Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Участие тирозиновой протеинфосфатазы SHP-1 в передаче сигнала от рецептора инсулина

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Кривцов, Андрей Владимирович, Москва

РОССИЙСКИЙ КАРДИОЛОГИЧЕСКИЙ НАУЧНО-ПРОИЗВОДСТВЕННЫЙ КОМПЛЕКС МЗ РФ

На правах рукописи

КРИВЦОВ Андрей Владимирович

Участие тирозиновой протеинфосфатазы 8НР-1 в передаче сигнала от

рецептора инсулина

03.00.04. - Биохимия

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель: д.б.н. Меньшиков М.Ю. Научный консультант: к.б.н. Ульрих А.

Москва - 1999 г.

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ...........................................................................................................5

ВВЕДЕНИЕ...................................................................................................................................7

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.................................................................................................................9

1. РОЛЬ ФОСФОРИЛИРОВАНИЯ ТИРОЗИНОВЫХ ОСТАТКОВ В КЛЕТОЧНОЙ СИГНАЛИЗАЦИИ........................................................................................................................9

2. БЕЛКИ УЧАСТВУЮЩИЕ В СИГНАЛИЗАЦИИ ОТ РОСТОВЫХ ФАКТОРОВ................9

2.1. Рецепторы ростовых факторов......................................................................................9

2.2. Рецепторы PDGF и EGF.................................................................................................11

2.3. Рецептор инсулина........................................................................................................ 11

2.3.2. Уникальность инсулиновой сигнализации..............................................................12

2.4. Сигнальные белки, расположенные «ниже» рецептора инсулина. МАРкиназный путь..........................................................................................................................................13

2.4.1. SH2 домены или SH2 содержащие белки...............................................................13

2.4.2. Адапторный белок She (Src Homology / Collagen)..................................................13

2.4.3. Комплекс Grb2/SOS..................................................................................................14

Активация MAP киназы......................................................................................................14

2.5. Участие IRS-1 в инсулиновой сигнализации и путь Р13-киназы.............................15

2.5.1. Идентификация IRS-белков....................................................................................16

2.5.2. IRS- белки координируют разветвленную и гибкую сигнальную систему............17

2.5.3. Сигнальные белки, взаимодействующие с IRS-1...................................................19

2.6. Р13-киназа и роль IRS-1 в её активации. Р13-киназный путь.................................... 19

2.7. тирозиновые протеинфосфатазы SHP-1 и SHP-2......................................................21

2.7.1. SHP-1 в гематопоэтических клетках.......................................................................22

2.7.2. SHP-1 и SHP-2 и Т-клеточная сигнализация..........................................................24

2.8. IRS-1 активирует фосфатазу SHP-2.............................................................................25

2.9. ингибирование сигнализации через IRS-1.................................................................26

2.10. Семейство белков SIRPa............................................................................................27

3. СИНТЕЗ ГЛИКОГЕНА И РОЛЬ ГЛИКОГЕНСИНТЕТАЗЫ В СИНТЕЗЕ ГЛИКОГЕНА. 28

3.1. Активация синтеза гликогена инсулином................................................................28

3.2. Судьба глюкозы в организме.......................................................................................28

3.3. Стадии, определяющие скорость синтеза гликогена..............................................29

3.4. Механизм активации гликогенсинтетазы.................................................................32

3.4.1. Дефосфорилирование гликогенсинтетазы приводит к ее активации....................32

3.4.2. Передача инсулинового сигнала на гликогенсинтетазу.........................................33

3.5. Инактивация инсулином киназы, фосфорилирующейГС......................................35

3.6. Другие сигнальные пути, которые могут участвовать в регуляции ГС.................36

РЕЗЮМЕ....................................................................................................................................37

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ............................................................................................38

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ..................................................................................................38

2.1. Материалы......................................................................................................................38

2.1.1. Реактивы и материалы для биохимических и молекулярно-биологических

исследований.......................................................................................................................38

2.1.2. Реактивы и материалы для клеточно-биологических исследований.....................38

2.1.3. Реактивы и материалы для иммунохимических исследований..............................38

2.2. экспрессионные плазмиды.........................................................................................40

2.3. Праймеры и пептиды.....................................................................................................40

2.4. Клеточные линии...........................................................................................................41

2.5. Культивирование клеток..............................................................................................41

2.6. Стимуляция клеток лигандами, обработка вортманнином, конканавалином и

перванадатом, лизис клеток...............................................................................................42

2.7. иммунопреципитация..................................................................................................42

2.8. электрофорез в ПААГ в присутствие ДСН и..............................................................43

2.9. иммуноблоттинг (вестерн блоттинг)..........................................................................43

2.10. транзиторная гиперэкспрессия.................................................................................44

2.11. Стабильная гиперэкспрессия....................................................................................44

2.12. Определение активности фосфатидилинозитол-З ' киназы...................................45

2.13. Измерение активности гликогенсинтетазы.............................................................46

2.14. Измерение включения [3Н] тимидина в ДНК...........................................................46

2.15. Определение пролиферации по включению МТТ....................................................47

2.16. Измерение транспорта [3Н]-глюкозы в клетку.........................................................47

2.17. Измерение фосфатазной активности.......................................................................48

2.18. Мутагенез in vitro.......................................................................................................48

2.18.1. Получение одноцепочечной ДНК..........................................................................48

2.18.2. Отжиг праймеров и построение цепи ДНК, содержащей мутацию.....................49

2.18.3. Лигирование цепи ДНК, содержащей мутацию...................................................50

2.19. Выделение плазмиднойДНК.....................................................................................50

2.20. Определение нуклекотидной последовательности ДНК.......................................51

2.20.1. Щелочная денатурация ДНК..................................................................................51

2.20.2. Отжиг праймера......................................................................................................51

2.20.3. Сиквенсная реакция................................................................................................51

2.21. Ферментативное дегликозилирование белков........................................................52

2.22. Мечение клеток [3Н] глюкозаминомивыделенииеГФИ.......................................52

3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.......................................................................................54

3.1. Сравнительная характеристика связывания SHP-1 и SHP-2 с рецепторами факторов роста, EGF, PDGF и инсулина............................................................................54

3.1.1. Связывание SHP-1 и SHP-2 с рецептором EGF......................................................54

3.1.2. Связывание SHP-1 и SHP-2 с рецептором PDGF...................................................55

3.1.3. Связывание SHP-1 и SHP-2 с рецептором инсулина..............................................56

3.2. Связывание SHP-1 с субстратом рецептора инсулина - IRS-1................................57

3.2.1. Связывание SHP-1 и SHP-2 с IRS-1 в клетках BHK-IR..........................................57

3.2.2. Связывание эндогенных SHP-1 с IRS-1 в клетках IM9..........................................59

3.2.3. Картирование SH2 домена SHP-1, участвующего в связывании с IRS-1..............60

3.2.4. Взаимодействие IRS-1 с SHP-1 в клетках Rati........................................................61

3.2.4.1. Дефосфорилирование IRS-1 фосфатазой SHP-1 в клетках Rati......................62

3.2.4.2. Сравнительная характеристика IRS-1- зависимой активации Р13-киназы в клетках Rati, экспрессирующих каталитически активную и не активную SHP-1........64

3.3. Влияние стабильной экспрессии SHP-1 на биологические ответы клеток Rati, вызванные инсулином.........................................................................................................65

3.3.1. Активация гликогенсинтетазы................................................................................65

3.3.2. Синтез ДНК..............................................................................................................66

3.3.3. Клеточная пролиферация.........................................................................................67

3.3.4. Регуляция инсулин-зависимой активации фосфолипазы С, специфичной в отношении ГФИ в клетках Rati..........................................................................................68

3.3.4.1. Инсулин стимулирует расщепление ГФИ в Rati клетках................................69

3.3.4.2. Инсулин активирует ГФИ специфичную фосфолипазу С...............................70

3.3.4.3. Инсулин-зависимая активация ГФИ специфичной фосфолипазы С чувствительна к вортманнину.........................................................................................71

3.4. белок SIRPa - субстрат фосфатазы SHP-1.................................................................72

3.4.1. Предпосылки к изучению взаимодействия SHP-1 с SIRPa....................................72

3.4.2. Связывание SHP-1 с SIRPa......................................................................................73

3.4.3. Активация SHP-1 фосфопептидами SIRPa.............................................................75

3.4.6. SIRPa как субстрат для SHP-1.................................................................................76

3.4.6.1. Изучение взаимодействия SH0P-1 и SIRPa с помощью синтетических пептидов SIRPa...............................................................................................................77

3.4.6.2. Картирование SH2 домена SHP-1, опосредующего связывание с SIRPa.......78

3.5. Структурные и функциональные свойства нового субстрата фосфатазы SUP-1 -белка SIRPa............................................................................................................................79

3.5.1. Кросс-сшивка SIRPa с помощью антител не вызывает его тирозиновое фосфорилирование..............................................................................................................80

3.5.2. SIRPa образует устойчивые кластеры.....................................................................81

3.5.3. Влияние SIRPa на метаболические эффекты инсулина.........................................83

3.5.3.1. Транспорт глюкозы...........................................................................................83

3.5.3.2. Активация гликогенсинтетазы..........................................................................84

3.6. Контроль уровня фосфорилирования SHP-1..............................................................84

3.6.1. SHP-1 обладает способностью к аутодефосфорилированию.................................85

3.6.2. Димеризация SHP-1..................................................................................................86

3.6.3. Поиск адаптора, на котором могут образовываться димеры SHP-1......................88

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ...............................................................................................90

1. Взаимодействие SHP-1 и SHP-2 с рецепторами факторов роста...............................90

2. Аутодефосфорилирование SHP-1 как процесс, контролирующий уровень шрозинового фосфорилирования этой фосфатазы.........................................................93

3. Участие фосфатазы SHP-1 в регуляции уровня тирозинового фосфорилирования IRS-1........................................................................................................................................94

3.1. Участие инозитолфосфогликана в инсулиновой сигнализации...............................96

4. Влияние стабильной экспрессии SHP-1 на митогенные эффекты инсулина...........97

5. Структурные и функциональные свойства нового субстрата фосфатазы SHP-1 -белка SIRPa............................................................................................................................98

ВЫВОДЫ..................................................................................................................................101

БЛАГОДАРНОСТИ.................................................................................................................. 102

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ.........................................................................................................103

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

AMP аденозинмонофосфат

ATP аденозинтрифосфат

cfu колониеобразующая единица

crk киназа подобная циклину, cycline related kinase

ddNTP дидезоксинуклеотидтрифосфат

dNTPs смесь четырех дезоксинуклеотид трифосфатов

DTT дитиотрейтол

EGF фактор роста эпидермиса, Epidermal Growth Factor

EGFR рецептор фактора роста эпидермиса

ERK Extracellular regulated Kinase

fyn киназа семейства Src

Gab-1 докинг-белок семейства IRS- белков

GPI-PLC фосфолипаза С специфичная в отношении

гликофосфатидилинозитола

Grb2 белок, связывающийся с рецепторами факторов роста; Growth

Receptor Binding protein-2

GSK-3 киназа гликогенсинтетазы-3

HA гемоагглютинин

IGF-1 инсулино подобный фактор роста, Insulin-like Growth Factor

IL интерлекин

IR рецептор инсулина, Insulin Receptor

IRS-1 субстрат-1 инсулинового рецептора

IRS-2, 4PS субстрат-2 инсулинового рецептора

LB культуральная среда Лоуренса - Бертани

MAP Mitogen Activated Protein

MEK киназа MAP киназы

MTT Тиозолин голубой

PDGF фактор роста из тромбоцитов, Platelet Derived Growth Factor

PDGFR рецептор тромбоцитарного фактора роста

pfu бляшкообразующая единица

PH домен гомологичный плекстрину, Plextrin Homology domain

PI фосфатидилинозитол

PI3-k фосфатидилинозитол-3 '-киназа

PMSF фенилметилсульфонил фторид

pNPP р-нитрофенилфосфат

PS фосфатидилсерин

PTB связывающий фосфотирозин домен; Phosphotyrosine Binding

Domain

SH2 Src Homology -2

SH3 Src Homology -3

SHP-1 фосфатаза-1, содержащая SH2 домены; SH2-containing

Phosphotase-1

SHP-l-CS каталитически неактивная форма SHP-1

SHP-1 -CS-HA SHP-l-CS с добавленной НА-последовательностью

SHP-1-HA SHP-1 с добавленной НА последовательностью

SHP-1-R138K форма SHP-1 с заменой аргинина 138 на лизин

SHP-1-R32/138K форма SHP-1 с заменой аргининов 32 и 138 на лизины

SHP-1-R32K форма SHP-1 с заменой аргинина 32 на лизин

SHP-2 фосфатаза 2, содержащая SH2 домены; SH2-containing Phosphotase-2

SHP-2-CA каталитически неактивная форма SHP-2

SOS белок Son Of Sevenless

Src киназа вируса саркомы Рауса

БСА бычий сывороточный альбумин

ГС гликогенсинтетаза

ГФИ гликофосфатидилинозитол

ДМЕМ минимальная среда Игла модифицированная Dulbecco

ДМСО диметилсульфоксид

ДСН додецилсульфат натрия

кДНК кодирующая последовательность ДНК

ПААГ полиакриламидный гель

ПХ пероксидаза хрена

ПЦР полимеразная цепная реакция

РТПК рецепторная тирозиновая протеинкиназа

РТПФ рецепторная тирозиновая протеинфосфатаза

ТПК тирозиновая протеинкиназа

ТПФ тирозиновая протеинфосфатаза

ТХУ трихлоруксусная кислота

ФГИ фосфогликоинозитол

ФСБ фосфатно-солевой буфер

ЭГТА этиленгликольбистетраацетат

ЭДТА этилендиаминтетраацетат натрия

НА эпитоп хемоаглютинина, HemaAgglutinin epitop

ЭСТ эмбриональная сыворотка теленка

ВВЕДЕНИЕ

Процессы роста, дифференцировки, выживания, метаболизма и смерти клеток регулируются фосфорилированием и дефосфорилированием сигнальных белков по специфическим тирозиновым остаткам [Ullrich and Schiessinger, 1990]. Фосфорилирование тирозиновых остатков осуществляется тирозиновыми протеинкиназами, а их дефосфори-лирование катализируется тирозиновыми протеинфосфатами. Все рецепторы факторов роста обладают тирозин-протеинкиназной активностью. При взаимодействии ростовых факторов с их рецепторами на клеточной поверхности происходит аутофосфорилирование рецепторных тирозиновых протеинкиназ, выражающееся в их каталитической активации, что приводит к фосфорилированию многих внутриклеточных субстратов этих рецепторов. Считается, что терминация внутриклеточной сигнализации происходит при участии тирозиновых протеин-фосфатаз. В то же время последние данные свидетельствуют о том, что тирозиновые протеинфосфатазы могут не только подавлять сигнализацию, но также и усиливать её [Stein-Gerlach et al., 1998].

Инсулин оказывает множественное воздействие на клетку. С одной стороны он регулирует метаболизм глюкозы в организме [Lawrence and Roach, 1997]. В то же время являясь, фактором роста, он активно воздействует на пролиферацию и дифференцировку клеток [Roth and Cassell, 1983]. Кроме того, инсулин является вазодилятирующим агентом, влияющим на тонус сосудов [Cleland et al., 1998]. Связывание инсулина со своим рецептором (IR) на поверх-ности клеток активирует тирозин-протеинкиназный домен рецептора, что выражается в аутофосфорилировании ß-субъединицы рецептора с последующим связыванием и фосфорилированием внутриклеточных мишиней инсулинового рецептора, -субстрата-1 инсулинового рецептора (IRS-1) и адапторного белка гомологичного src и коллагену (She). Эти два докинг-белка в фосфорилированном по тирозиновым остаткам состоянии связывают множество сигнальных белков, содержащих SH2 домены, образуя муль-тисубъединичные сигнальные комплексы модулирующие передачу сигнала внутри клетки.

Регуляция инсулиновой сигнализации требует участия тирозиновых протеинфосфатаз. К настоящему времени клонированы две тирозиновые протеин-фосфатазы, содержащие SH2 домены (SHP-1 и SHP-2), позволяющие этим фосфатазам связываться с фосфорилиро-ванным инсулиновым рецептором и его субстратами. Выяснение роли этих фосфатаз в

инсулиновой сигнализации может помочь понять механизмы инсулиновой сигнализации, которая до сих пор остается одним из белых пятен молекулярной биологии клетки.

Нарушение обмена глюкозы в организме приводит к серьезному заболеванию -сахарному диабету. При инсулин-независимом сахарном диабете нет нарушений в секреции инсулина в кровь, но при этом инсулин не регулирует метаболизм глюкозы. Это может быть вызвано нарушением процесса передачи сигнала от рецептора инсулина в клетку. С другой стороны, нарушения в инсулиновой сигнализации могут приводить к другим, трагичным для организма, последствиям. Инсулин является фактором роста и контролирует пролиферацию и дифференцировку жировых клеток [Roth and Cassell, 1983; Smith et al., 1997]. Известно, что нарушения механизмов контроля роста клеток, выражаются в безудержной пролиферации клеток, что приводит к появлению злокачественных новообразований [Daughaday and Deuel, 1991]. Выяснение конкретных участников путей сигнализации факторов роств может помочь в создании специфических ингибиторов неконтролируемого роста клеток для терапии раковых образований, а также регуляторов клеточного роста и метаболизма. В частности, понимание механизмов процессов активации инсулином транспорта глюкозы в клетку и синтеза гликогена может помочь в борьбе с таким заболеванием, как инсулин-независимый сахарный диабет.

Целью нашего исследования было выяснение роли фосфатазы SHP-1 в сигнализации рецепторов факторов