Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

УСОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ МЕТОДА ТРАНСПЛАНТАЦИИ ЭМБРИОНОВ

ВАК РФ 03.00.13, Физиология

Автореферат диссертации по теме "УСОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ МЕТОДА ТРАНСПЛАНТАЦИИ ЭМБРИОНОВ"



ВСЕСОЮЗНЫЙ ОРДЕНА ПУДОВОГО КРАСНОГО , НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ЖИВОТНОВОДСТВА

<ВИЖ)

На правах рукошмй КУТРА Мовйс ПотлоМп

удк п ш6м

УСОВЕРШСНСТВОВАНИС МПОДА

ТРАНСПЛАНТАЦИИ ЭМБРИОНОВ

крупного рогатого екдга

Автореферат

д ясеерпвш м соискание ученой степени йМЯМ"^ ММоппескнх наук

и. Дубрмнцы, Москоккой обл.| 1М1

сгаг (я^см&ъ*^

Работа выполнена в Литовском институте животноводства.

Научный руководитель:

— заслуженный деятель науки РСФСР, доктор биологических наук, профессор Ю. Д. КЛИНСКИЙ.'

Официальные оппоненты:

— доктор биологических наук В. П; КОНОНОВ,

— кандидат биологических наук В, Я, ЧЕРНЫХ,

Ведущее учреждение —

Всесоюзный научно-исследовательский институт физиологии, биохимии и питания сельскохозяйственных животах, Боровск.

Защита диссертации состоится

1991 года в—.^...^...„часов на заседании Специализированного совета Д020.16.02 при Всесоюзном ордена Трудового Красного знамени научно-исследовательском институте животноводства. Адрес: 142012, Московская область, Подольский р-н, пос. Дубровицы.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке института. ^^^^ ' ^

Автореферат разослан <c7.iT..,,» 1991 года.

' Ученый секретарь Спецмлмзжромпаго совета, кыдидат {мммпеаих наук

И. И, ШМЫГИН

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

В последнее время, наряду с традиционными биотехнологическими методами (искусственное осеменение, глубокое замораживание и длительное хранение семени быков, вызывание половой охоты и др.)> практическое значение приобрела трансплантация эмбрионов, которая рассматривается как эффективный $*етод ускоренного размножения высокоценных племенных животных.

В Литве первые успешные пересадки эмбрионов крупного рогатого скота сделаны в 1985 г. специалистами сектора трансплантации эмбрионов Литовского НИЖ. За 1989 год от высокопродуктивных коров-доноров было получено ИЗ телят-трансплантантов. Приживляемость пересаженных эмбрионор в среднем составила 55—60%, В настоящее время освоены методики и успешно проводятся работы по микрохирургическому делению, культивированию in vitro и замораживанию эмбрионов. *

Воспроизводительная функция животных контролируется сложным комплексом механизмов нейроэндокринной системы, ключевую роль в которой играет гипоталамус. Поэтому открытие гипоталамическ^го гонадотропин-рилизинг гормона (Гн-РГ) и успешный синтез его аналога сурфагона вызывали особый интерес среди многих, исследователей, .После того как было установлено, что коровы на введение Гн-РГ, реагируют, выделением лютеинизирующего гормона (ЛГ), его начали применять с целью стимуляции воспроизводительной функции у коров в послеотельный период,

В научной литературе имеется мало экспериментальных данных об использовании сурфагона при вызывании суперовуляции у коров-доноров и о его влиянии на овуляцию, ■ развитие эмбрионов и гормональный статус в организме животных. Недостаточно данных и об исследовании отечественных- гипофизарных препаратов и простаглаядинов, применяемых ттри вызьтдтпт (-уутррпиу п спрпт

ЦЕНТРАЛЬНАЯ НАУЧНАЯ БИБЛИОТЕКА Моск. селоско-лоз. академии им. К. А. Тимиеяэова ^ •

gmm.

Цель и задачи исследований. Цель исследований заключалась в усовершенствовании и разработке более эффективных методов гормонального вызывания суперовуляции у коров-доноров, синхронизации овуляций и улучшении качества эмбрионов путем применения гоиадотропного рили-зинг-гормона — сурфагона.

Исходя из этого были поставлены следующие задачи:

— изучить эффективность применения различных гона-дотропных препаратов (ФСГ-П, фоллитропин, фоллнгон) отдельно иг в.комплексе^ с Гн-РР на-проявление полиовуляции, выход, качество и возраст эмбрионов;

устан6вить-''коррелятивную связь уровня/ прогестерона, эстрадиола, лютеинюзирующего го рмона в 'крови доноров перед1 началом. гормональной обработки;; во время охоты и во-время'вымывания эмбрионов'с последующим выходом'эмбрионов и их качеством; - 1 - * .

" — определить: оптимальное место введения семени, и кратность осеменения - коров-доноров при суперовуляции; " установить.'связь гормонального статуса реципиентов с приживляемостыо. эмбрионов... ,.......■ .. .

Научная новизна работы заключается в том, что впервые изучено влияние сурфагона на созревание и* синхронность овуляций фолликулов в.связи с динамикой ЛГ в крови после обработки коров-доноров ФСГ-П, фоллитропином и фол-

ЛИГОНОМ.. . 1 , .. ■ ...........у 1 ■ .1-1- - ; ."

Впервые для синхронизации охоты у телок-реципиентов использован; синтетический г;аналог' тфостагланднна'Рга — анипрост' и: установлено,' что препарат, пригоден для этой цели (приживляемость:эмбрионов у. обработанных анипрос-том • телок-реципиентов существенна не различалась от приживляемое™ у; обработанных эстрофаном^и у.телок 'со спонтанной (охотой). : . ' >' '-'.т ^: . :. ■ "' Установлено негативное действие высоких доз сурфагона на гипофиз, вследствие чего уменьшается выделение/лю-теинизпрующего- гормона < при повторных обработках меньшими дозами этого препарата. ' м -'.. : •' * • • • 1

Практическая значимость работы. Полученные нами данные* позволяют эффективно использовать Гя-РГ-{сурфа-гонХ при вызывании суперовуляций разными' фолликулостй-мулирующими- препаратами и увеличить- выход пригодных .для трансплантации эмбрионов,;эффективно провести, осеменение коров-доцоров-и. цересадку-;эмбрионов. *■ • ■

Апробация работы. Основные положения диссертации доложены на: .

всесоюзной научно-технической конференции по при-мене!шгогбкотехнол0гш1в .животноводстве, растениеводстве и ветеринарной."медицине (Москва, 1988);

•—'республиканской конференции «Состояние и перс-пе^тийы развития' генетики и селекщш в Литве», Вильнюс,

1989; - • - ......- - - ......

—: республиканской конференции. «Вклад молодых- ученых и специалистов 'при интенсификации животноводства в республике», Байсогала, 1988, 1989 гг.

Объем работы;'Диссертация изложена на 130 страницах машинописного ^текста; содержит-28'таблиц,-4 графика; состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной-части, ' 6б<^ждеийя:р*езультатов; выводов и предложений производству, списка литературы; включающего 138 источников,- из них 82 на иностранных языках.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДИКА-ИССЛЕДОВАНИЯ

Научно-исследовательские опыты: проводили в '1987— 1989 "гг.- в Байсогальском экспериментальном'хозяйстве Литовского научно-исследоватёА4>ского института животноводства и; 'ветеринарии, и- в ¡ экспериментальном - хозяйстве - Литовского- научно-исследовательского~ институтаг земледелия. Для: опытов использовали коров-доноров литовской черно-пестрой породы,. 4—7-летнего-возраста живой массой- 500— 650;кг со средней продуктивностью 4500—6000 кг молока за лактацию и телок-реципиентов 16—18-месячного возраста живой.массой 340—-360-кг.

Рационы кормов для коров-доноров и телок-реципиентов в зимний и летний периоды были сбалансированы по основным'питательным веществам, согласно нормам-ВИЖ.

Перед обработкой животных гормональными препаратами проверяли общее-состояние^их здоровья (с учетом физиологических показателей-крови). *

Состояние половых органов "Исследуемых животных проверяли путём ректального обследования яичников (с учетом их размеров и-наличия - в -них хорошо -развитого желтого

тела);- ______ \ _ - '

Опыты проводяли в осенний и зимний'периоды.

I опыт

Применение сурфагона в сочетании с тппофизарнымн н плакцентарвымн говадотропннамн для, синхровяэацни овуляций

! ■ Число

rjiynna j. Препарат Дом . живот-

i ' ных

Контрольная ФСГ ' 40 мг 20

I опытная ФСГ-сурфагок 40 мг+25 мкг . 20

И опытная Фоллитропнн ■ ПВО ЕД 20

III опытная Фо" литропи н Ц- сурфагок 1100 ЕД+25 мкг 20

IV баытная Фоллпгон 2S00 ИЕ 20

V опытная Фоллигон41 сурфагон 2500 ИЕ+25 мкг 20

Применеане разных доз сурфагона для вызывания суперовуляции

у телок

Группа Препарат Доза Число ЖИВОТНЫЕ

I опытная ' Сурфагон ' * 2400 мкг е

11 опытная Сурфагон 800 мкг 6

III опытная Сурфагон 500 мкг 6

IV опытная ' Сурфагон 400 мкг е

п ОПЫТ

Определение оптимального места ■ введения семени к оптимальной кратности осеменения коров-доноров при суперовуляции

Число

Группа Кратность я место введения семени живот-

ных

1, -

Контрольная Двухкратное осеменение в шейку матки с интер- 10

валом 12 ч

I опытная Двухкратное осеменение в тело матки с интер- to

ва дам 12 ч

II опытная Трехкратное осеменение в шейку матки с ин- 10

тервалами 12 ч

III опытная Трехкратное осеменение в тело матки с интер- 10

валами 12 ч 2.

Контрольная Трехкратное осеменение в тело матки с интер- 10

валами 12 ч

I опытная Двухкратное осеменение в тело матки с интер- 10

валом ,12 ч

II опытная Двухкратное осеменение в тело матки с ннтер- 10

валом 12 ч с применением сурфагона

Ш опытная Двухкратное осеменение в тело матки с ннтер- 10

?£лом 24 н

ш опыт

Првмевевие простаглавднаов для синхронизации охоты у темж-рецпчкевтов Влияние различных факторов на приживляем ость эмбрионов

■Группа

Приживляемость эмбрионов

, Число

-хояиж

Контрольная Прижив аемость эмбрионов у телок' со спон-

. . "тайной охотой ' 50

I опытная Приживляемость эмбрионов у телок со синхронизированной эстрофаном охотой 100 И опытная Приживляемость эмбрионов со синхроннзиро- *

ванной акипростом озотоп .20

В лабораторных и научно-производственных опытах использовано 152 коровы н 250 телок.

Содержание прогестерона и эстрадиола в крови определяли радиоиммунологнческнм методом в лаборатории эндокринологии ВИЖ, уровень ЛГ—в лаборатории Всесоюзного кардиологического научного центра Академии Медицинских паук СССР.

На каждого животного вели индивидуальный учет.

Для гормонального вызывания суперовулящги использовали стандартный СЖК (Folligon), ФСГ-П и фоллитрошш по 4-дневной схеме. Для синхронизации овуляций применяли синтетический аналог гонадотропного рнлизинг-гормона — сурфагон. ,

Корсв-доноров осеменяли ректоцервнкальным методом замороженным-оттаянным семенем одного быка с количеством подвижных сперматозоидов в дозе не менее 15 млн.

Для синхронизации охоты у телок-реципиентов использовали проста гланд ни Fza эстрофан (ЧССР) в дозе 500 мкг и ашгпрост (СССР) в дозе 500 мкг.

Кровь для определения концентрации гормонов брали из яремной вены у коров-доноров 1 раз перед" началом гормональной обработки (9—11 день полового цикла), 5 раз с 1-часовыми интервалами во время охоты и 1 раз после вымывания эмбрионов (7 день полового цикла). У телок, у которых вызвали суиеровуляции с помощью сурфагокаг кровь брали перед началом обработки, 3 раза с 2-часовыми интервалами после введения сурфагона, 1 раз во время охоты и 1 раз на

7 день полового цикла. У телок-реципиентов кровь брали на 7 день полового цикла (после пересадки эмбрионов). Гормоны определяли в сыворотке крови, до анализа хранившейся при —20 'с;'

3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

3.1; Исследование влияния сурфагона на созревание фолликулов, овуляцию и качество эмбрионов

Во время опыта установлено, что при обработке коров-доноров различными. гормональными препаратами овуляция начинается и происходит неодновременно и зависит от вида применяемого гонадотропина, *

Так, у 23,8% коров, обработапых ФСГ-П, 14,4%—фол-литропином и 6,7% фоллигоном, овуляция завершилась до 48 ч после введения эстрофапа.

Более растянутая овуляция отмечена у животных, обработанных фоллигоном. Это отражает анализ стадий развития вымытых эмбрионов, а также исследования уровня ЛГ во время охоты.

Для синхронизации овуляций у коров-доноров был использован синтетический Гн-РГ—сурфагон. Время , его введения (через 48 часов после обработки простагландинами, т.е. предполагаемое начало охоты) выбрано с целью через выброс ЛГ воздействовать на неовулировавшие фолликулы. Для определения влияния сурфагона на овуляцию нами было подсчитано процентное соотношение одновозрастных эмбрионов. - - •

Наибольший эффект синхронизации овуляций сурфагон дает при использовании его е фоллигоном (процент однозначных по возрасту эмбрионов достигал 74,9%) (Р<0,001), а у обработанных только фоллигоном число таких эмбрионов составило 46,4%. Менее значительный эффект синхронности получен при применении сурфагона с ФСГ-П и фол-литропином. При этом синхронность возраста эмбрионов повышалась на 4,1 и 6,6% (Р<0,05) (табл. 1),

Во всех группах животных, обработанных сурфагоном, увеличилось число эмбрионов, стадия развития которых во время вымывания была {на 7 день полового цикла) поздней морулы и ранней бластоцисты. При этом соответственно уменьшалось число эмбрионов других стадий (табл. 2).

Было установлено, что эффект сурфагона проявляется не только синхронизацией овуляции, но и влиянием на качество эмбрионов;

У коров-доноров, обработанных ФСГ-П, в среднем с одного донора вымыто 3,4, фоллитропнном — 3,6 и фоллигоном— 3,4 пригодных для трансплантации эмбрионов (Р< 0,05). В то время с коров, обработанных фолликулостиму-

Таблица 1. Сивхроввость развития эмбрионов в момент 1гх вымывания при использовании разных гормональных препаратов

Показатель ФСГ<1 контрольная) ФСГ+сур- фагон (I опытная) Фоллитро-пин (I контрольная) Фоллнтро-пмн+РГ 411 опытная) фоллигоп (Ш коот-рольная) Фо. ЛИГОИ+ сурфагон (Ш онытяая)

Число ЖИВОТНЫХ 19 16 . 21 17 : 15 16 '

Вымыто эмбрионов 'ш . И9 150 99 81 88

Вымыто однозначных эмбрионов на 1 донора 55,6±4,Ю 59,7 ±6,4 61г5±5,3 68,1 ±7,ОС 46,5 ¿4,56 74,9±4,5

Таблица 2. Синхронность возраста эмбрионов при использовании различных фоллжкулостиму дарующих препаратов отдельно ' и с сурфа гоном

Показатель

Число животных Всего вымыто эмбрионов Вымыто эмбрионов по их возрасту; М;,

Ык, ч/% Мнл Б/, ч/% б/г,

Б/у. ч/%

е

О э

е а

19 16 21 17 45 16

115 119 130 99 81 88

14 - 1 ■ 111 1 8 8

12,1- о,« •8 1,0 9,9 9,1

7 16 38 а 21 10

0,6 13,4 25,3 8,18 2,6 1М

№ 38 ■15 13 16 18

13,9 31,9 10,0 13.1 19,8 20.5

И 26 17 32 . И 20

9,5 21,8 11,3 32,3 13,5 22,7

22 8 21 tз 7 16

19,1 6,7 14,0- 13,1 8,6 18,2

■20 - 6 23 16 Э 9

25,2 5,0 15,3 15.2 Н,1 10,2

5 ■ 0 1 5 0

0,8 4.2 0 1,0 6.1 0

лирующими препаратами и дополнительно сурфагоном, получено: ФСГ-П — 3,9, фоллнтропином — 4,0 и фоллигоном— 3,7 пригодных для трансплантации эмбрионов с одного положительного по суперовуляции донора (табл. 3).

3.2; Уровень суперовуляции в зависимости от концентрации гормонов в крови коров-доноров в отдельные моменты полового цикла при обработке различными гормональными препаратами

Гормональный фон крови коров-доноров перед обработкой фолликулоспшулирующими препаратами (9—11 дни полового цикла) соответствовал физиологическим нормам.* Уровень прогрестерона в среднем составил 4,9±0,20 нг/мл (Р<0,05), эстраднола 17р — 18,5± 1,3 пг/мл, ЛГ—3,2±0,61 нг/мл. Нами учитывались уровень гормонов перед началом гормональной обработки и реакция яичников сутгеровуля-дией на 7 день полового цикла (во время вымывания эмбрионов) (табл. 4).

Таблица 3. Число н качество эмбрионов у коров-дозоров при введении фолликулосгвмулирующнх препаратов отде »во я с сурфагоном

Показатель ФСГ ФСГ+сур-фагон Фоллитро-пин Фоллтро-пин+сур-фагон фоллигоп фоллигон+ сурфагоя

Число животных 21 22 21 30 18 20

Число ову, рций 193 .243 221 248 187 204

Число овуляций на .1 донора 9,2 ±0,90 1.1,1 ±0,92 ■10г5±0,86 12,4±1,21 10,3±!1,01 10,2±0,93

Всего вымыто эмбрионов 119 120 150 102 82 92

Число эмбрионов ва 1 донора 5,6 ±0,вв '5,4 ±'1,06 74 ±0,97 5,1 ±0,80 4,5+0,86 4,6±0,81

Число эмбрионов, пригодных для 74 «7 74 81 62 -72 ■

трансплантации, ч/% 62,2 72,5 49,3 79,4 75,6 78,3

Число пригодных для трансплантации эмбрионов на 1 донора 3,4 ±0,76 3,9±0,79 3,6+0,68 4,0±0,79 3,4 ±0,60 3,7+0,82

Извлечено эмбрионов от числа овуляций, % 1 ' 61,7 49,0 67,8 41,1 43,9 45,1

Оплодотвор яемость яйцеклеток, % 86,6 ш Й4.7 83,4 94,0 91,3

Таблица 4. Реакция яичников суперовуляцей в зависимости от> уропяя гормонов в крови перед гормональной обработкой

Реакция I Груп-яичников | па Число ЖИВОТНЫХ Прогестерон, нг/мл Эстрадиол. 17р. пг/мл ЛГ, нг/мл

10 а больше же>

тьгх тел I . 23 4,9 ±0,32 16,1 ±¡1.77 4,5±ilp02

4—9 желтых тел II 17 5,0 ±0,3? 1в,0±2^18 1,7±0,64

3 и менее желтых

тел III 6 5,4 ±0,43 едо±о.4б ■ 5,4±3,78

Концентрация прогестерона в крови перед гормональной

обработкой у коров с хорошей и средней суперовуляторной реакцией была приблизительно одинаковая (4,9 и 5,0 нг/мл), у нереагпровавших— более высокой и достигла в. среднем 5,4 нг/мл.

У коров со слабой реакцией яичников:в то время концентрация эстрадиола 17р была 25,0 пг/мл и с увеличением реакции яичников имела тенденцию уменьшаться.

Нами было установлено, что реакция яичников. на гормональную обработку, более связана с концентрацией гормонов в крови во время охоты. Из данных таблицы 5 видно, что наилучшая реакция суперовуляцией была у коров с низким уровнем прогестерона и наиболее высокимикон-центрациями эстрадиола и ЛГ. Замечено, что у коров, плохо реагировавших или совсем'нереагировавших. на гормональную обработку (группа III), был относительно высокий уровень ЛГ в крови.

Таблица 5. Реакция.яичников суперовуляцией к уровень гормонов в крови во время охоты.

Реакция яичников Группа Число живот-пых Прогестерон, нг/мл Эстрадиол i <мах.), пг/мг ЛГ <мах), нг/мл

10 и больше жел-

тых тел I 15' 0,9 ±0,24 50,4 ±7,27 47,7±7,04

4—9 желтых тел И 12 -■1,1±0,47 40,1 ±5,85* 23,9± 7,32*

3 и меньше желтых

тел III 7 1,7 ±0,84 27,6±8,43* 31,2±8,24* *

При анализе данных о связи между величиной пика ЛГ и выходом пригодных для трансплантации эмбрионов уста- новлено, что больше пригодных для трансплантации эмбрио-

нов вымыто у доноров II группы (повышение концентрации ЛГ в крови достигало 20—49 нг/мл) (табл. 6).

Таблица 6. Выход н качество эмбрноиов вря раишюм уровне ЛГ

во время охоты

.Уровень ЛГ, нг/мл <мах) ■Группа Число ЖИВОТНЫХ Число эмбрионов на .1 донора Число пригодных эмбрионов на 1 донора

50 и больше I 5 6.4 ±2,42: 4,2±2,24

49—20 II 14 4,5±0,Ш

19 и меньше III 11 5,6±1,41* 2,9±0,43

* —Р<а,05.

У животных с более высоким пиком ЛГ в крови (50 и больше нг/мл) число пригодных для трансплантации эмбрионов уменьшалось. Оно уменьшалось и при более низком его пике (19 и меньше т/мл).

Уровень гормонов в день вымывания эмбрионов (на 7—8 день полового цикла) был близким базальному и не зависел от использованного для обработки гормонального препарата. Отмечено повышение лишь уровня прогестерона в зависимости от числа желтых тел..

В опыте исследовалась динамика ЛГ во время охоты после обработки коров-доноров фоллшсулостимулирующими препаратами отдельно и в сочетании с сурфагоном. ,

У коров-доноров, обработанных ФСГ-П через 48 ч после введения эстрофана концентрация ЛГ была низкой по сравнению с таковой у коров, обработанных другими тонадот-рошшами, и в среднем достигала 6,7 нг/мл (Р<0,1). У животных, обработанных фоллитропином и фоллигоном, уровень ЛГ был значительно выше и в среднем составлял 15,4 |(Р<0,1) и 24,6 нг/мл (Р<0,02) соответственно.

Результаты исследования образцов крови, взятой через более длинные интервалы (49, 50, 51, 52 ч), показывают, что у обработанных ФСГ-П животных значительного повышения концентрации ЛГ в креви не было. У коров-доноров, которым через 48 ч после введения эстрофана вводили сур-^ фа гон, максимальное повышение концентрации ЛГ' (до 23,6—24,3 нг/мл) фиксировано через 2—3 часа с момента его введения (график 1).

В крови коров-доноров, обработанных фоллитропином, замечена более пульсирующая выброска ЛГ (график. 2). Максимальная волна. ЛГ (32,3 нг/мл) была через 50 часов

ИТ ¡мл

/

/

30..

20

40..

■90 -49 50 51

Время после инъекции эстрофана (часы) График: 1, '

-ФСГ-П ■

--- ФСГнП в сочетании с сурфагоном

нг/мл

т

Время посе иньекции эстрофана (часы)

График 2. -:— фоллитропин

.—— фоллитропин в сочетании с сурфагоном '

после введения эстрофана. При введении сурфагона пик ЛГ отмечен также через 2 часа после его введения и достигал 32,3 нг/мл.

В группе доноров, которым суперовуляцию вызывали фоллигоном, самый высокий уровень ЛГ отмечен через 48 часов после введения эстрофана (24,6 нг/мл) и снижался ¡неравномерно (график 3). Второе значительное повышение концентрации этого гормона в крови наблюдалось через 3 часа после введения сурфагона.

, нг/мл

Бремя пос.е иньекцпи эстрофана (часы)

Гргафик 3. -:-фоллигон

_--фоллигон в сочетании с еурфагоном

Из полученных данных видно, что выброс ЛГ начинается в течение 1—2 часов после введения сурфагона и потом начинает постепенно уменьшаться. Повышенное количество ЛГ наблюдается около 2—3 часов.

3.3. Применение сурфагона для стимуляциироста1 фолликулов с целью вызывания суперовуляции

Исходя из того, что большие дозы сурфагона стимулируют выделение из гипофиза ФСГ, а небольшие — ЛГ, нами был проведен опыт на половозрелых телках с целью вызывания суперовуляции еурфагоном. Полученные результаты

показывают, что ни в одной группе суперовуляцпн не было; только в группе телок, которым вводили общей дозой 2400Г мкг сурфагона, яичники были увеличены почти вдвое, твердоватой консистенции, их поверхность ровная.. У телок других групп, которым вводили сурфагон общей дозой 400* ч 800 мкг, яичники не увеличились, только незначительно-изменилась их форма.

Было установлено воздействие высокой дозы сурфагона; ча выброс ЛГ. (график 4). Через 2 часа после введения сур-

иг/мл

2001

\

О

. ч

Время после инъекции эстрофана {часы)

Графяк 4.

100 мкг 75 мкг

50 мкг 25 мкг

1У

•фагона дозой 100 мкг уровень ЛГ в крови достигал в среднем 200,7 нг/мл (базальный уровень ЛГ перед введением сурфагона был 14,15 нг/мл). В дальнейшем уровень ЛГ в ■крови, взятой через 4 и 6 часов после введения сурфагона, уменьшился и составил 79,96 и 38,6 нг/мл соответственно. . Через 12 часов тем же самим животным было введено '75 мкг сурфагона, но повышение уровня ЛГ в крови, взятой через 2 часа после введения сурфагона было незначительное й составляло 14,67 нг (базальный уровень— 13,6 нг), 'Также незначительной была разница между уровнем ЛГ в крови, взятой через 4 и 6 часов после введения сурфагона,

4. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ОПТИМАЛЬНОГО МЕСТА И КРАТНОСТИ ВВЕДЕНИЯ СЕМЕНИ У КОРОВ-ДОНОРОВ ПРИ СУПЕРОВУЛЯЦИИ

Нашими опытами установлено, что оптимальным местом введения семени можно считать тело матки. При введении семени в тело матки на глубину 1—1,5 см оплодот-воряемость яйцеклеток былана 7,3% выше, чем при. введении в кранильную часть шейки матки,- Также с коров, •осемененных в тело матки, пплучено на 15,4% больше качественных эмбрионов (табл. 7).

Таблица 7. Общий результат оплодотворяемое™ яйцеклеток в зависимости от места введения семеян

Место введения семени

Показатель. тело шейка.

матки матки

Число животньцг : Всего извлечено эмбрионов В том числе: Т9 112 : сз 1(74

нормальных, ч/% 70 62,5 82 47,1 г

А сгенерированных, ч/% 36 32,1 70' 40,2

неоплодотворенных яйцеклеток, ч/% 6 , 5,4 22 12,6

Среднее число зародышей на донора ' Среднее число пригодных для трансплантации зародышей на донора Вымыто эмбрионов от числа овуляций, % ■Оплодотворяемоеть яйцеклеток. % 5,8±1,00 3,6 ±0,78 52,7 94,7 7,5±1,05 3,5±0,82 61,347,4 ■

ив

Неодновременная овуляция фолликулов при гормональной обработке коров-доноров требует многократного их осеменения. Проведенные нами опыты по осеменению коров-доноров показали, что оптимальным можно считать трехкратное осеменение в тело матки с 12-часовыми интервалами, первый раз осеменяя через 12 ч с начала охоты. При этом оплодотворяемость яйцеклеток достигала 94,4%, и вымыто достаточно высокое •число нормальных эмбрионов (67,3%) (табл. 8).

Таблица 8. Сравнительные результаты оплодотворяемости яйцеклеток при двухкратном н трехкратном осеменении,

Кратность введения семени

Показатель - 3-кратное с интервала-мн 12 ч (контрольная группа) 2-кратное с интервалом 12 ч (I опыт- мая группа) 2-крат-но«: с( интервалом 24 ч (II опытная группа) 2-кратное (сур-фагон) с интервалом 12ч [III опытная группа)

Число животных 10 10 11

Всего навлечено эмбрионов 52 60 ' 57 70

5 том числе; *

нормальных, ч/% 35 35 28 67

67,3 58,3 49,1 81,4'

дегенерированных, ч/% 14 22 20 10

26,9 35,1 14,3"

неоплодотворенных . яйцекле- 3 3 8 3

ток, ч/% 5,8 5,0 14,0 4,3

Среднее чне,- о зародышей на до- 3.5±0,82 6,6^1,93 5,1±0,6Э 6,3 ± 1,27"

нора

Среднее число пригодных для

трансплантации зародышей на дет-

вора 3,5±0,83 3.8±1.43 2,5 ±0,62 5,1 ±1,02

вымьгто эмбргтонов от числа ову-

ляций, % 46,4 60,0 47,8 50,0

Оплодотворяемость яйцеклеток, \ 94,3 95,0 ее,о , 95,7

Высокая- оплодотворяемость (95,0%) получена и при "двухкратном осеменении, но число пригодных для трансплантации эмбрионов было на 10% меньше, чем при трехкратном осеменении.

.5. ПРИМЕНЕНИЕ ПРОСТАГЛАНДИНОВ ДЛЯ СИНХРОНИЗАЦИИ ОХОТЫ У ТЕЛОК-РЕЦИПИЕНТОВ. ВЛИЯНИЕ РАЗЛИЧНЫХ ФАКТОРОВ НА ПРИЖИВЛЯЕМОСТЪ ЭМБРИОНОВ

В опыте исследовали влияние синхронизации охоты простагландинами на результаты приживляемости пересаженных. эмбрионов. Для- синхронизация охоты телок-реципиентов использованы простагландины эстрофан (СПОФА, ЧССР)-и анипрост («Витамины», СССР).

Установлено, что нет существенной разницы между уровнем стельности у телок-реципиентов со спонтанной и синхронизированной простагландинами охотой. Стельность реципиентов со спонтанной охотой составила 51,9%, синхронизированных эстрофаном — 53,3 и анипростом — 53,3%.

Не выявлено существенной разницы и между прижив-ляемостью эмбрионов у телок-реципиентов с хорошим; и (среднеразвитым желтым телом. (58,6 и 56,9%). Значительно ниже (31,5%).стельность была у телок с плохо развитым •желтым телом. •

При исследовании крови у телок-рецйпиентов (на 7 день полового цикла) достоверной' связи между уровнем прогрес-терона и приживляемостыо эмбрионов не обнаружено (табл. 9). В крови стельных телок в это время количество проге-.стерона составило 4,2 нг/мл,. а у нестельных— 3,9 иг/мл.

Та С л и ц з 9. Уровень гормонов в крови у телок-реципиентов на 7 день полового цикла

Показатель

Число животных

Прогестерон, нг/мл

Эстрадно т, пг/мл

-Стельные Нестельные

23 15

4,2 ±0,30 3.9 ±0,34

14,1± 2,7-4 11н3±2,23

Также не обнаружено значительной разницы в уровне прогестерона в крови телок с хорошо и средневыраженным желтым телом (4,0 и 3,9 нг/мл) (Р<0,1).;

Установлена зависимость приживляемости эмбрионов от стадии их развития. При пересадке реципиентам поздних морул и ранних бластоцист приживляемость составила 66,7 и 64,7%. Пересаженные эмбрионы более ранней или более поздней стадии приживлялись хуже, особенно ранние мо-рулы (45,5%) и поздние бластоцисты (43,5%) (табл. 10).

Г20

Таблица 10 Приживляемость эмбрионов в -зависимости < от стадии их развития

Стадия развития эмбрионов

Показатель М< М,/ Мш Бл/ БЛ1/ bau г

Число животных Из них стельных Стельность, %

И 35 5 19 45,5 54/3

15 10

60,7

17 И

64,7

51 23 30 10 58,в . 43,5

Получены данные о приживляемости пересаженных эмбрионов в зависимости от их качества (табл. И). Для опыта

Таблица Iii, Приживляемость эмбрионов в зависимости от их качества'

Качество эмбрионов

Показатель отличное хорошее среднее

4+ 0 + 2+

Чис животных Из них стельные Стельность, %

25 16

ъ4,0

40 25 62,5

28 15 63,6

использованы эмбрионы отличного, хорошего и среднего качества. Наилучший результат получен при пересадке эмбрионов отличного качества и составил 64,0% приживляемости. Почти такой же процент приживляемости получен и при пересадке эмбрионов хорошего качества (62,5%). _ Была изучена приживляемость двух эмбрионов одинакового и различного качества, пересаженных в один рог матки. Наилучшая приживляемость эмбрионов — 63,2% была у телок, которым пересажены эмбрионы хорошего качества (табл. 12). У животных И Ii III группы приживляемость эмб-

Таблица 12. Приживляемость эмбрионов-различного; качества, - ~ _пересаженных по два. в один рог матки

Показатель 2 эмбриона хорошего качества (I группа) Эмбрион хорошего качества и условно пригодный (11 группа) Эмбрион хорошего качества и дегенернро в анный <Ц1 группа)

Число животных 19 23 20

Число стельных ' . 12 12 10

Стельность, % 63,2 52,2 50.0

«з них родилось двоен 2 3 1

% двойневости 23,0 25,0 10.0

Абортировало 1 _ _

% абортов от стельных: 8.3 — ■ —

рионоа была меньше и достигала 52,2 и 50,0% соответственно.

6. ВЫВОДЫ

1. Фоллитропин по фолликул остимулирующему действию' и выходу пригодных для трансплантации эмбрионов не ус- . тупает зарубежным препаратам ФСГ-П" (США) и фоллигону (Голландия).

2. Включение в общую схему гормональной обработки' сурфагона в дозе 25 мкг через 48 ч после введения проста-гландпна дает возможность "увеличить число эмбрионов с одинаковой стадией развития: в сочетании с ФСГ-П — па 4,1%, с фоллитротошом — на 6,6% и с фоллигоном — на 28,4%. Препарат сурфагон увеличивает выход нормальных: эмбрионов при его применении с ФСГ-П на 10,3%, с фол-литропином— на 30,1% и с фоллигоном—на 2,7%.

■ 3. Введение сурфагона в дозах 2400, 800, 500, 400 мкг половозрелым телкам по 4-дневной схеме (аналогично ФСГ) не вызывает роста фолликулов в яичниках. ■

4. Введение сурфагона в дозе 25 мкг через 48 ч после введения эстрофаиа. продлевает натуральную предовуля-торную волну ЛГ на 1—2 часа.

5. Выход нормальных эмбрионов'выше у коров-доноров, предовуляторный пик ЛГ в крови которых во время охотьг был в пределах от 20 до 50 нг/мл. При наличии слишком высокого или низкого уровня ЛГ выход качественных эмбрионов уменьшается.

6. Уровень прогестерона на 9—11 день полового цикла в крови коров-доноров с хорошей, средней и плохой супе-ровуляторной реакцией яичников существенно не различался. Уровень прогестерона в крови животного перед гормональной обработкой может служить только дополнительным критерием для отбора коров-доноров.

7. Осеменение коров-доноров трехкратно в тело матки ' с интервалами 12 ч, первый раз осеменяя через 12 ч с начала охоты, обеспечивает высокий процент (94,3%) опло-дотворяемости и выхода качественных. эмбрионов (70,2%).

При использовании сурфагона в начале охоты достаточно осеменять двухкратно с интервалом 12 ч, первый раз осеменяя через 12 ч с начала охоты.

8. Нет существенной разницы между1 уровнем стельности у телок-реципиентов со спонтанной и синхронизированной простагландииами охотой. г

9. Простагландин анипрост не уступает зарубежному аналогу ПГФ2а— эстрофану (ЧССР) по лютеолитическому действию и по эффективности синхронизации охот у телок-реципиентов и не оказывает отрицательного влияния на приживля емость эмбрионов.

7. ПРЕДЛОЖЕНИЯ ПРОИЗВОДСТВУ

1. Для повышения выхода нормальных зародышей и синхронизации овуляции- у коров-доноров следует в начале охоты (через 48 ч после введения простагландина) применять сурфагон в дозе 25 мкг.

2. Коров-доноров следует осеменять трижды в тело матки с интервалами 12 ч, первый раз осеменяя через 12 ч с начала охоты. При использовании сурфагона коров-доноров осеменить двухкратно в тело матки через те же интервалы.

3. Для синхронизации охоты у коров-доноров и телок-реципиентов следует применять анипрост в дозе 500 мкг.

По теме диссертация опубликовано в научных работ:

1. Эффективное использование эмбрионов среднего качества н усовершенствование морфологического метода их оценки//Гезисы докладов симпозиума «Трансплантация эмбрионов у крупного рогатого скота».— Тарту, 19Ё6.— С. 22 <в соавт,),

2. Экспериментальное обоснование применения в животноводстве упрощенного способа разделения эмбрионов//Тезисы док Ьдов Всесоюзной научно-технической конференции по применению биотехнологии в животноводстве, растениеводстве н ветеринарной медицине.—М., 1988.—С. 6 (в соавт.).

3. Применение метода клеточной хирургии в практике//Тезисы докладов Республиканской конференции «Состояние н перспективы развития генетики И селекции в Литве»,— Вильнюс, 1989.— С. 41 (в соавт.).

4. Осеменение коров-доноров при трансплантации эмбрионов//Тезисы докладов Республиканской конференции «Состояние и перспективы развития генетики н селекции в Литве». —Вильнюс, 1989. — С. 51—52 (в соавт.).

5. Применение Гн-РГ для синхронизации овуляции у коров-доноров// Тезисы докладов конференции «Вк*ад молодых ученых а специалистов при интенсификация животноводства в республике».—Байсогала,— 1988.— С, 23.

6. Разработка программы для ЭВМ по селекции коров-доноров н тран* сплантации эмбрионов//Тезисы докладов конференции «Научно-исследовательская работа молодых ученых в животноводстве».—Байсогала,— 1989.— 12—14 с.

Подписано к печати 12.02.1991 г. Формат 60X84. 13 п. л. Тираж. 100 экз. Отпечатано в типографии «Райде» г. Каунас, ул. Спаустувининку 11,

Заказ № 20027