Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Вирус иммунодефицита крупного рогатого скота: индикация инфекции и распространенность в хозяйствах Российской Федерации

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Вирус иммунодефицита крупного рогатого скота: индикация инфекции и распространенность в хозяйствах Российской Федерации"

На правах рукописи

Колотвин Вячеслав Васильевич

оозиэ-з ' ^ ~ • ипнг /ии/

ВИРУС ИММУНОДЕФИЦИТА КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА: ИНДИКАЦИЯ ИНФЕКЦИИ И РАСПРОСТРАНЕННОСТЬ В ХОЗЯЙСТВАХ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

03.00.23 - биотехнология

16.00.03 - ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

МОСКВА 2007

003053744

Работа выполнена на кафедре биологии, вирусологии и генной инженерии ФАО ГОУ ВПО Московский государственный университет прикладной биотехнологии и в лаборатории генетики вирусов Института Биологии Гена Российской Академии Наук (Москва)

Научные руководители: Доктор биологических наук, профессор Валихов Алексей Федорович

Доктор медицинских наук, профессор,

Официальные оппоненты: Доктор биологических наук, профессор Верховский Олег Анатольевич

Ведущая организация - ФГОУ ВПО Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии им. К.И.Скрябина

Защита состоится « | Н » 2007 г в 14 — часов на заседании

диссертационного совета Д 006.033.01 при ГНУ Всероссийский научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии им. Я.Р. Коваленко по адресу: 109428, Москва, Рязанский проспект, д. 24, к.1,

Заслуженный деятель науки РФ

Альтштейн Анатолий Давидович

Кандидат биологических наук

Шмаров Максим Михайлович

виэв.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВИЭВ

Автореферат разослан г.

Ученый секретарь диссертационного профессор

1. Общая характеристика работы

Актуальность темы. Вирус иммунодефицита КРС относится к семейству Retroviridae и роду Lentivirus, который включает также вирусы иммунодефицита человека, кошек, обезьян, вирус инфекционной анемии лошадей, вирусы артрита-энцефалита коз и мэди-висна овец (Van Regenmortel et al 2000). Особое внимание к вирусу бычьего иммунодефицита вызвано его филогенетической близостью к вирусу иммунодефицита человека-1 (ВИЧ-1), что позволяет использовать ВБИ в качестве удобной модели для изучения иммунодефицитных состояний животных и человека (Gonda et al 1987).

Впервые ВБИ был выделен из крови коровы с повышенным лимфоцитозом, прогрессирующей слабостью и истощением (Van der Maaten et al 1972). При экспериментальном заражении телят у них появлялись противовирусные антитела и развивалась гиперплазия лимфатических узлов. Вирус бычьего иммунодефицита, встречается во многих странах мира и часто сопутствует другой ретровирусной инфекцией, вызываемой вирусом бычьего лейкоза (ВБЛ) (Carpenter et al 1992, Meas et al 2003, Usui et al 2003, Snider et al 2003).

Эпизоотологическая обстановка по ВБЛ-инфекции в нашей стране хорошо изучена, разработаны методы диагностики и внедрены эффективные системы противолейкозных мероприятий (Гулюкин и др. 2005, Бурба, Шишков и др. 1985, 1992.). Однако вирус бычьего иммунодефицита никогда не служил объектом исследования, а отсутствие диагностических систем не позволяло оценить степень распространения ВБИ среди крупного рогатого скота на территории Российской Федерации (Федоров, Верховский 1996).

Целью наших исследований была разработка диагностической тест-системы ПЦР и изучение распространения ВБИ в некоторых хозяйствах крупного рогатого скота на территории РФ. Задачи исследования: получить инфекционный вирус бычьего иммунодефицита; создать видоспецифичные праймеры для выявления ДНК провируса ВБИ методом ПЦР;

- оптимизировать процесс амплификации по температурному и временному профилю реакции;

- изучить специфичность и чувствительность разработанной тест-системы;

исследовать пробы крови крупного рогатого скота из различных хозяйств РФ на содержание провирусной ДНК ВБИ;

- исследовать пробы мяса на содержание провирусной ДНК ВБИ. Научная новизна. Разработана ПЦР-тест-система для

идентификации провирусной ДНК вируса бычьего иммунодефицита в крови крупного рогатого скота. Подобраны видоспецифичные праймеры для идентификации ДНК провируса вируса бычьего иммунодефицита. Получена клеточная линия легкого эмбриона быка (FBL), пригодная для размножения инфекционного ВБИ. Получен инфекционный ВБИ, соответствующий референтному штамму R-29. Проведена оценка чувствительности и специфичности тест-системы. Проведено исследование крови крупного рогатого скота из нескольких животноводческих хозяйств на содержание провирусной ДНК. Впервые на территории Российской Федерации выявлены животные, инфицированные ВБИ. Проведена сравнительная оценка распространенности вирусов бычьего иммунодефицита и бычьего лейкоза в стадах Московской области и Ставропольского края. Показано, что варианты вируса иммунодефицита, циркулирующего в хозяйствах нашей страны, отличаются от стандартного штамма вируса R-29 по гену pol. Проведено исследование партий

импортной бескостной говядины, полученных из стран Восточной Европы, Евросоюза, Южной Америки и показана возможность выявления ДНК-провируса ВБИ в образцах мяса КРС.

Практическая значимость. Результаты научных исследований были использованы при разработке методических рекомендаций по диагностике инфекции, вызванной ВБИ с помощью полимеразной цепной реакции (Утверждены академиком-секретарем отделения ветеринарной медицины РАСХН А.М.Смирновым 07.12.2006 г.). Разработан диагностический набор для выявления провирусной ДНК ВБИ методом полимеразной цепной реакции.

Основные положения, выносимые на защиту.

- Получение новой перевиваемой линии клеток легкого эмбриона быка, пригодной для размножения ВБИ.

- Создание видоспецифичных праймеров для выявления ДНК провируса ВБИ методом ПЦР и оптимизация процесса по температурному и временному профилю реакции.

- Изучение специфичности и чувствительности разработанной тест -системы.

- Исследование проб крови и мяса крупного рогатого скота из различных хозяйств РФ на содержание провирусной ДНК ВБИ.

- Обнаружение инфекции вызываемой ВБИ в хозяйствах РФ.

Апробация результатов исследования. Результаты работы

доложены: на молодежной международной школе-конференции молодых ученых "Биотехнология будущего" Симпозиума "ЕС-Россия: Перспективы сотрудничества в области биотехнологии в 7-ой Рамочной программе" (Санкт-Петербург, 2006); на международной юбилейной научно-практической конференции, посвященной 110-летию Курской биофабрики и агробиологической промышленности России (Курск, 2006); на международной конференции "Живые системы и биологическая безопасность населения" (Москва, 2005 г.). Результаты работы доложены и

обсуждены на заседании секции инфекционной патологии животных отделения ветеринарной медицины РАСХН 1 ноября 2006 года.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 6 научных

работ.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 114 страницах компьютерного текста и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов собственных исследований, обсуждения результатов, вывода и практических предложений, приложение и список литературы, включающий 156 источников. Работа содержит 8 таблиц и 16 рисунков.

2. Результаты собственных исследований

Подбор ДНК-мишени и конструирование видоспецифичных праймеров для идентификации провирусной ДНК вируса бычьего иммунодефицита

Создание тест-системы ПЦР включало в себя: подбор специфичных олигонуклеотидных праймеров, обладающих сродством к определенным участкам выявляемой нуклеотидной последовательности; создание адекватных позитивного и негативного контролей; оптимизация процесса амплификации по температурному и временному профилю реакции; изучение специфичности и чувствительности разработанной тест-системы.

Выбранная стратегия создания праймеров для детекции провируса ВБИ основана на компьютерном анализе максимально возможного количества нуклеотидных последовательностей гена или фрагментов гена ВБИ для уменьшения вероятности ложноотрицательных результатов ПЦР-анализа. Из представленных в базах данных ЕМВЬ, ОепВапк и БОВ.1 была создана подбаза, содержащая все известные данные о нуклеотидных последовательностях генома и отдельных генов ВБИ.

Следующим шагом было множественное выравнивание участков генома выбранных изолятов с помощью пакета прикладных программ ЬаБеЮепе

Для оценки вариабельности и поиска консервативных участков нуклеотидные последовательности различных изолятов ВБИ были выровнены друг относительно друга с помощью системы ClastalW Multi Sequence Alignment. При разработке наборов праймеров были проанализированы различные локусы генома ВБИ - гены gag, pol и env, фрагменты которых могут быть маркерами для детекции провируса ВБИ. На основании компьютерного анализа были подобраны две пары праймеров:

gagl 5 '-GTCTTCCC А С ATCCGTA АСАТСТССТ-3' и gag 2 5'-CCCCAGGTCCCATCAACATTCATCAG-3' для детекции фрагмента гена gag (382 пары нуклеотидов, пн);

poll 5'-CCAGGAATTAAGGAATGTGAACACTTAACT-3' и ро12 5'-CATCCTTGTGGTAGAACATTCCACTG-3' для детекции фрагмента гена pol (167 пн).

Оценка специфичности сконструированных праймеров при помощи программы BLAST подтвердила гомологичность выбранных праймеров gagl и gag2 с нуклеотидной последовательностью гена gag и праймеров poll и ро12 с нуклеотидной последовательностью гена pol, и отсутствие значимой гомологичности с нуклеотидными последовательностями других видов вирусов. Праймеры, синтезированные на синтезаторе ASM-102 ("Биоссет", Новосибирск) и очищенные посредством электрофореза в ПААГ, были получены от фирмы "Синтол" (Россия). Термодинамический анализ праймеров и ампликонов был произведен с помощью программы Oligo

Сравнительный анализ методов выделения ДНК из цельной крови КРС

Известно, что эффективность выделения и качество очистки ДНК оказывает непосредственное влияние на результаты ПЦР, так как низкая концентрация ДНК-матрицы и присутствие в пробе ингибиторов реакции являются наиболее частой причиной ложноотрицательных результатов

ПЦР. В связи с этим в наши задачи входили выбор и оценка способов экстракции ДНК и их апробация на различном материале. Для выделения ДНК из образцов крови, были подобраны три принципиально отличающиеся методики выделения ДНК: лизис на основе гуанидинтиоционата с последующей нуклеосорбцией ДНК на силикагеле с использованием набора для выделения ДНК Diatom™ DNA Prep 100 (ООО "Лаборатория Изоген"); набор для выделения ДНК/РНК из сыворотки или плазмы крови" (НПФ "Литех"); лизис с использованием ионного детергента (SDS) с фенол-хлороформовой экстракцией и осаждением ДНК этанолом. Параметрами оценки являлись уровень чувствительности и воспроизводимость результатов ПЦР с использованием того или иного способа экстракции ДНК, а также наличие или отсутствие фоновой амплификации, приводящей к появлению шмера на электрофореграмме.

Наши исследования показали, что, исходя из выбранных критериев оценки, наиболее эффективным оказался метод выделения ДНК с использованием готового набора реагентов Diatom™ DNA Prep 100 (ООО "Лаборатория Изоген").

Получение первичной культуры клеток легкого эмбриона быка (FBL) и инфекционного ВБИ

Линия диплоидных клеток FBL была получена из первичной культуры трипсинизированных клеток легкого эмбриона быка, прошла несколько десятков пассажей и сохранялась в замороженном состоянии при -196 °С (рис.1). Клетки культивировали в среде DMEM с 10% эмбриональной бычьей сыворотки.

Рнс. i. Монослой культуры клеток FBL

Плазм и да pBlV 127, содержащая полный провирус ВБИ (Gonda et ai„ 1987), была получена из коллекции национального института здоровья США (NIH, USA).

Путем трансфекции первичных клеток легкого эмбриона быка плазмидой pBIV 127, получена клеточная культура продуцирующая ВБИ. В инфицированных культурах размножение вируса сопровождалось индукцией синцития и образованием очагов морфологически измененных или поврежденных клеток (рис.2). В культуральной жидкости появлялся инфекционный вирус.

Рис. 2. Образование циТопатийШкого эффекта (синцитиев) в монослое

культуры клеток FBL после трансфекшш плазмндой р!iIV127

В и русс пециф и чес к не изменения появлялись примерно через три дня после заражения нормальных клеток FBL и развивались с увеличением срока инкубации инфицированных культур, tilV-инфнцировапные клетки FB L (FBL-B1V) выдерживали обычно не более трех пассажей, поскольку клетки разрушались в результате цитопатяческого действия вируса.

Для Поддержан ия Продукции BIV в культуре FBL BIV-инфицированные клетки ¡ер-культивировал и с нормальными FBL. Работа проведена совместно с Л.М.ПискаревШ й к.б.н. Н.Ф.Грииенко (Институт Биологии Гена РАН, Москва).

Постановка ПЦР для выявления провирусной ДНК вируса иммунодефицита КРС

Полимеразную цепную реакцию для выявления провирусной ДНК ВБИ проводились в пластиковых пробирках объемом 0,5 мл. Реакционная смесь, объемом 25 мкл, содержала: по 0,1 рЦ каждого прайм ера (gag I /gag2

или pol 1/ро12); 2,5 цМ MgCl2 , 0.05 и/ц1 Taq-полимеразы; 0,2 mM dNTP, буфер для полимеразы и около 1 ц1 ДНК-матрицы. Добавляли около 20 мкл минерального масла и амплифицировали в термоциклере "Терцик" по следующей программе:

1 этап - 94°С - 3 мин (1 цикл), 2 этап - 94°С -40 сек, 58°С -40 сек, 72°С -1 мин (45 циклов), 3 этап - 72°С - 4 мин (1 цикл).

Для регистрации результатов использовался метод электрофореза реакционных смесей в 1,5%-м агарозном геле. Агарозный гель окрашивали бромистым этидием, который добавляли в гель до конечной концентрации 0,5 мкг/мл.

Электрофорез проводили при напряженности электрического поля 5 В/см. Детекцию проводили в ультрафиолетовом излучении с длиной волны 260 нм. Результаты документировались с помощью видеосистемы, состоящей из трансиллюминатора, цифровой фотокамеры и программного обеспечения "ViTran Photo" (ООО "Биоком").

Апробация чувствительности и специфичности сконструированной тест-системы ПЦР

Полученные результаты исследований позволили перейти к определению чувствительности и специфичности ПЦР-системы при тестировании крови КРС. С этой целью использовали различные концентрации плазмиды pBIV127, содержащей полный провирус ВБИ (Gonda et al., 1987) и ДНК из культуры клеток FBL и FBL-BIV.

Проведенные анализы подтвердили высокие показатели чувствительности и специфичности разработанных систем амплификации.

Отработка методики ПЦР была проведена с использованием плазмиды pBIV127 и ДНК из клеток FBL (отрицательный контроль) и FBL-BIV (положительный контроль). Постановка ПЦР реакции с ДНК-матрицами, содержащими провирус ВБИ, приводила к выявлению ампликонов ожидаемого размера (при использовании праймеров gag 1/gag 2 - 382 п.н, при использовании праймеров pol 1 /pol 2-167 п.н. соответственно)

(Рис.3). Проверка чувствительности метода показала, что обе пары праймеров способны выявить около 1000 копий матрицы в 1 мл крови. Чувствительность и специфичность реакции можно считать достаточной для проведения обследования КРС на наличие ДЫК-лровируса ВБИ.

12345 6789

■

ЦЩ

-.»«Ж

Рис. 3. Результаты Г1ЦР при использовании пранмеров {gagl/gag2 poll/pol2), плазм иды ]jBI V127 и ДНК клеток, хронически зараженных

ВБИ (FBL-B1V)

1 ^аркер моле кул яркой массы;

2 - отрицательныft ковгроль Амплификации (Н20)

3 -ДНК, выдоенная из неикфнццрованной культуры клеток FIÎL с лраймерами

gagî/gag2

4 - ДНК, выделенная m инфицирован ней культуры клеток FBL с прайм ерами

gagl/gag2

5 - млатммдная ДНК, содержащая клонированную нроенрусную ДИК lîblt с

нраймерачн gagl/gag2

6 - отри цягел ы1ы Г| контроль амнлифИкацниДОгО)

V - ДИК', выделенная из неипфшшровапной культуры клеток FBL с п рам мерам и poil/ро 12

fi - ДНК, в 1,1 деленная mi нлфшшровашшй культуры клеток FBL с лралмерамл poll/pol2

9 - плазмиднан ДНК, содержащая клонированную лровнруеную ДИК ВЬН с n рай мерам и polI/pol2

Исследования крови КРС из хозяйств Московского региона на ретровирусные провирусы

Были получены пробы ДНК, выделенные из цельной крови КРС трех скотоводческих хозяйств Московского региона (хозяйство Ленинского района Московской области - 100 образцов, опытное хозяйство Подольского района Московской области - 50 образцов, хозяйство Каширского района Московской области - 100 образцов). Всего было исследовано в ПЦР с праймерами gagl/gag2 и pol 1/ро12 250 проб ДНК, полученных от индивидуальных животных. Пробы ДНК от тех же животных были исследованы в ПЦР с праймерами, направленными на выявление вируса бычьего лейкоза (использовался диагностический набор серии GenePak ® DNA PCR test BLV" компании "Лаборатория Изоген" (Москва)). Полученные результаты приведены в табл. 1.

Как видно из таблицы, во всех трех хозяйства выявлены ретровирусные инфекции, вызванные как ВБИ, так и ВБЛ. Были обнаружены животные, зараженные обоими вирусами, или одним из них, или свободные от инфекции обоими вирусами. В двух хозяйствах выявлен высокий процент инфицированных ВБИ животных (44 и 67%), в одном хозяйстве провирус ВБИ обнаружен у 11% исследованных животных. В среднем, из 250 проб 100 (40%) дали положительный результат на наличие ВБИ, что в 1,5 раза уступает зараженности тех же животных ВБЛ (63,5%). Установлено отсутствие корреляции между выявляемостью провирусов вируса иммунодефицита и лейкоза КРС (табл.2).

Выявление ВБИ- и ВБЛ-инфекции у КРС из трех хозяйств Московского региона в полимеразной цепной реакции

Хозяйство Число Число Число

исследованных животных, животных,

животных положительных на ВБИ (%) положительных на ВБЛ (%)

Хозяйство 1 100 11 (11%) 72 (72%)

Хозяйство 2 100 67 (67%) 86 (86%)

Хозяйство 3 50 22 (44%) 19 (38%)

Итого 250 100(40%) 177 (63,5%)

Таблица 2

Сопоставление выявления провирусов ВБИ и ВБЛ у животных трех хозяйств Московского региона

Статус животного Хозяйство №1 Хозяйство №2 Хозяйство №3 Всего

ВБЛ /ВБИ - 25 (25%) 4 (4%) 22 (44%) 51 (20,4%)

ВБЛ + /ВБИ - 64 (64%) 29 (29%) 13 (26%) 106 (42,4%)

ВБЛ - /ВБИ + 3 (3%) 10 (10%) 6(12%) 19(7,6%)

ВБЛ + /ВБИ+ 8 (8%) 57 (57%) 9(18%) 74(29,6%)

Заражено ретровирусами 75 (75%) 96 (96%) 28 (56%) 199 (79,6%)

Всего животных 100(100%) 100(100%) 50(100%) 250(100%)

Следует отметить, что положительный результат на присутствие провирусной ДНК ВБИ был получен только в тех пробах, где были использованы праймеры gagl/gag2 (рис.4), тогда как в пробах, где использовались праймеры ро11/ро12, результат везде оказался отрицательным.

t 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18

382 П.Н.

Рие,4. Результаты исследования ДНК из образцов крови КРС в ПЦР с использованием праймеров gagl/gag2 1 -шрицягельный кшпрачь амплификации fJljO)

2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, У, 1Ü, 11, 12, 13, [4, 15, 16, 17 - ДНК, выделенная из кропи

Ж1ШОШЫХ

18 - положительный контроль (п.члимндй рШ V127, содержащая клонированную npoiiiipycftyio ДНКШ>11)

Исследования крови КРС из хозяйств Ставропольского края на ретровирусные провирусы

Были получены пробы ДНК, выделенные из цельной крови КРС шести скотоводческих хозяйств пяти районов Ставропольского края (хозяйство Ново-Александровского района, - 28 образцов; хозяйство №1 Кочубеевского района - 30 образцов; хозяйство №2 Кочубеевского района - 15 образцов; хозяйство Шпаковского района -- 16 образцов; хозяйство Красногвардейского района - 10 образцов; хозяйство Грачевского района -16 образцов). Всего было исследовано 120 проб ДНК, полученных от индивидуальных животных, о ПЦР с праймерами gagl/gag2 и poll/pol2.

Пробы ДНК от тех же животных были исследованы в ПЦР с праймерами, направленными на выявление вируса бычьего лейкоза (использовался диагностический набор серии GenePak ® DNA PCR test BLV" "ООО Лаборатория Изоген" (Москва),). В качестве положительного контроля использовались образцы ДНК, выделенной из перевиваемой культуры клеток почки эмбриона овцы (FLK-BLV). В качестве отрицательного контроля использовали дистиллированную воду. Полученные результаты приведены в табл. 3.

Выявление ВБИ- и ВБЛ-инфекции у КРС Ставропольского края в полимеразнон цепной реакции

Хозяйство Число исследованных животных Число животных, положительных на ВБИ (%) Число животных, положительных на ВБЛ (%)

НовоАлександровский район 28 5 (17,9%) 8 (28,5%)

Кочубеевский район хозяйство №1 35 4(11,4%) 9 (25,7%)

Кочубеевский район хозяйство №2 15 5 (33,3%) 4 (26,7%)

Шпаковский район 16 2(12,5%) 7 (43,7%)

Красногвардейский район 10 3 (30%) 2 (20%)

Грачевский район 16 0 (0%) 2(12,5%)

Итого 120 19 (15,83%) 32 (26,6%)

Как видно из табл. 3, в пяти хозяйствах выявлены ретровирусные инфекции, вызванные как ВБИ, так и ВБЛ. Только в одном хозяйстве Грачевского района мы не обнаружили животных, инфицированных ВБИ. Тогда как в остальных, были обнаружены животные со смешанной инфекцией ВБИ и ВБЛ, зараженные одним из них, или свободные от инфекции. В двух хозяйствах выявлен относительно высокий процент инфицированных ВБИ животных (30 и 33,3%). В остальных трех хозяйствах уровень инфицированности составил 11,4-17,9%. В среднем, из 120 проб 19 (15,83%) дали положительный результат на наличие ВБИ, что немного уступает зараженности тех же животных ВБЛ (26%). Работа выполнена совместно с к.в.н. Абакиным С.С. (ГНУ СНИИЖК, (РАСХН))

Положительный результат ПЦР на присутствие провирусной ДНК ВБИ был получен только в тех пробах, где были использованы праймеры £,agl/gag2, тогда как в пробах, где использовались праймеры poll/po!2, результат везде оказался отрицательным.

В среднем, в исследованных хозяйствах Российской Федерации инфицированность животных составила 32%, что превышает уровень инфицированности хозяйств Европы и стран Южной Америки, и при этом практически идентичен проценту инфицированных ВБИ животных в Южной Корее (33%).

Секвенирование продуктов ПЦР

Для выяснения причины получения отрицательных результатов ПЦР, при использовании праймеров poll и ро12, нами были подобраны праймеры, комплементарные нуклеотидным последовательностям, фланкирующих исследуемую область гена pol

(ро12а 5'-CCT-TAC-CCT-CCA-GGA-ATT-AAG-GAA-TGT-3' и pol2b 5'-CTG-GAC-CTT-TTC-ATC-TGG-GGT-CTT-AAA-AC-3'). В результате реакции, с добавлением праймеров ро12а и ро12Ь, был получен ПЦР-продукт размером 378 п.н., который секвенировали с использованием дидезоксирибонуклеотидов по методу ферментативного с.еквенирования. Работу проводили совместно к.б.н. Прилиповым А.Г. (лаборатория молекулярной генетики ГУ ВНИИ вирусологии им. Д.И.Ивановского (РАМН)).

В результате секвенирования было обнаружено большое количество иуклеотидных замен в генотипах ВБИ, циркулирующих на территории РФ, по сравнению с нуклеотидной последовательностью референтного штамма R-29 в области гена pol. Это послужило причиной отрицательных результатов исследования полевых проб крови в ПЦР с праймерами poll/pol2.

Результаты исследования мясного сырья КРС с помощью праймеров дад1/дад2

При проведении опытов использовали образцы мышечной ткани, полученных от КРС: из хозяйств Курской и Нижегородской областей, из хозяйств Украины, Аргентины, Бразилии, Парагвая, Франции и Италии. Из этих образцов были выделены пробы ДНК, поставлена ПЦР с праймерами для выявления вируса бычьего иммунодефицита и вируса лейкоза КРС. Результаты исследования приведены в табл. 4.

Таблица 4

Результаты исследования партий мясного сырья из нескольких регионов РФ, стран Европейского союза, Южной Америки и Восточной Европы на содержание провирусной ДНК ВБИ

Регион Количество исследованных партий мяса Из них количество положительных партий мяса(%)

Курская область 5 4 (80%)

Нижегородская область 1 1 (100%)

Аргентина 12 0 (0%)

Бразилия 34 3 (8,8%)

Парагвай 4 2 (50%)

Украина 5 3 (60%)

Италия 5 2 (40%)

Франция 4 2 (50%)

Всего: 70 17 (24,2%)

В результате исследования 70 партий бескостной говядины, замороженной в блоках, ДНК провируса ВБИ выявлена в 17 пробах, что составило в среднем 24,2%. Все 12 партий импортной говядины из Аргентины были отрицательными. Тогда как партии мяса из других регионов содержали ДНК провирус в 8,8-80,0% случаев. Мы смогли

провести исследования только одной партии мяса из Нижегородской области, которая дала положительный результат.

Таким образом, в результате проведенной работы разработана тест-система ПЦР для идентификации провирусйой ДНК ВБИ в крови КРС. Получена диплоидная линия культуры клеток эмбриона быка, чувствительная к ВБИ. Используя сконструированную ПЦР тест-систему Е.первые удалось показать существование ВБИ-инфекции в хозяйствах КРС Российской Федерации. ВБИ-инфекция обнаружена, в среднем, у 32% исследованных животных с колебанием по отдельным хозяйствам от 0 до Ы%.

Проведенное секвенирование показало что ВБИ, циркулирующий в исследованных хозяйствах, отличается по гену pol от изолята R-29 ВБИ и других известных вирусных изолятов, нуклеотидная последовательность которых учитывалась при подборе соответствующих праймеров.

Показана возможность обнаружения провируса ВБИ в образцах импортного мясного сырья из стран Восточной Европы, Евросоюза и Южной Америки.

Изучение распространения ВБИ-инфекции в хозяйствах различных регионов Российской Федерации и возможная корреляция распространенности этой инфекции с распространением ВБЛ и развитием различной патологии КРС будет являться предметом наших дальнейших исследований.

Выводы

1. Получена новая перевиваемая линия клеток легкого эмбриона быка (FBL), пригодная для размножения вируса бычьего иммунодефицита (ВБИ).

2. Созданы праймеры для идентификации ДНК провируса ВБИ методом ПЦР, оптимизирован процесс амплификации по температурному

и временному профилю реакции; изучена специфичность и чувствительности разработанной тест-системы ПЦР.

3. Впервые показано, что в России циркулирует вирус иммунодефицита КРС. В 9 хозяйствах Московского региона и Ставропольского края процент позитивных животных варьировал от 0 до 67%.

4. Установлено отсутствие корреляции между выявляемостью провирусов вируса иммунодефицита и лейкоза КРС.

5. Показана возможность обнаружения провируса ВБИ в образцах коммерческого мясного сырья крупного рогатого скота полученных от животных стран Восточной Европы, Евросоюза и Южной Америки.

6. Показано, что варианты вируса иммунодефицита, циркулирующего в хозяйствах нашей страны, отличаются от стандартного штамма вируса R-29 по гену pol.

7. Создан диагностический набор для выявления провирусной ДНК вируса иммунодефицита КРС в клетках животных методом ПЦР. Разработаны методические указания по диагностике ВБИ-инфекции КРС.

Практические предложения

На основании проведенных исследований разработаны и предложены для практического использования:

- Тест-система для обнаружения вируса бычьего иммунодефицита (ВБИ) методом полимеразной цепной реакции (ПЦР).

- Методические указания по диагностике ВБИ-инфекции крупного рогатого скота методом полимеразной цепной реакции (ПЦР). Утверждено академиком-секретарем отделения ветеринарной медицины РАСХН A.M. Смирновым 07.12.2006 г.

3. Список работ, опубликованных по материалам

диссертации

1. Колотвин В.В. Разработка тест-системы ПЦР для индикации вируса бычьего иммунодефицита и выявление ВБИ-инфекции у крупного рогатого скота в России / В.В.Колотвин, А.В.Капитонов, Н.Ф.Гриненко, JI М.Пискарева, Г.В.Пашвыкина, С.С.Абакин, Г.О.Шайхаев, А Д.Альтштейн, А.Ф. Валихов // Доклады РАСХН. - М., -2007. - №1. - С. 4:;-45.

2. Меграбян Д.С. Лейкоз КРС. Характеристика болезни и ее этиология. / Д.С.Меграбян, А.В.Метелев, В.В.Колотвин, М.И.Гулюкин, А.Ф.Валихов // Российский ветеринарный журнал (сельскохозяйственные животные). -V., - 2006. - №3. - С. 5-7.

3. Колотвин В.В. Выявление вируса иммунодефицита крупного рогатого скота в Московской области / В.В.Колотвин, А.В.Капитонов, Н.Ф.Гриненко, Л.М.Пискарева, Г.В.Пашвыкина, С.С.Абакин, Г О.Шайхаев, А.Д.Альтштейн, А.Ф.Валихов // Российский ветеринарный журнал (сельскохозяйственные животные). - М., - 2006. - №2. - С. 18 — 20.

4. Колотвин В.В. Разработка ПЦР тест-системы для выявления пэовирусной ДНК вируса иммунодефицита крупного рогатого скота / В.В.Колотвин, А.В.Капитонов, Н.Ф.Гриненко, Л.М.Пискарева, Г В.Пашвыкина, С.С Шайхаев, А.Д.Альтштейн, А.Ф.Валихов // Материалы международной юбилейной научно-практической конференции, пэсвященной 110-летию Курской биофабрики и агробиологической промышленности России. - Курск, 2006. - С. 137-141.

5. Kolotvin V.V., Valikhov А.F. Development of test-system PCR for d;tection bovine immunodeficiency virus and reveal prevalence of BIV infection in Russian cattle, Book of papers of the International Conference of Voung Scientists "Biotechnology of the Future", 2006, 35-36.

6. Колотвин В.В. Разработка ПЦР тест-системы для идентификации вируса бычьего иммунодефицита / В.В. Колотвин // Живые системы и биологическая безопасность населения: Материалы IV международной научной конференции студентов и молодых ученых. - М.: МГУПБ, 2005. -С. 215-216.

Подписано в печать 26.01.07. Усл. печ. л. 1,5. Тираж 100 экз. Заказ 1/43 МГУПБ. 109316, Москва, ул. Талалихина, 33. ООО "Полисувенир". 109316. Москва, ул. Талалихина, 33. Тел. 677-03-86

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Колотвин, Вячеслав Васильевич

Страница

Введение

1 Обзор литературы

1.1 Краткая историческая справка

1.2 Классификационное положение ВБИ

1.3 Особенности строения и жизненного цикла ретровируса

1.4 Морфология и физико-химические свойства ВБИ

1.5 Организация генома и репликация ВБИ

1.6 Структурные белки ВБИ

1.7 Культивирование ВБИ

1.8 Выявление ВБИ полимеразной цепной реакцией

1.9 Эпизоотология ВБИ

1.10 Клинические симптомы и патогенез ВБИ - инфекции

1.11 Пути передачи ВБИ

1.12 Антигенная активность ВБИ 36 Заключение 37 Собственные исследования

2 Материалы и методы

2.1 Образцы цельной крови КРС

2.2 Образцы мышечной ткани КРС

2.3 Плазмида

2.4 Получение первичной культуры клеток (РВЬ)

2.5 Забор цельной крови КРС и выделение ДНК

2.6 Подбор праймеров к геному провируса ВБИ

2.7 Постановка ПЦР

2.8 Регистрация результатов ПЦР

2.9 Секвенирование продуктов ПЦР

3 Результаты исследований

3.1 Подбор ДНК-мишени и конструирование праймеров для идентификации ДНК ВБИ методом ПЦР

3.2 Сравнительный анализ методов выделения ДНК из цельной крови КРС

3.3 Оптимизация процесса амплификации

3.4 Получение инфекционного вируса иммунодефицита КРС

3.5 Апробация чувствительности и специфичности сконструированной тест-системы ПЦР

3.6 Выявление распространенности ВБИ КРС в стадах Московского региона

3.7 Выявление распространенности ВБИ КРС в стадах Ставропольского края

3.8 Результаты секвенирования продуктов ПЦР

3.9 Результаты исследования мясного сырья КРС с помощью праймеров gagl/gag

4 Обсуждение результатов исследования 70 Выводы 78 Практические предложения 79 Список литературы 80 Приложение 1 (Методические рекомендации по диагностике инфекции, вызванной вирусом иммунодефицита КРС с помощью ПЦР)

Список сокращений

ВБИ - вирус иммунодефицита КРС

ВБЛ - вирус лейкоза КРС

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота

ИФА - иммуноферментный анализ

КРС - крупный рогатый скот мкл - микролитр нм - нанометр

ПЦР - полимеразная цепная реакция

РНК - рибонуклеиновая кислота

РИД - реакция иммунодиффузии т.п.н. - тысяча пар нуклеотидов

ЦПД - цитопатогенное действие

Ig - иммуноглобулины

LTR - длинные концевые повторы

PBS - место связывания праймера (т-РНК)

РРТ - полипуриновый тракт

STR - короткий концевой повтор

Введение Диссертация по биологии, на тему "Вирус иммунодефицита крупного рогатого скота: индикация инфекции и распространенность в хозяйствах Российской Федерации"

Вирус иммунодефицита КРС относится к семейству Retroviridae и роду Lentivirus, который включает также вирусы иммунодефицита человека, кошек, обезьян, вирус инфекционной анемии лошадей, вирусы артрита -энцефалита коз и мэди-висна овец (Van Regenmortel et al 2000). Особое внимание к вирусу бычьего иммунодефицита вызвано его филогенетической близостью к вирусу иммунодефицита человека-1 (ВИЧ-1), что позволяет использовать ВБИ в качестве удобной модели для изучения иммунодефицитных состояний животных и человека (Gonda et al 1987).

Впервые ВБИ был выделен из крови коровы с повышенным лимфоцитозом, прогрессирующей слабостью и истощением (Van der Maaten et al 1972). При экспериментальном заражении телят у них появлялись противовирусные антитела и развивалась гиперплазия лимфатических узлов. Вирус бычьего иммунодефицита, встречается во многих странах мира и часто сопутствует другой ретровирусной инфекцией, вызываемой вирусом бычьего лейкоза (ВБЛ) (Carpenter et al 1992, Meas et al 2003, Usui et al 2003, Snider et al 2003).

Эпизоотологическая обстановка по ВБЛ-инфекции в нашей стране хорошо изучена, разработаны методы диагностики и внедрены эффективные системы противолейкозных мероприятий (Гулюкин и др. 2005, Бурба, Шишков и др. 1985, 1992.). Однако вирус бычьего иммунодефицита никогда не служил объектом исследования, а отсутствие диагностических систем не позволяло оценить степень распространения ВБИ среди крупного рогатого скота на территории Российской Федерации (Федоров, Верховский 1996).

Целыо наших исследований была разработка диагностической тест-системы ПЦР и изучение распространения ВБИ в некоторых хозяйствах крупного рогатого скота на территории РФ.

Задачи исследования:

- получить инфекционный вирус бычьего иммунодефицита; создать видоспецифичные праймеры для выявления ДНК провируса ВБИ методом ПЦР; оптимизировать процесс амплификации по температурному и временному профилю реакции;

- изучить специфичность и чувствительность разработанной тест-системы; исследовать пробы крови крупного рогатого скота из различных хозяйств РФ на содержание провирусной ДНК ВБИ; исследовать пробы мяса на содержание провирусной ДНК ВБИ.

Научная новизна

Разработана ПЦР-тест-система для идентификации провирусной ДНК вируса бычьего иммунодефицита в крови крупного рогатого скота. Подобраны видоспецифичные праймеры для идентификации ДНК провируса вируса бычьего иммунодефицита. Получена клеточная линия легкого эмбриона быка (FBL), пригодная для размножения инфекционного ВБИ. Получен инфекционный ВБИ, соответствующий референтному штамму R-29. Проведена оценка чувствительности и специфичности тест-системы. Проведено исследование крови крупного рогатого скота из нескольких животноводческих хозяйств на содержание провирусной ДНК. Впервые на территории Российской Федерации выявлены животные, инфицированные ВБИ. Проведена сравнительная оценка распространенности вирусов бычьего иммунодефицита и бычьего лейкоза в стадах Московской области и Ставропольского края. Показано, что варианты вируса иммунодефицита, циркулирующего в хозяйствах нашей страны, отличаются от стандартного штамма вируса R-29 по гену pol. Проведено исследование партий импортного говяжьего тримминга, полученных из стран Восточной Европы, Евросоюза, Южной Америки и показана возможность выявления ДНК-провируса ВБИ в образцах мяса КРС.

Практическая значимость

Результаты научных исследований были использованы при разработке методических рекомендаций по диагностике инфекции, вызванной ВБИ с помощью полимеразной цепной реакции (Утверждены академиком-секретарем отделения ветеринарной медицины РАСХН А.М.Смирновым 07.12.2006 г.). Разработан диагностический набор для выявления провирусной ДНК ВБИ методом полимеразной цепной реакции.

Публикации по диссертационной работе и апробация результатов исследования

По материалам диссертации опубликовано 6 работ. Результаты работы доложены: на молодежной международной школе-конференции молодых ученых "Биотехнология будущего" Симпозиума "ЕС-Россия: Перспективы сотрудничества в области биотехнологии в 7-ой Рамочной программе" (Санкт-Петербург, 2006); на международной юбилейной научно-практической конференции, посвященной 110-летию Курской биофабрики и агробиологической промышленности России (Курск, 2006); на международной конференции "Живые системы и биологическая безопасность населения" (Москва, 2005 г.). Результаты работы доложены и обсуждены на заседании секции инфекционной патологии животных отделения ветеринарной медицины РАСХН 1 ноября 2006 года.

1. Обзор литературы

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология", Колотвин, Вячеслав Васильевич

Выводы

1. Получена новая перевиваемая линия клеток легкого эмбриона быка (FBL), пригодная для размножения вируса бычьего иммунодефицита (ВБИ).

2. Созданы праймеры для идентификации ДНК провируса ВБИ методом ПЦР, оптимизирован процесс амплификации по температурному и временному профилю реакции; изучена специфичность и чувствительности разработанной тест-системы ПЦР.

3. Впервые показано, что в России циркулирует вирус иммунодефицита КРС. В 9 хозяйствах Московского региона и Ставропольского края процент позитивных животных варьировал от 0 до 67%.

4. Установлено отсутствие корреляции между выявляемостыо провирусов вируса иммунодефицита и лейкоза КРС.

5. Показана возможность обнаружения провируса ВБИ в образцах коммерческого мясного сырья крупного рогатого скота полученных от животных стран Восточной Европы, Евросоюза и Южной Америки.

6. Показано, что варианты вируса иммунодефицита, циркулирующего в хозяйствах нашей страны, отличаются от стандартного штамма вируса R-29 по гену pol.

7. Создан диагностический набор для выявления провирусной ДНК вируса иммунодефицита КРС в клетках животных методом ПЦР. Разработаны методические указания по диагностике ВБИ-инфекции КРС.

Практические предложения

На основании проведенных исследований разработаны и предложены для практического использования:

1. Тест-система для обнаружения вируса бычьего иммунодефицита (ВБИ) методом полимеразной цепной реакции (ПЦР).

2. Методические указания по диагностике ВБИ-инфекции крупного рогатого скота методом полимеразной цепной реакции (ПЦР). Утверждено академиком-секретарем отделения ветеринарной медицины РАСХН A.M. Смирновым 07.12.2006 г.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Колотвин, Вячеслав Васильевич, Москва

1. Альтштейн А.Д. Вирусные инфекции и генетическая инженерия / А.Д.Альтштейн // Биотехнология. 1987. - № 3. - С. 276 - 283.

2. Ахматулина Н.Б. Генетика вирусов человека и животных / Н.Б. Ахматулина. Алма-Ата: Наука, 1990. - 168 с.

3. Лиманская О. Детекция провирусной ДНК вируса иммунодефицита крупного рогатого скота посредством полимеразной цепной реакции/ О. Лиманская, М. Rola, L. Bicka //Вопросы вирусологии/ 2005.- №50, 2. С. 38-43

4. Самуйленко А.Я. Инфекционная патология животных: В 2 т / А .Я. Самуйленко, Б.Н. Соловьев, Е.А. Непоклонов, Е.С.Воронин. М.: ИКЦ «Академкнига», 2006. т.1.- С. 486-489

5. Сингер М. Гены и геномы /М. Сингер, П. Берг. М: "Мир", 1998, Том 1, -С. 360-363.

6. Сюрин В.Н. Вирусные болезни животных./ В.Н. Сюрин. М: ВНИИТИБП, 1998. - С. 445-448.

7. Федоров Ю.Н. Вирус иммунодефицита крупного рогатого скота. / Ю.Н. Федоров, О.А. Верховский // Ветеринария. 1996. - № 10.

8. Agresti A., Ponti W., Rochi M.et al 1993. Use of polymerase chain reaction to diagnose bovine leukemia virus infection in calves. Am. J. Vet. Res. 54, 373376.

9. Amborski G. F., Lo J. L., Seger C. L. 1989. Serological detection of multiple retroviral infections in cattle : bovine leukemia virus, bovine syncytial virus and bovine visna virus. Veterinary Microbiology 20, 247±253.

10. Avidan 0, Bochner R, Hizi A. 2006. The catalytic properties of the recombinant reverse transcriptase of bovine immunodeficiency virus. Virology. Jul 20;351(l):42-57.

11. Barboni P.,Thompson J., Brownlie N. et al 2001. Evidence for the presence of two bovine lentiviruses in the cattle population of Bali. Vet. Microbiol. 80:313-327.

12. Baron T., D. Betemps, F. Mallet et al 1998. Detection of bovine immunodeficiency-like virus infection in experimentally infected calves. Arch. Virol. 143:181-189.

13. Battles JK, Hu MY, Rasmussen L et al 1992. Immunological characterization of the gag gene products of bovine immunodeficiency virus. J Virol; 66: 6868-6877

14. Beier D., Blankenstein P., Marquardt O. et al 2001. Identification of different BLV provirus isolates by PCR, RFLPA and DNA sequencing. Berl. Munch. Tierarztl. Wochenschr. 114, 252-256.

15. Berkowitz R. D., lives H., Lin Yu Wei et al 2001 Construction and molecular analysis of gene transfer systems derived from Bovine immunodeficiency virus Journal of Virology, april, 3371-3382

16. Berkowitz R. D., Fisher and S. P. Goff. 1996. RNA packaging. Curr. Top. Microbiol. Immunol. 214:177-218.

17. Berzofsky JA, Ahlers JD, Janik J et al 2004. Morris Progress on new vaccine strategies against chronic viral infections J Clin Invest; 114: 450462

18. Bicka L., Rola M., Kuzmak J. 2000. Experimental infection of sheep with bovine immunodeficiency virus/ Bull. Vet. Inst. Pulawy., Vol. 44, 3-11

19. Bielanski A et al 2000. Viral contamination of embryos cryopreserved in liquid nitrogen/ Cryobiology;40(2):l 10-6

20. Bieniasz P. D., T. A. Grdina, H. P. Bogerd et al 1999. Highly divergent lentiviral Tat proteins activate viral gene expression by a common mechanism. Mol. Cell. Biol. 19:4592^1599.

21. Bouillant A.M., Ruckerbauer G.M., Neilson, K.H. 1989. Replication of the bovine immunodeficiency-like virus in diploid and aneuploid cells: permanent, latent and virusproductive infections in vitro. Res. Virol. 140, 511-529.

22. Brownlie J., Collins M.E., Heaton P. 1994. Bovine immunodeficiency-like virus a potential cause of disease in cattle? / Vet Rec, 134, 289-291

23. Brownlie J. 1992. Comparing Jembrana Disease Virus (JDV) of Bali Cattle and Bovine Imunnodeficiency Virus / Current Topics Institute of Animal Health (IAH), 12, Compton, Newbury, UK

24. Burns D., Desrosiers R.C. 1994. Envelope sequence variation, neutralizing antibodies and primate lentivirus persistence/ Current Topics in Microbiology and Immunology, 188, 185 -219

25. Carpenter S., Miller L. D., Alexandersen S. et al 1992. Characterization of early pathogenic eaects after experimental infection of calves with bovine immunode/Eciency-like virus. Journal of Virology 66, 1074-1083.

26. Carpenter S., S. A. Nadin-Davis, Y. Wannemuehler et al 1993. Identification of transactivation-response sequences in the long terminal repeat of bovine immunodeficiency-like virus. J. Virol. 67:4399-4403.

27. Carpenter S, Vaughn EM, Yang J et al 2000. Antigenic and genetic stability of bovine immunodeficiency virus during long term persistence in cattle experimentally infected with the BIV (R29) isolate / J Gen Virol, 81, 463 -472

28. Cavirani S et al . Seroprevalence to bovine immunodeficiency virus and lack of association with leukocyte counts in Italian dairy cattle/Prev Vet Med, 37(1-4): 147-57

29. Chadwick B. J., R. J. Coelen, G. E. Wilcox et al 1995. Nucleotide sequence analysis of Jembrana disease virus: a bovine lentivirus associated with an acute disease syndrom. J. Gen. Virol. 76:1637-1650.

30. Chen H., G. Wilcox, G. Kertayadnya et al 1999. Characterization of the Jembrana disease virus tat gene and the eis- and trans-regulatory elements in its long terminal repeats. J. Virol. 73:658-666.

31. Chen L., and A. D. Frankel. 1994. An RNA-binding peptide from bovine immunodeficiency virus Tat protein recognizes an unusual RNA structure. Biochemistry 33:2708-2715.

32. Chen G, Wang S, Xiong K et al 2002. Construction and characterization of a chimeric virus (BIV/HIV-1) carrying the bovine immunodeficiency virus gagpol gene. AIDS; 16:123-125

33. Cho KO, Meas S et al. 1991. Seroprevalence of bovine immunodeficiency virus in dairy and beef cattle herds in Korea/ J Vet Med Sei 1999;61(5):549-51

34. Clements! E. 1993. Genetic regulation of the ungulate lentiviruses. AIDS 5:S15-S20.

35. Coats K. 1995. Dual infection with bovine immunodeficiency virus and bovine leukaemia virus in Mississippi dairy cattle/ Vet. Ree., 18, 136(11):269-70

36. Cockerell G. L., Jensen W. A., Rovnak et al 1992. Seroprevalence of bovine immunode^Eciency-like virus and bovine leukemia virus in a dairy cattle herd. Veterinary Microbiology 31, 109-116.

37. Coffin J.M. 1979. Structure, replication and recombination of retrovirus genomes: some unifying hypotheses./ Journal of General Virology, 42, 1-26

38. Coffin J.M. 1992. Genetic diversity and evolution of retroviruses / Current Topics in Microbiology and Immunology, 176, 143-164

39. Coffin JM, Essex M, Gallo R et al 2002. Bovine immunodeficiency virus/Materials of the Sixth ICTV Report

40. Cooper C., Hanson L., Diehl W. et al 1999. Natural selection of the pol gene of bovine immunodeficiency virus/ Virology, Vol. 255, N 2., 294-301

41. Egberink, H., and M. C. Horzinek. 1992. Animal immunodeficiency viruses. Vet. Microbiol. 33:311-331.

42. Flaming K., Van Der Maaten M., Whetstone C. 1993. The eäect of bovine immunode/Eciency-like virus infection on immune function in experimentally infected cattle. Veterinary Immunology and Immunopathology 36, 91-105.

43. Flaming K. P., Frank D. E., Carpenter S.et al 1997. Longitudinal studies of immune function in cattle experimentally infected with bovine immunodeyEciency-like virus and}or bovine leukemia virus. Veterinary Immunology and Immunopathology 56, 27-38.

44. Fong S. E., Greenwood J. C., Williamson, D. 1997. Bovine immunodeficiency virus tat gene: cloning of two distinct cDNAs and identification, characterization, and immunolocalization of the tat gene products. Virology 233:339-357.

45. Fong, S. E., L. A. Pallansch, J. A. Mikovits et al 1995. cis-acting regulatory elements in the bovine immunodeficiency virus long terminal repeat. Virology 209:604-614.

46. Forman, A. J., C. A. Gibson, and B. J. Rodwell. 1992. Serological evidence for the presence of bovine lentivirus infection in Australia. Aust. Vet. J.69:337.

47. Garvey,K.J., Oberste,M.S., Elser,J.E. et al 1990 Nucleotide sequence and genome organization of biologically active proviruses of the bovine immunodeficiency-like virus/ Virology, 175 (2), 391-409

48. Gelmenn, E.P., Popovic, M., Blayney, D. et al 1983. Proviral DNA of a retrovirus, human T-cell leukemia virus, in two patients with AIDS. Science 220, 862-865.

49. Goff S.P. et al 2001 in book: Fieds Virologi, Lippincott Williams & Wilkins, USA, vol.2, 1874- 1941,

50. Gonda MA et al 1994 Bovine immunodeficiency virus: molecular biology and virus-host interactions/ Virus Res.,, 32(2): 155-81

51. Gonda MA, Braun MJ, Carter SG et al 1987 Characterization and molecular cloning of a bovine lentivirus related to human immunodeficiency virus, Nature,, 2, 330(6146):388-91

52. Gonda, M.T., Oberste, M.S., Garvey, K.J. et al 1990. Contemporary developments in the biology of the bovine immunodeficiency-like virus. In: Schellenkens, H., Horzinek, M.C. (Eds.), Animal Models in AIDS. Elsevier, The Netherlands, pp. 233-255.

53. Gradil CM et al. 1999 Detection of bovine immunodeficiency virus DNA in the blood and semen of experimentally infected bulls/ Vet Microbiol;70(l-2):21 -31

54. Gonzalez GC et al. 2001. Very low prevalence of bovine immunodeficiency virus infection in western Canadian cattle/ Can J Vet Res, 65(1 ):73-6

55. Greenbaum, N. L. 1996. How Tat targets TAR: structure of the BIV peptide RNA complex. Structure. 4:5-9.

56. Guo X, Hu J, Whitney JB, Russell RS et al 2004. Important role for the CA-NC spacer region in the assembly of bovine immunodeficiency virus Gag protein. J Virol; 78: 551-560

57. Hirai, N., H. Kabeya, K. Ohashi et al 1996. Detection of antibodies against bovine immunodeficiency-like virus in dairy cattle in Hokkaido. J. Vet. Med. Sei. 58:455-457.1657.

58. Horner, G. W. 1991. Serologic evidence of bovine immunode/Eciencylike virus and bovine syncytial virus in New Zealand. Surveillance 18, 9±14.

59. Horzinek M et al 1991. Bovine immunodeficiency virus: immunochemical characterization and serological survey/ J Gen Virol; 72 ( Pt 12):2923-8

60. Horowitz R, Frank, M. B. 1997. Polymerase Chain Reaction. In: Frank, M. B. ed. Molecular Biology Protocols. USA.

61. Hu W.S., Temin H.M. 1990. Genetic consequences of packaging two RNA genomes in one retroviral particle: pseudodiploidy and high rate of genetic recombination / Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, 87, 1556-1560

62. Hu W.S., Temin H.M. 1993. Retroviral recombination and reverse transcription / Science 250, 1227-1233

63. Isaacson, J. A., C. Roth, C. Wood et al 1995. Loss of Gagspecific antibody reactivity in cattle experimentally infected with bovine immunodeficiencylike virus. Viral Immunol. 8:27-36.

64. Isaacson JA et al 1998. Effects of long-term infection with bovine immunodeficiency virus and/or bovine leukemia virus on antibody and lymphocyte proliferative: Vet Immunol Immunopathol;64(3):249-66

65. Jacobs RM, Jefferson BJ, Suarez DL 1998. Prevalence of bovine immunodeficiency-like virus in buuls as determined by serology and proviral detection / Can J Vet Res, 62, 231 -233

66. Jacobs RM et al 1995. A serological survey of bovine syncytial virus in Ontario: associations with bovine leukemia and immunodeficiency-like viruses, production records, and management practices/ Can. J Vet. Res., 59(4):271-8

67. Joag S.V., Stephens E.B., Narayan 0. 1996. Lentiviruses. Field virology, 1997-1996

68. Kuzmak Jacek, Bicka Leokadia 1999. Seroprevalence of Bovine Immunodeficiency Virus (BIV) in cattle from Poland/ vol. 55(11), 709-780, , pages 746-749

69. Li Yuxing, Susan Carpenter 2001. C/s-acting sequences may contribute to size variation in the surface glycoprotein of bovine immunodeficiency virus/ Journal of General Virology, 82, 2989 2999

70. Liu, Z.-Q., D. Sheridan, and C. Wood. 1992. Identification and characterization of the bovine immunodeficiency-like virus tat gene. J. Virol. 66:5137-5140.

71. Lower, R., J. Lower, and R. Kurth. 1996. The viruses in all of us: characteristics and biological significance of human endogenous retrovirus sequences. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:5177-5184.

72. Malim, M. H., J. Hauber, R. Fenrick et al 1988. Immunode-ficiency virus rev trans-activator modulates the expression of the viral regulatory genes. Nature 335:181-183.

73. Martin, S.J., O'Neill, T.P., Bilello, J.A. et al 1991. Lymphocyte transformation abnormalities in bovine immunodeficiency-like virus infected calves. Immunol. Lett. 2781±84.

74. McNab W.B., Yacobs R.M., Smith H.E. 1994. A serological survey for bovine immunodeficiency virus in Ontario dairy cattle and associations between test results, production records and management practices / Can J Vet Res, 58, 26-41

75. Meas, S., Kabeya, H., Yoshihara, S. et al 1998. Seropevalence and field isolation of bovine immunodeficiency virus. J. Vet. Med. Sci. 60, 1195-1202.

76. Meas S, Yilmaz Z, Usui T, Torun S, Yesilbag K, Ohashi K, Onuma M. Evidence of bovine immunodeficiency virus in cattle in Turkey. Jpn J Vet Res. 2003 May;51(l):3-8.

77. Meas S, Ohashi K, Sugimoto C. 2001. Phylogenetic relationships of bovine immunodeficiency virus in cattle and buffaloes based on surface envelope gene sequences. Brief report. Arch Virol.;146(5):1037-45.

78. Meas S, Ohashi K, Tum S. et al 2000. Seroprevalence of bovine immunodeficiency virus and bovine leukemia virus in draught animals in Cambodia. J Vet Med Sei. Jul;62(7):779-81.

79. Meas S et al. 2004. Evidence for bovine immunodeficiency virus infection in cattle in Zambia/Jpn J Vet Research, May;52 (l):3-8

80. Meas S et al. 2002. Seroprevalence and molecular evidence for the presence of bovine immunodeficiency virus in Brazilian cattle/J Vet Res;50(l):9-16

81. Meas S. et al. 2002. Vertical transmission of bovine leukemia virus and bovine immunodeficiency virus in dairy cattle herds/Veterinary Microbiology, , Vol.84, № 3, p. 275-282

82. Meas S et al 2000. Seroprevalence of bovine immunodeficiency virus and bovine leukemia virus in draught animals in Cambodia/ J Vet Med Sei ;62(7):779-81

83. Mitrophanous, K., S. Yoon, J. Rohll, D. et al 1999. Stable gene transfer to the nervous system using a non-primate lentiviral vector. Gene. Ther. 6:18081818.

84. Miyoshi, H., U. Blomer, M. Takahashi, F. H. et al 1998. Development of a self-inactivating lentivirus vector. J. Virol. 72:8150-8157.

85. Moody CA et al. 2002. Confirmation of vertical transmission of bovine immunodeficiency virus in naturally infected dairy cattle using the polymerase chain reaction/ J Vet Diagn Invest; 14(2): 113-9

86. Muluneh A. 1994. Seroprevalence of bovine immunodeficiency-virus (BIV) antibodies in the cattle population in Germany/ Zentralbl Veterinarmed B, , 41(10):679-84

87. Moore EC, Keil D, Coats KS. 1996. Thermal inactivation of bovine immunodeficiency virus/ Appl. Environ. Microbiol.; 62(11): 4280-3

88. Mullis KB, Faloona FA. 1987. Specific synthesis of DNA in vitro via a polymerase-catalyzed chain reaction/Methods Enzymol.; 155:335-50

89. Nadin Davis S.A., Chang S.C., Smith H. et al 1993. Detection of bovine immunodeficiency-like virus by the polymerase chain reaction / J Virol Mthods, 42, 323-336

90. Nagy P., Bujarski J.J. 2000. New insights into the mechanisms of RNA recombination / Virology 235, 1-9

91. Nash, J.W., Hanson, L.A., St. Cyr Coats, K., 1995. Detection of bovine immunodeficiency virus in blood and milk-derived leukocytes by use of polymerase chain reaction. Am. J. Vet. Res. 4, 445-449.

92. Nash JW, Hanson LA, St Cyr Coats K. 1995. Bovine immunodeficiency virus in stud bull semen/ Am J Vet. Res.; 56(6):760-3

93. Oberste, M. S., J. C. Williamson, J. D. Greenwood, K. et al 1993. Characterization of bovine immunode-ficiency virus rev cDNAs and identification and subcellular localization of the rev protein. J. Virol. 67:6395-6405.

94. Onuma, M., Ogawa, Y., Kawakami, Y., 1990. An evaluation of the syncytial assay for detection of bovine immunodeficiency-like virus. Jpn. J. Vet. Sei. 52, 1131-1133.

95. Onuma M et al 1992. Infection and dysfunction of monocytes induced by experimental inoculation of calves with bovine immunodeficiency-like virus/ J Acquire Immune Defic. Syndr., 5(10): 1009-15

96. Orr KA, O'Reilly KL, Scholl DT. 2003. Estimation of sensitivity and specificity of two diagnostics tests for bovine immunodeficiency virus using Bayesian techniques.Prev Vet Med. Oct 15;61(2):79-89.

97. Pallansch, L. A., C. S. Lackman-Smith, and M. A. Gonda. 1992. Bovine immunodeficiency-like virus encodes factors which trans activate the long terminal repeat. J. Virol. 66:2647-2652.

98. Patil S.S., Pattnaik B., Mishra N. et al 2003. Detection of proviral genomic sequence of bovine immunodeficiency virus in Indian cattle / Current science, Vol. 84, 4

99. Pifat, D. Y., W. H. Ennis, J. M. Ward, M. S. et al 1992. Persistent infection of rabbits with bovine immunodeficiency-like virus. J. Virol. 66:4518-4524.

100. Polack B et al 1996. Serologic evidence for bovine immunodeficiency virus infection in France/ Vet Microbiol, 48(1-2): 165-73

101. Puglisi, J. D., L. Chen, S. Blanchard, and A. D. Frankel. 1995. Solution structure of a bovine immunodeficiency virus Tat-TAR peptide-RNA complex. Science. 270:1200 -1203.

102. Renshaw, R.W., Casey, J.W., 1994. Trancriptional mapping of the 3% end of the bovine syncytial virus genome. J. Virol. 68, 1021-1028.

103. Rovid, A. H., Carpenter, S. & Roth, J. A. 1995. Monocyte function in cattle experimentally infected with bovine immunode/Eciency-like virus. Veterinary Immunology and Immunopathology 45, 31-43.

104. Rovid, A. H., Carpenter, S., Miller, L. D. et al 1996. An atypical T-cell lymphosarcoma in a calf with bovine immunode/Eciency-like virus infection. Veterinary Pathology 33,457-459.

105. Rychlik W., Spencer W., Rhoads R.E. 1990. Optimization of the annealing temperature for DNA amplification in vitro/ Nucl. Acid Res., Vol. 18, P. 1195-1202

106. Sagata, N., Yasunaga, T., Tsuzuku-kawamura, J. et al 1985. Complete nucleotide sequence of the genome of bovine leukemia virus: its evolutionary relationship to other retroviruses. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 677-681.

107. Sanger, F., Nicklen, S., Coulson, A.R., 1977. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proc. Nat. Acad. Sci. USA 74, 5463-5467.

108. Scholl, D.T., Truax, R.E., Baptista, J.M. et al 2000. Natural transplacental infection of dairy calves with bovine immunodeficiency virus and estimation of effect on neonatal health. Prev. Vet. Med. 43, 239-252.

109. Scobie, L., C. Venables, K. Hughes, M. et al 1999. The antibody response of cattle infected with bovine immunodeficiency virus to peptides of the viral transmembrane protein. J. Gen. Virol. 80(Pt. 1):237—243.

110. Scobie L, Venables C, Sayers AR et al 2001. Prevalence of bovine immunodeficiency virus infection in cattle in Great Britain.Vet Ree. Oct 13; 149(15):459-60.

111. Shucheng Z. et al. 1997. Immune Suppression in Calves with Bovine Immunodeficiency Virus/ Clinical and diagnostic laboratory immunology, , Vol. 4, No. 2 p. 232-235

112. S Schnell, C Mendoza 1997. Theoretical Description of the Polymerase Chain Reaction / J. Theor. Biol.,, 188, 313-318

113. Sninsky JJ 1990. The polymerase chain reaction (PCR): a valuable method for retroviral detection/Lymphology., 23(2):92-7

114. Snider TG, Hoyt PG, Coats KS 2003. Natural bovine lentiviral type 1 infection in Holstein dairy cattle. I. Clinical, serological, and pathological observations/ Comp Immunol Microbiol Infect Dis;26(2):89-101

115. Snider TG, Hoyt PG, Jenny BF 1997. Natural and experimental bovine immunodeficiency virus infection ic cattle / Vet Clin North Am Food Anim Prac, 13, 151-176

116. Snider TG 3rd, Coats KS et al. 2003. Natural bovine lentivirus type 1 infection in Holstein dairy cattle. II. Lymphoid tissue lesions/Comp. Immunol. Microbiol. Infect. Dis.,26(l):l-15

117. Snider, T. G., D. G. Luther, B. F. Jenny, P. G. Et al 1996. Encephalitis, lymphoid tissue depletion and secondary diseases associated with bovine immunodeficiency virus in a dairy herd. Comp. Immunol. Microbiol. Infect. Dis. 19:117-131.

118. St-Louis MC, Cojocariu M, Archambault D. 2004. The molecular biology of bovine immunodeficiency virus: a comparison with other lentiviruses. Anim Health Res Rev. Dec;5(2): 125-43.

119. St Cyr Coats, K., Pruett, S. B., Nash, J. W. et al 1994. Bovine immunode/Eciency virus : incidence of infection in Mississippi dairy cattle. Veterinary Microbiology 42, 181-189.

120. Stuhlmann H., Berg P. 1992. Homologous recombination of copackaged retrovirus RNAs during reverse transcription / Journal of Virology, 66, 2378 -2388

121. Suarez DL, Van der Maaten MJ, Whestone CA 1995. Improved early and long term detection of bovine lentivirus by a nested polymerase chain reaction test in expirementally infected calves / Am J Vet Res, 56, 579-586

122. Suarez, D. L., Van Der Maaten, M. J., Wood, C. et al 1993. Isolation and characterization of new wild-type isolates of bovine lentivirus. Journal of Virology 67, 5051-5055.

123. Suarez DL, Whetstone CA. 1999. Identification of hypervariable and conserved regions in the surface envelope gene in the bovine lentivirus / Virology 212, 728-733

124. Suarez DL, Whetstone CA. 1998. PCR diagnosis of the bovine immunodeficiency-like virus/ Methods Mol Biol;92:67-79

125. Suarez DL, Whetstone CA. 1997. Size variation within the second hypervariable region on the surface envelope gene of the bovine lentivirus BIV in experimentally and natural infected cattle / Journal of Virology, 24822486

126. Tajima, M. et al 1997. Distribution of bovine immunodeficiency virus in the organs of experimentally infected cows. Jpn. J. Vet. Res., 45(3): 163-167.

127. Taube, R., K. Fujinaga, J. Wimmer, M. et al 1999. Tat transactivation: a model for the regulation of eukaryotic transcriptional elongation. Virology 264:245-253.

128. Telesnitsky A., Goff S.P. 1997. Reverse transcriptase and the generation of retroviral DNA/ In Retroviruses, 121-160. Edited by: J.M. Coffin, S.H. Hughes, H.E. Varmus. Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Laboratory.

129. Tobin, G., Ennis, W., Clanton, D., et al 1996. Inhibition of bovine immunodeficiency virus by anti-HIV-1 compounds in a cell culture-assay. Antiviral Res. 33,21-31.

130. Tobin, G. J., R. C. Sowder, D. Fabris, M. Y. et al 1994. Amino acid sequence analysis of the proteolytic cleavage products of the bovine immunodeficiency virus Gag precursor polypeptide. J. Virol. 68:7620-7627.

131. Trono, D. 2000. Lentiviral vectors: turning a deadly foe into a therapeutic agent. Gene Ther. 7:20-23.

132. Usui T. et al. 2003. Seroprevalence of bovine immunodeficiency virus and bovine leukemia virus in dairy and beef cattle in Hokkaido/ J Vet Med Sei.

133. Van der Maaten MJ, Boothe AD, Seger CL. 1972. Isolation of a virus from cattle with persistent lymphocytosis. J. Natl. Cancer Inst.,, 49(6): 1649-1657

134. Van der Maaten, M.J., Whetstone, C.A., 1992. Infection of rabbits with bovine immunodeficiency-like virus. Vet. Microbiol. 30, 125-135.

135. Van Regenmortel M.H.V. et al. (eds) 2000. Virus Taxonomy. Seventh Report of the International Committee on Taxonomy of Viruses. Academic Press, , 369-387, USA.

136. Walder R et al 1995. Possible role of bovine immunodeficiency virus in bovine paraplegic syndrome: evidence from immunochemical, virological and seroprevalence studies/Res.Virol., 146(5):313-23

137. Wannemuehler, Y., J. Isaacson, M. Wannemuehler et al 1993. In vitro detection of bovine immunodeficiency-like virus using monoclonal antibodies generated to a recombinant Gag fusion protein. J. Virol. Methods 44:117-127.

138. Whetstone, C. A., M. J. Van Der Maaten, and J. W. Black. 1990. Humoral immune response to the bovine immunodeficiency-like virus in experimentally and naturally infected cattle. J. Virol. 64:3557-3561.

139. Whetstone, C. A., M. J. Van Der Maaten, and J. M. Miller. 1991. A Western blot assay for the detection of antibodies to bovine immunodeficiency-like virus in experimentally inoculated cattle, sheep and goats. Arch. Virol. 116:119-131.

140. Whetstone C.A., Suarez D.L., Miller J.M. et al 1997. Bovine lentivirus induced early transient B cell proliferation in experimentally inoculated cattle and appears to be pantropic/ J. Virol., Vol. 71, N 1, 640-644

141. Willey, R.L., Rutledge, R.A., Dias, S., et al 1986. Identification of conserved and divergent domains within the envelope gene of the acquired immunodeficiency syndrome retrovirus. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, 5038-5042.

142. Wooley D.P., Bircher L.A., Smith R.A. 1998. Retroviral recombination is nonrandom and sequence depend / Virology, 243, 229-234

143. Wu D, Murakami K, Morooka A, Jin H, et al 2003. In vivo transcription of bovine leukemia virus and bovine immunodeficiency-like virus.Virus Res. Nov;97(2):81-7.

144. Zhang J., Temin H.M. 1993. 3' junctions of oncogene virus sequences and the mechanisms for formation of highly oncogenic retroviruses / Journal of Virology, 67, 1747-1751

145. Zhang J., Temin H.M. 1993. Rate and mechanism of nonhomologous recombination during a single cycle of retroviral replication. / Science, 259, 234-238

146. Zhang J., Tang L.Y. et al 2000. Most retroviral recombinations occur during mini strand DNA synthesis / Journal of Virology, 74, 2313-2322

147. Zhang S et al 1997. Immune suppression in calves with bovine immunodeficiency virus/ Clin Diagn Lab Immunol; 4(2): 232-5

148. Zhang, S., D. L. Troyer, S. Kapil, L. et al 1997. Detection of proviral DNA of bovine immunodeficiency virus in bovine tissues by polymerase chain reaction (PCR) and PCR in situ hybridization. Virology 236:249-257.

149. Zhang, S., C. Wood, W. Xue, S. M. et al 1997. Immune suppression in calves with bovine immunodeficiency virus. Clin. Diagn. Lab. Immunol. 4:232-235.

150. Zhang, S., W. Xue, C. Wood, Q. et al 1997. Detection of bovine immunodeficiency virus antibodies in cattle by Western blot assay with recombinant gag protein. J. Vet. Diagn. Investig. 9:347-351.

151. Zheng, L., M. Swanson, J. Liao, C. et al 2000. Cloning of bovine immunodeficiency virus gag gene and development of the recombinant protein-based enzyme-linked immunosorbent assay. Clin. Diagn. Lab. Immunol. 7:557-562.

152. Yi-Xin Zhu, Chang Liu, Xin-Lei Liu et al 2005. Construction and characterization of chimeric BHIV (BIV/HIV-1) viruses carrying the bovine immunodeficiency virus gag gene, World J Gastroenterol May 7;11(17):2609-2615