Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Вариабельность митохондриального генома Phytophtora infestans (Mont.) de Bary и структурная перестройка современных популяций гриба на территории России

ВАК РФ 03.00.24, Микология

Автореферат диссертации по теме "Вариабельность митохондриального генома Phytophtora infestans (Mont.) de Bary и структурная перестройка современных популяций гриба на территории России"

На правах рукописи УДК 575.174:632.401/08

МАЛЕЕВА Юлия Владимировна

ВАРИАБЕЛЬНОСТЬ МИТОХОНДРИАЛЬНОГО ГЕНОМА PHYTOPHTHORAINFESTANS (MONT.) de BARY И СТРУКТУРНАЯ ПЕРЕСТРОЙКА СОВРЕМЕННЫХ ПОПУЛЯЦИЙ ГРИБА НА ТЕРРИТОРИИ РОССИИ

03.00.24 - Микология 03.00.03 - Молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 1996

Работа выполнена на кафедре молекулярной биологии Биологического факультета Московского Государственного Университета имени М.В. Ломоносова.

Научный руководитель:

доктор биологических наук А. А.Колесников.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

О.Л. Озерецковская

кандидат биологических наук В.Г. Джавахия.

Ведущая организация:

Институт общей генетики РАН им. Н.И.Вавилова.

Защита диссертации состоится 27 декабря 1996г. в 15— часов на заседании диссертационного совета Д.053.05.65 Биологического факультета МГУ по адресу: 119899, Москва, Ленинские горы, МГУ, Биологический факультет.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МГУ.

Автореферат разослан 27 ноября 1996 г.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор биологических наук

С.Н. Лекомцева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Состояние проблемы и актуальность темы. Активные исследования последних лег демонстрируют серьезные изменения, происходящие по всему обширному ареалу Phytophthora infestons (Mont.) de Вагу. С конца 70-х гг. в Европе генетическая изменчивость гриба резко возросла, и стала сравнимой по своему уровню с популяцией в Центральной Мексике, на родине этого паразита (хотя по другой теории родиной предлагают считать Перуанские Анды).

Из всего комплекса факторов, влияющих на популяционный полиморфизм этого вида фитофторы, можно выделить несколько основных.

Во-первых, это степень дивергенции вида по отношению к своим растениям-хозяевам. Она возрастает в процессе сопряженной эволюции. P.infestons является паразитом целого ряда диких клубненосных пасленовых из секции Tuberaria, но в основном вредит картофелю и томатам. В последние годы вредоносность фитофтороза на томатах сильно возросла, все больше распространяется стеблевая форма болезни. И вопрос об уровне специализации в этих паразитарных системах поднимается все чаще.

Во-вторых, генетическое разнообразие и характер популяционных группировок любого микроорганизма зависят от системы его размножения. До недавнего времени вне Центральной Мексики встречались изоляты P.infestons только одного типа спаривания - А1, и популяции были агам-ными. А с конца 70-х гг. в Европе и России стали обнаруживать изоляты противоположного типа - А2. Их появление делает возможным половое размножение этого гетероталличного оомицета, приводящее к рекомбинации признаков и резко увеличивающее адаптивные возможности паразита.

Третьим фактором, роль которого трудно переоценить, является миграция. Фитофтора с этой точки зрения является идеальным объектом, так как ее появление в разных странах строго документировалось. По этим данным и на основе анализа выборок разных лет сотрудникам Корнельско-го университета удалось представить схему нескольких миграций P. infestons, в результате которых гриб расселился практически по всему миру. Было также показано, что больше 130 лет (начиная с Ирландской эпифитотии 1845 г и до европейской засухи 1976 г, погубившей весь урожай картофеля, что заставило закупить его в Мексике) европейская популяция фитофторы была представлена единственным клоном. А в конце 70-х гг. в Европе «старые» изоляты А1 типа спаривания стали вытесняться «новыми», относящимися к обоим типам спаривания.

«Новые» популяции отличаются несколько более высокой агрессивностью, а также по биохимическим и молекулярным маркерам (изоферментным спектрам пептидазы и фосфоглюкоизомеразы, локусам, определяемым методом гибридизации ядДНК со специфическим зондом RG-57, представляющим собой фрагмент умеренных повторов, и по полиморфизму мтДНК). Причем, митохондриальные маркеры из-за небольших

«

размеров мт генома, его гаплоидности и наследования без рекомбинации вне зависимости от способа размножения организма считаются одними из лучших для изучения миграционных процессов.

Наши коллекции P.infestons (в отличие от Мексиканских и Европейских) были охарактеризованы очень фрагментарно и в основном по мор-фолого-физиологическим признакам.

Цель и задачи исследования. Целью работы был анализ популяцион-ной структуры P. infestons, патогена картофеля и томатов, и возможных механизмов ее динамики на Европейской территории России в 1990-95 гг. с использованием молекулярных генетических маркеров. Мы ставили перед собой следующие задачи:

1) подобрать митохондриальный маркер, удобный для анализа структуры и динамики генотипического состава популяций P.infestons-,

2) оптимизировать метод тестирования изолятов по полиморфизму мтДНК;

3) сопоставить характеристики изолятов P.infestons по цитоплазматиче-скому и ядерным маркерам;

4) исследовать выборки изолятов P.infestons с использованием подобранного митохондриального маркера с целью анализа:

а) географической изменчивости P. infestons-,

б) мониторинга состояния популяции гриба в течение эпифитотии;

в) многолетнего наблюдения за популяционной структурой паразита;

г) степени дивергенции вида P. infestons по отношению к двум растениям-хозяевам - картофелю и томатам;

5) проанализировать вариабельность нуклеотидной последовательности полиморфного фрагмента мтДНК разных типов, встречающихся в исследованных выборках;

6) разработать подходы, обеспечивающие получение новых цитоплазмати-ческих маркеров, для более детального изучения генотипического разнообразия P.infestons и механизмов его формирования.

Научная новизна и практическая значимость работы. Впервые в нашей стране проведен комплексный анализ популяций P.infestons с использованием молекулярных характеристик, что позволяет сравнивать ситуацию, складывающуюся в России, с процессами, происходящими в других странах.

По данным анализа вариабельности полиморфного участка мт генома в комплексе с физиолого-биохимическими характеристиками продемонстрирована частичная генетическая изоляция между популяциями гриба, паразитирующими на картофеле и томатах, векторизованное вытеснение «старых» генотипов «новыми» и запаздывание миграционной волны в томатных популяциях по сравнению с картофельными.

Результаты изоферментного анализа показали существование в российских популяциях P.infestans до 1993г. включительно высоко гомогенной внутривидовой группы изолятов с Ib типом мтДНК. 2

Разработай экспресс-метод для определения типа мтДНК Р.infestons в чистой культуре и на инфицированном растительном материале, позволяющий проводить мониторинг популяционных изменений в процессе быстротечной эпифитотии.

Предложены подходы для разработки новых популяционных маркеров P. infestons - это поиск других вариабельных участков мт генома гриба на основе Long PCR-амплификации и анализ полиморфизма двуспираль-ной РНК в суммарных препаратах нуклеиновых кислот.

Апробация работы. Результаты исследования были представлены на I Всероссийском Съезде по защите растений (1995, С.-Петербург, Россия), V Конгрессе Европейского Общества Эволюционной Биологии (1995, Эдинбург, Шотландия), юбилейной фитопатологической конференции "Phytophthora-\50" (1995, Дублин, Ирландия), III Европейской Конференции по Генетике Грибов (1996, Мюнстер, Германия), 13 Трехгодичной Конференции Европейской Ассоциации по Изучению Картофеля (1996, Вельдховен, Нидерланды), а также на научных семинарах, проводившихся на каф. молекулярной биологии биологического ф-та МГУ и в Колледже Биологических Наук Университета Северного Уэльса (Англия). Диссертация апробирована на совместном заседании сотрудников кафедр микологии и альгологии и молекулярной биологии в 1996 г.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 4 печатных работы и сданы в печать 2 статьи.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, методической части, результатов, обсуждения и выводов; изложена на страницах машинописного текста, содержит таблиц и рисунков. Список литературы включает наименований, в том числе на иностранных языках.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

176 изолятов P. infestons, выделенных с картофеля и томатов в 199095 годы в разных точках на территории России (рис. 1.) и предварительно проанализированных по типу спаривания и устойчивости к фунгициду ме-талаксилу, были переданы нам для дальнейшего тестирования из коллекции кафедры микологии и альгологии биологического ф-та МГУ. Тип мтДНК был нами также определен у 59 изолятов, выделенных в 1993 и 1995 гг. в окрестностях Бангора (Северный Уэльс, Англия).

В зависимости от задачи P. infestons культивировали на жидких и агаризованных средах, приготовленных на основе отваров горошка, картофеля, семян ржи и овсяных хлопьев, при +15-20°С.

При выделении ДНК из препаратов P. infestons использовали следующие методы разрушения материала: растирание мицелия или инфицированного растительного материала в жидком азоте, энзиматический лизис

3

клеточной стенки мицелия с улиточным ферментом, растирание мицелия с песком в 20% сахарозе в гомогенизаторе, лизис замороженного в жидком азоте мицелия прогретым до +65°С буфером с цетавлоном или протеина-зой К, лизис суспензии зооспорангиев или зооспор теми же буферами.

Рис. 1. Точки сбора изолятов P. infestons на территории России и Московской области в 1990-95 гг.

Препараты суммарной ДНК депротеинизировали фенолом и/или смесью хлороформа с изоамиловым спиртом (24:1) и осаждали изопропа-нолом.

МтДНК выделяли из суммарных препаратов нуклеиновых кислот методом очистки в градиенте CzCl или из митохондрий, полученных методом дифференциального центрифугирования в градиенте сахарозы.

Количество и качество полученных препаратов проверяли методом электрофореза в 1% агарозном геле.

Для PCR-диагностики использовали пару специфичных праймеров Р2, которые фланкировали полиморфный фрагмент мтДНК P.infestons (рис. 2) и имели следующую структуру: 4

PiMtP2F5'-TTCCCTTTGTCCTCTACCGAT-3' (21 п. н„ 34081-34101),

PiMtR2C5'-TTACGGCGGTTTAGCACATACA-3' (22 п. н„ 35150-35129).

PCR реакцию проводили в тонкостенных 0,5 мл пробирках в 25 мкл смеси (dNTP - 200 цМ каждого; MgCl - 2,75 шМ; олигонуклеотидные праймеры - 0,325 [¿М каждого, lxThermo Buffer, Tag DNA полимераза "Promega Ltd" -1 U), покрытой 50 мкл минерального масла, по следующей схеме, подобранной для амплификатора Techne РС-2:

1 цикл (+94°С - 2,10 мин, +55°С - 1,0 мин, +72°С -1,30 мин);

29 циклов (+94°С - 0,40 мин, +55°С - 1,00 мин, +72°С - 1,30 мин);

■ 1 цикл (+94°С - 0,40 мин, +72°С -10,00 мин, +72°С - 0,23 мин).

Специфичность амплификации доказывали методом прямого секве-нирования PCR-продукта, используя для этого асимметричную матрицу (модификация В.Н.Ксензенко).

Для определения типа мтДНК использовали рестрикционный анализ амплифицированного фрагмента с эндонуклеазой Mspl. Продукты рестрикции анализировали в 2% агарозном геле с последующей окраской бромистым этидием.

Нуклеотидную последовательность ДНК определяли прямым секве-нированием PCR-продуктов по методу Сэнгера. Для экстракции PCR-продуктов из геля использовали QIAquick Gel Extraction Kits.

Оптимизированный режим для Long-PCR реакции:

1 цикл (+94°С - 90 сек);

15 циклов (+94°С - 30 сек, +60°С - 30 сек, +68°С - 7 мин);

1 цикл (+68°С - 10 мин).

Праймеры для Long-PCR были разработаны с использованием программ Genetics Computer Group / SEQNET (Daresbury Lab., U.K.) и Macintosh-based Amplify (v. 1.2, BillEngels, Univ. of Wisconsin, Madison, U.S.A).

Изоферментный анализ проводили по стандартной методике, определяя электрофоретическую подвижность водорастворимых белков мицелия, экстрагированных после заморозки жидким азотом 20% раствором сахарозы. Крахмальный форез проводили 16 ч при 80 V в амино-морфолиновой буферной системе (рН 7,2), акриламидный (7,5 %) -2ч при 200 V в трис-боратной (рН 8,3-8,5) системе.

В качестве контролей использовали мексиканские изоляты P.infestans с известным генотипом, полученные из лаборатории Dr. Shaw (Ун-т Сев. Уэльса).

К одному фенотипу относили изоляты P.infestans, которые относились к одному и тому же типу спаривания, имели одинаковую чувствительность к металаксилу и один и тот же тип мтДНК.

Достоверность различий между выборками определяли с использованием теста на гетерогенность %2. Для анализа уровня разнообразия фенотипов в выборках использовали индекс Шеннона. Пары выборок сравнивали по двум коэффициентам сходства - Шорыгина и Серенсена, учитывающих не только набор фенотипов, но и их обилие. Кластерный анализ по методу невзвешенных средних, показывающий взаимоотношения между выборками, проводили на основании расчета показателя сходства Жи-вотовского.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Разработка молекулярно-генетичсских подходов для анализа популяционной изменчивости P.infestans.

1.1. Выбор метода анализа митохондриального полиморфизма P.infestans.

Основной проблемой при выделении грибной ДНК являлось, с одной стороны, эффективное разрушение клеточной стенки, а с другой стороны, -предотвращение деградации молекул ДНК. Для скрининга большого количества образцов особое значение приобретала также длительность, количество стадий и сложность процесса выделения ДНК. Сравнив несколько методов (растирание мицелия или инфицированного растительного материала в жидком азоте, энзиматический лизис клеточной стенки мицелия с улиточным ферментом, растирание мицелия с песком в 20% сахарозе в гомогенизаторе, лизис замороженного в жидком азоте мицелия прогретым до +65°С буфером с целгавлоном или протеиназой К), мы пришли к выводу о том, что последний метод получения суммарного препарата нуклеиновых кислот является наиболее подходящим по всем перечисленным параметрам.

Сравнение методов выделения мтДНК P.infestans ( из суммарных препаратов нуклеиновых кислот с помощью очистки в градиенте CzCl или из митохондрий, полученных в результате дифференциального центрифугирования в градиенте сахарозы) с амплификацией конкретного полиморфного фрагмента мтДНК методом PCR также показало неоспоримое преимущество последнего варианта с точки зрения эффективности и производительности. Кроме того, рестрикционный анализ амплифицирован-ного продукта позволял отнести изолят к группе «старых» или «новых» генотипов.

i. 2.. Сайт-полиморфизм мтДНК P. infestons.

Рестрикционный анализ амплифицированных фрагментов мтДНК показал, что в исследованных выборках изолятов Р.infestons были представлены только три типа мтДНК (Ib - «старый» тип, 1а и На - «новые») из семи известных (рис. 2). В наших выборках на картофеле преобладал Па тип мтДНК, а на томатах оба «новых» типа были распределены практически равномерно. На картофеле «старый» Ib тип в 1990г. был отмечен на Урале, а в 1991 - в Белоруссии. На томатах «старый » тип задержался дольше - в 1992 и 1993 гг. он был обнаружен в Московской области. В более поздних выборках он обнаружен не был.

Эти данные свидетельствуют о том, что в России, как и в Европе, в последние годы, видимо, происходила перестройка популяций P. infestons с вытеснением «старых» генотипов новыми. Причем, миграционная волна на томатах несколько запаздывала по сравнению с картофельной.

Проведенный анализ первичной последовательности полиморфного Р2 фрагмента мтДНК P.infestons показал практически полную гомологию последовательности для семи изолятов с разным митохондриальным типом за исключением нескольких точечных замен, приводящих к сайт-полиморфизму (рис. 2).

33

34

35

36 I

37 kb

"atp 1

"tRNA

"NAD4

Тип мтДНК

MsplMspl Mspl

| U

la Ib

Ha + +

- + - +

la CTGG CCGG CCGT Ib CTGG CCGG CCGG Ha CCGG CCGG CCGT

Полиморфный по МярЬсайтам фрагмент мтДНК Рлг^еэШпз содержит нуклеотидные последовательности концевых участков генов, кодирующих а субъединицу АТФазы и субъединицу 4 НАДН де-гидрогеназы, а также ген

тРЩО»

Рис. 2. Сайт-полиморфизм амплифицированных фрагментов, позволяющий диагностировать два «новых» (1а и Па) и один «старый» (1Ь) типы мтДНК Р.

1.3. Оптимизация метода определения типа мтДНК.

При неоспоримых достоинствах описанного метода тестирования типа мтДНК Р. hгfestam на чистых культурах гриба при его использовании для анализа инфицированных листьев на рестрикционном профиле наблюдалось наличие большого числа неспецифических полос, затрудняющих интерпретацию результата анализа (рис. 3). Это связано с тем, что

один из генов, ген а-субъединицы протонной АТФазы, который фланкирует исследуемый фрагмент, гомологичен пластидному растительному гену. Поэтому растительный материал, растираемый с азотом вместе с грибом, обеспечивал дополнительную матрицу для неспецифического отжига праймера.

Па Па 1а Па 1а 1а Па Па Па Па Па М Па 1Ь Па Па Па Па 1а Па Па Па Па

I

рттттштшттщ тмтщшфтщтШ««$

m m» - m <* г

рщ m щшшш Штщщ

.. . ' . - • " : , ' : ."" . , ."..■■•• г

k b

0.75 0.70 0.3 5 0.20 0.15 0.05

А - анализ чистых культур РлпГеБ1апз; Сверху указаны типы мтДНК изолятов (1а, 1Ь и Па), справа - размер рестрикционных фрагментов. М -1 кЬ маркер.

Б - анализ гомогенатов из листьев картофеля, инфицированных P. infest ans-,

В - анализ суспензий зоо-спорангиев, смытых с пораженных Р. infesta- ns плодов томатов.

Рис. 3. Рестрикционный анализ амплифицированных фрагментов мтДНК P. infestons в 2% агарозном геле

Подбор других полиморфных участков мтДНК P.infestons осложняется высоким содержанием А-Т пар в молекуле (78%), поэтому мы модифицировали способ подготовки материала для анализа. P.infestons имеет зооспоры, лишенные клеточной стенки, таким образом, использование их для выделения ДНК снимало проблему разрушения грибной клеточной стенки, а использование суспензии зооспорангиев, смываемых с инфицированной поверхности, сильно ускоряло процесс анализа, позволяя обхо-8

диться без выделения гриба в чистую культуру, не использовать трудоемкую процедуру растирания материала с жидким азотом и избавляло от попадания в препарат растительной ткани, мешающей анализу. Для анализа было достаточно материала с поверхности одного фитофторозного пятна, так как PCR требует в качестве матрицы единичных копий ДНК.

Таким образом, предложена оригинальный экспресс-метод определения типа мтДНК, позволяющий проводить скрининг большого количества образцов в сжатые сроки в условиях in vivo. Метод был опробован для популяционного скрининга P.infestans на томатах в 1995г в Англии (данные не показаны).

1.4. Изоферментный анализ.

В литературе встречаются противоречивые данные о возможности рекомбинации у одного изолята «старых» и «новых» характеристик, кодируемых ядерным геномом. По одним данным доказательства такой рекомбинации отсутствуют (Fry et al., 1993), а по другим данным один изолят из России имел «новый» генотип по изоферментам и «старый» генотип по 25 ядерным локусам, гибридизующимся с пробой RG-57 ( Goodwin et al., 1994). В то же время полагают, что изоляты со «старым» lb типом мтДНК, найденные в разных регионах, имеют общее происхождение и представляют собой высоко гомогенную группу, не скрещивающуюся с другими изолятами из-за разницы в плоидности ядер (Carter et al., 1991).

Для проверки корреляции между цитоплазматическими и ядерными характеристиками мы провели сравнительный изоферментный анализ 7 изолятов P.infestans со «старым» и 38 с «новыми» фенотипами, определенными по мтДНК. Было протестировано 6 изоферментов, из которых фос-фоглюкоизомераза (Е.С.5.3.1.9), пептидаза (Е.С.3.4.*.*) и малик энзим (Е.С. 1.1.1.40) оказались полиморфными, а малатдегидрогеназа (Е.С. 1.1.1.37), изоцитратдегидрогеназа (Е.С. 1.1.1.42) и глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа (Е.С. 1.1.1.49) - мономорфными. Причем, вся первая выборка была полностью гетерозиготной по фосфоглюкоизомеразе (генотип 86/100), а по пептидазе в ней были представлены два генотипа -92/100 и 100/100. Что соответствовало «старой» популяции. В другой выборке маркера «старой» популяции - гетерозигот по фосфоглюкоизомеразе,- не было. В результате и по изоферментным спектрам изоляты разделились на те же группы, что и по мтДНК. Таким образом, нами не было обнаружено рекомбинации между «старыми» и «новыми» генотипами P.infestans.

Популяционная изменчивость P. infestons.

2.1. Географическая изменчивость и перестройка популяционной структуры P. infestons в 90-е гг.

В выборках изолятов P. infestons с картофеля и томатов разных лет было обнаружено 15 различных фенотипов, выделенных по комплексу признаков и отличавшихся по частотам встречаемости в России и Англии (рис. 4).

Номер фенотипа Маркеры Количество изолятов

тип спар. уст-ть к мет. тип мтДНК

картоф. томат. картоф.*

1 А1 R На 34 1 0

2 А1 R la 3 5

3 А1 I lia 10 0

4 А1 I la 3

5 А1 S lia 14 7 1

6 А1 S la 1 38 25

7* А1 S Ib . 5 15 0

8 SF S la 1 0

9 SF R Ha 1 0

10 А2 R Ha 16 0

11 А2 R la 4

12 А2 I lia 1 2 0

13 А2 I la 1 0

14 А2 S Ha 5 17 0

15 А2 S la 1 3 1

Рис. 4. Характеристики фенотипов в популяцияxP.infestans в 1990 -95 гг.: типы спаривания - А1, А2 и вР (самофертильность), устойчивость к металаксилу - И (устойчивость), 8 (чувствительность) и I (промежуточная устойчивость), типы мтДНК - 1Ь, 1а и Иа. - изоляты, выделенные в Англии.

Анализируя коллекции картофельных изолятов Р.ш/ку/ят, собранные в 1990-1991гг, и сравнивая их со сборами 1993-1995гг., можно говорить о векторизованном распространении популяций паразита на Европейской территории России с северо-запада на юго-восток (рис. 1), которое сопровождалось падением индексов сходства с увеличением расстояния между точками сборов. Например, индексы сходства между белорусской выборкой 1990-1991гг. и коллекцией из Московской области 1990г. со-10

ставляло 33,3 - 32.2%, а между той же белорусской выборкой и уральской (Свердловск, 1990г.) - только 12,5 - 21% . Однако, сходство подмосковной и белорусской выборок можно объяснить и большими закупками белорусского картофеля, традиционными для Москвы и области.

Подмосковные популяции фитофторы с соседних картофельных и томатных посадок 1993 г. были сходны только на 4-6%, а в 1995 г сходство возросло до 44,5 - 61%. Разнообразие этих популяций по индексу Шеннона также было различным: на картофеле оно возросло почти в два раза (Нк/93=0.635, Нк/95=1.214), а на томатах оно было практически одинаково (Нт/93=1.165, Нт/95=1.129 - разница на 3.2%).

Сибирская картофельная популяция 1994-95гг. резко отличалась от Одинцовской 1993г. - их коэффициенты сходства составили только 5,6 -5,4%; а со Звенигородской популяцией 1995г. сходство было значительно больше - 55,6 - 37%. И опять после 1994г. разнообразие возросло в Одинцовской популяции 1993г. оно было минимальным (Н=0,635) по сравнению с разнообразием выборок 1995г. (Н=0,869 для Сибири и Н=1,214 для Звенигорода).

Видимо, на нашей территории в начале 90-х годов происходили какие-то изменения, в результате которых старый клон постепенно вытеснялся, а его место занимали новые клоны, вариабельность которых возрастала по мере адаптации в новых для них нишах. Возможно, это эффект горлышка бутылки. Причем, на картофеле мы наблюдали процесс уже в стадии увеличения разнообразия популяции паразита, а на запаздывающих в этом отношении томатах аналогичное вытеснение только происходило.

2.2. Динамика развития эпифитотии.

Анализируя выборки изолятов РлпГезгаш, выделенные в начале (конец июля), середине (начало августа) и в конце (середина августа) эпифитотии фитофтороза 1993г., можно с некоторой долей вероятности сказать, что практически гомогенная начальная выборка сменилась более разнообразной, но различия между этими выборками оказались недостаточно достоверными, поэтому для окончательного ответа на этот вопрос необходимо провести анализ на большем материале.

2.3. Уровень специализации Р.тГех1ат по отношению к растениям-хозяевам.

Анализ выборок изолятов Р. ¿н/еяШм с различных частей томатного растения-хозяина показал, что выборки с томатных листьев гораздо более гетерогенны, чем выборки с плодов. Причем, в 1993г. разница между ними была более резкой, чем в 1995 (Нл/93=1,145, Нп/93=0,535, а индексы сходства составили 41,1 - 40%; Нл/95=1,199, Нп/95=0,831, а индексы сходства -68,7 - 64%). Кластерный анализ также показал более сильные различия между выборками с плодов и листьев 1993г., чем между аналогичными

11

выборками 1995г. (рис. 5).Сходные результаты были нами получены по изменчивости типа мтДНК на английских томатах (данные не показаны).

AVERAGE LINKAGE METHOD TREE DIAGRAM

DISTANCES

0.000 0.500

Тл /95

Tn/95

Тл/93

Тп /93

Рис. 5. Дендрограмма, показывающая взаимоотношения между выборками изолятов Р. т/ез1апз с томатных листьев (Тл) и плодов (Тп) 1993, 1995 гг., кластеризованными по методу невзвешенных средних на основании показателя сходства Животовского.

Отмеченное большее разнообразие популяций Р.т/ез1ап$ на томатных листьях, чем на плодах мы склонны рассматривать как следствие разного уровня горизонтальной устойчивости плодов и листьев к фитофторо-зу. Листья, видимо, оказались менее устойчивыми, и создавшиеся для гриба более благоприятные условия обеспечили большее разнообразие выборки паразита. Можно провести экологическую аналогию, когда в более благоприятных условиях формируются более богатые и разнообразные сообщества.

Сравнивая выборки Р.ш/Ыши с разных частей томатов с соседними картофельными популяциями, можно говорить о большем сходстве между изолятами с томатных листьев и картошки, чем с томатных плодов и картошки. Например, в 1993г. сходство между выборками было 8,3-7% для листьев и 0% для плодов.

Таким образом, можно, видимо, говорить только о частичном заносе картофельных изолятов на томатные листья и более жестком отборе, происходящем в популяция паразита, на томатах.

Говоря о возможных источниках формирования популяций на томатах, необходимо отметить, что при исчезновении «старого» клона на картофеле, на томатах Московской области 1993 г. он еще присутствовал. Вопрос о возможности заноса спор из южных районов, где томаты выращи-

ваются на больших площадях в открытом грунте, в качестве вероятного объяснения, остался открытым, т.к. вся малочисленная выборка из Адлера была представлена доминирующим на томатах 6-м фенотипом, а «старый» фенотип в ней обнаружен не был. В то же время, 6-й фенотип на картофеле был обнаружен только в Воскресенске, что, вероятно, связано с голландским посадочным материалом. Таким образом, томатная фитофтора, видимо, имеет свой собственный способ зимовки в отличии от зимующих в клубнях в виде мицелия картофельных изолятов, однако, оценка вклада этого источника при формирование томатных популяций требует дополнительного исследования.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Итак, мы убедились в достаточно высокой информативности выбранного нами подхода и митохондриального полиморфизма в качестве диагностического признака.

Однако, у других грибов известен более высокий уровень митохонд-риальной изменчивости. Например, у комплексного вида P.megasperma, где вариабельность мт генома больше, чем между видами одного рода в ряде групп грибов (Forster et al.,1988, 1989). Причем, дивергенция этого вида происходит по специализации в отношении растений-хозяев. Можно сказать, что у P.infestans такая специализация только начинается. Однако, тенденция аналогична. Поэтому, нам нужны новые, более гетерогенные молекулярные маркеры, что заставляет проводить поиск новых полиморфных участков.

В мтДНК менее консервативны участки Ori-репликации, межгенные спейсеры. У P.infestans повышенная вариабельность возможна в районе вставки, по которой отличаются мт геномы 2-х основных типов (рис. 6).

В связи с этим нами была поставлена еще одна методическая задача - подобрать условия для так называемой Long PCR, в результате которой амплифицируются длинные 5-11 kb фрагменты мтДНК (обычно мы ам-плифицируем lkb фрагмент). В этом случае в одном опыте можно анализировать более протяженные участки молекулы, и вероятность обнаружения новых полиморфных участков значительно увеличивается.

На грибах такая задача была решена впервые. Мы подобрали условия для амплификации 5,5 и 7,5 кЬ фрагментов, выбрав для анализа участок, занимающий около трети мт молекулы и сконструировав праймеры на основе компьютерного анализа достаточно А-Т . богатой нуклеотидной последовательности, что само по себе представляет непростую задачу.

Эта работа только начата, но проведенный рестрикционный анализ амплификатов уже показал отличие полученных фрагментов от компьютерной версии.

orf79

COx2

0IÍ32 cox1 ap9

nac¡9

atp6cox3

Ip3?rp$12 ¡psW nad2

Рис. 6. Амплифицируемые фрагменты на генетической карте мтДНК P.infestans (по L. Forget & B.F. Lang, 1995). На внешней окружности обозначены гены, транскрибируемые по часовой стрелке, на внутренней -против часовой. Подчеркнуты гены, обычно не встречающиеся в мтДНК животных и растений. Ог£248 гомологична mt or£244 Marchantía polymor-

pha. - частично перекрывающиеся гены. <-> - район 2 kb вставки

в мтДНК типа II.

Другим цитоплазматическим маркером может, по всей видимости, служить двуспиральная РНК (dsRNA), обнаруженная нами в некоторых суммарных препаратах нуклеиновых кислот P.infestans (данные не показаны). Ранее dsRNA была зарегистрирована только в мексиканской популяции гриба (Tooley et al., 1989). Однако, происходящая в современных популяциях P.infestans перестройка, вероятно, изменила пространственное распределение и этого признака.

Таким образом, мы считаем, что использованные молекулярно-генетические маркеры позволили значительно расширить наше представление о популяционном полиморфизме P.infestans, а намеченные новые

направления исследований обеспечат дальнейший прогресс в этом направлении.

Автор выражает искреннюю признательность профессорам Ю.Т.Дьякову, И.АКрашенинникову, В.Н.Максимову, к.б.н. В.Н.Ксензенко, Т.В.Малининой, Б.А.Калабушкину, Drs. D.S.Shaw, G.W.Griffith & J.Artnour за исчерпывающие консультации и методическую помощь, АВ.Долговой и А.Смирнову за предоставление изолятов Р.infestons и их предварительную морфолого-физиологическую характеристику, а также всем сотрудникам кафедр микологии и альгологии и молекулярной биологии за под держку и постоянный интерес к работе.

Работа была поддержана грантами Госкомвуза, Английского Королевского Общества и Европейского Научного Фонда.

ВЫВОДЫ

1. Предложенный подход на основе PCR-тестирования типа мтДНК в комплексе с другими физиолого-биохимическими маркерами обладает высокой информативностью для популяционно-генетических исследований вида P.infestons.

2. Продемонстрирована частичная генетическая изоляция между российскими популяциями P.infestans, паразитирующими на картофеле и томатах, вероятно поддерживаемая за счет существования собственных источников зимовки томатных штаммов вне клубней картофеля и селективным отбором штаммов, попадающих на томаты из посадок картофеля.

3. На основе анализа изменчивости мт генома P.infestans в комплексе с другими признаками продемонстрирована перестройка популяционной структуры гриба на европейской территории России и, видимо, происходящее в 1990-93гг. векторизованное вытеснение "старых" генотипов "новыми" и "запаздывание" миграционной волны в томатных популяциях по сравнению с картофельными.

4. В результате анализа генетической изменчивости P.infestans по цитоплазматическому и ядерным маркерам рекомбинация признаков между "старым" и "новым" генотипами не обнаружено, что подтверждает существование единой высоко гомогенной внутривидовой группы, образованной изолятами с Ib типом мтДНК.

5. Разработан эффективный экспресс-метод для определения типа мтДНК P.infestans по анализу суспензии зооспор, позволяющий избежать выделения гриба в чистую культуру, упрощающий процедуру выделения препарата ДНК и снимающий проблему неспецифического отжига прай-меров на матрицах из растительных примесей.

6. Определение первичной последовательности амплифицированных фрагментов мтДНК трех типов, содержащих концевые участки генов а

15

субъединицы АТФазы и 4 субъединицы НАДН дегидрогеназы, показало наличие в этих фрагментах точечных нуклеотидных замен.

Список работ, опубликованных по теме диссертации.

1. Дьяков Ю.Т., Аникина М.И., Багирова С.Ф., Долгова А.В., Колесников А.А., Малеева Ю.В., Смирнов А.Н. Популяции Phytophthora in-festans на территории России и сопредельных стран (структура, динамика генотипического

состава, регулирующие механизмы) // Защита растений в условиях реформирования АПК: экономика, эффективность, экология: Материалы I Всероссийского съезда по защите растений. - С.-П., 1995. - С. 562.

2. Maleeva, J.V., Kolesnikov, A.A.. The population diversity of Phytophtora infestans in Russia revealed by PCR-based mtDNA ananlysis // Proc. of the 5th Congress of the ESEB, Scotland , Sept. 4-8, 1995. - Edinburgh, 1995. - P. 212.

3. Maleeva, J.V., Dolgova, A.V., Smirnov, A.N., Kolesnikov, A.A., Dyakov, Y.T. Phytophtora infestans population divergence on potato and tomato in Moscow region // Proc. of the 3rd European Conference on Fungal Genetics, Germany, March 27-30, 1996. - Munster, 1996. - P.96.

4. Maleeva, J.V., Pipe, N., Kolesnikov, A.A., Shaw, D.S. Variation in the sequence of mtDNA in Phytophthora infestans on potato and tomato plants in Russia // Proc. of the 13th Triennial Conference of European Association for Potato Research, The Netherlands, July 14-19, 1996. - Veldhoven, 1996. - PA 18.

5. Малеева Ю.В., Колесников A.A., Гриффитц Г.В., Шоу Д.С. Экспресс-метод определения типа мтДНК Phytophthora infestans (Mont.) de Вагу, основанный на полимеразной цепной реакции // Микология и фитопатология. - 1997. - Т. - (в печати).

6. Dolgova, А.V., Smirnov A.N., Maleeva, J.V., Bagirova, S.F., Ko-zlovskiy, I.N., Kolesnikov, A.A., Shaw, D.S., Dyakov, Yu.T. Comparison of Phytophthora infestans populations on potato and tomato crops in Moscow region // Plant Pathology.-1997. - V. 46. - (in press).

Ш7