Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Ультраструктура гладкого эндоплазматического ретикулума в маутнеровских нейронах рыб в норме и при некоторых экспериментальных воздействиях

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Ультраструктура гладкого эндоплазматического ретикулума в маутнеровских нейронах рыб в норме и при некоторых экспериментальных воздействиях"

р Г Б ОД

11 мар ДО6

На правах рукописи

САНТАЛОВА ИРИНА МИХАЙЛОВНА'

УЛЬТРАСТУКТУРА ГЛАДКОГО ЭНДОПЛАЗМАТИЧЕСКОГО РЕТИКУЛУМА В МАУТНЕРОВСКИХ НЕЙРОНАХ РЬБ В НОРМЕ И ПРИ НЕКОТОРЫХ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ ВОЗДЕЙСТВИЯХ

03.00.02 - биофизика АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Пущино - 1996

Работа выполнена в Институте теоретической и экспериментальной биофизики Российской Академии наук

Научный руководитель: доктор биологических наук Мошков Д.А.

ифициальные оппоненты: заслуженный деятель науки РФ,

доктор биологических наук, профессор Косицин Н.С.

доктор биологических наук Чемерис Н.К.

Ведущая организация: Институт биофизики клетки Российской Академии наук, Пущино

Защита состоится " 1996 г. в часов на

заседании Диссертационного Совета Д 200.22.01 в Институте теоретической и экспериментальной биофизики РАН по адресу: 142292 г. Пущино, Московской области ИТЭБ РАН.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИТЭБ РАН Автореферат разослан 1996 г.

Ученый секротарь Диссертационного Совета

кандидат биологических науи- П. А. Нелипович

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования. Одной из главных проблем, рассматриваемых при изучении принципов функционирования нейронов, является проблема взаимосвязи между структурными и функциональными изменениями на тканевом, клеточном и субклеточном уровнях. Нормальная функциональная активность нервных клеток осуществляется благодаря слаженному взаимодействию всех его органоидов. Отвечая на воздействия внешней среды, нейроны не просто статично поддерживают свою целостность, но направленно, специфично изменяют и модифицируют деятельность всех своих компонентов (Косицын, 1975: Боголепов, 1979; Меркулова, Даринский, 1982; Машанский, Рабинович, 1987).

Несмотря на то, что нервная система весьма пластична, функциональные перегрузки могут привести к развитию патологических явлений, которые проявляются в структуре и функции нейронов. Важное,. если не основное значение в этих процессах имеют ионы кальция. Установлено, что значительное увеличение их концентрации в цитоплазме клетки ведет к повреждению органоидов, деструкции цитоскелета, активации катаболических энзимов, что в конечном счете может вызвать гибель клетки (Orrenius et al., 1989). В нейронах, как в любых клетках эукариотов, имеется целый ряд внутриклеточных систем и органоидов, регулирующих количество кальциевых ионов в цитозоле и управляющих их распределением в разных участках нейрона - соме, дендритах, аксоне. Сюда относятся митохондрии, ядро, секреторные гранулы, аппарат Гольджи и гладкий ретикулум. Последнему в настоящее время уделяется особое внимание специалистов разного профиля в связи с его активным участием в быстром захвате и аккумуляции кальциевых ионов (Костюк, 1992; Hepler et al.,1990; Koch 1990; Terasakl 1994;Pozzan et al,1994).

Для успешного выяснения механизмов пластичности нервных клеток и их органоидов применяется широкий диапазон различных методических подходов, и в их числе, несомненно, важное значение имеет морфология и особенно электронная микроскопия (Мошков, 1985). Особенно продуктивны ультраструктурные исследования на таком классическом объекте, каким считаются маутнеровские нейроны (МН) костистых рыб, единственные идентифицированные нейроны позвоночных, представляющие собой парные командные нейроны, принимающие афферентные окончания от разных сенсорных систем и отделов головного мозга и управляющие специфическими формами плавательной активности (Сахаров, 1961; Diamond, 1971; Zottoli et

а1., 1987; СопПе1<3 а1., 1993).

Цель и задачи работы. Целью работы было изучение особенностей ультраструктурной организации гладкого эндоплазма-тического ретикулума МН некоторых видов рыб, а также структурной изменчивости этого органоида, при определенных, экспериментально вызванных состояниях нейронов.

Были поставлены следующие задачи. 1. Проанализировать морфологические особенности гладкого ретикулума МН некоторых видов рыб, характеризующихся разным уровнем врожденной двигательной активности. 2. Исследовать строение гладкого ретикулума в незрелых МН мальков рыб. 3. Провести сравнительный количественный анализ ультраструктурных перестроек ретикулума, возникающих в МН взрослых рыб и мальков в результате интенсивной сенсорной стимуляции. 4. Установить значение частичной деафферентации МН взрослых рыб и мальков для ультраструктуры данных нейронов в условиях относительного покоя и при интенсивной сенсорной стимуляции. 5. Определить цитохимически локализацию ионов кальция в дендроплазме МН рыб в интактном состоянии и после длительной стимуляции.

Научная новизна. В дендроплазме МН рыб впервые выявлена специфическая, упорядоченная организация гладкого эндоплазматическо-го ретикулума, состоящая из продольных и регулярных поперечно расположенных цистерн и канальцев, напоминающая селтальный гладкий ретикулум, описанный в некоторых нейронах беспозвоночных и позвоночных животных. Установлено закономерное усложнение развития гладкого ретикулума в МН зрелых рыб по сравнению с нейронами мальков. Оно состоит в увеличении общей протяженности элементов ретикулума и увеличении числа его поперечных компонентов. Выявлено, что интенсивная сенсорная стимуляция МН мальков и взрослых рыб приводит к пролиферации гладкого ретикулума, которая значительно сильнее проявляется в незрелых МН мальков и достигает уровня развития, характерного для этой структуры у взрослых рыб. Обнаружено, что сенсорная стимуляция МН на фоне их частичной деафферентации оказывается более щадящей как для ультраструктурного, так и для функционального состояния данных нейронов. Цитохимическое выявление ионов кальция в МН, находящихся в разных функциональных состояниях, показало, что первичное накопление и перераспределение этих ионов в МН в результате интенсивной стимуляции происходит с участием гладкого ретикулума и его производных - субповерхностных цистерн.

Научно-практическая ценность работы. Проведенное исследование имеет в основном теоретическое значение. Установленные в работе видоспецифические закономерности в организации и развитии гладкого эндоплазматического ретикулума в МН рыб и цитохимическое выявление перераспределения ионов кальция в результате стимуляции расширяют наши представления об адаптивных ультраструктурных преобразованиях на уровне отдельного нейрона при изменении его функционального состояния и свидетельствуют об участии гладкого ретикулума МН в устранении повышенной концентрации кальция в цитоплазме клетки. Данные результаты имеют определенную практическую значимость при разработке подходов к профилактике и коррекции нейронапьного утомления. Результаты работы используются при чтении курса лекций в Пущинском ГУ.

Апробация работы. Результаты работы были доложены и обсуждены на рабочем совещании "Ультраструктура и пластичность нейронов" (Пущино, 1990), международном симпозиуме "Signal molecules and mechanism of animal behaviour" (Пущино, 1989), нейрогистологических колосовских чтениях (С.-Петербург, 1993 и 1994 гг.), ежегодной научной конференции ИТЭБ РАН (Пущино, 1994 и 1995гг.).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 8 печатных работ.

Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания методов исследования, результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы. Материалы изложены на 112стр., содержат 9 таблиц и 36 рис. Список цитируемой литературы включает 175 наименований отечественной и зарубежной литературы.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В качестве объектов исследования были использованы рыбы следующих видов: ■ золотые' рыбки СагаБэШз аигаШБ, мальки и взрослые, гуппи ЬеЫв1ез геМаЛаШв, мальки и взрослые, ксенотоки Хепо1ока е^эеш кчиег, взрослые и ротаны Регсо^э В1е1ш1, взрослые.

Функциональное состояние МН оценивали косвенным путем по специальным поведенческим тестам. В узком кольцевом канале измеряли скорость плавания рыб и количество спонтанных поворотов

при смене направления движения. Сенсорную стимуляцию МН осуществляли в экспериментальной установке, вращающейся в 2-х плоскостях со скоростью 24 оборота в минуту в течение 2-х часов.

Выключение зрительной афферентации выполняли хирургическим путем: рыбку анестезировали на льду и тонкими хирургическими ножницами удаляли оба глаза. Выживаемость составляла 97%.

Для электронномикроскопического анализа из продолговатого мозга рыб выделяли кусочки мозга, содержащие МН и фиксировали их в растворе, содержащем параформ, глутаральдегид, диметил-сульфоксид, на 0,1 M какодилатном буфере (рН 7,2) в течение 16 часов. Дофиксировали в 1% растворе четырехокиси осмия в том же буфере в течение 2 часов, обезвоживали в спиртах возрастающей концентрации и ацетоне. Затем пропитывали и заливали в эпон 812.

Для изучения локализации ионов кальция использовали модификацию пироантимонатного метода (Петруняка, 1987). Образцы, содержащие МН, помещали в раствор А, содержащий пироантимонат кальция, глутаральдегид, танниновую кислоту и тритон Х-100. Затем переносили в раствор Б того же состава, но без тритона на 3 часа. Дофиксацию проводили в 2% растворе осмиевой кислоты с пироантимонатом калия. Все растворы готовили на деионизованной воде (рН 9). Далее образцы обезвоживали и заключали в эпон 812 по описанной выше схеме.

Для выбора нужного участка изготавливали полутонкие срезы толщиной 10 мкм, которые просматривали в световом микроскопе, отбирали нужные, содержащие сому и дендриты МН. Их переклеивали на новые эпоновые блоки и готовили ультратонкие срезы, которые контрастировали водным раствором уранилацетата и цитратом свинца. Препараты просматривали и фотографировали в электронном микроскопе Tesla BS-500.

Морфометрический анализ негативов проводили на приборе "Микрофот" с общим увеличением 90 ООО. Измеряли протяженность элементов гладкого эндоплазматического ретикулума, расстояние между его поперечными компонентами, подсчитывали число поперечных компонентов и митохондрий, число близких прилеганий между элементами гладкого ретикулума и митохондриями, оценивали площадь митохондрий.

Результаты количественной оценки поведения и морфометриче-ские данные обрабатывали стандартными статистическими методами, достоверность различий средних величин оценивали с помощью критерия Стыодента.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. Сравнительный анализ структуры гладкого ретикулума в МН некоторых видов рыб с разным уровнем двигательной активности.

На четырех видах аквариумных рыб - золотых рыбках, ротанах, ксенотоках и гуппи было изучено строение гладкого ретикулума в МН. Ультраструктурный анализ цитоплазмы 2-х главных дендритов, латерального и вентрального, выявил хорошо развитую организацию этого органоида, состоящего из цистерн и канальцев, пересекающихся друг с другом и образующих сложную сетчатую структуру, пронизывающую всю цитоплазму. В составе ретикулума обнаружены продольные компоненты, расположенные параллельно оси нервного волокна и поперечно ориентированные. Подобная организация гладкого ретикулума была выявлена в некоторых нервных клетках беспозвоночных и позвоночных и названа септальной (Павленко, 1988; ЫЬегтап, 1971). Непосредственно под плазмалем-мой расположены уплощенные субповерхностные цистерны, относящиеся к производным гладкого ретикулума.

Таблица 1. Результаты морфометрических измерений гладкого эндоплазматического ретикулума МН рыб, X 1 М

золотые рыбки, ВД ротаны ксеноки гуппи

ЛД ВД ЛД ВД ЛД ВД

ДКР 51,0*2.3 41.2*3.5 41.7*2,4 92, 6*2, 3 76,7*2,2 46, 8*3,4 16,4*

ЧПКР РПКР 1,1 ±0.3 26, 8*6, 3 0,4 ±0, 1 16, 0*1, 2 0,4*0,1 14,6*1, 1 0,6*0,1 23,3*3,2 0,7*0,1 24,1*3,0 0,1*0,04 11,3*2,3 О, о

Примечание: ДКР - длина компонентов гладкого ретикулума на 10000 мкм поверхности среза; ЧПКР - число поперечных компонентов на поверхности среза; РПКР - расстояние между соседними поперечными компонентами ретикулума; ВД - вентральный дендрит; ЛД - латеральный дендрит.

Сравнительный анализ результатов морфометрических измерений некоторых параметров ретикулума в МН разных видов рыб позволил обнаружить определенные закономерности в его строении (табл.1) и

выявить корреляцию между степенью организации этого органоида и уровнем двигательной активности подопытных рыб. Наибольшее развитие гладкий ретикулум получает у ксенотоков, самых подвижных среди изученных рыб, за исключением гуппи, наименьшее у ротанов, проводящих значительный период времени в состоянии затаивания. В МН золотых рыбок результаты измерения гладкого ретикулума имели промежуточное значение и их поведение тоже характеризовалось средней активностью. Наиболее быстрые, подвижные рыбы, гуппи, отличались некоторыми особенностями в строении гладкого ретикулума в дистальных отделах обоих дендритов МН, в цитоплазме которых обнаружено большое число разбухших гипертрофированных цистерн. В вышележащих отделах этих дендритов структура ретикулума приобретает обычный вид и состоит в основном из продольных тубул и канальцев. В связи с тем, что количественные измерения в данном случае отражали строение ретикулума преимущественно средних участков дендритов, т.к. невозможно было стандартными способами провести измерение гипертрофированных цистерн, эти результаты оказались заниженными по сравнению с полученными на других видах рыб.

2. Структура гладкого ретикулума в дендроплазме МН мальков

Мальки золотых рыбок и гуппи обладали двигательной активностью, свойственной взрослым особям соответствующего вида рыб: первые характеризовались плавными движениями с невысокой скоростью, а вторые отличались большой подвижностью. Ультраструктурная организация гладкого ретикулума МН мальков имела общие черты в строении с ретикулумом взрослых животных и отличалась " признаками структурной незрелости (табл. 2). При морфометрическом анализе МН мальков золотой рыбки с взрослыми особями выявлено, что протяженность компонентов гладкого ретикулума у них в полтора раза меньше и поперечные элементы ретикулума тоже встречаются существенно реже, чем у взрослых.

При ультраструктурном анализе МН мальков гуппи было выявлено, что гладкий ретикулум у них характерен наличием тех же набухших гипертрофированных цистерн в дистальных участках обоих главных дендритов, что у взрослых гуппи. В средних и проксимальных участках дендритов гладкий ретикулум был представлен короткими продольными канальцами и тубулами, поперечно ориентированные элементы ретикулума встречались очень редко. Количественные измерения показали, что протяженность

компонентов гладкого ретикулума в МН мальков гуппи в несколько раз меньше, чем у взрослых рыб (табл. 1,2).

Полученные результате вкупе с литературными данными позволяют сказать, что у половозрелых животных наблюдается закономерное усложнение организации внутринейрональных структур (Заварзин, Харазова, 1982; Артюхина,1989; Мошковидр., 1992). На примере гладкого эндоплазматического ретикулума это проявляется в форме прогрессивного развития и усложнения сети канальцев и цистерн с образованием хорошо выраженных поперечных составляющих.

Таблица 2. Результаты морфометрических измерений гладкого эндоплазматического ретикулума МН мальков, X 1

золотые рыбки гуппи

лд вд лд вд

ДКР ЧПКР РПКР 33,8 - 2,4 0,3 ± 0,1 16,2 ± 0,1 37,6 ± 2,6 0,8 ± 0,1 20,5 ± 1,4 6,5 1 1,3* 0, 1 ±0,01 13,0 ± 2,0 5,6 ± 0,8*

Примечание: * - Р < 0,001 по сравнению с взрослыми рыбами соответствующего вида

3. Сравнительный анализ влияния длительной сенсорной стимуляции на строение гладкого ретикулума МН мальков и половозрелых рыб.

Параллельные поведенческие и ультраструктурные исследования позволили установить, что интенсивная 2х часовая стимуляция МН через афферентные входы от вестибулярного и зрительного анализаторов приводит к значительным перестройкам в структуре этих клеток у мальков. На поведенческом уровне это проявлялось как угнетение двигательной активности, в особенности реакции спонтанного , выполнения поворотов, которая, как известно, непосредственно регулируется МН и зависит от их функционального состояния (Мошков, 1985). На ультраструктурном уровне эффект стимуляции проявлялся следующим образом: профиль ядра вытягивался, цитоплазма вакуолизировалась, снижалось число рибосом, запустевали синалтические бутоны. В дендроплазме была выявлена значительная пролиферация гладкого эндоплазматического

ретикулума. Это выражалось в увеличении общей протяженности канальцев и цистерн, появлении большего числа поперечных компонентов. напоминающих септы, и усиленном развитии субповерхностных цистерн, которые выглядели набухшими, приобретали ответвления, уходящие вглубь дендроплазмы, где ассоциировались с другими компонентами ретикулума. Морфометрические измерения показали, что длина компонентов гладкого ретикулума увеличивалась более чем в полтора раза, и теперь становилась сопоставимой с данной величиной у взрослых интактных золотых рыбок. Количество поперечных составляющих ретикулума тоже достигло значений, наблюдаемых у взрослых рыб (табл.3). Отмечена направленность некоторых таких поперечных канальцев в сторону синаптических контактов и их частичная приуроченность к синаптическим бутонам, расположенным на поверхности дендрита. В результате стимуляции регистрировалось набухание митохондрий, их кристы редуцировались, матрикс просветлялся. Цитоскелет имел явные следы повреждения, он становился рыхлым, число микротрубочек сокращалось, нейрофиламенты теряли свою упорядоченную структуру и были представлены укороченными извитыми волокнами.

В МН взрослых ксенотоков интенсивная сенсорная стимуляция оказывала меньшее воздействие на тонкое строение изучаемых клеток, которое проявлялось в основном на пресинаптическом уровне. В пресинаптических бутонах частично или полностью исчезали синаптические везикулы, матрикс просветлялся, цитоплазма бутонов вакуолизировалась. Эти изменения в одинаковой мере были присущи обоим дендритам МН. Ультраструктура самих нейронов не претерпевала заметных изменений. В дендритах сохранялась цитоскелетная нейрофиламентозная сеть. Количественный анализ позволил установить определенную трансформацию в строении гладкого ретикулума, которая состояла в некотором увеличении общей длины его элементов в вентральном дендрите (в 1,2 раза) и возрастании числа поперечных компонентов в обоих дендритах (в 1,4-2 раза; табл.3). На поведенческом уровне эффект стимуляции у ксенотоков оказался менее выраженным, чем у мальков; судя по изменению скорости поступательного движения - в 4 раза, а по способности совершать повороты - многократно, т. к. у мальков данная форма поведения после экспериментального воздействия практически исчезала.

Таблица 3. Результаты морфометрических измерений гладкого эндоплазматического ретикулума МН рыб после сенсорной стимуляции, X 1 ДЬ

золотые рыбки, мальки ксенотоки, взрослые /

лд вд лд ВД

ДКР ЧПКР РПКР 51,2 ± 2,6** 0,5 - 0,1* 16,5 ±0,9 61,3 ± 2,4 1,1 ± 0,1* 18,6 ± 0,6 85,6 ±3,6 1,5 ± 0,2** 20,8 ±0,8 95,0 ± 3,1** 1,0 ± 0,3 20,2 ± 2,4

Примечание: * - Р < 0,05; ** - Р < 0,001 по сравнению с соответствующими интактными рыбами.

Полученные данные сравнительного морфометрического анализа у мальков и взрослых рыб демонстрируют, что несмотря на сходство размеров МН у мальков золотой рыбки и взрослых нсенотонов еЬ а1., 1987), особи, достигшие половозрелого возраста, обладают повышенной резистентностью к экстремальным нагрузкам. Наблюдается положительная корреляция между устойчивостью на клеточном уровне в форме лучшей сохранности внутриклеточных органоидов, и на поведенческом уровне в форме сохранения большей двигательной активности после экспериментального воздействия.

В связи с установленным фактом значительной пролиферации гладкого ретикулума в дендроплазме МН рыб, вызванной экспериментально 2х часовой сенсорной стимуляцией, закономерно встает вопрос - какое значение имеет данное ускоренное развитие компонентов ретикулума в МН мальков до уровня, соответствующего состоянию этого органоида в аналогичных клетках интактных взрослых рыб и образование его дополнительных элементов в дендроплазме стимулированных взрослых рыб. По условиям нашего эксперимента с принудительным вращением рыб, происходит естественная стимуляция вестибулярного аппарата и зрительного анализатора, главных источников афферентных окончаний на МН. Очевидно, что в период подобной синаптической активации происходит продолжительное, массивное поступление ионов кальция в нейроны. Именно это, вероятно, ведет к повреждению и гибели клеток (Оггешиз е1 а1., 1989). С другой стороны, в настоящее время идет активная дискуссия о том, что среди функций гладкого ретикулума одной из важнейших является участие в быстром захвате

и депонировании ионов кальция, во всяком случае в нервных клетках (Костюк, 1992; МеШо1еву, 1994; Роггапе1а1., 1994). После рассмотрения литературных данных и собственных результатов, мы пришли к заключению, что обнаруженная пролиферация гладкого ретикулума, особенно значительная в незрелых МН мальков, не обладающих полностью сформированными внутриклеточными органоидами, связана именно с необходимостью устранения повышенной концентрации кальция и в этом заключается основной биологический смысл выявленной пролиферации гладкого ретикулума.

4. Влияние частичной деафферентации и длительной сенсорной стимуляции на структуру МН.

К настоящему моменту установлено, что МН, являясь командными нейронами, получают многочисленные афферентные входы от разных органов чувств в виде синалтических окончаний. Причем входы от двух важнейших анализаторов - вестибулярного и зрительного - строго сегрегированы: латеральный дендрит получает иннервацию от отолитов, вентральный - от зрительного анализатора (гоиоП et а1., 1978). Удаление одного из наиболее значительных для МН зрительного анализатора существенно ослабит поток афферентных импульсов на вентральный дендрит как в покое, так и при экспериментальной сенсорной стимуляции при одновременном полноценном функционировании латерального дендрита. Таким образом имеется уникальная возможность изучения и сравнения на одной клетке ультраструктурных перестроек в обоих дендритах в условиях их различной функциональной активности.

Эксперименты проводили после нормализации поведения, не ранее чем через 2 недели после энуклеации. Морфологический анализ МН оперированных рыб не выявил дегенеративных изменений в нейронах, ни в соматической части, ни в обоих дендритах. Исследование ультраструктурных перестроек в МН в ответ на интенсивную сенсорную стимуляцию энуклеированных мальков золотой рыбки показало лучшую сохранность всех внутриклеточных органоидов МН по сравнению со стимулированными МН зрячих- мальков, в том числе и гладкого ретикулума. Основные различия были выявлены в строении цитоскелета. При сравнении с МН зрячих мальков, у которых нейрофиламентозная сеть в результате сенсорной стимуляции имела рыхлый, разреженный вид, в МН слепых рыбок наблюдалось увеличение плотности расположения нейрофиламентов с образованием пучков нейрофибрилл.

Аналогичные результаты были получены на МН энуклеированных взрослых ксенотоках. Ультраструктурная картина их нейронов после стимуляции была схожа с наблюдаемой в контрольных препаратах. Некоторые изменения были выявлены в структуре цитоскелета и, хотя нейрофиламентозные пучки встречались довольно редко. многие участки дендроплазмы выделялись более плотным расположением нейрофиламентов. Тестирование двигательной активности показало, что инактивация зрительных входов на МН способствовала лучшей сохранности двигательных реакций и. в особенности, реакции поворотов.

Полученные результаты, свидетельствуют об увеличении резистентности МН к длительной стимуляции на ультраструктурном и функциональном уровне. Очевидно, при их частичной деафферентации снижается сила экспериментального раздражения. Это ведет к уменьшению количества ионов кальция, поступающих в цитоплазму нейронов во время воздействия, в результате чего концентрация этих ионов не достигает критического уровня для запуска деструктивных процессов, обнаруживаемых в МН зрячих подопытных рыб. Существенно, что при этом мы выявили одинаковую ультраструктурную картину в обоих дендритах - и с полноценной афферентацией, и с частично удаленной. Это можно объяснить, исходя из предположения, что структура ретикулума в МН рыб имеет непрерывный характер и объединяет свои компоненты, находящиеся в дендритах и соматической части клетки в единый компартмент, по аналогии с нейронами Пуркинье (Martone et, al., 1993; Terasaki et al., 1994). Мы считаем, что сеть ретикулума может в данном случае координировать свою работу и перераспределять ионы кальция из более "загруженного" латерального дендрита в менее "загруженный" вентральный дендрит, что ведет к более быстрому и полному устранению избытка кальция из цитозоля. Благодаря этому происходит дополнительное снижение травмирующего воздействия стимуляции, а значит лучше сохраняется ультраструктура обоих дендритов.

Известно, что повышенная концентрация ионов кальция в клетке разрушает цитоскелетную сеть (Orrenius et al., 1989). Этот эффект мы обнаружили после сенсорной стимуляции в МН зрячих рыб . Однако в дендроплазме частично деафферентированных МН мы выявили не деградацию, а скорее трансформацию элементов цитоскелета с образованием ; пучков нейрофиламентов. Известно, что благодаря особым физико-химическим свойствам пучков по сравнению с отдельными нитями (Schmidt, Shashoua, 1988) они более стабильны к

повреждающим воздействиям. Такая стабилизация цитоскелетной сети может способствовать усилению резистентности МН к длительной стимуляции.

5. Выявление локализации ионов кальция в дендроплазме МН рыб в покое и после сенсорной стимуляции.

Цитохимическое выявление ионов кальция в препаратах интактных нейронов ксенотоков позволил обнаружить преципитат пироантимоната кальция преимущественно в синаптической щели в области активных зон. Сенсорная стимуляция ведет к перераспределению этих ионов из синаптической щели вглубь цитоплазмы. Обнаружено, что активное накопление кальция идет в расположенных вблизи активных зон синапсов субповерхностных цистернах, которые относят к производным гладкого ретикулума (Ме1с1о1езу, 1994), В более глубоко расположенных цистернах и канальцах ретикулума осадок связанного кальция преимущественно ассоциирован с внешней стороной мембраны и реже встречается в их просвете, очевидно, в связи с тем, что в элементах гладкого ретикулума ионы кальция связываются белками типа кальсеквестрина, что препятствует их обнаружению (Петруняка, 1987). По-видимому, эти более глубоко расположенные компоненты ретикулума являются "дренажной системой", отводящей ионы кальция из примембранной области в глубокие слои цитоплазмы, увеличивая этим ее аккумулирующую активность.

Другим важным депо ионов кальция в клетках являются митохондрии. Значительное количество осадка этих ионов было выявлено внутри митохондрий, в просвете между внешней и внутренней мембранами. Поскольку предполагается, что система митохондриального кальциевого транспорта включается при возникновении значительной перегрузки клеток кальцием (Бот1уо, 1984; Ме1йо1ез1 et а1., 1990), это свидетельствует, что сила экспериментального воздействия на МН была действительно высока, и это, в свою очередь, хорошо согласуется с данными поведенческого анализа.

В связи с интенсивной стимуляцией клеток концентрация ионов кальция может повышаться в их цитоплазме с 0,1 мкМ до 10 мнМ (Костюк, 1986) и становиться доступной для выявления этих ионов методикой пироантимонатного связывания (Петруняка, 1987). Поэтому не удивительно, что определенное количество связанных ионов Са2+ выявлено после сенсорной стимуляции не в мембранных структурах, а

непосредственно в цитозоле и на элементах цитоскелета.

На важное значение гладкого ретикулума в регуляции концентрации ионов кальция в нейронах указывалось во многих работах (КосП, 1990; Нер1ег еХ а1., 1990; Тегаэак! et а1., 1994). При этом связывание ионов кальция может отличатся значительной неравномерностью в разных участках цитоплазмы, из-за неравномерного распределения внутриклеточных Са11 -запасающих органелл (Маг(;оге е1 а1., 1993). На нейронах моллюсков, например, самая высокая буферная емкость была выявлена в примембранных областях клетки (Костюк, 1986). В наших экспериментах мы обнаружили после стимуляции значительное количество связанных ионов в субповерхностных цистернах, которые вероятно являются первыми внутриклеточными органеллами, включающимися в захват и депонирование кальция с момента превышения физиологических значений его концентрации.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Пластические свойства составляющих нервную систему отдельных нервных клеток, т.е. их способность перестраивать структуру внутриклеточных органоидов в связи с функциональной активностью лежат в основе адаптации, приспособления организмов к непрерывно меняющимся условиям окружающего мира. Изучение тонких механизмов, регулирующих данные приспособительные перестройки в отдельном нейроне было целью наших исследований.

Основное внимание было уделено изучению ультраструктуры гладкого эндоплазматического ретикулума в МН рыб. Нами было обнаружено наличие хорошо развитой септальной структуры гладкого ретикулума, пронизывающей всю цитоплазму клетки. У неполовозрелых животных в МН этот органоид представлен в основном продольными цистернами и канальцами. В период зрелости рыб он приобретает более развитую и лучше организованную форму с хорошо выраженными поперечными составляющими ретикулума, часто приуроченными к области синаптических контактов, значительно чаще встречаются субповерхностные цистерны. Выявлено, что организация ретикулума, степень его развитости в МН половозрелых рыб разных видов коррелирует с их поведенческими характеристиками: рыбы с более активными двигательными реакциями имеют лучше организованный и развитый ретикулум.

Сенсорная стимуляция МН, вызываемая в эксперименте, сопровождается пролиферацией гладкого ретикулума. У мальков, судя

по морфометрическим данным, уровень развития гладкого ретикулума достигал значений, характерных для этого органоида в МН взрослых интактных рыб соответствующего вида. У взрослых рыб, обладающих зрелыми МН с полностью сформированными внутриклеточными органоидами, стимуляция приводила к менее выраженной пролиферации рптикулума.

Биологический смысл таких пластических перестроек ретикулума становится ясным, если принять во внимание его функциональное значение в нервной клетке. Согласно современным представлениям, гладкий ретикулум являясь важным внутриклеточным депо для ионов кальция, участвует в быстрой регуляции их концентрации (Meldolesi et al., 1994; Kost.yuk, Verkhrasky, 1994), поскольку в больших количествах он может стать причиной гибели клетки (Orrenius et al., 1989). В наших экспериментах при длительной интенсивной стимуляции МН рыб происходит значительное увеличение концентрации Са?+ в цитоплазме клетки. Его более активное устранение происходит за счет пролиферации элементов гладкого ретикулума. Увеличение числа субповетхностных цистерн и поперечных компонентов ретикулума, локализующихся около синапсов, связано, видимо, с тем, что основные "ворота", через которые ионы поступают в цитоплазму, расположены на постсинаптической мембране активных зон (Smith, Augustia, 1987). Субповерхностные цистерны, вероятно, первыми включаются в процесс депонирования Са"' с момента повышения его концентрации. Отсюда кальций по другим элементам ретикулума транспортируется в его цистерны, расположенные в более глубоких слоях цитоплазмы, где связывается белками типа кальсеквестрина. Наши результаты, полученные в опытах по цитохимическому выявлению ионов кальция хорошо согласуются, с этим предположением.

Уменьшение синаптической активности у частично деафферен-тированных-рыб, практически не сказывалось на ультраструктурном состоянии их МН. Сенсорная стимуляция оказывала на таких рыб меньшее влияние по сравнению со зрячими. Это выявлялось и при тестировании двигательной активности, и при изучении тонкого строения МН. Мы объясняем этот эффект уменьшением силы экспериментального воздействия, несмотря на соблюдение стандартных условий воздействия. При сенсорной стимуляции рыб, афферентное возбуждение на МН поступает преимущественно от вестибулярного и зрительного анализаторов, удаление последнего уменьшает поток возбуждения и снижает общее количество Са2+, поступившего в МН в данных условиях, в результате чего их

концентрация не достигает критического уровня для запуска деструктивных процессов, выявленных в МН зрячих рыб.

Таким образом, можно сказать, что структурно-функциональное единство в нейроне имеет сложный характер и зависит от разных факторов. Выявляя последовательно связи и зависимости между структурой и функцией отдельных клеточных органелл, мы сможем в конечном счете сложить истинную картину скрытых механизмов, регулирующих деятельность нервной клетки и научимся управлять ими.

Выводы

1. В дендроплазме маутнеровских нейронов рыб впервые выявлена специфическая упорядоченная септапьная организация гладкого эндоплазматического ретикулума, состоящая ия продольно и поперечно расположенных цистерн и канальцев.

2. Параллельные ультраструктурные и поведенческие исследования показали, что организация гладкого эндоплазматического ретикулума в маутнеровских нейронах коррелирует с уровнем врожденной двигательной активности рыв. У более активных видов рыб степень развития и организации ретикулума была выше, чем у менее активных.

3. В маутнеровских нейронах мальков рыб организация гладкого ретикулума повторяет в общих чертах строение ретикулума взрослых рыб соответствующего вида, но отличается меньшой развитостью.

4. Интенсивная сенсорная стимуляция маутнеровских нейроном мальков золотой рыбки приводит к значительной пгюлийерации гладкого эндоплазматического ретикулума. Зто выражаете,я в увеличении протяженности всех компонентов ретикулума, увеличении числа поперечных цистерн и канальцев и возрастании количества оубповерхнпстных цистерн до уровня, характерного для этой структуры у взрослых рыб.

5. Аналогичная стимуляция маутнеровских нейронов нзрослых рыб вызывала меньшую пролиферацию гладкого ретикулума и оказывала более слабое воздействие на поведение рыб. По-видимому, морфологическая зрелость ретикулума способствует функциональной стабильности нейронов.

6. Длительная стимуляция маутнеровских нейронов на фоне частичной деафферентации одного из его дендритов оказывается более щадящей как для структуры, так и для функционального состояния

этих нейронов. Предполагается, что структура ретикулума в соме и обоих дендритах представляет собой единый компартмент, эффективно перераспределяющий ионы кальция из зоны с опасно возросшим уровнем в одном локусе клетки в области с его меньшей концентрацией, что способствует нормальному функционированию к.лртки.

7. Проведено цитохимическое выявление локализации ионов кальция в маутнеровских нейронах рыб в норме и после длительной стимуляции. Проанализирован путь, по которому кальций поступает в клетку и где он депонируется. Показано, что первичное накопление и перераспределение этих ионов в результате интенсивной стимуляции происходит с участием гладкого ретикулума, и в первую очередь его производных, субповерхностных цистерн.

8. На основании сравнительного анализа полученных данных по организации гладкого ретикулума в маутнеровских нейронах, находящихся на разной стадии зрелости и его реакции на стимуляцию, а также цитохимических данных можно заключить, что выявленная нами специфически организованная сеть гладкого ретикулума способна к пластическим перестройкам, связанным с функциональными потребностями нейрона. Физиологический смысл пластичности ретикулума состоит в регуляции гомеостаза ионов кальция за счет их быстрого депонирования и транспортирования вглубь цитоплазмы. При травмирующем воздействии на маутнеровские нейроны ретинулум может пролиферировать, что способствует увеличению буферной емкости депо и предохраняет клетку лт повреждения и гибели.

СПИСОК РАБОТ. ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Санталова И. М', Мошков Д.А. Исследование вклада двух разных афферентных входов в утомление маутнеровских нейронов золотой рыбки. В сб. Ультраструктура и пластичность нейронов. Пущино, 1990, стр.91-100.

2. Moshkov П. А. , Santalova I.M., Tiras N. R.. Zheniev G.V. . Kashapova L. A. Interaction two different sensory inputs at the level jf Mauthner neurons in goldfish. Morphofunctiona) analysis. Signal molecule,", and behaviour. Manchester: Univ. Press, 1991, p. 285-289.

3. Санталова И. M., Мотков Д. А. Локализация ионов кальция в дендритах маутнеровских нейронов аквариумных рыб ксенотоков в

покое и после вестибулярной стимуляции. - Цитология, 1993, т.35, N 8, стр. 30-37.

4. Санталова И.М., Мошков Д.А. Регулярная сеть гладкого ретикулума в дендритах маутнеровских нейронов рыб. Электронномикроскопическое исследование. - Морфология, 1993, N 7-8, стр.50.

5. Санталова И. М., Мошков Д. А., Кгжоя U.M., Михалева И. И., Зиганшин P.X. Влияние кеоторфина на ультраструктуру и функцию маутнеровских нейронов золотой рыбки. В сб."Колосовские чтения -94" С, - Петербург, 1994, стр.64.

6. Санталова И.М., Мошков Д.А. Ультраструктура дендритов как индикатор функционального состояния маутнеровских нейронов. Цитология. 1995, т. 37. N 1-2, стр. 91-100.

7. Moshkov D.A., Rantalova I.M. Distribution of calcium piroantimonate precipitates in Xenotoca Mautliner cells at normal and increased functional activity. - Neurosclece, 1995, v.65, N 3, p.917-925.

8. Санталова И.M., Мошков Д.А. Реакция цитоскелета и гладкого ретикулума маутнеровских нейронов золотой рыбки на частичную денервацию и длительную сенсорную стимуляцию. - Морфология, 1996, (в печати).

22.02.96 г. Зак.6905Р. Тир.100 экз. Усл.печ.л. 1,0

Отпечатано на ротапринте в 0НТИ ПНЦ РАН