Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Управление ростом и метаболической активностью иммобилизованных клеток микроорганизмов

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Управление ростом и метаболической активностью иммобилизованных клеток микроорганизмов"

Р Г Б Ой

- а май

НАЦИОНАЛЬНАЯ АКАДЕМИЯ НАУК РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ИНСТИТУТ МИКРОБИОЛОГИИ И ВИРУСОЛОГИИ

На правах рукописи

ЖУБАНОВА А ЖАР АХМЕТОВНА

УПРАВЛЕНИЕ РОСТОМ И МЕТАБОЛИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТЬЮ ИММОБИЛИЗОВАННЫХ КЛЕТОК МИКРООРГАНИЗМОВ

03.00.07. - микробиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Алматы, 1995

Работа выполнена в Казахском Государственном Национальном Университете им. Аль-Фараби

Научный консультант: член-корреспондент HAH PK,

доктор биологических наук, профессор М.Х. ШИГАЕВА

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

Доктор биологических наук

М.Г. САУБЕНОВА

Доктор медицинских наук

Л.И. КАЛАМКАРОВА

Чл.-корр. HAH PK, доктор химических наук К.Ж. ПРАЛИЕВ ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ: Казахский научно-исследовательский

Защита диссертации состоится 19 мая 1995г. в 14 часов на заседании специализированного совета K.008.0I.01 по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора биологических наук при Институте микробиологии и вирусологии HAH PK по адресу: 480100, Алматы, ул. Богенбай - батыра, 103.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института микробиологии и вирусологии HAH PK.

Автореферат разослан "_" апреля 1995 г.

Ученый секретарь специализированного совета,

институт пищевой промышленности

доктор биологических наук

Н.А.Айтхожина

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы. Разработка новых биотехнологий для получения ценных химических веществ, продуктов питания, биотоплива и др. требует поиска реальных путей увеличения роста и бпосинтетическоп активности микроорганизмов. В связи с этим, актуальной является проблема управления ростом и житнргтротель'юстис микроорганизмов с целые получения популяции с определенными заданными свойствами. Решение её, в значительной мере, связано с использованием природных и синтетических модификаторов роста, среди которых достаточно высокой эффективностью отличаются вещества растительного происхождения или полусинтетические препараты на их основе (Шигаева и др., 1986). Анализ имеющихся сведений показывает, что большинство из них обладают свойствами поверхностно-активных веществ, биологически активны и могут быть использованы в качестве стимуляторов и ингибиторов роста микроорганизмов. Так как биологическое действие растительных препаратов тесно связано с их структурой, для выявления соединении, высокоэффективных в отношении управления ростом микроорганизмов, необходимо проведение комплексных исследовании, включающих изучение состава, структуры и механизма действия вещества при определенных параметрах внешней среды.

Практическое использование таких разработок зависит от наличия способов, позволяющих сохранять полученный эффект. По имеющимся данным, наиболее приемлимым путем стабилизации, а в ряде случаев, и активизации метаболической активности клеток микроорганизмов является иммобилизация их включением в гранулы полисахаридных гелей и сорбцией на различных носителях(Кощеенко, Суходольская, 19S7; Mozes, et al, I9S7; Tramper, 1990). Цель к задачи исследования.

Цель данной работы - разработка комплексных подходов управления ростом и метаболической активностью микроорганизмов, использующихся для получения этанола, молочной кислоты и ферментированных напитков.

Для достижения указанной цели были поставлены следующие задачи:

- Отбор стимуляторов роста микроорганизмов среди новых химических препаратов растительного происхождения.

- Изучение механизма стимулирующего действия нового препарата-салицилината сахарозы (СЭС) , включающее выявление его действия на метаболизм, восстановительную способность и поверхностные свойства клеток в динамике роста в условиях периодического культивирования и в "острых" опытах.

- Сравнительное изучение влияния иммобилизации дрожжевых и .бактериальных клеток включением в матрицу природных и синтетических гелей и сорбцией на различных носителях на метаболическую активность клеток в условиях работы биореактора периодического и непрерывного действия.

- Повышение сорбционной активности носителей и интенсивности метаболизма иммобилизованных клеток микроорганизмов модифицированием адсорбционных свойств носителей.

- Изучение влияния ростстимулирующего препарата СЭС на иммобилизованные клетки микроорганизмов.

Разработка способов получения этанола и молочной кислоты иммобилизованными клетками лактозосбраживающих дрожжей и молочнокислых бактерий на основе молочной сыворотки.

- Получение десертных напитков при помощи одновременного и последовательного сбраживания молочной сыворотки иммобилизованными клетками дрожжей и молочнокислых бактерий.

Научная новизна.

Проведен отбор стимуляторов роста среди 37 новых полусинтетических препаратов на основе природных соединений, относящихся к классу природных кислот или их производных.

Установлено, что наиболее эффективным стимулятором роста является салицилинат сахарозы(СЭС), обладающий свойствами неионного ПАВ. !

Для изучения механизма действия препарата впервые проведено определение восстановительной способности и электрофоретической подвижности клеток дрожжей в динамике роста популяции в условиях

стимуляции. Выявлено, что местом приложения действия препарата является клеточная поверхность.

Показано, что дрожжевые клетки, иммобилизованные включением в матрицу природных и синтетических гелей и сорбцией на различных носителях, представляют собой высокоэффективный биокатализатор пролонгированного действия.

Выявлено модифицирующее влияние, микробных ПАВ на сорбционные сппйст??. носителей а клеток.

Установлено, чю комплексный подход, включающий иммобилизацию микробных клеток, оптимизацию условий культивирования и использование модификаторов роста позволяет значительно увеличить эффективность бродильных процессов и выход конечных продуктов метаболизма. Практическая значимость.

Для определения механизма действия химических соединений, используемых в качестве стимуляторов и ингибиторов, рекомендуется изучение восстановительной способности и электрофоретическон подвижности клеток микроорганизмов - параметров отражающих свойства клеточной поверхности.

Иммобилизация клеток дрожжей и молочнокислых бактерий включением в матрицу полисахаридных гелей и сорбцией на нативных и модифицированных носителях повышает их бродильную активность и создает основу дчя получения новых типов биокатализаторов.

Способы получения молочной кислоты и этанола ферментацией молочной сыворотки свободными и иммобилизованными клетками высокоактивных штаммов молочнокислых бактерий и лактозосбраживающих дрожжей рекомендуются для производств, в которых в качестве побочного продукта образуется молочная сыворотка.

Для сбраживания молочной сыворотки с целью получения напитков массового потребления и специализированного назначения рекомендуется использовать моно- и смешанные культуры дрожжей и молочнокислых бактерий в иммобилизованном состоянии.

Положения, выносимые на защиту:

1. Неспецифические стимуляторы и ингибиторы, местом приложения которых является лаг-фаза, вызывают изменение свойств поверхностных структур чувствительных клеток.

2. Иммобилизация клеток микроорганизмов повышает и стабилизирует их метаболическую активность.

3. Включение клеток микроорганизмов в гранулы природных гелей не препятствуют действию на них стимуляторов и ингибиторов роста. Апробация работы. Основные положения диссертации доложены на 111 всесоюзном биохимическом съезде (Рига, 1974), на 4 и 5-ой конференциях биохимиков Средней Азии и Казахстана(Ашхабад, 1986; Ташкент, 1991); 4-х всесоюзных конференциях ( "Биофизика микробных популяций", Красноярск, 1987; "Микробиологические процессы при промышленной переработке сельскохозяйственного сырья", Пущино, 1990; "Биотехнология и биофизика микробных популяций", Алматы, 1991; "Поверхностные силы", 1992), ежегодных научных конференциях КазГУ им.Аль-Фараби.

Публикации. Основные материалы диссертации опубликованы в 31 печатных работах. Получены положительные решения Патентного Ведомства РК на выдачу патентов по четырем заявкам. Структура и объем диссертационной работы. Работа изложена на 275 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания объектов и методов исследований, 7 глав, содержащих результаты экспериментов, заключения, выводов, списка цитированной литературы (335 источников) и приложения.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

В работе использовались следующие культуры: Дрожжи Тоги1орз1з кеГуг уаг. киппэ шт. 17 из коллекции кафедры микробиологии КазГУ им. Аль-Фараби. Культура выделена из кумыса (М.Х.Шигаева, М.Ш.Оспанова, 1983).

Производственные штаммы дрожжей БассЬагошусез сегеу1$1ае: гибрид 512 и Р 12, полученные из Госагропрома РК.

Молочнокислые бактерии: Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus 221, Lactobacillus delbrueckii subsp. lactis 21 и Lactococcus lactis 40 из коллекции кафедры микробиологии КазГУ им. Аль-Фараби.

Дрожжевые культуры поддерживали на скошенном сусло-агаре. Для экспериментов биомассу получали выращиваннем клеток дрожжей в колбах объёмом 750 мл, содержащих 200 мл сусла (8 ОБ}. при nH fi-7 ic.'.iiicpaTvpe 23 - 30"С в течение 24 - 4£ часпч. Молочнокисл!,:е бактерии хранили в пробирках, содержащих 10 мл гидролизованного молока. Для получения накопительной культуры молочнокислые бактерии переносили из пробирок в колбы объёмом 750 мл, содержащих 200 мл молочной сыворотки и культивировали их при температурах 28° С (лактококки) и 37°С(лактобациллы) в течение 24 часов.

В качестве питательных сред использовали солодовое сусло, полученное на пивзаводе г. Алматы, и творожную молочную сыворотку , полученную в детской кухне Советского района или на молочном комбинате г. Алматы. По физико-химическим показателям используемая в работе сыворотка соответствует требованиям ГОСТа (отраслевой стандарт - СТ 4992 - 75 "сыворотка молочная"). Стерилизацию сред проводили при 0,5 атм. в течение 30 минут.

Ростстимулирующее действие 37 новых полуенн готических препаратов на основе растительных соединений, полученных в лаборатории "Химии растений" ИХН IIAII РК и отнесенных к классам органических кислот, терпенов и стероидов, изучали на кул,.гурах Е. coli WP2 и St. aureus-209, типичных представителях грамотрицательных и грамположительных бактерий. Выявленные стимуляторы испытывались на производственном штамме S. cerevisiae гибрид 512. Микроорганизмы выращивали на полноценных питательных средах (МПА, МПБ, нсохмелсшюс солодовое сусло, сусло-агар).

Для иммобилизации микроорганизмов использовали методы включения клеток в синтетические и природные полимеры и сорбции на различных носителях.

Иммобилизацию микробных клеток в полиакриламидный гель (ПААГ) проводили по методу К.А.Кошеенко, Г.В.Суходольской (1988), в альгинатный гель - по методу D.Toth, et al (1989), в каррагинановый гель - по методу П.Марека (1988).

Для вычисления клеточной нагрузки на носителе определенное количество гранул растирали в ступке и суспендировали в 10 мл стерильной дистиллированной воды. Из этой .смеси готовили несколько разведений (10"5 - 10 ) и по 0,1 мл высевали на чашки Петри с твердой средой (сусло-агар). Через 24 - 48 часов роста при оптимальных

для каждой культуры температурах производили подсчет выросших колоний (Кощеенко, Скрябин, 1984).

Для определения "показателя жизнеспособности" (ПЖ) иммобилизованных клеток использовали метод микрокультурального анализа (Пуста, Фихте, ] 990). Для количественной оценки включения клеток в различные гели использовали метод определения количества белка в гранулах модифицированным методом Фримана ( Хансон, Филлипс, 1984). Изучение действия акриламида на дрожжевые клетки проводили методом Луста К.А. и Старостиной Н.Г. (1985).

Для иммобилизации клеток микроорганизмов методом сорбции использовали следующие носители: пенополиуретан (ППУ, ГОСТ 1473-71), полимерные волокна диаметром 1 мм и "вии" ( структура из синтетических нитей в форме ресниц, использующаяся в качестве сорбента в очистных системах).

В случае иммобилизации дрожжевых клеток адсорбцией или включением в матрицу различных гелей количество иммобилизованных клеток вычисляли по разнице в концентрации клеток в исходной суспензии и в смывах после промывания носителя (подсчет клеток проводили в камере Горяева или высевом суспензии на твердые среды и последующим подсчетом выросших колоний).

Сорбционную способность носителей' и клеток определяли методом Г.Н.Никовской, A.C. Гордиенко, Л.Н.Глоба (1986) в "острых" опытах. Для этого сорбцию микробных клеток на различных носителях проводили в 500 мл физиологического раствора в течение 24

часов встряхиванием микробной суспензии в концентрации 1,0 х 10'-4,0 хЮ^ клеток в 1 мл с определенным количеством носителя. Для определения времени завершения сорбции и установления сорбционного равновесия определяли оптическую плотность образцов, отобранных через равные промежутки времени (ФЭК-М, светофильтр N6, кювета - 10 мм). Концентрацию клеток рассчитывали по калибровочной кривой.

Удельнута сорЗцию микроорганизмов вычисляли по уравнению: а = (Со - Ср ) х 1000/т (кл/г) ял и а = (Со - Ср ) х ЮОО/тБ (кл/мм2), где: Со и Ср - исходная и равновесная концентрация клеток, найденные по калибровочной кривой (кл/мл), т - концентрация носителя (г/мл), Б - удельная поверхность носителя ( мм2/г)

Десорбцию изучали перенесением носителя с сорбированными клетками микроорганизмов в 500 мл стерильного физиологического раствора, последующим встряхиванием и измерением оптической плотности образцов этой суспензии через определенные промежутки времени в течение 1 часа.

Степень десорбции микроорганизмов расчитывали по уравнению:

д = Сд х 100/ (Со - Ср ) (%), где

Сд - количество (концентрация) десорбированных клеток.

Для оценки метаболической активности свободных и иммобилизованных клеток микроорганизмов определяли:

- концентрацию редуцирующих веществ в культуральной среде - орто-золуидиновым методом (ЧССР, биотест, Брегмейер, 1970) и методом Бертрана (Филиппович и др., 1982).

- концентрацию белков в культуральной среде - биуретовым методом, методом Лоури и модифицированным методом Фримшгд (Филиппович и др., 1982; Хансон, Филипс, 1.984).

- интенсивность дыхания - полярографичсски с помощью электрода Кларка (Виноградова и др., 1989),

- кислотность культуральной среды - по методу Тернера,

- концентрацию этанола в культуральной среде - методом Мартена (Егоров, 1976) и газохроматографически (Смайберт, Крит, 1984),

- концентрацию молочной кислоты в культуральной среде -колориметрически ( Атраментова и др., 1977) и газохроматографически (Смайберт, Криг, 1984),

- выделение и частичную очистку молочной кислоты проводили по методу Lockwood L.B. (1979).

Изучение ростстимулирующего действия препаратов проводили методом серийных разведений (Першин, 1971; Силин, 1985). Стимулирующий эффект оценивали нефелометрическим методом после культивирования дрожжей 48 часов при 28 - ЗО^С. Количество жизнеспособных клеток определяли методом высева на чашки Петри с агаризованной средой(Егоров, 1976).

Класс ПАВ определяли методом A.A. Абрамзона и др.(1988). Для выявления действия стимулятора и ингибитора роста на микробные клетки определяли следующие параметры:

величину окислительно-восстановительного потенциала (ОВП) среды регистрировали потенциометрическим методом с использованием измерительного платинового (ЭПВ-1) и вспомогательного хлорсеребряного (ЭВЛ-1МЗ) электродов. Милливольтметром служил рН-метр-340, на котором одновременно регистрировали величину pH с использованием стеклянного электрода (ЭСЛ-63).

- восстановительную способность клеток оценивали по скорости восстановления феррицианида калия - искусственного акцептора электронов, который не проникает в клетки, которую измеряли с помощью редокс-стата (Балмуханов и др., 1981).

- электрофоретнческую подвижность клеток измеряли методом микроэлектрофореза в постоянном электрическом поле (Духин, Дерягин, 1976) .

- Mg/АТФазную активность осадочной и надосадочной фракции, полученной при центрифугировании гомогената, полученного при озвучивании дрожжевой суспензии при помощи ультразвукового дезинтегратора ИД-11, при 15000об/мин. в течение 20 минут оценивали

по количеству неорганического фосфора, образовавшегося в результате ферментативного гидролиза АТФ (Иващенко, 1978).

Полученные результаты подвергались статистической обработке (Урбах, 1975; Плохинский, I97S).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

рргутгм»« рсста дри/кжсй новыми природными соединениями

Известно, что для микробного метаболизма характерна большая гибкость, т.е. в ответ на изменения в составе среды культивирования микроорганизмы способны изменять свой обмен. В связи с этим, открывается возможность для управления их ростом и метаболической активностью при помощи внешних факторов, в частности, препаратов, влияющих на рост микробных культур.

Несмотря на быстрое накопление данных о поведении микроорганизмов в условиях стимуляции и ингибиции, имеется большой пробел в изучении воздействия на них веществ, изменяющих клеточную поверхность.

Основу проведенных нами исследований некоторых механизмов управления ростом микроорганизмов составляет изучение действия 37 новых химических соединений, относящихся к классам органических кислот, терпенов и стероидов, на микробные клетки. Исследования проводились на культурах Escherichia coli WP2 и Staphylococcus aurcus-209. Соединения вносили в питательную среду в дозах 0,01-150 мкг/мл одновременно с посевной суспензией. Действие препаратов оценивали нефелометрически и по увеличению количества жизнеспособных клеток.

При изучении антимикробного действия новых химических соединений выявлен ряд препаратов с минимальной подавляющей дозой (МПК) 10-150 мкг/мл. Установлено, что наибольшей активностью и широким спектром действия обладают фтористые производные соласодииа, причем, по мере увеличения числа атомов фтора в молекуле препарата, его активность повышается. Нами для

использования в качестве ингибитора роста отобран трифторацетат соласодина, оказывающий на клетки дрожжей Saccharomyces cerevisiae 512 бактериостатический эффект в дозе 40 мкг/мл.

Стимулирующий эффект соединений проявлялся в различной степени в зависимости от химической структуры и концентрации препарата и вида культуры микроорганизмов. Выявлено 11 соединений, стимулирующих рост бактериальных культур в дозах 0,5-3 мкг/мл и показано, что они проявляют свойства ПАВ.Согласно полученным данным, большое влияние на уровень стимуляции оказывает природа заместителей. Так, сравнение ростстимулирующего действия салициловой кислоты, её натриевой соли и сложного эфира этой кислоты - салицилината сахарозы показало, что наиболее выраженный эффект на обеих культурах отмечается при внесении в среду эфира салициловой кислоты и сахарозы (СЭС), т.е. введение в молекулу салициловой кислоты углеводного остатка приводит к усилению ростстимулирующей активности препарата.

Испытание активных препаратов на производственном штамме Saccharomyces cerevisiae 512 показало, что СЭС и в этом случае более эффективен, в дозе 10 мкг/мл он стимулирует рост дрожжей на 50,5 %.

Нами изучалось влияние препарата СЭС на рост клеток дрожжей S. cerevisiae гибрид 512 в условиях периодического культивирования на ячменном сусле и в "острых" опытах.Выявлено, что стимулирующий эффект СЭС проявляется в сокращении длительности лаг-фазы и опережении развития культуры в последующие сроки (рис.1). Математическая обработка полученных данных, позволяет констатировать, что инкубация клеток S. cerevisiae 512 в среде, содержащей 10 мкг/мл СЭС, укорачивает время генерации клеток и повышает удельную скорость роста в логарифмической фазе(табл.1). При описаини периода лаг-фазы различают две ее формы -инокулятзавпсимую и инокулятнезависнмую. В наших экспериментах посевная суспензия содержала одинаковое количество жизнеспособных клеток в контрольных и опытных вариантах, поэтому мы имели дело с инокулятнезавнсимой лаг-фазой, природа которой не совсем ясна. Во многих работах описывается период, протекающий непосредственно

/V "V*

Рис. i. Juna^um росла лопу/глции клеток £. ceïevULae ¿uopuà £¿2. / - KO H/про/lh ■

<2-ê npuaymamêvu СЭС Uû •

3-S лрисутстёии TÇ>JC (40 .

после посева культуры на новую среду, во время которого наблюдается фиксируемый прирост биомассы за счет увеличения размеров клеток, а не их деления (Коротяев, 1973). Инициация процессов клеточной репродукции, связанная с репликацией хромосом и сопряженная с увеличением количества клеточного белка, и переход клеток к активному размножению предполагает существование точки старта,

Таблица!

Влияние СЭС на показатели роста популяции клеток S. cerevisiae гибрид 512

Варианты И (Ч ) V g ( ч )

Контроль 0,330 0,475 2,10

СЭС 0,374 0,540 1,85

Стимуляция в °/о 13,3 13,7 12,0

Примечание: ц - удельная скорость роста,

V - константа скорости деления, g - время генерации

называемой критической, прохождение которой предопределяет все дальнейшие события в жизни клетки. Поэтому результатом действия химических соединений, способных выполнять роль ростовых стартеров является сокращение длительности лаг-фазы (Lord, Wheale, 1980; Ameyama, et al, 1984).

Что касается причины сокращения длительности лаг-фазы при росте клеток в присутствии СЭС, то они, скорее всего связаны с влиянием этого соединения на проницаемость и функционирование

клеточных мембран, которым принадлежит важная роль в адаптационных реакциях, позволяющих клеткам быстро перестраивать свои метаболизм в ответ на изменяющиеся условия внешней среды (Афанасьев, 1988; Несмеянова, 1985; Землянухин и др., 1981; Несмеянова и др., 1976; Евдокимова и др., 1977; Михалева, 1983).

И, действительно, наблюдаемое нами сокращение длительности лаг-фазы при росте дрожжевых клеток в присутствии стимулятор я роста сопровождается закисяенисм среды культивирован!«», увеличением интенсивности дыхания в период лаг-фазы и повышением скорости потребления углеводов дрожжевыми клетками на всем протяжении эксперимента. Скорость поглощения кислорода клетками дрожжей впоследствии заметно снижается и, как и следовало ожидать, повышается скорость этанолообразования. Так, в конце 2-х суток концентрация этанола в среде при росте микроорганизмов в присутствии СЭС составляет 154 % от контроля. ТФАС в этих условиях вызывает задержку роста популяции и ингпбирует все катаболические процессы, протекающие в клетках дрожжей. Корреляционный анализ результатов, проведенный с помощью ЭВМ "Искра-1256, показал, что все изученные нами показатели тесно взаимосвязаны. Высокая степень корреляции (0,82 - 0.9S9) еще раз указывает на взаимообусловленность процессов роста и метаболизма.

Как известно, в аэробных и анаэробных процессах центральное место занимают сопряженные реакции образования и использования АТФ (Atkinson, 1977). Синтез АТФ осуществляет белковая структура, называемая FoFl/АТФазной или АТФ-синтазой, которая в дрожжевых клетках локализована на внутренней мембране митохондрий (Фридрих, 1986, Ryric, 1975, Rehenwald, Hess, 1977). Поскольку влияние салицилината сахарозы и трифторацетата соласодина на дыхание дрожжевых клеток может быть связано с торможением или активацией АТФ-сннтазной активности, нами изучено действие растительных ПАВ на этот' параметр. Поскольку в митохондриях практически весь аденозинтрифосфат связан с ионами Mg++ (Хочачка и др., 1988), нами определялась Mg/АТФазная активность дрожжей.

Выявлено, что ТФАС в концентрации 10-4 М (40 мкг/мл) подавляет активность Mg/АТФазы осадочной фракции гомогената клеток на 21,3%, растворимой - на 16,1% (табл.3). Стимулятор роста СЭС в концентрациях 1 х 10-5 и 2 х 10"5 М (5-10 мкг/мл) не оказывает влияния на Mg/АТФазную активность дрожжевых клеток.

Поскольку pH, концентрация кислорода и других компонентов, участвующих- в окислительно-восстановительных процессах, отражаются на значениях ОВП среды, а, с другой стороны, ОВП определяет потенциальные возможности культуры, нами для оценки влияния препаратов проводилась потенциометрическая регистрация ОВП среды в процессе культивирования клеток дрожжей S.cerevisiae 512 в условиях стимуляции и ингибиции роста.

Известно, что по мере роста микробных культур ОВП среды смещается в сторону отрицательных значений. В наших экспериментах величина ОВП достигала минимальных значений через 10 часов культивирования (рис.2). Внесение в среду салицилината сахарозы сопровождается более интенсивным снижением величины ОВП, а трифторацетата соласодина - очень медленным, т.е. характер изменений ОВП среды отражает интенсивность развития популяции.

Поскольку сдвиги ОВП обусловлены метаболическими процессами, происходящими в клетках микроорганизмов, Б.С.Балмуханов и др. (1980,1981) непосредственной причиной этих сдвигов считают транспорт восстановительных эквивалентов через клеточную поверхность. Нами при помощи модели, предложенной B.S. Balniukhanov. et al (1981) для установления характера и механизма обмена клеток с окружающей средой восстановительными эквивалентами, изучена восстановительная способность дрожжевых клеток в условиях стимуляции и ингибирования их роста. Критерием служила скорость восстановления микробными клетками феррпцианида калия (СВФК) - искусственного акцептора

электронов, гидрофильные анноны которого не проникают через клеточную мембрану и характеризуются высокой скоростью установления равновесия на платиновой поверхности (Clark, et al, 1981; Ellen, Key, 1983).

û&n СMb)

aro.-

jdû

О

i"

SO

JÍS

¿o

¿If 4ÖC

Рис. 2.. изменение ¿J&f) среды S проце^ие рас/ъа. кульгг>уры S,. ceiavLsiüe. zuôpud 5~12 d - контроль ;

¿-S npuci/mcmSüU ¿ЭС (¿Ом*г/мл); 3- S присутствии ТФАС. (№м*г/км).

Согласно полученным данным, после 2-х часового культивирования скорость восстановления феррицианида калия дрожжевыми клетками достигает максимального значения (рис.3). При росте клеток в присутствии СЭС наблюдается стремительное увеличение СВФК н уже через 30 минут величина этого параметра достигает максимальных величин. Впоследствии, СВФК быстро уменьшается, но, как и в контроле, минимальное значение этого параметра наблюдается через 10 часов роста культуры. Результаты измерения СВФК клетками дрожжей при их росте в присутствии стимулятора подтверждают наши предположения о том, что местом приложения действия СЭС является лаг-фаза. При внесении в среду ТФАС время, необходимое для достижения максимального значения СВФК увеличивается до 8-10 часов, а минимального - до 24 часов. Очевидно, ингибитор ТФАС нарушает функционирование клеточных систем, связанных с транспортом восстановительных эквивалентов и смещением ОВП среды. Сходство характера изменений ОВП и СВФК в процессе периодического культивирования дрожжевых клеток позволяет считать, что ОВП среды формируется за счет транспорта в нее восстановительных эквивалентов (Лукьянова и др., 1982).

Таким образом, согласно полученным результатам, характер влияния испытуемых соединений на рост клеток дрожжей коррелирует с изменениями окислительно-восстановительных условий в ранние сроки культивирования. Поэтому можно предположить, что действие этих препаратов на рост обусловлено влиянием на редокс-системы плазматических систем мембран микроорганизмов и сопряжено с активным транспортом питательного и энергетического субстратов.

Известно, что поверхность клеток микроорганизмов сложна по составу и архитектуре и может перестраиваться в процессе жизнедеятельности (Свенсон, 1980; Гузев, Звягинцев, 1979). Отдельные молекулы и их комплексы могут перемещаться вдоль поверхности клеток. Кроме того, перераспределение ионов как вокруг, так и внутри клеток происходит в результате пассивного и активного транспорта ионов и молекул через клеточную поверхность (Котык, Яначек, 1980; Poo Muting, 1981). Степень диссоциации различных ионогенных групп,

Рис. 5. Скорость ¿occnaHoß/iä-Httfl ipeppu цианида пял и я S динамике роста илгток -S. <i&tevLs>Lae zuSpuâ У - кон/гра/1ь ;

2-S npuât/mcmSuu СЗС. Шм*1/м*);

3- ê npuùymcmSuu ТФАС С 40 Мкг/„Л).

локализующихся на . клеточной поверхности, определяется нескомпенсированными зарядами, находящимися в плоскости скольжения в данный период жизнедеятельности клетки. При конкретных значениях рН и ионной силы среды культивирования она обуславливает сдвиги в электрофоретической подвижности (ЭФП) клеток (Мирошников, 1986; Фомченков и др., 1986).

Исходя из предположения, что наблюдаемые изменения окислительно-восстановительного потенциала среды и скорости транспорта восстановительных эквивалентов дрожжевыми клетками при их росте в присутствии СЭС и ТФАС, могут быть связаны с влиянием препаратов не только на физиологическое состояние микроорганизмов, но и на структуру клеточной поверхности, нами проведено изучение электрофоретической подвижности клеток при их. росте в условиях стимуляции и ингибирования в периодической культуре и в "острых" опытах. Измерения, проведенные при фиксированных значениях рН и ионной силы, показали, что, если в контроле наблюдается быстрое увеличение ЭФП в течение лаг-фазы от 0,39 до 1,38 м^/В-с с последующим снижением, то внесение СЭС в среду приводит к повышению ЭФП изначально (0,56 м^/В-с). Через 1 час величина этого параметра достигает 1,5 м2/В-с и впоследствии изменяется синхронно с контрольным вариантом, оставаясь при этом выше на протяжении всего эксперимента (рис. 4). Изменения электрокннетических свойств дрожжевых клеток при их росте в присутствии СЭС свидетельствуют о том, что использованный нами препарат изменяет ионный состав клеточной поверхности, причем, именно действие в первые часы роста определяет стимулирующий эффект препарата. Можно предположить, что события, происходящие в структуре клеточной поверхности и на границе раздела фаз, способствуют увеличению доступа питательных веществ к клеткам и потому отражаются на физиологических свойствах всей популяции.

Действие трифторацетата соласодина в бактериостатической дозе на дрожжевые клетки проявляется в снижении заряда клетки на всем протяжении эксперимента. В "острых" опытах показано, что трифторацетат соласодина резко снижает ЭФП клеток из

у

S

I

I

<м

!? 4j 4 ij

\ Ol ^^сз'чэ ^

& ^ ... !

^ ^ N-) -ij.

стационарной фазы, а в ранних стадиях развития культуры наблюдается даже перезарядка клеток.

Известно, что в нейтральных средах поверхность микроорганизмов несет суммарный отрицательный заряд (Borst-Pauwels, 1981). Ионогенные ПАВ, диссоциирующие в растворе, могут повышать или понижать отрицательный заряд клетки. Для сравнительного анализа действия ТФАС на микробную клетку нами был использован известный катионный ПАВ - цетиламмоний бромид (ЦГАБ) в бактериостатической дозе I0"4 М. Выявлено, что ЦТАБ оказывает на ЭФП дрожжевых клеток такой же эффект, как и ТФАС, имеющаяся разница касается только абсолютных величин измеряемого параметра. Проведя аналогию в механизмах действия ТФАС и ЦТАБ, можно предполагать, что снижение ЭФП клеток S. cerevisiae в ответ на внесение ТФАС свидетельствует о том, что данный препарат в растворах электролита диссоциирует с образованием поверхностно-активного катиона, который, адсорбируясь на отрицательно заряженной поверхности клеток, снижает величину заряда.

Таким образом, изменения электрофоретической подвижности дрожжевых клеток в условиях стимуляции и подавления роста полусинтетическими препаратами на основе растительных ПАВ отражают влияние СЭС и ТФАС на динамику роста популяций.

В связи с расширением задач биотехнологии по получению различных продуктов микробного синтеза поиск веществ, влияющих на рост и биосинтетическую активность различных микроорганизмов приобретает все большее значение. Нами изучена возможность использования стимулятора роста СЭС для модификации роста других групп микроорганизмов, в частности, молочнокислых бактерий. Согласно полученным данным, препарат СЭС увеличивает накопление биомассы Lactococcus lactis 40 в 2,7 раза, а при внесении его в среду вместе с дрожжевым автолнзатом - в 3 (рис.5).

¿0 /о

У6

¿0

8 6 Ь 2

а

Зоомасса (г/л)

2

5

£ сутки

Л2. 5.

¿и.чймияа измгнг/шя оиомассь! и-лето,-Lactoc.Dcc.us, лри их рас/па

Нй молочной С.ы£оротке:

М - контроль ;

¿-рост оиомаасы 6 лриед^а/лбиц

дро.юка^Ьго а&толизй/ъа 2- /по та £> приадтатбии стимулятора

сэс.'

то ме 8 присутствии дрожжеЗогд йЗтолизата и .•

Использование иммобилизации для регуляции роста и метаболической активности микробных клеток

Для практического использования результатов экспериментов по управляемому культивированию необходимы способы стабилизации и длительного сохранения полученного эффекта. В этом аспекте представляет интерес методический прием, который в течение последних 10 лет широко изучается и уже успешно применяется в ряде биотехнологических производств, - иммобилизация клеток микроорганизмов. Если в первых публикациях внимание исследователей уделялось иммобилизации, как способу стабилизации ферментативной активности, то в настоящее время подчеркивается, что в ряде случаев иммобилизация позволяет регулировать и усиливать многие полезные свойства микроорганизмов (Шеховцева и др., i 992).При этом, воздействие иммобилизации на клеточный метаболизм в большой степени зависит от условий среды, свойств поверхности и видовой специфичности микроорганизма ( Loosdrecht, 1988; Marshall, 1976).

В настоящее время чаще всего используются 2 метода иммобилизации - включение клеток в матрицу гелей и адсорбция их на поверхности различных носителей. Набор использующихся носителей чрезвычайно широк. Кроме того, используя различные методы и приемы, получают модификации известных носителей с желаемыми свойствами.Например, при иммобилизации в гели для упрочнения связи носитель-клетка в систему при помощи бифункциональных агентов вводят дополнительные связи. При адсорбционной иммобилизации для образования координационных связей между носителем и клетками вводятся атомы переходных металлов и т.д.(ИГтильман, 1987).

Нами изучена физиологическая активность клеток дрожжей Torulopsis kefyr var. kumis T17, иммобилизованных включением в полиакриламидный, альгинатный и каррагинановый гели и сорбцией на полимерных носителях.

Эксперименты ставились следующим образом:

Клетки дрожжей Т. kefyr var. kumis, выращенные на молочной сыворотке, промывали 2-3 раза физиологическим раствором центрифугированием при 5000 об/мин. в течение 5 минут, определяли вес сырой биомассы и проводили иммобилизацию клеток.

Взвешенное количество гранул (или 100 штук), содержащих дрожжевые клетки, помещали в 100 мл стерильной моттпчнсм сыворотки и инкуб;;роь^1П в термостате при 30"С. в течение 2 - 5 суток, Пробтл из кулыуральнон среды отбирали через 6, 24 и 48, 72, 96 и 120 часов. Затем шарики геля отделяли от культуральной жидкости, промывали на фильтре стерильным физиологическим раствором и использовали для исследований.

Включение микробных клеток в матрицу геля можно считать успешным толькб в том случае, если при этом достигается достаточно высокая клеточная нагрузка на носителе и создаются условия для функционирования ферментативных систем клетки. Поэтому наши первые эксперименты были посвящены таким вопросам, как определение % включения микробных клеток в гелевую матрицу, показателя жизнеспособности (ПЖ) клеток и показателей роста клеток внутри гелевых частиц. Рост клеток в гранулах различных гелей оценивался по количественному приросту в них белка. Показатель жизнеспособности и прирост клеток в гранулах геля изучали после 4S-mii часового культивирования иммобилизованных дрожжевых клеток на молочной сыворотке. Полученные результаты представлены в табл.2.

Как видно из таблицы 2, прирост белка в гранулах полиакриламидного, Са-альгинатного и каррагннанового гелей составляет 17, 47 и 128 % соответственно. Но, следует учитывать тот факт, что прирост белка не всегда означает увеличение числа жизнеспособных клеток. Для характеристики свойств геля необходимы данные по физиологическому состоянию иммобилизованных клеток. Установлено,что включение в шарики гелей природных полисахаридов повышает интенсивность энергетических процессов в клетках дрожжей. Согласно полученным данным, и сами природные гели

(альгинат и каррагинан), и процедура включения в них не оказывают повреждающего влияния на клетки. Очень вяло ведут себя клетки, иммобилизованные в ПААГ. Это является результатом того, что процедура иммобилизации включает этап, в котором дрожжевые клетки контактируют с мономером - акрнламидом, оказывающим на них токсическое влияние.

Таблица 2

Процент включения дрожжевых клеток в различные гели, ПЖ клеток и содержание белка в гранулах после 48-ми часового культивирования

Показатели ПААГ Каррагинан Альгинат

% включения клеток в гель 89,1 ± 3,2 99,0 ± 3,6 95,0 ± 3,6

ПЖ клеток в % 35,0 ± 2,0 70,0 ± 2,3 70,0 ±2,1

Исх. содержание белка (мг) в гран. 4,1 ± 0,5 4,7 ± 0,5 2,1± 0,3

Содержание белка через 48 часов (мг) 4,8+0,5 10,8 ± 0,9 3,2 ± 0,3

Для изучения длительности функционирования одна и та же порция иммобилизованных клеток использовалась нами многократно, т.е. после очередной ферментации биокатализатор отмывался от сброженной среды и помещался в свежую. Установлено, что бродильная активность иммобилизованных дрожжевых клеток в 3-ей ферментации сопоставима с таковой в 1-ой.

Поскольку клетки дрожжей Тоги1ор51з кеГуг уаг. кипш Т17, иммобилизованные в альгинатный гель, продемонстрировали высокую метаболическую активность при многократном их использовании для ферментации молочной сыворотки, можно считать, что, во-первых, включение в гранулы этого геля не создает диффузионных ограничений для субстратов и продуктов ферментативных реакций и, во-вторых, образующиеся гранулы обладают достаточно высокой механической прочностью. Такие же результаты получены при

включении в альгинатный гель клеток молочнокислых бактерий Lactococcus lactis 40

При разработке путей управления ростом и метаболической активностью иммобилизованных клеток микроорганизмов необходимо учитывать проницаемость гелевой матрицы. Нами при помощи полиенового антибиотика нистатина показано, что включение микробных клеток в альгинатный гель не препятствует взаимодействию микроорганизмов с иизкомилекулярными pcry.wiopaMn роста. Результаты экспериментов представлены на рис. 6, 7.

В литературе имеются сведения, что внесение неспецифического активатора в культуральную среду увеличивает биосинтез фермента и повышает продуцирующую способность как свободных, так и иммобилизованных клеток культуры Asp. awamori 16 (Блиева, Бекбосынова, 1982). Нами изучено влияние стимулятора СЭС на иммобилизованные клетки дрожжей и молочнокислых бактерий. Выявлено, что салкцилинат сахарозы увеличивает спиртообразующую активность иммобилизованных клеток дрожжей Torulopsis kefyr var. kumis T17 при их культивировании на молочной сыворотке на 33%, причем для проявления такого эффекта препарат должен присутствовать в среде на всем протяжении эксперимента.

При изучении иммобилизованных клеток возникает вопрос, каким образом популяция клеток существует в течение нескольких дней, месяцев и даже лет в условиях, ограничивающих их размножение и жизнедеятельность? Описанные в литературе примеры функционирования полученных таким образом иммобилизованных биотализаторов в течение длительного времени (Nagashima, еу а!, 1984; Rosevear, et ai, 1984), очевидно можно объяснить метаболической пластичностью микроорганизмов, их способностью к адаптации к специфическим и неспецифическим воздействиям (Александров, 19S6).

На основании многолетних исследований кинетических закономерностей процессов синтеза некоторых органических и аминокислот клетками бактерии, иммобилизованными в гели различных носителей, В.И. Яковлева (1987) заключает, что ключевую

/laumza (X)

ED - О rncoê J й - ¿b vaca ; Щ ~ ^ часоё.

Рис. 6 ■ Содержание лал/пизы S молочной сыёоротке при зармешыции ^ е& сёооодными плевами ¿1рош<еи Toiu^opsLs, к&.-уч й / дез доиабления нистатина ;

о) HUâ,f7>arr>uH S àû3é ;

ß) ни с/л a mu н ß дозе J25Û ед. ;

г) нистатин ß ao3â ed.

i"

/?аклюза CA)

3 ¿

û

ШШ-Û wcoê ; - 2J, часа ; - 4S uaccê

Рис. 7. Содержание лая/позы ¿ mo/?qwoù Cbiêopofnfia ори рермён/г.ации ее ¿jMWOL/sf¿j3oáaríuá/Mu мле/пками 7ozu^ops¿s Mafyz а) ¿Тез добаё/зения ниататина ; д) нистатин о доза ед. ; S) нистатин 6 : доза ед. ; г) нистатин S дозе ¿SOÜ ед.

роль при функционировании клеток в качестве специфических биокатализаторов играют транспортные процессы, на которые большое влияние оказывает ионный состав среды. Дело в том, что в начальный период (24-48 часов) инкубации иммобилизованной клеточной системы в питательной среде клетки размножаются в приповерхностном слое геля. Характер последующего за этими событиями послойного распределения клеток в геле зависит от природы и структуры носителя, состава питательной среды и потребностей культуры.

П. Хочачка, Дж. Сомеро (1977), отмечая, что стратегия биохимической адаптации клетки сводится к соответствию между внешними воздействиями и изменениями метаболизма клетки регуляцией синтеза или активности ферментов, подчеркивают, что клеточные ферменты способны активно функционировать при высоких концентрациях метаболитов во внешнем растворе, поддерживая низкий уровень их внутриклеточного фонда. На основании этого, как считает В.И.Яковлева (1987), к известным способам регуляции интенсивности метаболизма - изменение количества и активности ферментов, можно добавить ещё один - изменение скорости поступления субстратов. Частным случаем использования такой регуляции является иммобилизация клеток, создающая условия, при которых концентрации субстратов и продуктов в микроокружении клеток значительно выше, чем в макроокружении. Это позволяет считать, что иммобилизация клеток микроорганизмов должна рассматриваться не только как путь к решению бнотехнологических задач, но и как определенный подход к решению такйх теоретических проблем, как бнокннетика, транспорт метаболитов, функционирование ферментов в клетках и др.

В ряде работ сообщалось об использовании иммобилизованных клеток микроорганизмов в биореакторах непрерывного действия. Так, Ю.Бартош (1982) для непрерывной ферментации молочной сыворотки использовал трубчатый колоночный реактор с иммобилизованными в полиакриламидном геле клетками Юиууеготусеэ П^Мб. Минимальный период полураспада биокатализатора составлял 50

суток. Поскольку спиртовое брожение сопровождается выделением углекислого газа, некоторые авторы предлагают для проведения такого процесса применять наклонные или даже горизонтальные реакторы (Chotani, Constantinides, 1984; Salzbmnn, et al, 1984). Для лучшего прохождения субстратов и продуктов через слой иммобилизованного каталтятопя предлагаете." npcKiuiuaib суостряг под давлением (Mitani, et а!, 1981). Сложный 1рсхс1>пенча1ып реактор с различной степенью упаковки разработан для оптимизации процессов газовыделения J. Klein, В. Kressdorf (1984), но D.H. Mitchell, et al, (1984) обращают внимание на то, что для применения в крупнотоннажном производстве многореакторная система слишком сложна.

Длительность функционирования иммобилизованных клеток дрожжей и молочнокислых бактерий изучалась нами в одно- и двухступенчатых колоночных биореакторах, работающих по принципу вытеснения (рис.8). Размеры внутреннего объема колонок были постоянными - 150x40 мм, глубина сбраживания субстрата регулировалась скоростью протока субстрата. Согласно полученным данным, одноступенчатый биореактор с иммобилизованными в альгинатный гель клетками дрожжей Torulopsis kefyr var. kumis T17 или молочнокислых бактерий Lactococciis lactis 40 успешно функционирует в течение 600 часов. При пропускании молочной сыворотки со скоростью 30 мл/час через слои иммобилизованного биокатализатора на 7-ые сутки процесс фермойаиии стабилизируется и выход конечного продукта становится постоянным до конца эксперимента( для дрожжей - содержание этанола в сброженной среде -3%, для молочнокислых бактерии-содержанис молочной кислот ы-1,6%). Нами проведена дегустация молочной сыворотки, ферментированной иммобилизованными клетками дрожжей Torulopsis kefyr var. kumis T17. Установлено, что полученный продукт обладает приятными органолептпческими показателями, по вкусу и запаху напоминает кумыс и можен быть рекомендован к употреблению в качестве напитка. Преимуществами напитка, полученного с

Рис. 8. Бипцслктлр пепргрыпнпгп дшстыш для пгргрлбпткп молочной сыпирички.

помощью иммобилизованных клеток микроорганизмов являются стабильность, стерильность и низкая стоимость. Напиток прошел предварительную экспертизу в Институте региональных проблем питания HAH PK.

В двухступенчатом биореакторе с такими же размерами колонок, как и в одноступенчатом, молочная сыворотка вначале сбраживалась молочнокислыми бактериями Lactococcus lactis dn затгм

добряжпвплась во 2-ой колонке клетками дрожжей Torulopsis kef>r var. kumis TI7. При скорости протока 40 мл/час в результате поэтапного сбраживания субстрата иммобилизованными клетками молочнокислых бактерий и дрожжей образуется продукт со следующими свойствами: кислотность - не выше 700Т, содержание лактозы и этанола - не более 1,5%. Выявлено, что после 264-х часового функционирования такого биореактора свойства продукта сохраняются постоянными, но в последующие сроки процесс становится нестабильным и параметры образующегося продукта изменяются. Меньшие сроки длительности работы двухступенчатого биореактора объясняются удвоением длины пути прохождения субстрата и, следовательно, возрастанием диффузионных ограничении, механических повреждений и т.д. Преимуществом двухступенчатого биорсактора является то, что в нем иммобилизованные клетки молочнокислых бактерий и лактозосбраживающих дрожжей упакованы отдельно в объемах двух различных колонок. Это дает возможность регулировать глубину сбраживания субстрата каждой культурой при помощи варьирования скорости протекания субстрата в колонке.

Еще одним преимуществом является то, что для биореакторов непрерывного действия можно применять нестерильные среды, так как при больших скоростях протока свободные посторонние микроорганизмы легко вымываются, не успевая размножиться.

Молочная сыворотка 'является подходящим субстратом для такого биореактора, т.к. при использовании иммобилизованных клеток среда не должна быть слишком "богата", потому что излишний рост клеток ведет к обрастанию частичек носителя, ухудшает

массообменные характеристики ферментера, увеличивает количество клеток в среде и уменьшает выход продукта (Mitchell, et al, 1984).

Известно, что для получения иммобилизованного биокатализатора, наряду с методами включения клеток микроорганизмов в матрицу природных и синтетических гелей, используются методы сорбции клеток на различных носителях. Достоинствами адсорбционной иммобилизации являются простота проведения процедур иммобилизации, доступность и относительно низкая стоимость сорбентов, отсутствие диффузионных ограничений при эксплуатации сорбированного биокатализатора (Savage, Fletcher, 1985). Сорбированные биокатализаторы широко используются для различных целей и это отражается на разноплановости исследований, проводимых авторами(Блиева, 1991; Манасбаева, Исабаева, 1993; Илялетдинов, Алиева, 1987).

Нами изучена физиологическая активность клеток дрожжей и молочнокислых бактерий, сорбированных на различных носителях -"виях", пенополиуретане (ППУ) и полимерных нитях. Надо сказать, что нами была сделана попытка провести иммобилизацию дрожжевых клеток не обычной сорбцией в готовую пенополиуретановую губку, а связыванием их с изоцианатными группами в процессе получения пенополиуретана. Однако, взаимодействие с изоцианатными группами оказало сильное токсическое действие на клетки и потому в дальнейших экспериментах для прикрепления клеток к ППУ использовалась только сорбция. Установлено, что сорбированные клетки, независимо от вида микроорганизма и типа носителя, демонстрируют высокую метаболическую активность. В литературе последних лет уделяется большое внимание разработке различных приемов, улучшающих сорбционные свойства носителей. Результаты серии экспериментов, в которых изучались сорбционные свойства носителей, модифицированных внеклеточными поверхностно-активными веществами, являющимися микробными

зкзометаболитамн, убитыми дрожжевыми клетками и ионами металлов позволяют констатировать, что увеличение сорбционной активности носителя в отношении микробных клеток наблюдается

только при использовании в качестве рецепторнон подложки для модификации поверхности ППУ новых микробных биосурфактантов, полученных в лаборатории "Экологии микроорганизмов" Института микробиологии и вирусологии HAH PK (А.Б.Манасбаева и др., 19931 Использование этих препаратов для модификации сорбции продиктовано тем обстоятельством, что продуцируемые микробными клетками внеклеточные пппрр»ност:!я птстшшыс ьешестиа (ВПАВ} часто выполняют рочь посредников при адсорбции или десорбции различных соединений с поверхности раздела фаз и потому могут существенно влиять на процессы сорбции клеток на носителях (Gutnick, Minas, 1987).

Модификация носителей проводилась выдерживанием их в течение 48 часов в растворах ВПАВ. Сорбцию клеток Lactococcus lactis 40 на натнвных и модифицированных носителях проводили в колбах Эрленмейера на качалке в течение 24 часов при температуре 22^ С. Пробы (5 мл) отбирали через каждые 4 минуты и после 1 -минутного отстаивания измеряли оптическую плотность микробной суспензии на ФЭК-56 при длине волны - 540 нм. По установлению постоянной величины оптической плотности исследуемых проб регистрировали время завершения сорбции и достижения сорбционного равновесия (рис.9). Как видно, обработка носителей микробными сурфактантами в 3 раза снижает время установления сорбционного равновесия. Изучение метаболической активности выявило, что иммобилизация молочнокислых бактерий на модифицированном пенополиуретане позволяет увеличить выход молочной кислоты на 2S%.

Получение молочной кислоты и этанола с помощью иммобилизованных клеток микроорганизмов

Проблема стимуляции метаболической активности молочнокислых бактерий с целью увеличения выхода молочной кислоты является актуальной в связи с широким применением этого соединения в различных отраслях народного хозяйства,

Рис. 9. Миивтииа. йороции k/ien>DH lactocaccus ¿actis. 4>û ría пенополиуретане (ппу) и „Sшх" У- ППУ (натиёныи ); 2- ППУ (ModutpuqupûôtZHHùtú ßMß);

3 - „ ßuu " (натибнь te ) ;

4 -Sou"(модифицированные ВП/1&).

преимуществами микробиологического способа ее получения перед химическим и т.д.

Известно, что конечная стоимость продукта биотехнологического производства определяется биохимической активностью выбранного штамма микроорганизма, затратами на сырье, оборудование и очистку конечного продукта. В качестве продуцентов молочной кислоты используются гомоферментативные молочнокислый иамсрии с высокий кислотообразующей активностью

В поисках дешевых субстратов для получения молочной кислоты исследователи обратили внимание на молочную сыворотку - побочный продукт, образующийся при производстве сыра, творога и т.д. Молочная сыворотка обладает низкой стоимостью, хотя и содержит все компоненты, необходимые для роста микроорганизмов и не требует больших затрат на предварительную подготовку. Увеличения выхода конечных продуктов при ферментации достигают сгущением молочной сыворотки, добавлением в неё дополнительных источников питания, таких как дрожжевой автолизат, кукурузный экстракт, белковые гидролизаты и др.

Существующая технология микробного синтеза молочной кислоты - многостадийный трудоемкий процесс, включающий большое число операций очистки и выделения продукта (Смирнов, 19S3). Интенсифицировать процесс получения молочной кислоты, облегчить выделение и дальнейшую обработку полученного продукта можно, используя биореакторы с иммобилизованными клетками микроорганизмов. Такие биореакторы позволяют интенсифицировать и стабилизировать процесс получения молочной кислоты, облегчают переход на непрерывный режим и осуществление очистки конечного продукта.

Учитывая вышеизложенное, нами для увеличения выхода молочной кислоты ферментация сгущенной молочной сыворотки, обогащенной различными источниками углерода и азота проводилась иммобилизованными клетками микроорганизмов.

В работе использовались культуры молочнокислых бактерий Lactobacillus delbrueckii subsp; lactis шт. 21 и Lactococcus lactis шт. 40.

Культуры выращивали и. поддерживали на стерильном обезжиренном молоке. В качестве субстрата использовалась молочная сыворотка, предварительная обработка которой включала нагревание в течение 1 часа при 90-98° С, отделение белков фильтрованием и стерилизацию. Ферментируемая среда содержала 100 мл сыворотки и 10 об% инокулята, Сбраживание проводили в течение 6 суток при температурах 28°С - для лактококка и 37°С - для лактобацилл. Пробы среды отбирали через каждые 24 часа и определяли в них такие параметры, как активная и титруемая кислотность, концентрация лактозы и молочной кислоты. Поскольку данные, полученные для обеих культур идентичны, приводятся результаты экспериментов с Ьасюсоссиз ¡ас^ 40 (рис. 10).

Как видно, максимальный выход молочной кислоты при ферментации нативной молочной сыворотки не превышает 1,6 %. В условиях поддержания кислотности культуральной жидкости на уровне 5,5-6,0 вносеннем в среду тонкоразмолотого стерильного мела выход молочной кислоты при росте обеих культур молочнокислых бактерий увеличился вдвое. Известно, что активность аллостерического фермента - лактатдегидрогеназы прямо зависит от концентрации субстрата в среде. Если она низка, то лактатдегидрогеназа малоактивна и бактерии превращают пируват другим путем в формиат, ацетат и этанол. Это дает основание считать, что для наиболее полного превращения субстрата в лактат необходимо работать с высокими концентрациями углеводов. Нами увеличение концентрации углеводов в среде достигалось тепловым сгущением сыворотки до уменьшения ее объема вдвое. Как видно из рис. 10, сгущение сыворотки позволило вдвое увеличить концентрацию молочной кислоты, образующейся при ферментации лактозы молочной сыворотки клетками Ьа^ососсиз Кас^э 40. Заметное влияние на этот показатель оказывает комплексное внесение дрожжевого автолизата с глюкозой и лактозой или добавление его в сгущенную сыворотку.

В настоящее время известны производства, связанные с получением органических кислот, в которых использовались

Лак/поза. (У.)

Рис. ¿0. Влияние дополнительных иеточнимод ли/яания ¿/л ин/пенсионас/пь ¡рерментации малочнии шборо/яни мле/лмами ¿¿¡¿¿ососсиз. /ас.И& 40 1- хснцвгиТ.рлция молочной кис/ю/пы и

¿¿хпозы 3 динамцие рос/па мле//>ом • 2,2'-То те при добавлении 6 среду угленазы; 3,3' - Та же при дооаЦлении £ среду галактозы ; -'<,!<' - Та при дооаЗлении £ среду лактозы; - То -<не при аода$ле.нии 6 среду дрои<ме£ого аЗто/шзагглх (/¡А).

иммобилизованные биокатализаторы (Каданцева и др., 1991). Показано, что во многих случаях ферментативная активность прикрепленных клеток намного выше, чем свободных. Другое не менее важное их преимущество - легкость отделения биокатализатора от среды и, связанные с этим, возможности для более полной очистки и концентрирования конечного продукта, в частности, молочной кислоты.

Нами для получения молочной кислоты использовались клетки молочнокислых бактерий Ьас1ососсиз ¡ас^ 40, иммобилизованные включением в матрицу альгинатного геля и сорбцией на пенополиуретане (ППУ) и "виях". Такой набор носителей позволяет провести сравнительный анализ интенсивности кислотообразования клетками молочнокислых бактерий при использовании трех типов биокатализаторов, в которых клетки были либо "заперты" в гелевых ячейках альгината кальция, либо находились в ячейках губчатой структуры (ППУ), но имели возможность выйти из них, либо сорбировались на полимерном носителе, имеющем вид ресничек ("вии").

Согласно полученным данным, концентрация молочной кислоты в культуральнои среде после 6-ти суточной ферментации сгущенной молочной сыворотки иммобилизованными клетками лактококков во всех вариантах выше, чем при использовании для брожения свободных клеток (рис.11). Величина этого параметра для клеток, сорбированных на "виях" и ППУ на 40%, а включенных в альгинатный гель на 20 % выше, чем в контрольном варианте.

Внесение в среду культивирования иммобилизованных клеток препарата СЭС заметно активизирует метаболическую активность микроорганизмов. Причем, большее влияние стимулятор оказывает на клетки ЬасЮсоссиз 1ас11з 40, включенные в альгинатный гель. Объяснение этому явлению видится в том, что препарат СЭС, беспрепятственно проникая в матрицу альгинатного геля, клеточная нагрузка в котором достаточно высока, получает возможность воздействовать на микробные клетки. Как показано нами выше,

П ¿'з.чзнйпге мелочней

6 мелочней сб/£сротке, шармештчтп&мпи Vлап»-уи

различных НССи<7)ву7ЯХ I - сйоиодныг мне/ян. и ; Л -мл^тми, имг*о'ои,1цза£я>/ныз //.? ЛПУ; £-нлги, нныа па рыл £

/)писита/т:£иц ; V - м.¡¿куц, им.чозилизо£аннь/з на „ ¿и& "; 5~-млатни,иммо^или заданные на. „Вив", рос/л 6

прис.утс.л>6ии ; 6-плетки, й.члючеиныг £ гёль альгината ¿!а ; -млгяки, Включенные & 2вмь &льгина.та. Са, ро ¿/я В лрисулюпВии .

местом приложения этого соединения является клеточная поверхность.

Полученные результаты позволяют констатировать, что ферментация сгущенной молочной сыворотки в течение 6 суток при 28"С клетками молочнокислых бактерий Ьа^ососсиБ 1асйз 40, иммобилизованными в различных носителях, в присутствии стимулятора роста СЭС и дрожжевого автолизата позволяет получать молочную кислоту в виде лактата кальция с выходом 9,5 - 10,0 %.

Для получения молочной кислоты ферментированную сыворотку отделяли от биокатализатора и фильтровывали. Полученный осадок содержал белки и соли, а фильтрат - лактат кальция. При обработке фильтрата серной кислотой образуется нерастворимый и потому легко удаляемый осадок сульфата кальция (гипс). Для получения технической молочной кислоты раствор, полученный после отделения осадка центрифугированием, выпаривали до тех пор, пока концентрация молочной кислоты не достигала 37 %. Чистота препаратов молочной кислоты и способы ее очистки во многом определяются содержанием в готовой продукции посторонних примесей (Шапошников, 1947). В промышленности для получения химически чистой молочной кислоты проводят перекристаллизацию, обработку сорбентами, экстрагирование растворителями, фракционную перегонку, и т.д. Использование биокатализаторов на основе иммобилизованных клеток микроорганизмов способно намного облегчить операции выделения и очистки молочной кислоты, так как позволяет полностью отделить клетки от культуральной среды с минимальными затратами.

Установлено, что иммобилизация клеток молочнокислых бактерий, независимо от применяемого метода и носителя, значительно повышает их метаболическую активность. Такие результаты дают возможность выбора метода иммобилизации в зависимости от субстрата, конструкции биореактора и т.д.

Выявление стимулирующего эффекта СЭС па иммобилизованные клетки создает предпосылки для управления ростом и метаболической

активностью иммобилизованных клеток при помоши химических соединений.

Еще в 40-х годах В.Е.Волотько были начаты и в 1971-1973 году продолжены во ВНИИМСе работы по производству спирта из подсырной сыворотки. При этом брожение осуществляли традиционно с помощью свободных клеток микроорганизмов. Максимальный выход спирта составлял 2,5-3 % (Храмцов, 1990). Недостатками тяvr.fi ферментации ярлптг^тсл снижение активности продуцентов при брожении, уменьшение продуктивности процесса и необходимость рециклизации клеток. Использование для получения этанола иммобилизованных клеток микроорганизмов позволяет создавать в среде, в которой происходит ферментация, большую концентрацию клеток и увеличивать вследствие этого продуктивность процесса, а также обеспечивает многократное и длительное применение клеток.

Нами проведено изучение интенсивности спиртообразования при ферментации молочной сыворотки свободными и иммобилизованными включением в альгннатный гель и сорбцией на ППУ, "впях" и волокнистом полимерном носителе клетками лактозосбраживающих дрожжей Тоги!ор81з кеГуг гаг.кипш Т!7. Согласно полученным данным, выход конечного продукта брожения -этанола при ферментации молочной сыворотки иммобилизованными клетками был выше, чем свободными, независимо от способа иммобилизации.

На основе клеток дрожжей Тоги1ор$т<; кеГуг \'лг. кипиБ Т17, иммобилизованных включением в альгннатный гель, нами разработан способ получения этанола, согласно которому одна и та же порция иммобилизованного биокаталнзатора, после использования в очередной ферментации, отмывалась и применялась в последующей, и так - 6 раз, при этом выход этанола в каждой из этих ферментации составлял 3,9 %. Это означает, что клетки дрожжей Топ11орз1з кеГуг уаг. кипш Т17 в иммобилизованном состоянии могут функционировать длительное время.

Нами показано, что использование гранул альпшатного геля с включенными в них клетками дрожжей ТогЫорз^ кеГуг уаг. кипнБ Т17 в

биореакторе для непрерывной переработки молочной сыворотки позволяет проводить процесс ферментации с постоянным выходом конечного продукта в течение 600 часов, причем, скоростью протока субстрата можно регулировать концентрацию этанола в сброженной жидкости. Выявлено, что в условиях работы используемого нами бнореактора, для того, чтобы выход этанола составлял 3,9 % , скорость протока молочной сыворотки должна быть -10 мл/час.

Таким образом, для управления ростом и метаболической активностью микроорганизмов можно использовать различные пути. Их совокупность может привести к значительному повышению метаболической активности микроорганизмов. Это особенно важно, когда в качестве субстрата используется дешевое сырьё, для переработки которого применение дорогостоящих технологий нецелесообразно. Как показано в данной работе, используя биореакторы с иммобилизованными клетками микроорганизмов для непрерывной ферментации молочной сыворотки, можно получать -молочную кислоту, этанол, десертные напитки и другие продукты.

ВЫВОДЫ

1. Проведен отбор стимуляторов среди 37 новых химических соединений растительного происхождения, относящихся к классам органических кислот и их производных. Выявлено, что новый полусинтетический препарат - салицилинат сахарозы (СЭС), стимулирует рост дрожжей Saccharomyces cerevisiae гибрид 512 на ячменном сусле на 50,5 % и увеличивает рост ' молочнокислых бактерий на молочной сыворотке на 95 %.

2. Установлено, что наиболее эффективной стимулирующей дозой СЭС для дрожжей Saccharomyces cerevisiae гибрид 512 является 10 мкг/мл, для молочнокислых бактерий Lactococcus lactis 40 и Lactobacillus delbrueckii ssp.lactis 21 - -0,4 мкг/мл.

3. Показано, что иммобилизация клеток дрожжей Torulopsis kefyr var. kumis TI7 и молочнокислых бактерий Lactococcus lactis 40 и Lactobacillus delbrueckii ssp. lactis 21 включением в гели и сорбцией на

различных носителях повышает их метаболическую активность при росте на молочной сыворотке.

4. Выявлено, что стимулятор СЭС, модифицирующий поверхностные свойства клеток микроорганизмов, повышает метаболическую активность этих клеток в иммобилизованном состоянии.

5. Показано, что препарат бактериального сурфактанта, полученный на основе Pcendomonas a!ca!:gc;ici, повышает сорбцнонную способность пенополиуретана и "вин" и метаболическую активность молочнокислых бактерий Lactococcus lactis 40, сорбированных на этих носителях.

6. Подобраны режимы работы биореактора для получения стерильного напитка со стабильными биохимическими показателями, приятным вкусом и запахом ферментацией молочной сыворотки иммобилизованными клетками дрожжей Torulopsis kefyr var.kumis Т17.

7. Подобраны оптимальные условия для совместного использования иммобилизованных клеток дрожжей и молочнокислых бактерий для сбраживания молочной сыворотки. Установлено, что проведение ферментации субстрата в двухступенчатом биореакторе позволяет контролировать содержание спирта, углекислоты и кислотность продукта.

8. Разработаны способы получения этанола свободными и иммобилизованными клетками дрожжей Torulopsis kefyr var. kumis T17 сбраживанием молочной сыворотки. На способы получены положительные решения Патентного ведомства РК

9. Разработаны способы получения молочной кислоты свободными и иммобилизованными клетками молочнокислых бактерий Lactococcus lactis 40 сбраживанием молочной сыворотки. На способы получены положительные решения Патентного ведомства РК.

ПО МАТЕРИАЛАМ ДИССЕРТАЦИИ ОПУБЛИКОВАНЫ СЛЕДУЮЩИЕ РАБОТЫ: 1. Балмуханов Б.С., Жубанова А.А. и др. Влияние полиенового антибиотика нистатина на дыхание и гликолиз асцитных клеток/Реф. 111 всесоюз. биохим. съезда.-Рига.-1974,- С.50.

2. Иващенко А.Т., Балмуханов B.C., Жубанова A.A., С.Б. Балмуханов Влияние одновалентных ионов на АТФазную активность мембран эритроцитов крысы//Доклады АН СССР, 1974,- N2,- С.712-714.

3. Жубанова A.A. и др. О повреждающем действии натриевой соли нистатина на клетки асцитных опухолей // Вопросы онкологии.-1975.-21, №6. - С. 112-116.

4. Сармурзина Р.Г., Жубанова A.A. и др. Влияние полиенового антибиотика нистатина на ультраструктуру клеток асцитной опухоли Эрлиха// Известия АН КазССР.-!975,- № 6.- С.25-29.

5. Иващенко А.Т., Жубанова A.A., Балмуханов Б.С. НСОз-чувствите-льная аденозинтрифосфатаза клеток асцитных опухолей // Биохимия.-1975.-№3.-С. 1091 -1093.

6. Иващенко А.Т., Жубанова А.А.Влияние облучения на АТФазную активность ядер и митохондрий клеток асцитных опухолей II Радиобиология,-197б.-№2.- С.264-266.

7. Сармурзина Р.Г., Жубанова A.A. и др. Исследование противоопухолевой активности натриевой соли нистатина // Вестник АН КазССР.-1976.-№9,- С.52-55.

8. Жубанова A.A. и др. Действие лазерного излучения на окислительно-восстановительные процессы в дрожжевых клетках // Тез. докл. конф. биохимиков Ср.Азии и Каз-на.-Ащхабад.-1986.-С.336.

9. Жубанова A.A. и др. Динамика некоторых физико-химических параметров популяции клеток E.coli при действии соединений растительного происхождения II Биофизика мнкр. популяций: тез.докл.всес.конф.-Красноярск, 1987.-С.114

Ю.Дощанова Б.К., Жубанова A.A. и др. Изменение редокс-потенциала, скорости восстановления феррицнанида калия и электрофоретической подвижности клеток E.coli WP-2 в периодической культуре.-Деп. в ВИНИТИ.-М., 19S9.-№8 (214).-С.149.

П.Дощанова Б.К., Шпгаева М.Х., Жубанова A.A. Антимикробное действие растительных ПАВ,- Изв. АНКазССР, сср.биол.-1989.-К°6.-С.45-51.

!2.Дощанова Б.К., Жубанова A.A. Первичный скрмшшнг химических соединений растительного происхождения // Сб. науч. тр. Акт. пробл. совр. биол.- Алма-Ата: КазГУ.-1991.- С.26-28.

13. Шигаева М.Х., Жубанова A.A. и др. Влияние химических и физических факторов на рост микроорганизмов и образование основных метаболитов // Сб. науч. тр. Акт. пробл. совр. биол.-Алма-Ата: КазГУ.-1991.- С. 28-34.

14. LLinibiCii^ М.Х., ^Кубапсг-п А.А-, Лтн.^знога Ф.Ф.

клеток микроир!анизмов в различных гелях ',! Сб. науч. тр. Лкт. пробл. совр. биол,- Алма-Ата: КазГУ.-1991.- С.34-36.

15.Шигаева М.Х., Бузурбаев Г.Г., Дощанова Б.К., Жубанова A.A., Шупшибаев К.К. Полярографический метод определения активности супероксиддисмутазы микробных клеток // Биотехнология и биофизика микробных популяций.- Алматы, 1991.-С.131.

16.Жубанова A.A. и др. Получение ферментированной молочной сыворотки // Мат-лы 5-ой конф. биохимиков Ср.Азии и Казахстана, Ташкент, 1991,- С.362.

17.Жубанова A.A. Иммобилизация молочнокислых бактерий в различных носителях // Мат-лы 5-ой конф. биохимиков Ср.Азии и Казахстана, Ташкент, 1991.-C.36i.

IS. Жубанова A.A. и др. Ферментация молочной сыворотки ммобилизо-ваннымп клетками дрожжей и молочнокислых бактерий // Мол.пром-ть.-1991, №1,- С. 15-19.

19. Шигаева М.Х., Жубанова A.A., Дощанова Б.К. Кислотообразование L.lactis на молочной сыворотке в зависимости от источников углеродного питания // Вестник КазГУ, сер.биол.-1994,- С.55-58.

20.Жубанова A.A., Шигаева М.Х. Влияние иммобилизации в различные гели на физиологическую активность клеток кумысных дрожжей // Вестник КазГУ,-сер.биол.-1994.- С.66-73.

21.Жубанова A.A., Дигель И.Э. Модификация адсорбционных свойств пенополиуретана (ППУ) обработкой солями металлов и убитыми дрожжевыми клетками. Деп. в КазНИИНТИ, 1994, №5473-Ка94

22.Жубанова п др. Спиртообразующая активность дрожжей рода Torulopsis, иммобилизованных в альгинатный гель и адсорбированных на различных носителях Деп. в КазНИИНТИ,

1994, №5474-Ка94.

23.Zhubanova A.A., Shigaeva M.Ch. The use of immobilizated cells of Torulopsis kefyr for fermentation of whey // Докл. HAH PK, 1994.-№6.-P.80-84.

24.Шигаева M.X., Жубанова А.А. и др. Способ получения этанола из молочной сыворотки. Заявка N940690.1. Решение форм.экспертизы Патентного ведомства РК от 29.08.94.

25.Шигаева М.Х., Жубанова А.А.и др. Способ получения этанола из молочной сыворотки с помощью иммобилизованных дрожжей. Заявка N940689.1. Решение форм.экспертизы Патентного ведомства РК от 29.09.94.

26.Шигаева М.Х., Жубанова А.А.и др. Способ получения молочной кислоты (свободные клетки). Заявка N940797.1. Решение форм, экспертизы Патентного ведомства РК от 29.08.94.

27.Шигаева М.Х., Жубанова А.А. Способ получения молочной кислоты (иммобилизованные клетки). Заявка N940798.1.Решение форм.экспертизы Патентного ведомства РК от 29.08.94.

28.Zhubanova А.А. The methods of the increasing of physiological activity of lactic acid bacteria grown on whey. // Докл. HAH PK.-1995.-№ 1.-P.82-85.

29. Жубанова А.А. Изучение проницаемости альгинатного геля для полиенового антибиотика нистатина. Деп. в КазНИИНТИ,

1995, Р5948-Ка95.

30.Синявский Ю.А., Жубанова А.А., Шнгаева М.Х. Получение ферментированных напитков с помощью метода иммобилизации клеток микроорганизмов. Деп. в КазНИИНТИ, 1995, Р6001-Ка95.

31. Жубанова и др. Оптимизация условий культивирования и подбор носителей для иммобилизации клеток микроорганизмов. Деп. в КазНИИНТИ, 1995, Р60002-Ка95.

Жубанова Ажар Ахметкдлзы

"Микроорганизмдердщ иммобшшзацияланган клеткалардщ есу жэне метаболистж белсендшгш баск/jpy"

Бул жумыс микроорганизмдердщ есу жэне метаболистж

(ла ыои к i A ipiu }лгтлия wiiugrrLT A^tiir'Ftf хг^лгчдлгс-п япиддгяп

Мунда микрпб'пк гинтрч ироцргтррпчщ нятижрлмтн арттыруына 6ipneme жолдарын пайдалануга болатынын керсе-плген. Олар: ортаны оптимизациалау; есудщ химиялык, модифнкаторлардыц кемепмен микроорганизмдердщ метаболистж белсендьлтн ынталандыру; табига полисахаридтердщ гельдердщ белшектерше ецпзу арк^глы жэне ортурлз тасушыларды сорбция арк^глы микробтык, клеткаларды иммобнлизациалау.

Сут к£1шк£1лы бактериалардыц жэне ашытк^шыц бос жэне иммобнлнзациаланган клеткалармен сут ipxiTin фермегггациалау арк^1лы сут к£1шк£1лын жэне этанолды жасап inuFapy эд1стер! усынылган.

"The regulation of growth and metabolic activity of immobilized microorganisms cells"

The problems of elaboration of complex methods of microorganism growth and metabolic activity regulation are worked out in this research. It was established that different ways can be used to increase the activity of microorganism synthesis process: medium optimization, microorganism metabolic activity stimulation by chemical modificators of growth, cell immobilization to natural polysaccharide gels and their sorbtion on different carriers.

The methods of lactic acid and ethanol recoiption by whey fermentation by free and immobilized cells of lactic acid bacteria and yeasts and also offered in this work.

ТУЖЫРЫМ

Zhubanova Azhar Achmetovna

SUMMARY