Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Усовершенствование технологии изготовления и изучение свойств трипсина сухого для вирусологических целей

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Попова, Вера Михайловна, Москва

/^у/ / Д / //С»?

российская академия сельскохозяйственных наук

всероссийский научно-исследовательский и технологический институт биологической

промышленности

На правах рукописи

ПОПОВА ВЕРА МИХАИЛОВНА

УДК 619: 615.37.08

УСОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ ТЕХНОЛОГИИ ИЗГОТОВЛЕНИЯ И ИЗУЧЕНИЕ СВОЙСТВ ТРИПСИНА СУХОГО ДЛЯ ВИРУСОЛОГИЧЕСКИХ ЦЕЛЕЙ

03.00.23 - биотехнология

ДИССЕРТАЦИЯ ( на соискание ученой степени кандидата

биологических наук

>

Научные руководители: доктор биологических наук В.Т. Иочевный кандидат технических наук А.И. Гуславский

Москва -1999

ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ.....................................................................................................5

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ...................................................................................8

в »

! , 1.1. Некоторые аспекты производства протеолитических ферментов...............8

1.2. Состояние вопроса и анализ технологии получения протеолитических ферментов (трипсина).................................................11

1.2.1. Технологические особенности производства........................:...................11

1.2.2. Методы контроля качества трипсина.........................................................16

1.2.3. Техническое оснащение производства ферментов..................................... 18

1.2.4. Применение протеолитических ферментов в практике.............................. 24

1.3. Заключение...................................................................................................27

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ........................................................29

2 . МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ......................................................................29

; 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.............................................................36

3.1. Усовершенствование технологии и оптимизация

условий изготовления трипсина сухого.....................................................36

3.1.1 . Выбор и подготовка сырья..........................................................................36

' 3.1.2. Исследование способов измельчения

исходного сырья и подбор оборудования...................................................41

3.1.3. Исследование стадий, параметров и выбор режимов

технологии изготовления трипсина............................................................43

, 3.1.4. Сравнительная оценка методов очистки трипсина...................................72

3.1.5. Анализ и выбор методов высушивания трипсина....................................80

3.2. Выбор и совершенствование методов контроля качества

трипсина сухого, используемого для вирусологических целей.................90

3.3. Разработка технологической линии производства трипсина сухого........93

3.4. Освоение опытно-промышленной технологии производства

трипсина сухого для вирусологических целей..........................................100

3.5. Использование трипсина сухого для получения

культур тканей и вирусов............................................................................105

3.5.1. Применение трипсина сухого для получения

культур клеток при'обработке культуры ткани..........................................105

3.5.2. Оценка чувствительности к вирусам культур клеток,

полученных с использованием трипсина..................................................108

3.6. Оценка эффективности использования трипсина сухого

для изготовления противовирусных препаратов.......................................112

3.7.' Технико-экономическое обоснование промышленного

• производства трипсина сухого для вирусологических целей...................122

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ...............................................................128

ВЫВОДЫ....................................................................................................140

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ........................................................142

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ........................,..................................................144

ПРИЛОЖЕНИЯ...........................................................................................158

УСЛОВНЫЕ СОКРАЩЕНИЯ

БМ - болезнь Марека

ВБА - вирус болезни Ауески

ВГИ - вирус герпеса индеек

ВЧП - вирус чумы плотоядных

ГА - гем агглютинация

ИП - индекс пролиферации

ИРТ - инфекционный ринотрахеит

КРС - крупный рогатый скот

МДБК - перевиваемая линия почек телят

мдск - перевиваемая линия почек собак

НТД - нормативная техническая документация

пвэс - парвовирусный энтерит собак

ПГ-З - парагрипп-3

ПК - почка крольчат

пкш - почка кошек

плк - перевиваемая линия клеток

ПС - питательная среда

пщ 5 - почка щенка

пэк - почка эмбрионов коров

РА - рост (рост стимулирующая активность в баллах)

ск - сыворотка крови

спэв - перевиваемая линия почек свиней

ТБ - текстулы быка

тс - трипсин сухой для вирусологических целей

УК - урожай клеток

ФЭК - фибробласты эмбрионов кур

ФЭП - фибробласты эмбрионов перепелов

ЦПД - цитопатогенное действие вирусов

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы. В вирусологической практике для диспергирования тканей животных и птиц наиболее широко используется трипсин и значительно реже другие протеолитические ферменты, в основном импортного производства (41, 60). Отечественные препараты, как правило, нестандартны по активности, производятся в незначительных количествах и не обеспечивают возрастающие объемы производства культур клеток и противовирусных пренара-

»

тов.

Анализ существующих технологий изготовления трипсина показал, что для производства препарата используются, в основном, несовершенные способы разделения суспензии, получения и высушивания конечного продукта, которые не отвечают современным требованиям по техническим и технологическим характеристикам и приводят к низкой активности и повышенной токсичности фермента.

Поэтому исследования, направленные на изыскание новых средств и технологических решений промышленного получения трипсина имеют для производства противовирусных препаратов бесспорную актуальность.

Большой вклад в решение указанных проблем внесли отечественные и зарубежные исследователи, труды которых определили общее направление и перспективы дальнейшего научного поиска (6, 15, 16, 48, 91). Многие вопросы еще не решены и нуждаются в теоретическом обосновании, разработке и внедрении в практику.

Цели и задачи исследований. Целью работы явилось усовершенствование технологии и оптимизация условий промышленного производства трипсина сухого для вирусологических целей с использованием современного оборудования, средств и методов контроля препарата, изучение его физико-химических и диспергирующих свойств, оценка эффективности применения препарата в вирусологической практике.

Для достижения цели работы потребовалось решить следующие задачи:

- изучить способы получения и контроля трипсина и изыскать возможные пути усовершенствования технологии производства препарата;

- определить общие требования к исходному сырыо и его подготовке к технологическому процессу;

- изучить влияние различных технологических параметров на эффективность производства и качество конечного продукта;

- разработать и оптимизировать технологию изготовления сухого трипсина с использованием современного оборудования;

- разработать технологическую линию производства трипсина для вирусологических целей;

- отработать методы контроля препарата, отвечающего требованиям квалификации "для культур клеток";

- оценить пригодность трипсина для получения широкого спектра культур клеток, вирусов и противовирусных препаратов;

- разработать нормативно-техническую документацию на получение, контроль и применение трипсина квалификации "для культур клеток" в вирусологической практике.

Научная новизна. Научно обоснован комплекс данных по характеристике биообъекта, общности и специфичности биотехнологических процессов, их оснащенности, выбору средств, методов и оптимальных условий получения трипсина сухого квалификации "для культур клеток".

На основе применения отечественного оборудования разработана технологическая линия и определены оптимальные технологические параметры процессов промышленного производства трипсина. Выявлено влияние различных

факторов на качество готового препарата.

Показана возможность применения сухого трипсина для получения широкого спектра культур клеток, вирусов и противовирусных препаратов.

Практическая ценность работы. Разработана промышленная технология получения трипсина сухого для вирусологических целей, оптимизированы ус-

ловия его производства при применении технологической линии с использованием современного и модернизированного оборудования.

Определеньт общие требования к исходному сырью, подобрано высокопроизводительное отечественное оборудование, определены оптимальные режимы изготовления и методы контроля трипсина сухого квалификации "для культур клеток".

Доказана пригодность и перспективность препарата для использования в вирусологической практике.

Разработана и утверждена нормативно-технологическая документация на изготовление, контроль и применение трипсина для вирусологических целей.

Апробация работы. Основные положения исследований доложены и получили положительную оценку на IV Всесоюзной и V Всероссийской конференциях "Научные основы технологии промышленного производства биологических препаратов" (Москва, 1991, 1996), Всероссийской научной конференции "Инфекционные болезни молодняка сельскохозяйственных животных" (Москва, 1996), на Ц Международной научно-производственной конференции "Актуальные проблемы ветеринарной медицины и ветеринарно-санитарного контроля сельскохозяйственной продукции" (Москва, 1997), на Всероссийской научно-практической конференции "Научные основы технологии промышленного производства ветеринарных биологических препаратов" (Щелково, 1998).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 11 статей, утверждена нормативно-техническая документация.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 178 страницах машинописного текста и включает введение, обзор литературы, собственные исследования, обсуждение результатов, выводы, практические предложения. Работа содержит 35 таблиц, 16 рисунков. Библиографический список включает 167 наименования, из них 101 отечественных и 66 зарубежных авторов.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Некоторые аспекты производства нрогеолитических ферментов

Протеолитические ферменты - это биокатализаторы. Длительное время они служили и продолжают служить моделью для изучения кинетики и специфичности ферментных реакций (48).

, Изучение нрогеолитических ферментов, расшифровка их первичной, вторичной и третичной структуры была проведена в 50 - 70 годы Нортропом, Ку-нитцем, Херриотом, В.В. Мосоловым (48,60,122,133,138).

Протеолитические ферменты относятся к классу гидролаз (КФ класс 3) и подклассу пептид - гидролаз ( КФ 3.4), который разделяется на четыре группы КФ 3.4.1 - аминопептидазы, КФ 3.4.2 -карбоксипептидазы, КФ 3.4.3 дипептидазы, КФ 3.4.4 -протеиназы. Они катализируют реакции расщепления пептидных связей в белках и пептидах общего тина

-КСН-С-ЫН-СНЯ"- + Н20 - -КСН-С-О + 1Ш-СН1Г-

II II

О о

Наибольший интерес для вирусологической практики представляют про-теиназы КФ 3.4.4, полученные из разных источников животного происхождения (пепсин КФ 3.4.4.1, трипсин КФ 3.4.4.4, химотрилсин КФ 3.4.4.5, коллаге-наза КФ 3.4.4.19, ренин КФ 3.4.4.3), растительного происхождения (папаин КФ 3.4.4.10, фицин КФ 3.4.4.12, бромелаин КФ 3.4.4.24), микроорганизмов и про-теолитических систем бактерий и грибов (6,16,24,48,91,92,135).

Из протеолитических ферментов различного происхождения в большей степени изучены ферменты из органов и тканей животных. В поджелудочной железе эти ферменты синтезируются в виде неактивных предшественников-зимогенов. Процесс активации носит характер ограниченного протеолиза и сводится к расщеплению строго опрсделецрых стратегических пептидных свя-

зей в молекуле зимогена, в результате чего белок приобретает ферментативную активность. Ключевое положение в системе активации зимогенов занимает трипсин КФ 3.4.4.4, который осуществляет не только автокаталитическую активацию трипсиногена, но и активирует все без исключения зимогены поджелудочной железы: химотрипсиногены А, В и С, прокарбоксипептидазы А и В, а также зимоген фосфолипазы А (48,147 ).

Бычий трипсин получен Нортропом и Кунитцем в 1933 году , а в 1934 году они же выделили из кислого экстракта поджелудочной железы химотрипси-ноген, через год появилось сообщение о выделении предшественника трипсина трипсиногена из маточной жидкости, оставшейся после кристаллизации химот-рипсиногена (48,123,124,138).

Трипсин был также получен из поджелудочной железы свиньи Нордом в 1961г., Ван-Мелле в 1963г., Трэвисом и Латнером в 1965г., овцы Трэвисом в 1968г., из панкреаса индюка Рианом в 1965г. (48,149,150,159,160,161).

Протеолитические ферменты из поджелудочной железы различных видов животных и их зимогены неоднородны.

Присутствие неактивных примесей в значительной степени является результатом самопереваривания (автолиза), сопровождающего процессы активации зимогенов и очистки ферментов. В частности Шредором и Шоу отмечен заметный автолиз бычьего трипсина даже при хранении лиофилизированных препаратов (152). Автолиз приводит к загрязнению препаратов неактивными продуктами и к образованию модифицированных форм фермента, отличных от исходной формы (5,150,152). Содержание неактивных примесей в отдельных препаратах бычьего трипсина может достигать 40-50 %, свиного трипсина около 30 %, химогрипсина 10-20 % неактивных примесей (16,48,118,158,159).

Ионом и Лайнером предложен элементарный способ дополнительной очистки препаратов трипсина методом осаждения неактивных примесей в 1 М растворе №С1 или 0,05 М СаС12. Коул и Кинкейд очищали кристаллический трипсин на амберлите ТРС-50 в 8 М растворе мочевины (48,49,52,53,109,120).

В В. Мосолов и Е.В. Лушкова (50-54) предложили очистку трипсина с помощью специфической адсорбции фермента на нерастворимом ингибиторе белковой природы, который химически связан с целлюлозой или другим полимерным носителем (48,49,52,53).

Трипсин разного происхождения имеет в общем сходный аминокислотный состав. В свином трипсине четыре остатка гистидина, а в трипсине быка, овцы, человека и индюка - 3 остатка; трипсин человека и индюка содержит 8 остатков полицистина, а трипсин быка, свиней и овцы - 12; трипсин человека содержит только 1 остаток метионина. Трипсин индюка отличается от трипсина млекопитающих низким содержанием лизина (48,113,135).

Молекулярный вес трипсина составляет 23 - 25 кДа (113,143).

Бычий и свиной трипсины имеют белки с ярко выраженными основными свойствами, с изоэлектрической точкой около рН 10,0 (104,142)..

Марес-Гийа отметили, что ингибиторами трипсина являются соединения, содержащие аминную, гуанидиновую, ам иди новую группу, присоединенную к радикалу. Первой такой модификацией была обработка трипсина ангидридом монокарбоновых кислот (113,130-134,141,154-156).

Сведения о модификации трипсина, также как ацилирование его сопровождается изменением положения изоэлектрической точки белка и некоторым сдвигом оптимума рН в щелочную сторону (109,125).

Увеличение устойчивости ацилтрипсинов в нейтральной и щелочной зоне представляет интерес, так как при этом нативный фермент подвергается быстрому самоперевариванию (60,95,96). В.В. Мосолов и другие показали, что ацилирование предохраняет трипсин от инактивации в присутствии поверхностно-активных веществ - солей жирных и желчных кислот и синтетических детергентов (47,51,53).

Поскольку в одном обзоре невозможно полностью осветить все важные вопросы, связанные с протеолитическими ферментами попытаемся кратко изложить основные проблемы технологии их получения, в частности трипсина.

1.2. Состояние вопроса и анализ технологии получения прогеолитических ферментов (трипсина)

1.2.1. Технологические особенности производства

Получение ферментных препаратов из животного сырья сводится к извлечению ферментов и их очистке. Многие приемы и методы препаративного выделения ферментов запатентованы, или являются секретом фирм (15,16).

Из анализа литературы следует, что технологическая схема может быть представлена в виде процессов, проводимых в строго определенной последовательности: сбор ферментного сырья, консервирование, хранение и транспортировка, измельчение, экстракция ферментов из полученной суспензии, отделение раствора фермента от нерастворимого осадка тканей, осаждение продукта из очищенного экстракта методом высаливания или осаждения органическими растворителями, отделение осадка от надосадочной жидкости, очистка и кристаллизация очищенных растворов ферментов, получение готового продукта различными методами сушки (88,92,122,123,138,159).

Комплексное использование ферментного сырья имеет все большее место в практике. Так известно, что из поджелудочной железы выделяют ценнейший гормональный белок инсулин, необходимый больным диабетом. Остатки ткани железы (после экстракции инсулина) раньше утилизировали, однако в США, Дании, ФРГ выданы патенты на получение из остатков ткани рибонук-леазы, про I ео л ити ч ее к и х ферментов химотрипсина и трипсина, а затем и де-зоксирибонуклсазы. Из этих остатков ткани также получали эластазу, карбокси-пептидазу и панкрин (91). На первом этапе для извлечения ферментов использовали подкисленный спирт. Разбавленный спирт не денатурировал протеоли-тические ферменты. Кислая реакция смеси наиболее выгодна для сохранения

трипсина и химотрипсина. Зона наибольшей стабильности ферментов находит»

ся в и