Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

УСОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ ТЕХНОЛОГИИ КРИОКОНСЕРВИРОВАНИЯ ЭМБРИОНОВ КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА

ВАК РФ 03.00.13, Физиология

Автореферат диссертации по теме "УСОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ ТЕХНОЛОГИИ КРИОКОНСЕРВИРОВАНИЯ ЭМБРИОНОВ КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА"

А-ъоечъ

ВСЕСОЮЗНЫЙ ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ЖИВОТНОВОДСТВА (ВИЖ)

На правах рукописи Для служебного пользования

№00£Г

Фецюшкин Алексей Федорович

УСОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ ТЕХНОЛОГИИ КРИОКОНСБРВИРОВАНИЯ ЭМБРИОНОВ КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА

03.ОО. 13 - Физиология человека и животных

АВТОРЕФЕРАТ

аиосертацни на соискание ученой степени канонцата биологических наук

п. Дубровины Московской области 1991

■ --«у •

Работа выполнена в Центре по трансплантации эьйрионов с.-і. жквотені Всесоюзного научно-исследовательского института животноводства

Научный руководитель - доктор биологических наук,

профессор Н.И.СЕРГЕЕВ

0$вцналъвне оппоненты:

доктор биологически! наук, профессор А.Д.ВДГРОВ

кандидат биологических наук

Ведущее учреждение: Всесоюзный научно-исследовательский , институт разведения и генетики с.-х. животных »

, Бапгита диссертации состоятся " ¿ШС£іе//ІіР 199Х г.

в 4СУ' часов, на заседании сдециадизирсЛванногсґ совета Д.020.16.02 при Всесоюзном ордена Судового фасного Знамени научно-исследовательском институте живо тноводства.

Адрес института: І42012, Московская обл., ШДольский р-он, пос. Дубровицы.

С диссертациеб можно ознакомиться в библиотеке института.

. Автореферат разослан ЯІЛ " 1991 г.

Ученый секретарь специализированного совета, кандидат биологических наук

И.И.ШМЕШІН

' , І. 0КЦАЯ ЇАРАКІЕРЙСЇЖА РЛБОЇН .

їїюнсллантаїшя эмбрионов является одним из биотехнических приемов селекшш в жквотноводствэ./ускорйдща совершенствование стада в ряде поколения. Программа трансплантаты эмбрионов включает в себя метод замораживания и длительного хранения эьйрио-' нов, что позволяет рационально и экономически аффективно решать острейшую проблему интенсификации животноводства' 2.разведена6 высокопродуктивного скота.

Криоконсервирование - шогоэталннй и иногофакторныа_ вродесс, в течение которого биологические объекты, подвергаются действию различных: фвэгко-хншчвскго: факторов, обусловленных изменениями температуры,: составом компонентов и-системы. Для достижения этой цели применяются искусственные среды, в состав которых,входят специальные защитные вещества - криопрот екторы, а само охлаждение осуществляется программно. >._.-■

Замораживание эмбрионов позволяет существенно удеяевать и упростить программу трансплантация, внести элементы плановости и перевести ее на прошшшеннуто и коммерческую основу.

Актуальность. ; Іфиоконсервирование зародышей имеет большое значение как для практики животноводства, так в для фундамен-' таяьвьсс исследование. С . помощью' этого метода возможно создание генетических банков, значение которых заключается в возможности сохранения шбредных, мутантных в рек<$ьйинангннх ланий, которые представляют необходимый материал для экспериментальных биологических исследований; .

. -"в накоплении необходимого,числа однородных эмбрионов для молекулярно -биологических я других исследований; л'-- .

- подбирать спонтанных реципиентов, соответствующих по по-' левому циклу, возрасту эмбрионов и проводить пересадку в условиях ферм. ....

Для предохранения зародышей от холодового шока используют обогащенный фосфатно-солевоВ буфер, содержащий 1,4 М глицерина. Другим.криопротектором для защиты эмбрионов может быть ксполь- -зован 1,2-яропавднол. ■ . '

На процесс успешного, криоконсервирования оказывает большое влияние не только криопротектор, но. и совокупность охлавдавдах скоростей, на основания, котошзс-здгойяйяетеь програгшное. замора-

живание эмбрионов. РезвдутЬздазденгадолжен соответствовать и

Г1/А> ІЬгиїМ ¡V 1

Мо*;. акадйьем

режим оттаивания. \

. Для повышения эффективности замораживания эьйрионов необходим поиск маштоксичннх криопротекторов с' цвльв внедрения в практику • криоконсервирования - эмЗриоаов метода* витрифккацпи. '

Рель и задачи исследования. Цель исследовашгй-заключалась в повышении жизнеспособности з аыороженно-о ттаянных эмбрионов, 'путей совершенствования технологии криоконсервирования с учетом стадии^развития икачества зародышей, сравнительных испытаний стационарных н мобильных заыораасиваталей, режимов охлаждения я отогрева» с применением высоких', ковдеатравдй ^фиощютвктора . глицерина в сочетании 1,2-дропашгиола. и замораживании в газообразном азоте с. неравномерным температурным шлеи,' оттаивании я выведение криопротектора из ийриона о использованием сахарозы." . В -задачу- исследований входило: -

■■ — изучить факторы« влиянцие на жизнеспособность и'приживля—' едасть заиороженно-оттаянныг.эмбрионов;

- определить влияние* криогенных устройств, технологии затрагивания и оттаивания нажизнеспособностьэмбрионов; : '

- сопоставить в сравнительном аспекта морфологическую оценку качества свежополученшд и заморагенно-оттаяянйх эШрионов;

- сравнить методику замораживания в газообразном азоте с У традиционный методом замораживания;. .

- выявить огггииакьныз резит насыщения, криопротекгором охлаждения и отогрева, определить влияние времени от получения ' до замораживания на жизнеспособность н прпживляемость эмЗрионов;

-разработать методику кряоконсервирования эвлЗрионов с помощью высоких ковпентрадий смеси криопротекторов глицерина с 1,2-пропанллода« на ФЕС, путей прямого охлаждения в газообразном азоте;.-7 •. -" ■ ■■■''■■ '"'■'.'-' " ■ '

■ - исследовать метод оттаивания эмЗрионов и выведения врио-* Еонсервшта с помощь» раствора сахарозы.

. ручная иовизда работы заключается в определении влияния криогенных устройств на выживаемость эмЗрионов, а также скоростей охлаждения а оттаивания, высокой концентрации смеси глицерина с I,2-пропандиолои, усовершанствовании технологии криоконсер-вирогания эийрнонов в газообразной азоте в неравномерном темпера-турком поле и выведение криопротектора сахарозой. ; v

Практическая значимость работы состоит в усовершенствовании технологии замораживания эмбрионов друщого рогатого скота при использовании сивси криопротекторов глицерина с 1,2-пропаацио-лоы на ФБС, что дает возможность сократить процесс криоконсер-вирования в *10 раз но* сравнению с традиционным методой и иекдг-. чить дорогостоящую аппаратуру»

Реалнэашм результатов исследований ,

Результаты исследований внедрены в центре по.транешганта-ции эмбрионов сеяьскохозяйстаенных животных СВШС) и.'подтверждены .положительный'решением по заявке на изобретение'X 4909691/1313832 от 12 февраля 1991 г. . '• '

Ашзобаштя работы. Результаты исследований докладывались на .ежегодных производственных совещаниях по трансплантации, эмб- 1 рионов, на конференциях - молодыхі ученых при Всесоюзном научно-исследовательском институте (Дубровицы,: 1989, 1990).

Объем рейоты'.~«Вжесертация-изложена- на -122 -етраницах-машшо-; шеного текста. Состоит из введения,- обзора литературы, резуль-гатов _ и собственных исследований, выводов и практических предложений. Ишпзстрнровааа. 19 таблицами и' 19 рисунками, Список использованной литературы вклмает 199 наименований, в том числе 138 иностранных. ... ■". > • . ■■. - .,

2. .материалы и методы иссш5д0ваші

Исследования ш усовершенствовании технологии криоконсерви-рования эьйрионов крупного рогатого скота проведены в ВШе в период с 1988 ш 1991 гг. •' • •' •' •

5ч5рионы' получали от суперовуллровавшх. коров; обработанных гормональными препаратами ФСГ (США), $СГ отечественного производства - графолон,'фоллитрошш, фолликотропин (ЧСФР);и СЖК с аяти-сывороткой нехирургическим методом. - " :

Морфологическую оценку проводила под лупой при 100-кратном ■ увеличении или ' под инвертированный микроскопом -"Июговооп* .. 7 при 400-кратном увеличении. Для рриоконсервирования отбирали " эмбрионы с неповрежденными равномерными по толдане ополеевдрую-щими оболочками, клеточный комплекс которых соответствовал воз-. расту от оплодотворения до извлечения (7-8 дней). Биологически. голноценншш считали эмбрионы,'. имение правильну» тарообразнув форму, гомогенную светлую цитоплазму, неповрежденную оболочку,

■ одинакового размера бластомера о плотннм межклеточным комплексом. Морфологическую оценку жизнеспособности свеяеполучешых и . зашроженно-оттаянкшс эмбрионов проводили по пятибалльной шка-

- ле,. разработанной в ВДїе. ■

Эмбрионы замораживали в растворе криопротектора 1,4 М концентрации глицерина на замораживающих устройствах "Павег"' н-204, УШ-І, РПЗ, ШЭ, ЗЭМ-1' и в газообразном азоте. Так т ■ ■ ' в качестве криопротектора использовали глицерин в сочетании с .. 1,2-пропавдиолом н замораживала в газообразном азоте.-Есе'необходимые растворы готовили на- фэсфатно-солевом буфере Дольбекко

, В соответствии с методикой исследований эмЗрионы бшш раз- -' делены на три группы. Первая группа - эизрионн насищали раствором 1,4 11 концентрации глицерина в 4 этапа. Вторая - смесь крио-. протектора 25% глицерина + 25% 1,2-пропашшола и насыщали эмб- ■■

рлонн в два этапа. Третья' - - эийрионы гасеталл краопротекторной " смесь», состошей из 20£ глицерина + 40$ 1,2-пропанднола в три ступени. " Эьйрионн, насыщенные в растворе 1,4 М глицерина, замо-. раживали на программном замораживателе и в газообразном азоте.

Скорость охлаздения - от комнатной температуры до -7°С была * 1°С/шн, кристаллизация и далеесо скоростью 0»3°С/мин до затем переносили эмЗрионы в жидкий азот для хранения. Замораживание эибриоаоа второе и третьей группы проводили методом витри-фикадии, который осуществлялся в газообразном азоте; С помощью температурного датчика укладку паетт.с эмЗрионаыи устанавливала в газообразном поле жидкого азота на уровне температуры т60-65°С я наблюдали как іфиопротектор,принимал стекловидное; состояние, 1

- т.е.-застывал без образования кристаллов, данное состояние наступало через 1,5-2 мин. В течение .10 мин выдерживали на данном уровне газообразного азота, а затем погружали в жидкий азот на хранение. ...;.'. . ... ■' . ','■ ■' '.

Оттаивание замороженных паетт с эмбрионами -проводили в во-■ дяной бане при температуро +37°С и +30°С в течение 8-Ю секунд, . это если биоматериал криоконсервирован в растворе криопротекто- ' ра 1,4 М концентрации глицерина.' Эмбрионы били замороженные в смеси растворов: 25% глицерина + 25% I,2-проландиола осуществляв ■ ли отогрев при температуре +37°С, 20% глицерина + 10% 1,2-про-

пандиола были оттаяны при температуре водяной бани +20°С в те-. '.' ; чеяие 3-5 секунд, • . ■ , ,

Отогретые паегта освобождали от. манерной пробки- о одного ; конца, а с другого отрезали тис и ее содержалов переносилось на часовое стекло, где проводили поиск морфологическую оценку ' эмбрионов. Жизнеспособные, пригодные для пересадки эмбрионы, использовали для.трансплантации. ' .. *

Выведение криощютектора из экйриона осуществляли с покошьв раствора сахарозы в 0,5 М (3-5 минут) и I 1А (5-Ю минут).

■ После отмывания эмбрионов от крнопротектора и морфологически оцененншс их. помещала в паетты и пересаливали реципиентам. В качестве реципиентов использовали телок черно-пестрой.породы в возрасте 16-13 месяцев с живой кассой 350-380 кг. Телкам - ■ реципиентам по спонтанной и.синхронизированной охоте в день гормональной обработки вводили фронтально тетравит в дозе 5,0 мл.

Подученные "экспертментадьные лашще^подвергали^статЕся!----

. ческой обработке

но методике ¡ц'ррядоьевоЭ.Е.К» (1970) с помощью . Зг, предложенного К.Црисоном. -,

Экспериментальнул л .работз, • проводили в соответствии со схемой исследований. .. ' .

СХЕМА ИССЛЕДОВАНИЙ '

Жизнеспособность и приживляемость эмбрионов крупного рогатого скота на разных замораживателях

жизнеспособность и при-гшвляетость эмбрионов: -стадия развития, качество, температура оттаивания V Я-204 И Регош охлаждения

"УШИ ЗЭМ-1 рпз Удаление криопротек-тора. Замораживание эмбрионов в газообразном азоте ■

Дальняя транспортировка замороженных эмбрионов

\ -1 Время хранения. эмбрионов до криокон-сервпроваши

.Вятрифшсацпя

Состав криопро тектора

Культивирование { ■■. ,|Трансплантация|

3.. результаты-: исследовашй ..

3.1. Влияние биологических факторов ва казне- Г . . способность эмЗрионов при криоконсервировании

Морфологическая оценка состояния зародышей • является одним кз основных методов комплексной оценки в производственных условиях. Бе я ель - отбор пригодных для замораживания трансплантации эьйрионов, выбраковка дегенерироваюшх зародышей.и вшвле ние аномалий в их развитии. Решающее значение в оценке качества трансплантируемых замороденно-оттаянных змЗрконов'имеет их жизнеспособность, проверяемая культивированием вне организма или пересадкой реципиентам. , . :

Показателя морфологической оценки очень ваяны,, потопу что видимая морфологическая разнояачественвость является показателем внутренней физиологической в биологической неполноценности' зародышей. Особое внимание обращают на колебание объема эмбрионов, их $ор(цу, целостность, состояние прозрачной оболочки и протоплазмы. Критерий — уровені дробления - особенно важен, так как отставание в темпах развития в 90? случаев свидетельствует о начальных стадиях дегенерации эмбриона.

Биологически полноценными считают эмбрконы, имеющие шарообразную форму, гомогенную цитоплазму, неповрежденную прозрачную оболочку, одинакового размера бластомери с плотный межклеточным контактом и должны соответствовать - по уровню дробления возрасту от момента оплодотворения до их извлечения.

Нормальные морулы имеют форму сферы. Удваивание числа бластомеров а морулах происходит каяиые 24 часа. Степень дробления эмэрионов в ранний период развития может быть обусловлено растянутостью овуляции.' У некоторых морул отдельные клетки могут выпячиваться в перевителияовов пространство, на их поверх- ' ности допустимы небольшие пузырьки.

Иссладованм показала, что жизнеспособность и пршшвляе-ілость эшрионов крупного рогатого скота после замораживания - ' оттаивания и пересадки зависит от морфологического состояния и стадии развития (табл. I),

Данные таблицы I показывают, что с увеличением процента кизнеспособных от числа замороженных эмЗрионов (шрулы 89,3?,

ранние бдастоцисты 79,4$ ж поздние бластоцисты увеличи- -

вается и процент стельности от числа пересаженных <31,2%; 45,3% и 57,7$), соответственно.

• ■■-.".- Таблица.!"

Жизнеспособность -и прпживляемостг замороженно- ' оттаянных эиЗрионов в зависимости от стадии'развития

Стадия_р^звлтия,

Показатель' ' ' . шрулы оластоцисты

■ ■•-' ■ - • ■ поздние ранние- поздние

Заморожено и оттаяно эиЗрконов 272 277 228

' Пригодных к пересадке ' '■ 243 " ■ 220 ■ 226 :

Процент от числа замороженных 89,Ззас 79,4 ' . 99Д

Количество пересадок ; 237 ; 214 " 220

Стельных реципиентов . 74 * 97 '127

Доцент стельности^. „ ...31,г3" 57,7х

Хр<с0,05; хх-р<0,01 ' -

Для замораживания в производственных условиях ш использоз; ли эыйриокн отличного, хорошего и удовлетворительного качества (табл. 2), .

Таблица 2 -

Влияние качества заморожекно-оттаянных эибрионов перед пересадков на их приживляешсть

' Показатель Ка^ртв? э^рдрррр (Зодцї ' '. ■ отличные хороше удовлет-

• - • _ • ■■■ _ восттельнэе

Замороженно-оттаянных эмЭрионов. 29 419 329

Жизнеспособных после отогрева. 28 389; / 286

Процент сохранности ^ 96,6 • ■ 92,8 - 83,9 ,

Пересажено эмбрионов - 28 389 . 286

Стельных реципиентов 22 190 66

Процент стельности і 78,6 • . 48,8 ЗОД

Данные таблицы 2 показывают прямуй зависимость приживля-емости от. качества эмбрионов. Так, яри•замораживании и оттаивании процент сохранности эмбрионов отличного.качества соста-

зил 96,6%, хорошего - 92,и удовлетворительного -83,9^. Процент стельности от пересадка эмбрионов отличного качества.составил ?В,6% и заметно.ниже ври пересадке эмбрионов хорошего : качества (48,8%) и удовлетворительного качества (3Q,ISÎ),

При замораживании и оттаивании эмЗрионов на toc биологи-ческут> полноценноеть, вероятно, может-оказывать влияние соотношение в крови "ФСГ и ЛГ на день обработки.' Так, наблюдения показывают, что выживаемость эмбрионов имеет связь с типом го-' .надотрошна и'днем его введения (табл. 3>.

' ' Таблица 3

Жизнеспособность и приживляемость замороженно-оттаянныгэмбрионов в зависимости от дня обработки , донора и типа гонадотропика -,

■ - Показатель ' ^ <СШ1) Фолмгрошш.

.......эстрального шгала '■

■ . 9-Ю II-XS 9-10- II-12

■ Заторогено и оттаяно . эмбрионов 76 ; 56. . 45 -75

Пересажено эмбрионов 76 * _ 56 . 45 _ 71

Стельных реципзентов 35 22 18 26

Лроцент стельности _ 46,1 ' .. 39,3 40,0 ' 36,6

■ Иэ таблица 3 видно, что наибольшая прижизляедасть была при "введении 4СГ производства США в дозе 36 мг на 9-10 день цикла по сравнению с 11-12 днями (46,1 против'39,ЗЯ» так же был.выше и' процент стельности - 40,0& на 9-Ю день и 36,6$ .при обработке коров на II-I2 день цикла. .

.3 кряоконсервировании.эьйрионов ввделяют несколько этапов, каждый из которых.отличается своей специфичностью друг от друга. Одним из таких факторов является продолжительность нахождения эибрлона в среде при подготовке его к замораживанию (табл.4)

■ . Продолжительность хранения эмЗрионов от извлечения до замораживания отрицательно сказывается на их жизнеспособность :

и приживляемо сть. После оттаивания а пересадки наивысший процент стельности реципиентов 6Ш1 53,1? при хранении эмбрионов до замораживания не.более 2-х часов. С увеличением продолжительное-

. • . ;5.' - 9 -

-ти хранения эмЗрнонов от.извлечения до.замораааванетснижалась ' ИХ жизнеспособность и ПрИЖГОЛЯбМОСТЬ ПОСЛ0ПереСВДК2,-иэ:при-', ..веденвого следует, что хранение эмбрионов более 2-х часов.от '".:'■ ''извлечения до замораживания нецелесообразно., :■. '.-. -'.'"г

. '■,-.".'*'.■ ■ . '•-' } .■ ' Таблица 4

Езияние - времени хранения эмбрионов в среде ; до замораживания на их жизнеспособность и-приживляемость --;--

Показатель' -*- - - . Продол^т^К?^ УРаятя (<ИК>)

".. ■ .--■■■-■;.'-■ '■ до 2-х ■ 2-3 . 3—4 "-

Заморожено и оттаяно - ' ■'..■'' ■ ■-■.;'■'.

эмбрионов ■ Г-. ■ : .51. ■ ЬУ , 43 ■

жизнеспособных эмбрионов; 49 . 62 " 31

Процент от числа оттаянных ; 96;Г 91,1 * - - 72,X . /

Пересажено эмбрионов ^ ' 49 ' • 62 31 '." •-■

Стельных реципиентов. " .""28" 6~~.

Процент стельности*" .'"-."■ - 53,'1Х ' " • 45,2: ' ■ '22,Б33 t '

хр<0,05; '**p<uf,oi. > . " ; ; '

3.2. Воздействие физико-химических процессов на ■• -',-'■ криоконсервированиё эмбрионов іфупного ■ у'.' рогатого скота ' '"'' "

Основным направлением данных исследований является поиск- . ' наиболее простых и: экономичных,' но'в то же время' эффективных методов. замораживания и оттаивания зародышей, "позволякщих максимально сохранять шс жизнеспособность. : .

. В основу входило изучение влияния режимов охлаждения'с . минусовых температур'.и эатраживание в газообразном азоте на" жизнеспособность и приживляемость. эмбрионов, "а также"оцредЬ-' леки© эффективности применения различных типов программны!•замо-раживателей. ''': -'■; ..-,■'■■.".* ' "

В качестве контроля при оценке заыораживателей использовали заморакиватоль •."planer".R-204. . - V

В первом варианте охлаждение эмбрионов от +20°С до -7°С ' проводили со скоростью; 10С/мин. При достижении -7°С вызывали : искусственную;кристаллизацию. Посла этого'замораживание прово-

. -10 \ ,-г

■■'. диди со скоростьо'0,3 °С/мик до,.-36с>С;и.эатем образцы перенося-ла на хранение в жидкий "азот. "; V * "}'.:"■ - ' .'-■' ■г *" ■

■Во ■втором.варианте паетты с эмбрионами помещали в'камегу '•" задарадивателя. оо стабилизированной температурой -5°С,-, выдергивали Ю мш^т, потом'проводили искусственную кристаллизацию. ■ далее оглатаали ; в"режимеО,5°С/мин до-Зб°С,;а затем помещали. змЗрионы в'жидкий азот на хранение (табл. ' 5).: ' ■■■ -г ■ "■- - Таблица 5 Влияние режима-охлавдения' на жизнеспособность■ • -. _ . ■'. ' ' -эмбрионов'.";

" .■■''■■ Показатель ■ ■ '•У Охдаадейие от; Охлаждение от '■'.■

+20°С -5°С • І

Заморожено и оттаяно ■эмЗрионов 1 - 63 . 64

лизнеспособньс: эьйрионов . : '•" 54-85,7 58-90,6 . . :' ;

-■: Пересажено эмбрионов *: >;/\. 54 • ; 58

Стеяы^х рвшашентов , •". 28-51,8 ' 31-53,4 V

Данные таблицы 5 показывают,: что .замораживание эмбрионов, ',, начиная с минусовых.температур,, позволяет подучить почти равные 'результаты сохранения жизнеспособности эмбрионов (35,?$ против , 90,6?) с приживляемостью принехирургической" пересадко 51,8% .

и 53,4$ соответственно.. Применение данного метода обеспечивает'. '. -сокраяенив'затрат рабочего'времени с 2,5 ч до 2 ч на один цикл замораживания, что очень важно при работе в условиях практической -трансплантации. ■■-/ ;■;■' '--'.V. ; •'.-\

В настоящее время наоел применение. способ, замораживания : '■ - эмЗрионов в газообразном азоте.' Для охлаждения применяется сосуд Дьвара типа СДС-2, универсальный штатив, я камера из фтор- -: пласта. V ■■' : -V. л- : ■'*■'..''• '.'

.V -' Сравнительные испытания замораживания эмбрионов -Сна мо, бгиьном заморааивателе ЗЭМ-1 и в газообразном азоте без прог- .. раммннх замэражквателей показали,' что этот технологический примем может быть с равной долей успеха использован,в условиях ■ ферм (табл. 6.>. "

.-.-.■■V,■'■:■. - її - • .;.

. "- Таблица 6 : Жизнеспособность эмбрионов, эашрохенныг в газообразной азоте

Програшний Заморагаваиие ' ' ' Показатель " заморалашатвль в газообразной __'. ■ ■ ■_ЗЭм-Х_азоте

Заморожено и оттаяно эмЗра- : ■ ■

онов * 112 112.

. Жизнеспособных эмбрионов 101 98

Процент от числа оттаянных 90,2 , 87,5

Стельных реципиентов 40 42

Процент . стельности . 39,6 ■ ■'; 45,6

. Ери замораживании эибрионов в газообразной азоте жиэне-сшсобность.ло(уге_огтаиванші сохранилась у 87,5% эшрионов и

получена стельность ^"^^реівйшентов^-----——--------

Наш была исследована эффективность залюратавания эьйрго-нов при использовании различных програшних новых моделей отечественные замораживателей У0Е-І, ЗЭМ-1, 30, РИЗ в сравнении с мобильным заморажЕвателш "Планер" . Б-г04. Замораживание про-, водили до схеме от +20°С до -7°С со скорость» 1°С/мкн, кристаллизация и далее со скорость» 0,3°С/мин до —36°С и затеи ■■ перенос в жидкий азот (табл. 7).

Проведенные испытания криогенной техники показали, что жкз-неспособность эмбрионов после отогрева превышала контроль: зэм-1 - 90,2$; ЭД - 92,3$; НЮ -92,0$ по сравнение о ; й-204 . 84,7$) и У0П-Ї (65,9$). Стельность после пересадки заморожекно-оттаянных эмбрионов составила 45,5$ при задараживании на и-204 и 45,7$ при использовании РПЗ, соответственно.

Результаты сравнительных испытаний 5-ти моделей програм- -иных заморажяват елей доказала, что лабая кг испытанных маиин может бить использована с равной долей успеха в практической; криобиологии. Имешаэся различия, вероятно, связаны с качест- • вой эи5рионов перед замораживанием.

Табляца 7

Жизнеспособно сть и прюшалзедость эибрзонов -крушого рогатого скота, зшюраябнанг на

разных задараживателнх ' , ,

- г, . - ЗаморбядваивиоЕ Показатель - -—■ ■ ■■ — —.............- -------— —

в-го4 'том 'ззн-і ' аі ' но •

Зашрозено л оттаяно эизрионов ' 236. 228 112 зэ 50

Жизнеспособных.зиЗри-онов 200 196 101 .36 . 46

Процент от числа оттаянных 84,7 85,9 90,2 ■ 92,3 92,0

Пересажено эмЗрионов 200 196 . 101 36 46

Стельных реципиентов Я 91 40 13 21

Дроцент стельности. 45,5 " 46,4 * 39,6 36,1 45,7

3.3. Криоконсервирование Э1йргонов методом вятрификаши

Испытывали два метода - эамораасиваяне эмбрионов с цргманб-ни ем крыоаротевтора глицерина 1,4 М концентрации на программном замораживателе со скоростью охлаждения от +20°С до -7°С 1°С/мив, при -7°С проводили кристаллизацию и далее охлаждение ■ осуществляли со скоростью 0 . 3°С/ыкн до -36°С, затем соломинки с эмЗрионами перекосили в жидкий азот; ' — эаморажхванке эиЗрконов методом витрафикашга, включающий крдопротекторы глицерин в сочетании о 1,2-пропааплголом в раствора ®БС в высоких концентрациях а охлаждение в газообразном азоте в течение нескольких минут, а затем погрукекие в жизкий азот*' Замораживанио осуществляли без программного задарагава-твлл, но о применением специального устройства (табл. 8).'

Данные таблицы 8 показывают, что процент виживавшсти эмбрионов в контроле составил 92,и был вше на Однако

ддяттм* метод криоконсервировадая шжет быть использован в трансплантация эмбрионов, так как процент выживаемости зародышей достаточно высок (86,850* ''

Сравнивая схему двух процессов 'замораживания, цркведеаных

на рисунках 1 в 2.^необходимо отметить, что метод витри^икепш позволяет сократитьпроцесс so времени с 2.5 часов до 15 юнут т.е. в 10 раз.

Таблица 8

Еиэаеспособность эмЭрионов при замораживании ■ • разными способами

Метод краоконсервировсния

. Показатель —..........—-———

_■ общепринятый витркфдкацдя

Заморожено и оттаяно эмбрио- . . , . ■

нов .... .. 39 38

Іизнеспособннх эмбрионов . . 36 33 .

' Цроаеат выживаемости 92,3 - 66,6х

ХР > 0,05 ~~

Вдд кршіщіоте}чТ0рйтг"его ^-концентрация - кмеет- для -вккшаомос ти эдЗрионов особое значение. Механизм защтного действия сводится к эффекту растворенья солеЗ, внутриклеточному замораживание в стабилизации клеточных мембран. В практической криобиологии достаточно широко кспользушся проникающие в клетку крзо-защитвые вещества-{диметадсульфоксид, глицерин, 1,2-прозандгод, этален-гликоль в др.). Одної из основних требований к криопро-тея торам является наличие низкой токсичности при высоких концентрациях в легкая диффузия в клетке, а также ыассопереход из жидкого в твердое состояние л наличие мелких кристаллов в ' замерзшем состоянии. .

Ори сиешиванив двух раотворов в первой случае 25% глацеря на + 25? I,2-пропакдиола на ФБС при замораживания выявлено, что уровень массоперехода из жидкого состоят» в твердое понизился в сравнении о отдельно взятым раствором ж находился в пределах. от \ минус 46°С до минуо 54°С, в естественно уровень обратного перехода из твердого в жидкое состояние сдвигался от -24°С до . -8°С* Сравнивая представленные графики, можно отметить отсутствие резкого выброса теша ори переходе в твердое состояние .(рис. 3). '

. При замораживании смеси раствора криодротахтсра, состоящего из 20$ глицерина и '40% 1,2-пропандиода на ФБС, охлаждение

- I4t -

Pzc.'l*." Схема общепринятого метода замора-шваная: .

- I - охтдение; 2 - отогрев; 3 - кргсталлпзапзя; 4 — peEgzc таллаззпля.

V .■'■.-■.■. - 16 - ■ .; .. -'.

.проводили до -76°С (рис. 4).и на всем отрезке замораживания не •было эффективного выброса тепла, то есть раствор стал твердым без кристаллов. Теоретическая точка массоперехода из жидкого ■ состояния в твердое находилась а іфеделах от -54'до -60 °С. "■

■ При рекристаллизация зарегистрировано снижение уровня юассопе-рехода из твердого в жидкое'состояние на уровне температур' от -28°С до -14°С. Наличие такого плавного перехода:из одного состояния в другое способствует большей стабильности эмЗриона.

; так.как в данном случае не будет .смещения клеточных структурч -зародыша при переходах раствора из твердого в яидкое ■ состояние и наоборот.'.; ■ .■■.'■■,■•

Однако кряопротекторы, хотя ограничивают и предотвращают -краоповрелщекия, могут и саш. ггавреядагь клетки эьзЗриона пос-

■ редством осмотических изменений. Исходя из этого, целы> нашей . работы б шга определить влияние глицерина и его сочетаний с ,2-іфопандаолом,на жизнеспособность эмбрионов после замораживания и оттаивания, а также установить оптимальное■ время-нашиензя их .криопротектором. Данный процесс наблшали .под микроскопом . .

РЬсИогооо " при 400-кратном: увеличении, по реакции деформации оболочки эмбриона, которая изменяла свою сферу при выходе ".свободной воды. .'. • ■* V.- ..

,'. Начало деформации оболочки зародыша наблвдали в криопротек торной .смеси 15% глицерина + 20% I,2-пропандиола на ФБС.в тече. кие первых'З минут, с возвращением в первоначальное положение.

. Предельная деформация эмбриона при насыщении раствором 20% глицерина + 40(5 I;2-пропандиола на' ФБС наступала через 5 минут, что свидетельствует об'оптимальном времени насыцения.

Способ насыщения эмбрионов крупного рогатого скота криопро тектором высоких' концентраций; осуществляли двумя методами до • конечных концентраций: I способ ¿5^ глицерина + 25% 1,2-пропан-диола на ФБС и-П способ 20% глицерина + 40£ I,2-пропандиола на £БС (табл. 9). ' : . /' ■ '

' Процент выживаемости от числа замороженных, при насыщении 20^ глицерина 1,2-пропакдиола на ФБС был значительно выше ;И составил 94,чем В первом.случае (80,.

. Критерием эффективности зачоратшвакия эмбрионов при использовании высоких концентраций криопротекторов в результате, витркфикации является . их жизнеспособность после оттаивания. о

t.

: рис.З. І Кржшротектор 25? раствора глицерина и 25? 1,2-про-павдиала; I - заморавиваниеї 2 — отогрев/

Pic.4.v Крнопротектор 20$ расхвора глицерина и 40$ 1,2-пропавдиояаї 1 — заьюрааивание; 2 - отогрев? ' ■.

''-.'"■ - 19

. . ■" ". • . Таблаца 9

'Жизнеспособность эмбрионов в зависимости ;

от концентрации крио протек торов при витрификацки "

■ Концентрация раствора

. Показатель - ...... ■ ■ ■■■ ■ —■

2§£ глицерина + 20% гхшерина + . 25% 1,2-пропашаол 40% 1,2-просшшол

Заморожено и оттаяно эмбрионов 20 ■ 18 - ■

Жизнеспособных' после отогрева "16 17

Цроцент выживаемости 80,0 94,4х

. ХР<0,05 .

Отогрев, лаетт проводила в водяной бане при те^ературэ ьсг. +20°С в опыте и в кон^ле'+37°с;~6~тече1йе ' 5-8" с'бкукг до чеэаовешш аморфного и твердого состояния. Культивирование /г;-:-водкли б фосфатно-солевом растворе Дииъбехко с добавлением 30? фетальной сыворотки теленка.в термостате в течение 12 часов (табл. 10).

Таблица 10

Елйяние-температуры оттаивания на жизнеспособность эиЗрионов при культивировать

Температура о Показатель , (f

ттаивадш

20 37

Поставлено на культивирование 10 , 12

Количество развиващихся после • ■

. IZ ч культивирования 9 . ■ б

Цроцент жизнеспособных 90,0' 65,7

Результаты исследований показывают, что развитие эмбрионов в течение 12 часов было лучше при отогреве в водяной бане +20°С (90£), чем при+З^ (66,7?). При снижении температури уменьшается осмотическое давление, рттаиваиие паетт с эмбрионами в водяной бане при +20 °С оказывало более благоприятное влияние на их жизнеспособность. - .

После оттаивания эмбрионы находились в высокотоксичном растворе криопротектора и для сокращения дремени депщрогации зародыши помещали в 0,5 М, а потом и I М раствор сахарозы. Воздействие сахарозы в данной последовательности снияает пороговый перепад осмотического давления и ограничивает движение ; воды через мемЗраны клеток в течение диффузии глицерина и 1,2-лропандиола из эмбриона. Стельность после пересадки зародышей . реципиентам приведены в таблице IX.

- ■ ' Таблица II

Црижлвляешсть эмбрионов после реконсервации с использованием сахарозы

, ■ Показатель Кштвор сахарозы

I Щ) 0,5 и I (М)

Пересажено эмбрионов 8 .8

Стельных реципиентов -■ I , 3

Процент стельности . ■ ' .. 12,5 ' 37,5

Способ.выведения криопротектора раствором сахарозы можно считать удовлетворительным, процент стельности во втором случае составил 37,5jf против 12,5? при выведении криопротектор-ной смеси глицерина с I,2-пропандиолом с помощь» раствора сахарозы последовательно в 0,5 и I Ы концентрации. В итоге приведенных исследований (ложно отметить, что метод витрификации пригоден как способ кряоконсврвирования эмбрионов, при концентрации криопротектора 20% глицерина + 40л I,2-пропандиола на : ОБС. При наличии благоприятного исхода криоконсервкрования.амбр» онов методом витрификации, сокращаются затраты на замораживание I эмбриона в сравнении с традиционным методом (табл.* 12).

Данные таблицы 12 показывают, что при криоконсервировании эмбрионов методом витрификацаи можно сократить не только- про- ... цесс замораживания во времени с 2,5 часов до 15 минут, но я материальные затраты и тем садам снизить себестоимость одного эмбриона с 235,20 рублей до 224,05 рублей, то есть примерно на 5¿. .

По результатам исследований разработано изобретение *"Способ быстрого замораживания биологических объектов" (заявка

Таблица 12

Затраты при двух методах краоконс ервироваиия -.. эмбрионов

Показатель

Затраты на замораживание

I эмбриона (руб)

традшхион-' №_-

метод влгри-_Фккзшга ■

Стоимость аппаратуры .; 7,05 ' -

Процесс I цикла замораживания " "

(час) ч . 3 .0,25

Оплата'рабочего времени опера- - • 1

тора (руб) 3,94 0,66 ,

Расход жидкого азота (литр) . - \ 10 2

Стоимость жидкого азота ■ -' I .0,2

Количество потребляемой злекзро-

энер1та.на Гцагсгохлаждения^ ...

(квт) ' Г, 5

Стоимость электроэнергии ' ч ' 0,02

Себестоимость эмбриона " " 235-20. 224-05

Процентное соотношение себесто- ' •

шости. эмбриона ' . 100 . 95,25

£ 4909691/13-13832 от 12 февраля 1991 г., авторы: процесс ор-д.б.н, Сергеев Н.И., старший научный сотрудник к.б.н. Мазепккн С,А., иняенер Плаксеев A.A., аспиранты Сукачева Л.П.,.'Федш-кин А.Ф.), на которое получено положительное решение БНШГПЭ от 16 августа 1991г. • ¿ выдача авторского свидетельства,

■В Ы ВОДЫ,

1. Эффективность пересадки замороженно-оттаянных эмбрионов зависит от их качества до замораживания и после оттаивания."При пересадке Э1,йрионов отличного и хорошего качества можно полу- -чить 78,65 стельности реципиентов. Для замораживания наиболее подходящими являются эмбрионы на стадии поздней морулы и -ранней бластоцисты в возрасте 7-7,5 дней.

2. Замораживание эмбрионов, начиная о минусовых темпе- -ратур (-5°С) с использованием программных замораживателей мок-' но использовать с равной долей успеха в практической криобиоло-

. • - 22'- - -гш, обеспечивание сокращение .времени на цикл замораживания на 30 мин. Способ замораживания эмбрионов в газообразном азоте без программных эамораяивателеЯ является простым и может быть использован особенно г условиях ферм и неустойчивого энергоснайже ния с - высокой эффективностью.

3, Отечественные программные мобильные замораживатали РПЗ а ЗЭУ-I по своим техническим ж технологическим параметрам не уступают "своим зарубежным аналогам R-204 • "Планер" и обеспе- -чивают сохранение жизнеспособности у 92,0$ эмбрионов .с приживляемо стыз до 45,7$ после пересадки.:

4..Крнопротектор, состоящий из 20$ глицерина + 40$ 1,2- . пропавдиола- на ФБС, является эффективным защитным средством при замораживании эмбрионов методом вигрифнкацки, обеспечивает : сохранение жизнеспособности у 94,4$ эмбрионов. Оттаивание"эмбрионов, загороженных данным способом, проводить в водяной бане . при температуре +20°С в течение б-б секунд. Удаление криопро-.тектора осуществлять в два этапа с раствором сахарозы'в кон- .- . . центрации 0(5 11 и 1,0 U на ФБС в течение 5 минут. .

5. Сокращение времени пребывания эмбрионов. в питательней среде может быть достигнуто быстрым их охлаждением в rasooCpa*»-:ном азоте до промежуточной температуры минус 60°С, а затем путем погружения контейнеров с эмбрионами в »«тргкД азот.

■ практические шщжженш '

I. Для снижения трудоемкости и затрат проводить криокон-сервіфование эмбрионов крупного рогатого скота методом.витри-фикаези в газообразном азоте с неравномерным температурным полем -60°С. При оттадвании эмбрионов использовать водяную банп с температурой +20°С. Удаление криопротектора из эмбриона осуществлять раствором сахарозы в концентрации 0,5 М и 1,0 И , последовательно в течение 3-5 минут. - '> ': ■ ■

.список опубликованншс работ* 4 , :

I; Сергеевичи,, Мазешсин С.А., Федшжгя А.Ф. Способы замора- : ; жшй!н2§"скота // Зоотехния. - 1989, -VII; - С.47т50. ■ 2. Режимы замораживания и оттаивания эмбрионов. Сергеев H.H.",

Ыззопкян С.А., Фадшішн А.Ф., Адмарданов A.A. / Рекомекда- t • ции по криоконсервировашш эмбрионов крупного рогатого ско-

та. Дубровины. - 1990. - С.31-45. \ 3. Мазепкин С.А.. Фатошш А.Ф., Сукачева Л.П. Замораживание • эиЗрионов крупного рогатого скота / Cd. Проблеми развития -биотехнологии в животноводстве. Дубровины. - 1990. - С.59-6І* 4* Федшкин А.Ф., Иаэенкин С.А. Жизнеспособность замороженно-оттаянкнх эмбрионов в зависимости от дня обработки и типа гонадотропина / Тезисы докладов Республиканской научной конференции (Достижения биотехнологии я перспективи.их раз. вития). Львов. - 1991.;- С. 42.

Пвдпкса»» * п«ча?е 50.10.К31г. -3«и«з 692.

Sspos ХОО.гкэ« 'Овъеи 1,&-уч*-язя.л.

ПШ БИЖа