy C.J., Marillonnet S., Klimyuk V., Gleba Y., Webb R., Arntzen

96. C.J., Mason H.S. (2006) Protection conferred by recombinant Yersinia pestis antigens produced by a rapid and highly scalable plant expression system. // Proc Natl Acad Sci USA, V.103, p. 861-866.

97. Schnell J.R., Chou J.J. (2008) Structure and mechanism of the M2 proton channel of influenza A virus. // Nature, V.451(7178), p. 591-595.

98. Schodel F., Milich D.R., Will H. (1990) Hepatitis B virus nucleocapsid/pre-S2 fusion proteins expressed in attenuated Salmonella for oral vaccination. // J Immunol, V.145, p. 4317-4321.

99. Schodel F., Moriarty A.M., Peterson D.L., Zheng J.A., Hughes J.L., Will Ii., Leturcq

100. D.J., McGee J.S., Milich D.R. (1992) The position of heterologous epitopes inserted in hepatitis B virus core particles determines their immunogenicity. // J Virol, V.66, p. 106-114.

101. Schodel F, Wirtz R, Peterson D, Hughes J, Warren R, Sadoff J, Milich D. (1994) Immunity to malaria elicited by hybrid hepatitis B virus core particles carrying circumsporozoiteprotein epitopes. // J Exp Med, V.180, p. 1037-1046.

102. Schotsaert M, De Filette M, Fiers W, Saelens X. (2009) Universal M2 ectodomain-based influenza A vaccines: preclinical and clinical developments. // Expert Rev Vaccines. V.8(4), p. 499-508.

103. Seppanen H., Huhtala M.L., Vaheri A., Summers M.D., Oker-Blom C. (1991) Diagnostic potential of baculovirus-expressed rubella virus envelope proteins. // J. Clin. Microbiol., V.29(9), p. 1877-1882.

104. Shivprasad S., Pogue G.P., Lewandowski D.J., Hidalgo J., Donson J., Grill L.K., Dawson W.O. (1999). Heterologous sequences greatly affect foreign gene expression in tobacco mosaic virus-based vectors. // Virology, V.255, p. 312-323.

105. Sleat D.E., Gallie D.R., Jefferson R.A., Bevan M.W., Turner P.C., Wilson T.M. (1987). Characterisation of the 5-leader sequence of tobacco mosaic virus RNA as a general enhancer of translation in vitro. // Gene., V.60, p. 217-225.

106. Slepushkin V.A., Katz J.M., Black R.A., Gamble W.C., Rota P.A., Cox N.J. (1995) Protection of mice against influenza A virus challenge by vaccination with baculovirus-expressed M2 protein. // Vaccine, V.13(15), p. 1399-1402.

107. Stahl S.J., Murray K. (1989) Immunogenicity of peptide fusions to hepatitis B virus core antigen. // Proc Natl Acad Sci USA, V.86, p. 6283-6287.

108. Sullivan S.J., Jacobson R.M., Dowdle W.R., Poland G.A. (2010) 2009 H1N1 Influenza. // Mayo Clin Proc, V.85(l), p. 64-76.

109. Sylvan S.P., Hellstrom U.B., Flehmig B. (1987) Characterization of cell mediated immune responses to the hepatitis B core protein in man. // Clinical and Experimental Immunology, V.68, p.233-241.

110. Tarar M.R., Emery V.C., Harrison T.J. (1996) Expression of a human cytomegalovirus gp58 antigenic domain fused to the hepatitis B virus nucleocapsid protein. // FEMS Immunol Med Microbiol, V.16, p. 183-192.

111. Terry G.M., Ho-Terry L., Londesborough P., Rees K.R. (1988) Localization of the rubella El epitopes. // Arch Virol., V.98(3-4), p. 189-197.

112. Touze A., Enogat N., Buisson Y., Coursaget P. (1999) Baculovirus expression of chimeric hepatitis B virus core particles with hepatitis E virus epitopes and their use in a hepatitis E immunoassay. // J Clin Microbiol, V.37, p. 438-441.

113. Treanor J.J., Tierney E.L., Zebedee S.L., Lamb R.A., Murphy B.R. (1990) Passively transferred monoclonal antibody to the M2 protein inhibits influenza A virus replication in mice. // J. Virol, V.64(3), p. 1375-1377.

114. Trudel M., Nadon F., Séguin C., Amarouch A., Payment P., Gillam S. (1985) El glycoprotein of rubella virus carries an epitope that binds a neutralizing antibody. // J Virol Methods. V. 12(3-4), p.243-250.

115. Tsuda, S., Yoshioka, K., Tanaka, T., Iwata, A., Yoshikawa, A., Watanabe, Y., Okada, Y., 1998. Application of the human hepatitis B core antigen from transgenic tobacco plants for serological diagnosis. // Vox Sang. 74, 148-155.

116. Turpen T.H., Reini S.J., Charoenvit Y., Hoffrnan S.L., Fallarme V., Grill L.K. (1995) Malarial epitopes expressed on the surface of recombinant tobacco mosaic virus. // Biotechnology, V. 13, p. 53-57.

117. Varsani A., Williamson A.L., Stewart D., Rybicki E.P. (2006) Transient expression of Human papillomavirus type 16 LI protein in Nicotiana benthamiana using an infectious to-bamovirus vector. // Virus Res, V.120, p. 91-96.

118. Wanli Liu., Hua Li., Ying-Hua Chen. (2003) N-terminus of M2 protein could induce antibodies with inhibitory activity against influenza virus replication. // FEMS Immunology and Medical Microbiology, V.35, p. 141-146.

119. Watelet B., Quibriac M., Rolland D., Gervasi G., Gauthier M., Jolivet M., Letourneur O. (2002) Characterization and diagnostic potential of hepatitis B virus nucleocapsid expressed in E. coli and P. pastoris. // J Virol Methods, V.99(l-2), p. 99-114

120. Waxham M.N., Wolinsky J.S. (1985A) A model of the structural organization of rubella virions. // Rev Infect Dis., V.7-1, p. 133-139.

121. Waxham M.N., Wolinsky J.S. (1985B) Detailed immunologic analysis of the structural polypeptides of rubella virus using monoclonal antibodies. // Virology., V.143(l), p. 153165.

122. Webster R.G. (1998) Influenza: an emerging disease. // Emerg Infect Dis., V.4(3), p. 436-441.

123. Werner S., Marillonnet S., Hause G., Klimyuk V., Gleba Y. (2006) Immunoabsorbent nanoparticles based on a tobamovirus displaying protein. // A. Proc Natl Acad Sci USA, V.103,p. 17678-17683.

124. Wingfield P.T., Stahl S.J., Williams R.W., Steven A.C. (1995) Hepatitis core antigen produced in Escherichia coli: subunit composition, conformational analysis, and in vitro cap-sid assembly. // Biochemistry, V.34(15), p. 4919-4932.

125. Wolinsky J.S., Sukholutsky E., Moore W.T., Lovett A., McCarthy M., Adame B. (1993) An antibody- and synthetic peptide-defmed rubella virus El glycoprotein neutralization domain. // J Virol., V.67(2), p. 961-968.

126. Wynne S.A., Crowther R.A., Leslie A.G. (1999) The crystal structure of the human hepatitis B virus capsid. // Mol Cell., V.3(6), p. 771-780.

127. Wu F., Huang J.H., Yuan X.Y., Huang W.S., Chen Y.H. (2007) Characterization of immunity induced by M2e of influenza virus. // Vaccine, V.25(52), p. 8868-8873.

128. Yon J., Rud E., Corcoran T., Kent K., Rowlands D., Clarke B. (1992) Stimulation of specific immune responses to simian immunodeficiency virus using chimeric hepatitis B core antigen particles. // J Gen Virol, V.73, p. 2569-2575.

129. Zakis V., Skrastina D., Borisova G., Kuranova I. (1992) Immunodominance of T-cell epitopes on foreign sequences of the hepatitis B virus nucleocapsid fusion proteins // in Brown

130. F., Chanock R.M., Ginsberg H.S., Lerner R.A. (eds): Vaccines 92. Cold Spring Harbor, Cold Spring Harbor Laboratory Press, p, 341-347.

131. Zebedee S.L., Lamb R.A. (1988) Influenza A virus M2 protein: monoclonal antibody restriction of virus growth and detection of M2 in virions. // J. Virol, V.62(8), p. 2762-2772.

132. Zhao Y., Hammond R. W. (2005) Development of a candidate vaccine for newcastle disease virus by epitope display in the cucumber mosaic virus capsid protein. //Biotechnol Lett, V.27, p. 375-382.

133. Zharikova D., Mozdzanowska K., Feng J., Zhang M, Gerhard W. (2005) Influenza type A virus escape mutants emerge in vivo in the presence of antibodies to the ectodomain of matrix protein 2. // J. Virol, V.79(l 1), p. 6644-6654.

134. Zheng D.P., Frey T.K., Icenogle J., Katow S., Abernathy E.S., Song K.J., Xu W.B., Ya-rulin V., Desjatskova R.G., Aboudy Y., Enders G., Croxson M. (2003) Global distribution of rubella virus genotypes. // Emerg Infect Dis., V.9(12), p. 1523-1530.

135. Zheng J., Schôdel F., Peterson D.L. (1992) The structure of hepadnaviral core antigens. Identification of free thiols and determination of the disulfide bonding pattern. // J Biol Chem., V.267(13),:9422-9.