Участие регуляторных пептидов в поддержании тканевого гомеостаза слизистой оболочки желудка

Животова, Елена Юрьевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Участие регуляторных пептидов в поддержании тканевого гомеостаза слизистой оболочки желудка
ВАК РФ 03.03.04, Клеточная биология, цитология, гистология

Автореферат диссертации по теме "Участие регуляторных пептидов в поддержании тканевого гомеостаза слизистой оболочки желудка"

На правах рукописи

ЖИВОТОВА Елена Юрьевна

УЧАСТИЕ РЕГУЛЯТОРНЫХ ПЕПТИДОВ В ПОДДЕРЖАНИИ ТКАНЕВОГО ГОМЕОСТАЗА СЛИЗИСТОЙ ОБОЛОЧКИ ЖЕЛУДКА

03.03.04 - клеточная биология, цитология, гистология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

ь ЯНВ 2014

005544,5оо

- Владивосток I 2014

005544386

Работа выполнена в Центральной научно-исследовательской лаборатории государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Дальневосточный государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Научный консультант: Тимошин Сергей Серафимович,

Ведущая организация: Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Новосибирский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Защита диссертации состоится «27» февраля 2014 года в «10.00» часов на заседании диссертационного совета Д 208.007.01 при ГБОУ ВПО «Тихоокеанский государственный медицинский университет» Минздрава России по адресу: 690002, г. Владивосток, проспект Острякова, д. 2

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГБОУ ВПО «Тихоокеанский государственный медицинский университет» Минздрава России по адресу: 690002, г. Владивосток, проспект Остлякова. л. 2

доктор медицинских наук, профессор заслуженный деятель науки РФ, зав. ЦНИЛ ГБОУ ВПО «Дальневосточный государственный медицинский университет» Минздрава России

Официальные оппоненты: Целуйко Сергей Семенович,

доктор медицинских наук, профессор, заведующий кафедрой гистологии, цитологии, эмбриологии, проректор по науке ГБОУ ВПО «Амурская государственная медицинская академия» Минздрава России

Болтовская Марина Николаевна, доктор биологических наук, профессор, заведующая лабораторией клеточной иммунопатологии и биотехнологии ФГБУ «Научно-исследовагалхжий институт морфологии человека»

РАМН

Боровская Татьяна Федоровна,

доктор медицинских наук, профессор кафедры клинической диагностики ГБОУ ВПО «Дальневосточный государственный медицинский университет» Минздрава России

Автореферат разослан

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор медицинских наук, доцен'

I атвеева Наталья Юрьевна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Широкое внедрение в клиническую практику эндоскопических методов исследования выявило значительную распространенность эрозивно-язвенных поражений верхних отделов пищеварительного тракта (Белова Е.В., 2004). Независимо от этиологии, нарушение целостности слизистой оболочки желудка (СОЖ) возникает вследствие дисбаланса факторов агрессии и факторов защиты. Если в отношении язвенной болезни терапевтические подходы разработаны на уровне стандартных рекомендаций, подкрепленных огромным клиническим опытом, то в отношении симптоматических гастропатий такого значительного опыта не существует. Очевидно, что задачей терапии должно быть комплексное повышение устойчивости СОЖ к повреждающим факторам - развитие адаптивной цитопротекции (Jones М.К. et al., 2010). Сложность механизмов нарушения целостности СОЖ определяет либо неизбежность полипрагмазии, либо необходимость поиска новых комплексных лекарственных средств, обеспечивающих поддержание целостности СОЖ. Такие лекарственные средства должны обладать цитопротективным и антиоксидантным действием, модулировать процессы регенерации, улучшать микроциркуляцию, нормапизовывать вегетативный баланс организма, оказывать седативное влияние на ЦНС. Подобным комплексным воздействием на организм обладают некоторые регуляторные пептиды (РП) (Каменский А.А., 2010; Wu G. et al., 2011).

В последние годы достигнут значительный прогресс в исследовании внутриклеточных и тканевых механизмов поддержания тканевого гомеостаза. Достаточное внимание уделялось оценке РП, имеющих отношение к факторам, точкой приложения которых является гастроинтестинальный тракт - гастрину (Singh N. et al., 2012), соматостатину (Tarnawski A.S., Ahluwalia А., 2012), трефоиловым пептидам (Hernández С. et al., 2009), а также факторам роста -эпидермальному (Maity В. et al., 2008), трансформирующему (Jainu М. et al., 2010), инсулиноподобному (Zhao J. et al., 2009).

Хорошо известна высокая эффективность синтетического аналога лей-энкефалина — даларгина - в комплексной терапии язвенной болезни (Алексеенко С.А., Тимошин С.С., 1996). Проведенное нами ранее клинико-экспериментальное исследование выявило выраженное позитивное влияние даларгина на течение гастропатии, индуцированной приемом нестероидных противовоспалительных препаратов (Болоняева Н.А., Животова Е.Ю.. и др., 2005). Изучению участия опиоидных пептидов в регуляции функционирования гастроинтестинального тракта посвящены многочисленные исследования, однако механизмы защитного действия пептидов на эпителий слизистой

оболочки желудка остаются невыясненными (Булгаков С.А., Белоусова E.JL, 2011).

Кроме того, недостаточно изучены участие и характер действия в механизмах цитопротекции и процессах свободнорадикального окисления олигопептидов, на первый взгляд не имеющих прямого отношения к регуляции тканевого гомеостаза желудка, таких как компоненты ренин-ангиотензиновой системы.

В последние годы происходит переосмысление роли свободнорадикальных процессов в поддержании структурного гомеостаза. Соотношение физиологической и патологической компоненты в реализации эффектов активных кислородных метаболитов в каждой исследовательской ситуации решается индивидуально (Меньшикова Е.Б. и др., 2008).

Таким образом, анализ литературы и результаты проведенных нами предварительных исследований позволяют предполагать участие ряда РП в поддержании тканевого гомеостаза СОЖ. Высокая клиническая и социальная значимость проблемы поражения СОЖ, а также перспектива широкого внедрения препаратов на базе различных семейств РП в медицинскую практику, определили выбор темы данного исследования.

Цель исследования. Изучение характера и закономерностей влияния регуляторных пептидов из семейства опиоидных пептидов и компонентов ренин-ангиотензиновой системы на поддержание тканевого гомеостаза слизистой оболочки желудка в физиологических условиях и в условиях патологии.

Задачи исследования.

1. Изучить взаимосвязь между структурой и характером влияния лей-энкефалина и его аналогов на процессы синтеза ДНК слизистой оболочки желудка у лабораторных животных в физиологических условиях.

2. Изучить взаимосвязь между структурой и характером влияния лей-энкефалина и его аналогов на процессы свободнорадикального окисления в слизистой оболочке желудка у лабораторных животных в физиологических условиях и в условиях эрозивно-язвенного процесса.

3. Изучить характер влияния исследуемых аналогов лей-энкефалина на пролиферативный потенциал слизистой оболочки желудка при индуцированном индометацином эрозивно-язвенном поражении.

4. Исследовать участие системы NOS-NO в реализации протективного действия олигопептидов при индуцируемом индометацином эрозивно-язвенном процессе СОЖ.

5. Оценить общность механизмов гастропротекции дапаргина при этанол- и индометацин-индуцированном эрозивно-язвенном процессе.

6. Изучить влияние даларгина на процессы пролиферации и апоптоза в слизистой оболочке желудка больных остеоартрозом при НПВП-гастропатиях.

7. Изучить характер влияния на тканевой гомеостаз слизистой оболочки желудка компонентов системы ренин-ангиотензина в физиологических условиях.

8. Изучить характер влияния на тканевой гомеостаз слизистой оболочки желудка компонентов системы ренин-ангиотензина в условиях патологии.

Научная новизна

1. Впервые проанализирована зависимость между структурой ряда химических аналогов лей-энкефалина и их влиянием на процессы пролиферации в слизистой оболочке желудка.

2. Впервые показано, что высокая биологическая активность аналога лей-энкефалина - даларгина по отношению к слизистой оболочке желудка определяется сочетанием ряда факторов: повышенной устойчивостью к действию эндопептидаз (наличие D-Ala2), сродством к опиатным рецепторам (наличие Туг), активацией системы NOS-NO (отличительный фактор -присутствие Arg).

3. Впервые на основании собственных данных, а также работ, выполненных в лаборатории, установлено, что наличие в структуре опиоидного пептида молекулы аргинина существенно увеличивает цитопротективные свойства.

4. Впервые показано, что нормализация процессов пролиферации и регенерации слизистой оболочки желудка под воздействием даларгина обусловлена сочетанием активации синтеза ДНК, ослаблением процессов апоптоза и оптимизацией свободнорадикального статуса в слизистой оболочке желудка.

5. Впервые показано, что ингибитор ангиотензинпревращающего фермента эналаприл осуществляет свое протективное действие по отношению к слизистой оболочке желудка за счет способности нивелировать проявления оксидативного стресса, активировать систему NOS-NO и нормализовывать синтез ДНК в слизистой оболочке желудка.

Теоретическая и практическая значимость. Экспериментальные сведения о способности даларгина оказывать протективное действие при приеме НПВП получили дальнейшее развитие в клинической практике как метод профилактики и лечения нарушений целостности слизистой оболочки желудка при НПВП-гастропатиях.

Экспериментальные данные о способности эналаприла оказывать нормализующее действие на синтез ДНК позволяют рекомендовать

ингибиторы ангиотензинпревращающего фермента как оптимальное средство в комплексном лечении больных с артериальной гипертонией и сопутствующим хроническим гастритом.

Установленные закономерности влияния регуляторных пептидов на состояние тканевого гомеостаза СОЖ в физиологических условиях и при патологии могут использоваться при планировании направленного синтеза пептидов, обладающих цитопротективными свойствами.

Полученные экспериментальные данные могут быть использованы при подготовке лекционного материала по специальностям: патологическая анатомия, патологическая физиология, фармакология в ВУЗах медицинского и биологического направлений.

Внедрение полученных результатов. Полученные данные о характере влияния аналогов лей-энкефалина и компонентов системы ангиотензина II на состояние тканевого гомеостаза внедрены в курс лекций на кафедре патологической физиологии и клинической фармакологии КБОУ ДПО «Институт повышения квалификации сотрудников здравоохранения» (г. Хабаровск). Применение нестероидных противовоспалительных препаратов при лечении больных остеоартрозом в ГБУЗ «Консультативно-диагностический центр» «Вивея», ГБУЗ «Краевая Клиническая больница № 2» (г. Хабаровск) осуществляется с учетом данных нами рекомендаций по использованию даларгина для коррекции НПВП-гастропатий. Комплексное лечение больных артериальной гипертонией, сочетающейся с хроническим гастритом, в ГБУЗ «Краевая Клиническая больница № 2» проводится с использованием ингибиторов ангиотензинпревращающего фермента.

Степень достоверности и апробация результатов. Степень достоверности результатов проведенного исследования определяется соответствием его дизайна критериям доказательной медицины, анализом и достаточным объемом выполненных наблюдений с использованием современных разноплановых методов исследования. Примененные статистические методы адекватны поставленным задачам, сформулированные положения, выводы и практические рекомендации аргументированы и логически вытекают из анализа полученных данных.

Основные положения диссертации представлены на VI съезде анатомов, гистологов и эмбриологов России (г. Саратов, 2009); Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Вопросы патогенеза типовых патологических процессов» (г. Новосибирск, 2009), итоговой научно-практической конференции ДВГМУ (г. Хабаровск, 2010); XI международной научно-практической конференции «Фундаментальные и прикладные исследования, разработка и применение высоких технологий в промышленности» (г. Санкт-Петербург, 2011); научно-практической

конференции ДВГМУ (г. Хабаровск, 2012); XII международной научно-практической конференции «Фундаментальные и прикладные исследования, разработка и применение высоких технологий в промышленности» (г. Санкт-Петербург, 2012), научно-практической конференции «Актуальные вопросы патологической анатомии в Хабаровском крае» (г. Хабаровск, 2012), IV Международной научно-практической конференции "Высокие технологии, фундаментальные и прикладные исследования в физиологии и медицине" (г. Санкт-Петербург, 2012).

Публикации результатов исследования. По материалам диссертации опубликовано 27 научных работ (из них 19 - в изданиях, рекомендуемых ВАК Минобрнауки РФ; 2 публикации в международных журналах; 4 — в сборниках российских конференций с международным участием; 2 - в сборниках научных трудов).

Личный вклад автора. Планирование экспериментов, анализ материалов, использованных в диссертационной работе, написание статей, написание диссертационной работы выполнены автором лично. Все эксперименты, включая уход за животными, введение исследуемых веществ, морфометрическая оценка повреждения СОЖ, изготовление препаратов для авторадиографического исследования, подготовка проб для оценки процессов свободнорадикального окисления, обработка полученных результатов выполнены автором лично или при консультативном участии д.м.н. Флейшман М.Ю. (иммуногистохимические исследования: определение экспрессии антигена Ki-67, реакции апоптоза для TUNEL меченых клеток), к.м.н. Евсеева А.Н. (описание гистоморфологической картины поражения СОЖ); д.м.н. Лебедько O.A. (метод хемилюминесценции). Клиническая часть работы (наблюдение, углубленное обследование пациентов, включая фиброэзофагогастродуоденоскопию с прицельной биопсией СОЖ) осуществлялась врачами ГБУЗ «Консультативно-диагностический центр» «Вивея» (к.м.н. Болоняевой H.A.) и НУЗ «Дорожная клиническая больница на станции Хабаровск - 1 ОАО «РЖД» (к.м.н. Авиловой A.A.). Автором (при консультативном участии д.м.н. Флейшман М.Ю.) проводилось иммуногисшхимическое исследование биотагов СОЖ наблюдаемых пациентов.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 276 страницах машинописного текста и состоит из оглавления, списка сокращений, введения, 6 основных глав, выводов и списка литературы, включающего ссылки на публикации 185 отечественных и 489 иностранных авторов. Работа иллюстрирована 20 таблицами и 39 рисунками.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту:

1. Высокая морфогенетическая активность даларгина обусловлена способностью стимулировать синтез ДНК, оптимизировать состояние

свободнорадикального окисления, активировать систему NOS-NO и ослаблять процессы апоптоза.

2. Благодаря высокой морфогенетической активности даларгин уменьшает эрозивно-язвенные поражения в желудке, индуцированные нестероидными противовоспалительными препаратами и этанолом.

3. Восстановление тканевого гомеостаза слизистой оболочки желудка ингибиторами АПФ обусловлено их способностью нормализовать синтез ДНК, оптимизировать процессы СРО и активировать систему NOS-NO.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследования

Характеристика исследуемых веществ. Исследовали характер влияния лей-энкефалина и его структурных аналогов, ангиотензина II - представителя семейства вазоактивных пептидов - на состояние структурного гомеостаза слизистой оболочки желудка в физиологических условиях и при патологии.

В экспериментах были использованы следующие регуляторные пептиды:

1. Лей-энкефалин: Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu (молекулярная масса - 555,69 а.е.м)

2. [Т)-А1а]2-лей-энкефалин: Tyr-D-Ala2-Gly-Phe-Leu (молекулярная масса - 569,71 а.е.м.)

3. Неопиатный аналог лей-энкефалина (НАЛЭ): Phe-D-AIa-Gly-Phe-Leu-Aig. (молекулярная масса - 717,92 а.е.м.)

4. Даларгин: Tyr-D-Ala-Gly-Phe-Leu-Arg (молекулярная масса - 733,92 а.е.м.)

5. Ангиотензин II: H-Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Pro-OH (молекулярная масса - 996,27 а.е.м.)

Вещества были синтезированы в лаборатории синтеза пептидов (зав. проф. Ж.Д. Беспалова) Российского кардиологического научно-производственного комплекса МЗ РФ. Выражаем благодарность проф. Ж.Д. Беспаловой за любезно предоставленные вещества. Все пептиды синтезированы с использованием классического и твердофазного методов в лаборатории синтеза пептидов кардиологического научного центра РАМН (Москва). Они были гомогенны при контроле методами ТСХ (тонкослойной хроматографии) и ВЭЖХ (высокоэффективной обращеннофазовой жидкостной хроматографии). Абсолютное содержание пептидов в сухом веществе составляло не менее 97,5%. Идентификация веществ осуществлялась путем Н-ЯМР спектроскопии высокого разрешения (500 МГц).

Кроме того, в ряде экспериментов (с применением ингибиторного анализа) использовались:

1. Метиловый эфир №— нтро-Ь-аргинина или L-NAME («ICN Biomedicals Inc.», USA)-специфический неселективный ингибитор NOS (Boer R. et al., 2000).

2. Ингибитор ангиотензинпревращающего фермента (АПФ) -эналаприл («Gedeon Richten)).

Экспериментальные животные, объекты и методы исследования

Объектом исследования служил эпителий пилорического отдела желудка самцов белых мышей, 7-суточных и половозрелых самцов белых крыс.

Слизистая оболочка на своей поверхности имеет углубления -желудочные ямки, куда открываются железы желудка. Устье ямки открывается в полость желудка. Большую часть слизистой оболочки желудка занимают собственные или фундальные железы, образованные

высокоспециализированными клетками. В слизистой оболочке желудка обновление клеточных популяций ямки и железы осуществляется в области перешейка и шейки железы. В эпителии слизистой оболочки желудка интенсивно обновляются клетки поверхностно-ямочного эпителия, медленнее обновляются париетальные и слизистые экзокриноциты (Karam S.M., 2010). У грызунов и человека слизеобразующие эпителиальные клетки ямок мигрируют к поверхности желудка в течение 3-4 дней.

Эксперименты проводили на 7-суточных белых крысах обоего пола, самцах белых крыс массой 180-200 г и белых мышей массой 35-40 г. На протяжении всего эксперимента животным в виварии были обеспечены естественное освещение, температура 20-22° С, свободный доступ к воде и пище.

Введение пептидов осуществлялось внутрибрюшинно в область lig. inguinale в интервале с 1000 до II00 часов в количестве 0,1 мл на 100 г массы тела. Введение лей-энкефалина и его аналогов осуществляли пятикратно. Ангиотензин II вводили однократно (новорожденным - на 6 сутки постнатапьного развития) и пятикратно (новорожденным - ежедневно, со 2 по 6 сутки жизни). Животным контрольных групп в соответствующем режиме вводили эквиобъемное количество изотонического раствора хлорида натрия. В качестве дополнительного контроля использовали группы интактных животных. Выведение животных из эксперимента осуществляли путем быстрой декапитации спустя 4 и 24 часа после заключительной инъекции пептидов. Содержание и выведение животных из эксперимента соответствовало «Правилам проведения работ с использованием экспериментальных животных», утвержденным Приказом МЗ СССР № 755 от 12.08.77 г., а также положениям «Европейской конвенции по защите позвоночных, используемых для экспериментальных и иных научных целей». Проведение исследований разрешено этическим комитетом ГБОУ ВПО ДВГМУ Минздрава России. Всего в экспериментах использовано 637 животных.

Дозы исследуемых веществ были определены исходя из данных экспериментов, проведенных в лаборатории ЦНИЛ ДВГМУ ранее. Лей-

энкефалин и его аналоги вводились в дозе 100 мкг/кг (Радивоз М.И., 1999; Лебедько O.A., 2003); ангиотензин II - в дозе 50мкг/кг и 100 мкг/кг (Животова Е.Ю., 2001; Лебедько O.A., 2003).

Помимо основной серии экспериментов были проведены две дополнительные, с предварительным воздействием неселективного ингибитора NOS - L-NAME и ингибитора ангиотензинпревращающего фермента -эналаприла. L-NAME вводили за 30 минут до инъекции исследуемого пептида в дозе 9,33х10"5 моль/кг (Зинчук В.В., Борисюк М.В., 1999). Эналаприл (10 мг/кг, «Gedeon Richter») вводили при помощи металлического зонда орально в виде суспензии (Piotrkowski В. et al., 2007) в течение 14 дней. Контролем служили интактные животные, а также животные, которым вводили эквиобъемное количество 0,9% раствора NaCl.

Протективные свойства пептидов и эналаприла исследовали на моделях индометацинового и этанолового повреждения слизистой оболочки желудка, которые моделировали путем однократного внутрижелудочного введения индометацина (250 мг/кг, «Balkanpharma») и 96% этанола (4 мл/кг) (Moráis Т.С. et al., 2010) зондом оригинальной конструкции по окончании пятикратного введения исследуемых веществ.

Морфометрическую оценку протективного действия пептидов и эналаприла производили путем вычисления суммарной площади всех деструкций слизистой оболочки желудка, используя компьютерную морфометрическую приставку «МЕКОС-Ц».

Непосредственно после эвтаназии у животных выделяли желудок. Фиксацию материала осуществляли в смеси этилового спирта 70% - 100,0 мл, формальдегида 40% - 5,0 мл, уксусной кислоты 92% - 5,0 мл; выдерживали 24 часа при комнатной температуре. После фиксации материал с целью удаления формалина в течение суток промывали проточной водопроводной водой, далее по общепринятой схеме обезвоживали в спиртах восходящей концентрации, проводили по батарее фенолов, заключали в парафин (гистовакс) и готовили серийные срезы толщиной 5-6 мкм на микротоме Leica.

Состояние синтеза ДНК оценивали, используя метод авторадиографии с 3Н-тимидином (удельная радиоактивность 1530 ТБк/моль; ФГУП «ИЗОТОП», г. Санкт-Петербург). Изотоп вводили внутрибрюшинно за 1 час до предполагаемой эвтаназии в дозе 0,6 мкКи/г массы тела половозрелым крысам и 1 мкКи/г массы тела половозрелым мышам и новорожденным крысам (Епифанова О.И. и др., 1977). Радиоавтографы изготавливали по принятой в ЦНИЛ методике с использованием эмульсии двух типов: НИИХИМФОТО и KODAK Autoradiograhpy Emulsion, (Type NTB, for Light Microscope Autoradiograhpy). Индекс меченых ядер (ИМЯ) - отношение числа меченных 3Н-тимидином ядер к общему их количеству - определяли на основании

просмотра 2000-2500 ядер и выражали в процентах. Интенсивность метки (ИМ), характеризующую скорость прохождения клетками синтетического периода клеточного цикла, подсчитывали как среднее количество зерен серебра над 50 мечеными клетками.

Микроскопический анализ радиоавтографов производили в генеративных зонах исследуемых тканей на микроскопе Jenalumar, объектив х 90, окуляр х 7.

Иммуногистохимическое определение экспрессии антигена Ki-67 в биоптатах слизистой оболочки желудка больных остеоартрозом проводили с использованием полимерной системы детекции Novolink (Polymer Detection Sistem). Срезы окрашивали гематоксилином Лилли-Майера. Индекс экспрессии антигена Ki-67 рассчитывали как процент позитивно окрашенных эпителиоцитов после подсчета в 2000-2500 клеток в продольных срезах желез желудка, удовлетворительных по техническому качеству.

Иммуногистохимическую (ИГХ) реакцию для детекции апоптоза на серийных парафиновых срезах СОЖ проводили по общепринятой методике с демаскировкой антигенов с помощью протеиназы К (Proteinase К) и набора (ApopTag Peroxidase In Situ Apoptosis Detection Kit, фирма «Millipore»). Выявление продуктов реакции осуществляли с использованием диаминобензидин хромоген субстрата Substrate Kit for Proxidase «VECTOR NovaRED». Результаты ИГХ реакции для TUNEL меченых клеток оценивались в баллах полуколичественным методом по количеству позитивно окрашенных клеток эпителия желез СОЖ. Ставили негативный и позитивный контроль. Экспрессию апоптоза оценивали после подсчета 2000-2500 клеток в продольных срезах желез желудка, удовлетворительных по техническому качеству. Результаты реакций по TUNEL выражались в баллах по 4-бальной системе: 1 балл - 5-10% окрашенных клеток, 2 балла - 10-20%, 3 балла - 2040%, 4 балла - более 40% (Lam К.Y. et al., 2001, Demura Т. et al., 2008).

Для интегральной оценки процессов свободнорадикального окисления в гомогенатах желудка и сыворотке крови лабораторных животных использовали метод хемилюминесценции (XJI). Регистрацию хемилюминесценции производили на люминесцентном спектрометре «LS-50B» (Perkin Elmer). Сигнал стандартизировали с помощью встроенной программы «Finlab». Спонтанную и индуцированную Fe2+ XJ1 исследовали по принятому в лаборатории методу (Владимиров Ю.А. и др., 1991). Определяли светосумму за 1 мин. спонтанной XJI (Scn), величина которой коррелирует с интенсивностью генерации свободных радикалов; максимум быстрой вспышки (h) индуцированной XJI, свидетельствующий о содержании гидроперекисей липидов; светосумму (SHHAl) за 2 мин после «быстрой» вспышки, отражающую скорость образования перекисных радикалов липидной природы.

Инициированную Н2О2 в присутствии люминола кинетику XJI (Арутюнян А.В. и др., 2000) анализировали по максимуму свечения (Н), указывающему на потенциальную способность биологического объекта к перекисному окислению, и светосумме за 2 мин ХМЛ (Sin(i2), величина которой обратна активности антиоксидантной антирадикальной защиты (АОРЗ). Полученные результаты, измеряемые в милливольтах, рассчитывали на 1 г влажной ткани или в 1 мл сыворотки и выражали в относительных единицах.

Статистическую обработку экспериментальных данных проводили с помощью ПЭВМ в модуле Basic statistic программы Statistica 6,0. В каждой серии экспериментов определяли среднее арифметическое значение показателя и стандартную ошибку средней (М±ш). Показатели подопытных и контрольных групп сравнивали с использованием t-критерия Стьюдента для независимых выборок. В случае повторных изменений применяли парный t-критерий Стьюдента. Считали, что статистически значимые различия между показателями имеют место при р<0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Собственные исследования подразделены на три части:

1. Влияние лей-энкефалина и его аналогов на состояние тканевого гомеостаза в слизистой оболочке желудка в физиологических условиях;

2. Влияние лей-энкефалина и его аналогов на состояние тканевого гомеостаза в слизистой оболочке желудка в условиях патологии;

3. Влияние компонентов ренин-ангиотензиновой системы на состояние тканевого гомеостаза в слизистой оболочке желудка в физиологических условиях и при патологии.

Влияние лей-энкефалина и его аналогов на состояние тканевого гомеостаза в слизистой оболочке желудка в физиологических условиях

Пятикратное введение лей-энкефалина не оказало влияния на процессы синтеза ДНК в эпителии пилорического отдела желудка. Об этом свидетельствует отсутствие статистически значимых изменений ИМЯ и ИМ (табл. 1).

Таблица 1

Показатели синтеза ДНК в эпителии слизистой оболочки желудка белых крыс при введении лей-энкефалина и его аналогов (М±ш)_

Группа ИМЯ,% ИМ

Контроль, (п=9) 11,01 ±0,93 31,18±1,08

Лей-энкефалин, (п=8) 9,60±0,57 32,19±0,66

ГО-А1а12-лей-энкефалин, (п=9) 14,59±0,76* 32,64±0,78

НАЛЭ, (п=8) 12,03±1,07 31,97±1,51

Даларгин, (п=9) 14,23±1,01* 31,68±0,53

Примечание: * - р<0,05 по отношению к группе «контроль»

При пятикратном введении [0-А1а]2-лей-энкефалина имело место изменение пролиферативной активности исследуемой популяции клеток. Индекс меченых ядер СОЖ увеличился в 1,3 раза (р<0,05). Замена Ala2 на D-А1а2 не только повысила устойчивость пептида к действию эндопептидаз, но и обеспечила появление у [0-А1а]2-лей-энкефалина способности стимулировать синтез ДНК (табл. 1).

Пятикратное введение НАЛЭ не влияло на активность ДНК-синтетических процессов в эпителии слизистой оболочки желудка белых крыс (табл. 1). Эти результаты совпадают с полученными ранее данными о влиянии НАЛЭ на пролиферативную активность в различных популяциях клеток (Кузнецов A.B., 1998). В результате замены N-концевого Туг- на Phe- в молекуле НАЛЭ пептид утратил способность взаимодействовать с опиатными рецепторами, но сохранил способность вызывать широкий спектр биологических эффектов (Титов М.И. и др., 1985). Представляет интерес тот факт, что введение неопиатного аналога лей-энкефалина в физиологических условиях не изменяет ДНК-синтетическую активность клеток в эпителии трахеи новорожденных крыс. Однако в условиях гипоксии введение пептида способствует не только нормализации величины ИМЯ, но и приводит к достоверному увеличению этого показателя по сравнению с интактным контролем (Лебедько O.A., Тимошин С.С., 1994).

Пятикратное введение даларгина индуцировало повышение ИМЯ в 1,29 раза (р<0,05) (табл. 1). Аналогичные данные о стимулирующем влиянии даларгина на пролиферативную активность эпителия слизистой оболочки желудка получены ранее (Тимошин С.С. и др., 1991).

Анализ показателей ХМЛ гомогенатов желудка самцов белых крыс продемонстрировал, что введение биологически активных пептидов неоднозначно влияло на изменение компонентов антиоксидантной антирадикальной защиты организма.

Пятикратное введение лей-энкефалина индуцировало уменьшение скорости образования перекисных радикалов (Smd j) в 1,27 раза, снижение содержания гидроперекисей липидов (амплитуда h уменьшилась в 1,26 раза). Однако достоверного уменьшения уровня активности свободнорадикального окисления (Scn) в сравнении с контролем не отмечено. Кроме того, оставались в пределах базальных значений показатели активности антиоксидантной антирадикальной защиты С^индг) и устойчивости биосубстрата к перекисному окислению (Н). Редокс-статус исследуемых гомогенатов желудков самцов белых крыс в ответ на повторное воздействие [Т>-А1а]2-лей-энкефалина (Tyr-D-Ala-Gly-Phe-Leu) не изменялся. Уровни Scn , h, S¡ndi, Н , Sraiß не отличались от результатов, полученных в контрольной группе (табл. 2). [Т)-А1а]2-лей-энкефалин в отношении исследуемых показателей ХМЛ эффекта не проявил,

однако в наших исследованиях было продемонстрировано, что в условиях оксидативного стресса этот олигопептид способен проявлять определенную антиоксидантную активность (Животова Е.Ю. и др., 2007).

Таблица 2

Показатели хемилюминесценции гомогенатов желудка белых мышей при введении лей-энкефалина и его аналогов (отн. ед.; М±ш)_

Группа животных Sen (отн.ед) Инд. ХМЛ (Fe2+) Инд. ХМЛ (люминол-НгОг)

h 5ипл. 1 Н Shh.t.2

Контроль, (п=8) 1,330±0,093 2Д80±0,0770 2,882±0,141 2,150±0,106 1,090±0,099

Лей-энкефалин, (п=8) 1,215±0,098 1,800±0,093* 2,265±0,142* 1,990±0,138 0,930±0,064

tD-Aia]^ "лей-энкефалин, (п=8) 1,405±0,078 2,150±0,0790 3,030±0,183 2,260±0,154 1,290±0,084

НАЛЭ, (п= 9) Э,910±0,070* 1,620±0,070* 2,320±0,140* 1,430±0,070* 0,820±Ю,030*

Даларгин, (п=9) 3,531±0,050* 1,210±0,075* 1,638±0,076* 1,39±0,130* 0,440±0,030*

*р - 0,05 по отношению к группе «контроль»

Пятикратное введение НАЛЭ обеспечило статистически значимое (по сравнению с группой «контроль») уменьшение показателей АОРЗ слизистой оболочки желудка в 1,24-1,5 раза. Имело место уменьшение уровня свободнорадикального окисления (Scn), при этом понизилось содержание гидроперекисей липидов (h). Изменение скорости образования свободных радикалов (Smi) носило сонаправленный характер. Полученные изменения редокс-статуса были обусловлены повышением активности антиоксидантной антирадикальной защиты (S]rKi2) и повышением устойчивости биосубстрата к перекисному окислению (Н) (табл. 2). Можно сказать, что в желудке произошел сдвиг свободнорадикальных процессов в сторону детоксикации АКМ. В предыдущих исследованиях было показано, что в реализации антиоксидантного антирадикального эффекта НАЛЭ большое значение имеет активация ферментативного звена АОРЗ - супероксиддисмутазы и глутатионпероксидазы и каталазы (Лебедько O.A., Тимошин С.С., 1994).

Пятикратное введение даларгина значительно повысило активность антиоксидантной антирадикальной систем защиты слизистой оболочки желудка. Все исследуемые ХМЛ-показатели статистически значимо (по сравнению с контролем) уменьшились в 1,54-2,5 раза (р<0,05). Имело место: уменьшение показателя Н, отражающего состояние перекисной резистентности; снижение значения S|nd2, свидетельствующего об увеличении активности антиоксидантной антирадикальной защиты. При этом отмечено понижение содержания гидроперекисей липидов (h), скорости образования перекисных радикалов (Sindi), а также уровня активности свободнорадикальных процессов (Scn) в целом (табл. 2).

При исследовании влияния лей-энкефалина и его аналогов на изменение редокс-статуса сыворотки крови выяснено, что даларгин способен проявлять

антиоксидантные антирадикальные свойства не только на уровне органа, но и на уровне организма в целом.

Это подтверждает выраженное (по отношению к контролю) снижение уровня генерации АКМ (Scn), повышение устойчивости биосубстрата к перекисному окислению (Н). Выявлены однонаправленные изменения показателей, характеризующих скорость генерации перекисных радикалов и активность антирадикальной антиоксидантной системы.

При сопоставлении структурных изменений аналогов лей-энкефалина и их физиологической активности были установлены следующие закономерности. Для реализации пролиферативного эффекта аналогов лей-энкефалина необходимо сродство к опиатным рецепторам. Кроме того, способность активировать клеточное деление имеет место лишь при сочетании сродства к опиатным рецепторам (наличие Туг в структурной формуле) с повышением устойчивости к эндопептидазам, способствующей увеличению биодоступности олигопептида. Это свойство позволяет олигопептидным лигандам опиоидных рецепторов реализовать митогенный ответ, присущий опиатам с большим молекулярным весом (Р-эндорфин, динорфин и др.). Повышение устойчивости к действию эндопептидаз за счет замены Ala2 на D-А1а2, обеспечивающей возможность влияния на процессы пролиферации, имеет место у дерморфина и его аналогов (Флейшман М.Ю. и др., 2007). В настоящих исследованиях стимуляция синтеза ДНК отмечена у [0-А1а]2-лей-энкефалина и у даларгина.

Особо следует подчеркнуть, что для нормального течения процессов синтеза ДНК и регенерации необходим оптимальный оксидативный статус. В условиях стресса «принятие решения» - апоптоз или синтез ДНК - во многом зависит от редокс-состояния (Турпаев К.Т., 2002). Резерв антиоксидантной защиты способствует восстановлению ткани и преобладанию регенераторных процессов. Истощение антиоксидантной защиты приводит к изменению редокс-статуса и апоптозу (Дас Д.К., Молик Н., 2004).

Сочетание у даларгина способности стимулировать синтез ДНК с антиоксидантной антирадикальной активностью, а также наличие нитроксидергического компонента обеспечивают ему уникальные способности нормализовать тканевой гомеостаз.

Влияние лей-энкефалина и его аналогов на состояние тканевого гомеостаза слизистой оболочки желудка при патологии

Интрагастральное введение индометацина индуцировало у мышей возникновение деструкций, гистоморфологическая картина которых соответствовала острому эрозивно-язвенному процессу.

Средняя площадь деструкций (без предварительного введения пептидов) составила 10,92+2,05 мм2(табл. 3).

Таблица 3

Площади очагов деструкции и показатели синтеза ДНК в слизистой оболочке желудка белых мышей на модели индометацин-индуцированного повреждения СОЖ при введении лей-энкефалина и его аналогов (М±ш)

Группа животных Площадь повреждения, мм2 Синтез ДНК

ИМЯ,% ИМ

Контроль 0, (п=6) 9,19±0,97 (п=8) 18,11 ±0,50

Индометацин 10,92±2,05 (п=10) 5,88±1,11* (п=9) 14,05±0,98*

Лей-энкефалин+индометацин 7.21 ±0,89 (п=9) 4.00+1,49* (п=9) 12,89±1,68*

(Р-А1а]*-лей-энкефалнн +индо.метацин 6,92±1,81 (п=9) 5,39±0,90* (п=8) 13,60±0,91*

НАЛЭ+ индометацин 5,42±0,9* (п=9) 4,92±1,00* (п=9) 14,30+1.14

Даларгин +индометацин 2,79+0,74',а (п=9) 9,07±1,36* (п=9) 16,21+0.97

Примечание: * - р<0,05 по отношению к группе «контроль»

♦ - р<0,05 по отношению к группе «индометацин».

# - р<0,05 по отношению к группе «НАЛЭ+индометацин»

Введение лей-энкефалина и [Т)-А1а]2-лей-энкефалина не вызвало статистически значимого уменьшения площади эрозивно-язвенного поражения СОЖ, индуцированного индометацином. Введение НАЛЭ обеспечило уменьшение площади деструкций до 5,42±0,9 мм2. Предварительное (до воздействия индометацина) пятикратное введение даларгина также привело к уменьшению тяжести поражения, причем пептид проявил максимальный эффект. Площадь деструкций СОЖ у животных, получавших индометацин на фоне пятикратного введения даларгина, уменьшилась до 2,79±Д74 мм2(табл. 3).

Угнетение процессов синтеза ДНК является одной из причин возникновения повреждения СОЖ при НПВП-гастропатиях. В свою очередь, важным фактором, определяющим уменьшение эрозивно-язвенного поражения СОЖ, является стимуляция клеточного деления. В наших исследованиях интрагастральное введение индометацина индуцировало угнетение процессов синтеза ДНК в желудке, что подтверждается статистически значимым снижением ИМЯ в 1,56 раза (р<0,05) и уменьшением интенсивности метки в 1,28 раза (р<0,05) (табл. 3). Это свидетельствует о значительном нарушении процессов пролиферации, так как имеет место сочетание уменьшения количества ДНК-синтезирующих клеток со снижением скорости прохождения клетками Б-периода клеточного цикла.

Предварительное введение лей-энкефалина не обеспечило цитопротективного эффекта. В этой экспериментальной группе сохранялось выраженное угнетение процессов синтеза ДНК в СОЖ. Аналогичный характер

изменений наблюдался в экспериментальных группах животных, подвергнутых воздействию НПВП на фоне предварительного введения безаргининового аналога лей-энкефалина - пептида [0-А1а]2-лей-знкефалина, а также утратившего сродство к опиоидным рецепторам НАЛЭ. Введение даларгина полностью нивелировало негативное влияние индометацина на пролиферативную активность эпителия желудка. Свидетельством протективного действия даларгина является полная нормализация показателя ИМЯ: у животных, получавших даларгин в сочетании с индометацином, показатели синтеза ДНК не отличались от контрольных параметров (табл. 3).

Снижение пролиферативной активности в СОЖ после воздействия индометацина сопровождалось активацией свободнорадикальных процессов в тканях желудка: исследуемые показатели хемилюминесценции в гомогенатах желудка увеличивались в 2,84-4,78 раза, что свидетельствовало о формировании выраженного оксидативного стресса (табл. 4).

Таблица 4

Показатели хемилюминесценции гомогеиатов желудка белых мышей при коррекции иидометацин-индуцированного повреждения СОЖ на фоне введения лей-энкефалина и его аналогов (отн. ед.; М±ш)_

Группа животных ^.(огаец.) Ивд.ХМЛ^е'") Инд. ХМЛ (люминал-НгОг)

Ь ^Р11(2птт) Н 5 инл. 2

Контроль, (п=8) 1,04±0,06 1 ДНЮ,08 2,43±0,09 1,58±0,07 0,86±0,05

Индометацин, (п=10) 3,2б±0,24* 4,1740,22* 932±0,60* 5,94±0,37* 4,12±0,20*

Лей-энкефалин +индометацин, (п=9) 2^&0,16*,* 3,22Ш,14*,' 5,79аО30*,* 3,90±0,26*,* 1,98±0,12*,*

[1>А1а]2-лсй- э н кефал и н +индометацин, (п=9) 2,4410,14*,* ЗДМ),15*,* 5,53±0,34*,* 3,78±0,22*,* 2,07±0,11*,*

НАЛЭ+индометацин, (п=9) 238ЮД1*,* 3,14=1=0,12** 5,2Ш),28*,* 3,66±0,21*,* 1,82±0,09*,'

Даларгин+ индометацин, (п=8) 1,75Ю,09*,* 2,44±0,Ю*,* 3,98«,19*,' 2,11±0,13*,* 1,05±0,08*,*

Примечание. *р< 0,05 по отношению к группе «контроль»; * - р<0,05 по отношению к группе «индометацин»

При введении индометацина на фоне 5-дневного курса лей-энкефалина проявления оксидативного стресса частично уменьшились, однако показатели ХМЛ достоверно (в 2,19-2,47 раза) превышали контрольные значения. Предварительное введение стабильного аналога лей-энкефалина также ослабило выраженность оксидативного стресса, но состояние СРО не отличалось от того, которое имело место при введении лей-энкефалина. Аналогичная картина имела место при воздействии НАЛЭ, предварительное введение которого способствовало уменьшению выраженности сдвигов процессов СРО. Однако полной коррекции свободнорадикального статуса не отмечено: показатели ХМЛ были достоверно (в 2,06-2,31 раза) больше

аналогичных параметров контроля. Предварительное введение даларгина сопровождалось увеличением активности антиоксидантной и антирадикальной защиты желудка. Несмотря на то, что ни один из показателей группы «даларгин+индометацин» не достиг соответствующих значений группы «контроль», все они были максимально приближены к ним и статистически значимо меньше аналогичных показателей группы животных, получавших индометацин (табл. 4).

Таким образом, из всех исследуемых структурных аналогов лей-энкефалина даларгин наиболее эффективно способствовал профилактике эрозивно-язвенного процесса, индуцированного индометацином. Это свойство у пептида обусловлено способностью активировать синтез ДНК, оптимизировать свободнорадикальный статус. Особо следует учитывать роль остатка аргинина в молекуле даларгина. [Б-А1а]2-лей-энкефалин, в отличие от даларгина, не уменьшал площадь деструкций СОЖ и не повышал пролиферативный потенциал в условиях НПВП-гастропатии. Содержащий остаток аргинина неопиатный аналог лей-энкефалина тоже не повышал пролиферативный потенциал, однако уменьшал площадь деструкции. При взаимодействии с опиатным рецептором имеет место отделение Arg от молекулы олигопептида. Аргинин обладает широким спектром биологической активности. Необходимо отметить его способность активировать систему NOS-NO - основного регулятора локального кровообращения (Painsipp Е. et al., 2009).

Для оценки участия системы NOS-NO в эффектах даларгина проводились опыты с блокадой системы NOS-NO при помощи L-NAME, в ходе которых было выяснено, что L-NAME отменил корригирующее влияние даларгина на процессы синтеза ДНК в СОЖ (табл. 5).

Таблица 5

Показатели синтеза ДНК в эпителии пилорического отдела слизистой оболочки желудка крыс при коррекции даларгином индометацин-индуцировапного повреждения на фоне введения Ь^АМЕ (М±т)_

Группа животных ИМЯ, % ИМ

Контроль. (п=8) 4,80*0,74 18.68±0,73

L-NAME+индометацин. (п=9) 2,09±0,89* 16,35±0,45*

Даларгнн+Ь-ЫАМЕ+индометацин, (п=9) 2,63±0,60* 17,05±0,58

*- р<0,05 по отношению к группе «контроль»

NO — один из основных факторов, регулирующих оптимальный кровоток в слизистой оболочке желудка и, соответственно, поддерживающих ее целостность (Kwiecien S. et al, 2012). Противоязвенной активностью обладает донатор N0 сиднофарм (Жуйкова С.Е., Самонина Г.Е., 2002). Значительное уменьшение повреждающего влияния НПВП на СОЖ имеет место при сочетанном применении ибупрофена и L-аргинина (Jiménez M.D. et al., 2004).

Хронический прием НПВП способствует возникновению у больных гастропатии (Каратеев А.Е., 2007; Straube S. et al., 2009). В связи с этим представляла интерес попытка использовать даларгин для профилактики и лечения нарушений целостности СОЖ, индуцируемых 28-дневным курсом диклофенака (Болоняева H.A., Животова Е.Ю. и др., 2005).

Клиническую группу исследования составили больные остеоартрозом, проходившие комплексное обследование и лечение в ГБУЗ «Консультативно-диагностический центр» «Вивея». В 1 подгруппу вошли 23 пациента, получавшие диклофенак в дозе 0,05 г 2 раза в сутки в течение 28 дней. Во 2 подгруппу (26 человек) - пациенты, получавшие на фоне лечения диклофенаком в течение 28 дней даларгин по 0,002 г в сутки. Исследование проводилось до начала и по окончании 28 дней лечения. В совместных исследованиях установлено, что введение даларгина оказывает корригирующее влияние на течение НПВП-гастропатий у больных остеоартрозом, принимавших диклофенак. При этом улучшается качество жизни пациентов и уменьшается площадь поражения СОЖ (Болоняева H.A., Животова Е.Ю. и др., 2005).

В гастробиоптатах антрального отдела желудка больных, получавших диклофенак, наблюдались дистрофические изменения и некроз поверхностных эпителиальных структур, а также отек и очаговые кровоизлияния в подслизистой оболочке. В собственном слое СОЖ присутствовали: гиперемия, стазы в микроциркуляторном русле, очаговые кровоизлияния, лимфоцитарная инфильтрация с примесью нейтрофилов, отек и склероз стромы, признаки атрофии желез.

У больных, получавших диклофенак и даларгин, морфологические изменения носили менее выраженный характер: слабая инфильтрация мононуклеарами СОЖ, снижение активности воспалительного процесса, очаговый фиброз стромы. Эрозии СОЖ, лимфоидные фолликулы, очаги кишечной метаплазии не регистрировались. При этом наблюдалось повышение пролиферативного потенциала (табл. 6), что оценивалось как показатель адаптации СОЖ к действию диклофенака (Алексеенко С.А. и др., 2001).

Таблица 6

Показатели нролифератнвной активности (Кл 67) слизистой оболочки желудка больных остсоартритом при приеме диклофенака и даларгина (М±ш)__

Группа больных Индекс Ki 67,%

до лечения после лечения

Диклофенак, (п=23) 29,97±2,95 26,88±3,06

Диклофенак+даларгин, (п=26) 27,52±],38 32,99±1,43*

Примечание: *р<0,05 по отношению к группе «Диклофенак+даларгин» до лечения

Нарушение тканевого гомеостаза, проявляющееся при гастропатиях эрозиями и язвами, обусловлено не только нарушением пролиферации эпителия и усилением оксидативного стресса. В поддержании тканевого гомеостаза важная роль отводится сохранению баланса между процессами пролиферации и апоптоза. В связи с этим представляло интерес изучение характера влияния корригирующей терапии даларгином при НПВП-гастропатиях на процессы апоптоза.

Детекция апоптоза у больных обеих групп свидетельствует, что применение даларгина снижает уровень процесса программированной клеточной гибели. В то время как у больных, получавших диклофенак, выраженность апоптоза составила 2,8±0,51 балла, при коррекции НПВП-гастропатии даларгином этот показатель уменьшился почти в 2 раза (р<0,05) и составил 1,5±0,15 балла (табл. 7).

Таблица 7

Влияние даларгина на процессы апоптоза СОЖ больных осгеоаргритом (М±т)

Группа пациентов TUNEL, баллы

Диклофенак, (п=23) 2,8±0,51

Диклофенак+даларгин, (п=26) 1,5±0,15*

Примечание. *р< 0,05 по отношению к группе «Диклофенак»

Следует отметить, что снижение уровня апоптозных клеток не несет в себе угрозы канцерогенеза. В литературе имеются сведения о способности даларгина угнетать неопластические процессы (Анисимов В.Н., Борткевич С.М., 1990). В данной ситуации, по-видимому, уместно представление В.Т. Ивашкина о том, что снижение уровня апоптоза при гастритах является показателем эффективности лечения (Ивашкин В.Т. и др., 2002).

Причиной уменьшения уровня апоптозных тел при корригирующей терапии даларгином, вероятно, является совокупность нескольких взаимодополняемых факторов. Прежде всего, это способность лигандов опиоидных рецепторов оказывать антиапоптозный эффект, который осуществляется через ингибиторное воздействие на Bad и Вс1-2 (проапоптозные белки митохондрий) (Tang В. et al., 2011). Данное свойство ослабляется или отменяется селективным антагонистом опиоидных рецепторов налтриндолом (Wang D. et al., 2009). Кроме того, это наблюдаемое в настоящих исследованиях ослабление выраженности воспалительной реакции. Воспаление оценивается как дополнительный путь активации апоптоза, помимо воздействий, напрямую стимулирующих программированную клеточную гибель (Кононов A.B. и др., 2005).

Другой возможной причиной уменьшения уровня апоптозных тел при коррекции гастропатического действия диклофенака даларгином может быть антиоксидантная антирадикальная активность даларгина,

продемонстрированная, в частности, в экспериментах на мышах в настоящем исследовании. Согласно общепринятым представлениям проапоптотический эффект нндометацина реализуется через активацию свободнорадикального окисления (Рикитсйо К. е1 а1., 2011; ТатаЫ К. е1 а!., 2011), а антиоксиданты, обладающие гастропротективным действием, снижают уровень апоптоза (Оигеип Н. е( а1., 2009; БЫеутап Н. е1 а]., 2009).

Для оценки универсальности механизмов адаптации СОЖ под действием дапаргина были проведены опыты на модели этанол-индуцированного повреждения.

У животных, получавших этанол, имело место повреждение слизистой оболочки желудка, наличие обширных геморрагических эрозий и язв. Средняя площадь деструкций у животных, получавших этанол без предварительного воздействия пептида, составила 10,32±0,96 мм2. Пятикратное предварительное введение дапаргина обеспечило уменьшение площади деструкций в 1,6 раза. Введение этанола привело к угнетению ДНК-синтетических процессов. Наблюдалось статистически значимое уменьшение количества ДНК-синтезирующих клеток по отношению к контрольной группе - ИМЯ уменьшился в 2,29 раза (р<0,05). Предварительное введение даларгина ослабило индуцированное этанолом угнетение синтеза ДНК в слизистой оболочке желудка. Индекс меченых ядер в СОЖ мышей, получавших перед этанолом даларгин, в 1,5 раза превысил аналогичный показатель в группе «этанол». Хотя зарегистрированные показатели не достигали уровня интактного контроля, статистически значимое увеличение ИМЯ (относительно аналогичного показателя группы «этанол») свидетельствует о способности даларгина повышать адаптацию слизистой оболочки желудка к повреждающему действию этанола (табл. 8).

Таблица 8

Площади деструкций и показатели синтеза ДНК при коррекции даларгином этанол-индуцированного повреждения слизистой оболочки желудка белых мышей (М±т)_

Группа Площадь повреждения, мм' ИМЯ,% ИМ

Контроль 0, (п=6) 8,01±0,49 (п=8) 44,63±0,73

Этанол 10,32±0,96, (п=9) 3,49±0,18*, (п=9) 42,87±0,99

Даларгин+этанол 6.4±1,12\(п=9) 5,36±0,26*,\(п=9) 45,32±0,67

Примечание: * - р<0,05 по отношению к группе «контроль» ♦ - р<0,05 по отношению к группе «этанол».

Таким образом, даларгин проявлял адаптивные свойства не только при НПВП-гастропатиях, но и при эрозивно-язвенном процессе, индуцированном этанолом.

Снижение пролиферативной активности в СОЖ после воздействия этанола (как и в опытах с индометацином) сопровождалось значительной активацией процессов СРО и формированием в тканях желудка выраженного оксидативного стресса. Показатели хемилюминесценции в гомогенатах желудка увеличивались в 3,54-7,83 раза. Повышение генерации активных кислородных метаболитов сопровождалось увеличением количества гидроперекисей липидов (Ь) и ускорением образования перекисных радикалов (8иидл) на фоне ослабления антиоксидантной антирадикальной защиты (8,гал.2) и снижения устойчивости биосубстрата к перекисному окислению (Н) (табл. 9).

Таблица 9

Показатели хемилюминесценции при коррекции даларгином этанол-индуцированиого повреждения слизистой оболочки желудка белых мышей (М±м)___

Группа животных 5сп. (отн.ед.) Инд. ХМЛ (Ре^) Инд. ХМЛ (люминол-НгОз)

Ь 5инд. 1 (2пм(0 Н ^ инд. 2

Даларгин+ этанол, (п=8) 2,94±0,11*,* 5,11±0,22*,* 8,23±0,39*,* 5,23±0,35"'* 6,47±0,35"'*

Этанол, (п=9) 5,10±0,22* 6,73±0,27* 11,25±0,61* 7,83±0,43* 8,15±0,41*

Контроль, (п=9) 1,14±0,11 1,90±0,14 2,85±0,16 1,00±0,05 1,84±0,11

Примечание. *р< 0,05 по отношению к группе «контроль» * - р<0,05 по отношению к группе «этанол».

Введение даларгина оказало корригирующее влияние на редокс-статус тканей желудка у животных, получавших этанол. Все исследуемые ХМЛ-показатели статистически значимо (в 1,25-1,73 раза) уменьшились по сравнению с показателями группы животных, получавших этанол без коррекции. На фоне активации антиоксидантной антирадикальной защиты (Зщц), повышения перекисной резистентности (Н), имело место угнетение генерации активных кислородных метаболитов в целом (85р), в том числе за счет снижения концентрации гидроперекисей (Ь) и угнетения образования и накопления перекисных радикалов (БшсиХтабл. 9).

Таким образом, даларгин подтвердил свою способность поддерживать тканевой гомеостаз в условиях индуцированных этанолом язвенно-эрозивных поражений желудка. Способность уменьшать площадь поражения СОЖ в этих опытах, как и при НПВП-гастропатиях, сопровождалась ослаблением проявлений оксидативного стресса. При этом, как и при НПВП-гастропатиях, при этаноловом ульцерогенезе даларгин обеспечивает активацию антиоксидантной антирадикальной защиты, повышение перекисной резистентности как за счет угнетения генерации АКМ в целом, так и за счет снижения концентрации гидроперекисей и перекисных радикалов. Факторы,

ослабляющие проявления оксидативного стресса, ограничивают деструктивные процессы в СОЖ (Repetto, M.G., Boveris А., 2010).

Другим важным механизмом защитного действия даларгина при этанол-индуцированном нарушении целостности СОЖ является его способность повышать регенераторный потенциал. Активация синтеза ДНК при введении даларгина имеет место и в физиологических условиях (Панькова Т.Ю., 1992; Животова Е.Ю. и др., 2012) в широком диапазоне доз (Панькова Т.Ю., 1992; Радивоз М.И., 1999).

Сочетание у даларгина способности оптимизировать свободно-радикальный статус и активизировать процессы синтеза ДНК в слизистой оболочке желудка определяют высокую эффективность пептида как средства, способствующего восстановлению нарушенного гомеостаза.

Влияние компонентов ренин-ангиотензиновой системы на состояние тканевого гомеостаза слизистой оболочки желудка в физиологических условиях и при патологии

Ренин-ангиотензиновая система (РАС) осуществляет контроль вазоконстрикции, жажды, баланса электролитов. Основной гормон этой системы - ангиотензин II (ATII) - играет детерминирующую роль в регуляции артериального давления и гомеостаза жидкости. Наряду с этим, AT II принимает участие в регуляции пролиферативных процессов (Mehta Р.К., Griendling К.К., 2007; Zeeli Т. et al., 2010).

Введение ангиотензина II индуцирует стимуляцию синтеза ДНК в различных клеточных популяциях (миокарде; эпителиях языка, ушной раковины, двенадцатиперстной кишки), а также в пилорическом отделе желудка новорожденных и половозрелых крыс (Животова Е.Ю. и др., 1998, Тимошин С.С., Животова Е.Ю., 2000) (табл. 10).

Таблица 10

Показатели синтеза ДНК в эпителии пилорического отдела слизистой оболочки желудка половозрелых крыс при введении ангиотензина II (100 мкг/кг) (М±м)_

Группа животных ИМЯ,% ИМ

Однократное введение пептида

Контроль, (п=8) 8,67±0,32 16,7±0,7

Ангиотензин II, (п=8) 10,35±0,28* 19,13±1,27

Пятикратное введение пептида

Контроль, (п=8) 8,67±0,32 16,7±0,7

Ангиотензин И, (п=9) 11,7±0,42* 23,8±0,91*

*- р<0,05 по отношению к группе «контроль»

Однако в отличие от даларгина (как показано в параллельно выполненных исследованиях В.М. Пикаповой) стимуляция клеточного деления сопровождалась активацией процессов СРО (Пикалова В.М., 2001).

Результатом влияния ангиотензина II является активация ДНК-синтетических процессов в различных популяциях клеток, в том числе и не связанных непосредственно с функционированием сердечно-сосудистой системы (Животова Е.Ю. и др., 1998; Тимошин С.С., Животова Е.Ю., 2000).

Свойства ангиотензина II стимулировать синтез ДНК и активировать процессы СРО в эпителии желудка послужили предпосылкой выяснения характера влияния ингибитора ангиотензинпревращающего фермента эналаприла на состояние тканевого гомеостаза слизистой оболочки желудка в физиологических условиях и в условиях патологии.

Многократное введение с помощью зонда изотонического раствора поваренной соли и сопровождающая этот процесс манипуляция привели к увеличению количества ДНК-синтезирующих клеток. Введение эналаприла в дозе 10 мг/кг вызвало статистически значимое уменьшение величины ИМЯ по сравнению с группой животных, которым вводился 0,9% раствор хлорида натрия (табл. 11).

Таблица 11

Показатели синтеза ДНК в эпителии пилорического отдела слизистой оболочки желудка белых крыс при повторном введении эналаприла (М±т)

Группа животных ИМЯ ИМ

Контроль, (п=8) 8,46±0,48 26,83±1,18

0,9% №С1, (п=8) 10,07±0,89 27,51±0,56

эналаприл, (п=8) 7,31±0,36* 24,49±0,99

Примечание: * - р<0,05 по отношению к группе «0,9% ЫаС1»

Фактически можно говорить о том, что ингибитор АПФ способен нормализовать индуцированную стрессом пролиферацию в эпителиальных клетках желудка (Животова Е.Ю., Тимошин С.С. 2000).

При проведении морфометрических исследований в эксперименте с многократным воздействием эналаприла, предшествующим зондовому введению этанола, установлено следующее. Контролем служили интактные животные, при вскрытии которых повреждений слизистой оболочки желудка обнаружено не было. Аналогичная картина (отсутствие повреждений СОЖ) имела место в группе животных, получавших при помощи зонда эналаприл. Введение 0,2 мл 96% этанола вызывало повреждение СОЖ в 100% случаев. Морфометрический анализ показал, что средняя площадь язвенно-эрозивного поражения у животных, получавших этанол, без предварительного введения ингибитора АПФ составила 10,85±2,43 мм2. Результаты исследования состояния слизистой оболочки желудка у животных, получавших этанол на фоне многократного введения эналаприла, дают основание предполагать, что ингибитор АПФ в этих условиях способен оказывать протективное действие. Об этом свидетельствует уменьшение площади деструкций в 2 раза (табл. 12).

Таблица 12

Площади деструкции и показатели синтеза ДНК в слизистой

оболочке желудка белых мышей, получавших этанол на фоне эналаприла и Ь^АМЕ (М±т)_

Группа животных Площадь повреждения, Б (мм-) Показатели хемшпоминесценции, (отн. ед)

Яш Инд. ХМЛ (Ге2+) Инд. ХМЛ (люминоя- н2од

И ЭькИ Н 8Ы-2

Контроль 0, (п=б) 1,14±0,11, (п=8) 1,9040,14 2,85±0,16 1,00+0,05 1,84±0,11

Эналаприл 0, (п= 6) 1,16±0,06, (п=9) 1,89+0,07 2,90ьЮ,14 1,06+0,05 1,54±0,06*

Этанол 10,85*2,43, (п-9) 5,\та2* (П=9) 6,73+0,27* 11,25+0,61* 7,83±0,43* 8,15±0,41*

Эналаприл +ЭТШЮЛ 5,36±],09' (п=9) 3,42+0,16*,' (п=9) 4,68+0,21 *,' 8,50+0,42*,' 5,94+0,33*,' 6,80+0,32*,'

Эналаприл+ •ланол+Ь- ЫАМЕ 10,32±238 (п=9) 5,39+0,23* (ч=9) 7,00±031* 12,12±0,58* 8,14±0,46* 8,66±0,47

Примечание: * - р<0,05 по отношению к группе «контроль». * - р<0,05 по отношению к группе «этанол».

В наших исследованиях было установлено, что однократное введение с помощью зонда этанола и сопровождающая этот процесс манипуляция привели к угнетению процессов синтеза ДНК. Об этом свидетельствует уменьшение количества ДНК-синтезирующих клеток в 2,37 раза. Введение эналаприла также вызвало статистически значимое уменьшение величины ИМЯ по сравнению с группой контрольных животных (табл. 13). Это сопоставимо с результатами экспериментов, демонстрирующих способность эналаприла препятствовать постстрессорной активации процессов синтеза ДНК в тканях энтодермального происхождения (Тимошин С.С., Животова Е.Ю., 2000).

Таблица 13

Показатели синтеза ДНК в слизистой оболочке желудка белых

мышей, получавших этанол (М±м)

Группа животных ИМЯ, % ИМ

Контроль, (п-8) 8,01±0,49 44,64±0,72

Этанол,(п=8) 3,37±0,15* 42,21 ±0,91

Эналаприл, (п=9) 5,99±0,44* 45,29±0,59

Эналаприл+этанол, (п=9) 4,88±0,23*,* 45,17±0,90

Примечание: * - р<0,05 по отношению к группе «контроль»,

* - р<0,05 по отношению к группе «этанол»

В группе животных, получавших этанол на фоне многократного введения эналаприла, отмечено протективное действие ингибитора ангиотензинпревращающего фермента. Несмотря на то что индекс меченных тимидином ядер был в 1,64 раза (р<0,05) меньше, чем в контрольной группе, он

(ИМЯ) в 1,44 раза (р<0,05) превышал значение аналогичного показателя животных из группы «этанол» (табл. 13).

Нарушения процессов пролиферации в слизистой оболочке желудка мышей, получавших этанол, сопровождались активацией процессов СРО. Введение этанола способно индуцировать значительные макроскопические и микроскопические повреждения слизистой оболочки желудка за счет увеличения генерации АКМ и снижения эндогенных антиоксидантных механизмов защиты (Jonsson I.M., et al., 2007). Результаты XMJl-анализа свидетельствовали о формировании в ткани желудка оксидативного стресса. У мышей, получавших этанол, отмечено повышение интенсивности свободиорадикального окисления. Об этом свидетельствует увеличение величины Sen в 4,47 раза относительно аналогичной контрольной группы. Сдвиг равновесия в редокс-системе был обусловлен повышением содержания гидроперекисей липидов, а также ускорением образования перекисных радикалов. Об этом свидетельствуют соответствующие изменения показателей ХМЛ: амплитуда h возросла в 3,54 раза, величина SHIUi увеличилась в 3,94 раза. Помимо повышения интенсивности СРО, нарушения свободиорадикального статуса связаны с ослаблением антиоксидантной антирадикальной защиты и снижением устойчивости биосубстрата к перекисному окислению. Повторное введение энапаприла способствовало повышению активности антирадикальной и антиоксидантной систем защиты желудка у животных, получавших этанол. Несмотря на то, что введение ингибитора ангиотензинпревращающего фермента не смогло обеспечить коррекцию в редокс-системе в полной мере (ни один из показателей ХМЛ не достиг контрольных значений), можно говорить о протективном влиянии препарата на прооксидантно-оксидантный статус. Так, в ткани желудка наблюдалось увеличение перекисной резистентности и повышение активности антиоксидантной антирадикальной защиты (табл. 12).

Полученные данные свидетельствуют, что ингибитор ангиотензинпревращающего фермента оказывает влияние на состояние тканевого гомеостаза слизистой оболочки желудка, препятствуя постстрессорной активации процессов синтеза ДНК в слизистой оболочке желудка в физиологических условиях (Животова Е.Ю., Тимошин С.С. 1998).

Кроме того, при повторном применении эналаприла наблюдается нормализация ДНК-синтетических процессов СОЖ в условиях патологии -эксперименте при этанол-индуцированном поражении слизистой оболочки желудка белых мышей. Это послужило предпосылкой выяснения характера влияния ингибиторов ангиотензинпревращающего фермента на состояние тканевого гомеостаза СОЖ на клиническом материале.

Способность компонентов РАС нормализовать нарушения структурного гомеостаза подтвердилась и в совместных клинических исследованиях с

сотрудниками НУЗ «Дорожная клиническая больница на станции Хабаровск - 1 ОАО «РЖД», где было продемонстрировано влияние эналаприла и лизиноприла на процессы пролиферации СОЖ у больных с умеренной гипертонией и сопутствующим гастритом (Avilova A., Jivitova Е., et al., 2002). Клиническую группу исследования составили больные с умеренной гипертонией, при которой имел место сопутствующий гастрит, проходившие комплексное обследование и лечение в Дорожной клинической больнице. Больные были разбиты на 3 подгруппы. В 1 вошли 66 пациентов, получавших эналаприл (ингибитор АПФ), во 2 - 48 пациентов, получавших лизиноприл (ингибитор АПФ), в 3 - 22 пациента, получавших амлодипин (блокатор Са-каналов). Контрольную группу составили 12 человек, у которых в связи с диспепсическими исследованиями проводилось углубленное обследование, включая ФГДС с прицельной биопсией СОЖ. Исследование осуществлялось до начала лечения и спустя 12 недель после лечения.

При иммуногистохимическом анализе состояния пролиферации по экспрессии Ki-67 антигена было установлено, что индекс меченых ядер (ИМЯ) в фундальном отделе желудка у пациентов с неизмененной слизистой (контрольная группа) составил 16,8%, что соответствует данным литературы.

До начала лечения в СОЖ фундального отдела желудка во всех клинических группах имела место гиперрегенераторная реакция, характерная для хронического гастрита (Алексеенко С.А., Тимошин С.С., 1996; Rubio СА., 2009).

Трехмесячный курс эналаприлом привел к достоверному уменьшению ИМЯ с 22,1±2,2 до лечения к 17,0±1,5 - после лечения. При лечении лизиноприлом ИМЯ уменьшился с 22,8±2,2 до 18,2±1,9 (р<0,05). Способность ингибиторов АПФ нормализовать тканевой гомеостаз не зависела от их антигипертензивных свойств. Блокатор Са-каналов амлодипин при аналогичном курсе оказывал антигипертензивный эффект, но гастропротертивные свойства не проявлял (Avilova A., Jivitova Е., et al., 2002). Таким образом, лечение ингибиторами АПФ привело к нормализации процессов пролиферации, что служит благоприятным прогностическим признаком дальнейшего течения гастрита (Аруин Л.И. и др., 1998). Способность ингибиторов АПФ нормализовать пролиферативные процессы СОЖ дает основание использовать их как средство при сочетании гипертонической болезни и хронического гастрита, важным патогенетическим звеном которого является нарушение процессов пролиферации (Avilova А., Jivitova Е., et al., 2002). В целом, во всех рассматриваемых случаях, вне зависимости от фоновой ситуации, можно считать, что повторное введение ингибитора ангиотензинпревращающего фермента сопровождается частичной

нормализацией ДНК-синтетической активности эпителиоцитов желудка, т.е. нормализует гомеостаз СОЖ.

Анализ участия ряда опиоидных пептидов в восстановлении и поддержании тканевого гомеостаза в слизистой оболочке желудка, а также проведенные исследования позволили сделать заключение, что даларгин является наиболее эффективным гастропротективным регуляторным пептидом. Объяснению этой уникальной биологической активности в определенной степени может помочь анализ параллели между структурными изменениями аналогов лей-энкефалина и их физиологической активностью.

Повышение устойчивости даларгина к действию эндопептидаз необходимо для реализации эффектов лигандов опиоидных рецепторов. Эта структурная перестройка — замена Ala2 на D-Ala2 - широко используется при синтезе опиоидных олигопептидов (Титов М. И. и др., 1985). Доказательство опосредования митогенного эффекта даларгина через опиоидные рецепторы было получено ранее в нашей лаборатории. Особо следует отметить тот факт, что митогенный эффект даларгина и аргинин-содержащего опиоидного пептида — дерморфина реализуется в сверхнизких концентрациях — вплоть до 0,1 мкг/кг (Панькова Т.Д., 1992; Флейшман М.Ю., 2010). Подтверждением важности сродства к опиоидным рецепторам в нашей работе служат результаты опытов с НАЛЭ. Обладающий высокой биологической активностью в печени (в условиях «затравки» СС14) пептид фактически не влиял на синтез ДНК в слизистой оболочке желудка, в эпителии трахеи и бронхов. В условиях патологии - при гипоксии (Лебедько O.A., Тимошин С.С., 1994), а также в наших исследованиях при НПВП-гастропатии он проявляет свою активность. Важность сочетания «лиганд опиоидных рецепторов —» стимуляция клеточного деления» находит свое объяснение в работах (Philippe D. et al., 2006; Weinstock L.B., Chang A.C., 2011). В этих исследованиях показано, что в условиях in vitro, в биоптатах подвздошной и толстой кишок больных с воспалительными заболеваниями кишечника, экспрессия мРНК ц-опиоидных рецепторов по сравнению с контрольными показателями увеличивается в десятки раз. Это обеспечивает очагу повреждения весьма существенные преференции в элиминации лигандов опиоидных рецепторов из крови, то есть лиганды опиоидных рецепторов не только осуществляют анальгетический эффект, но и, концентрируя (за счет повышения содержания) рецепторы в очаге повреждения, стимулируют пролиферативные процессы именно в очаге повреждения. Это частично объясняет отсутствие у даларгина канцерогенных свойств (Анисимов В.Н., Борткевич С.М., 1990). Его способность стимулировать процессы пролиферации осуществляется в первую очередь в очаге повреждения. Подтверждением этому служат результаты исследований С.А. Алексеенко, выполненные в нашей лаборатории. Согласно этим данным,

даларгин прежде всего стимулировал процессы синтеза ДНК в зоне самой язвы (Алексеенко С.А., Тимошин С.С., 1991). Более того, в исследованиях JI.A. Наумовой в СОЖ детей с хроническим гастритом лечение даларгином достоверно уменьшало индекс меченных 3Н-тимидином ядер. При этом имело место ослабление выраженности воспалительной реакции. Таким образом, даларгин, ослабляя степень воспаления, способствовал нормализации тканевого гомеостаза СОЖ (Наумова JI.A., 2001). Еще одним фактором высокой эффективности даларгина при поддержании тканевого гомеостаза служит наличие в его структуре Arg. Даларгин, помимо присущей лигандам опиоидных рецепторов способности нормализовать тканевой гомеостаз, является «транспортом» для доставки Arg в очаг поражения.

Представления об участии различных субпопуляций опиоидных рецепторов в антиноцептивных программах претерпели в последние годы определенные изменения. В отличие от имеющейся точки зрения о том, что ц-опиоидные рецепторы ответственны за реализацию анальгетических процессов, а 5-рецепторы - за висцеральные эффекты (Сергеев П.В. и др., 1999), в настоящее время доминирует точка зрения об относительно одинаковом вкладе ц-, 5- и к-рецепторов в обеспечение эффективной аналгезии (Дубынин В.А., Каменский A.A., 2010). В определенной степени это относится и к участию опиоидных пептидов в поддержании тканевого гомеостаза (Tegeder I., Geisslinger G., 2004). Подтверждением этому служит тот факт, что при определенных условиях специфический лиганд одной субпопуляции рецепторов может взаимодействовать с другой субпопуляцией (Brasel С.М et al., 2008).

Взаимодействие с опиоидными рецепторами запускает каскад реакций, приводящих к стимуляции синтеза ДНК.

Опиоидные рецепторы относятся к суперсемейству G сопряженных белков GPCR (Беспалов А.Ю., Звартау Э.Э., 2000), митогенный эффект которых осуществляется через три возможных сигнальных пути.

Первый сигнальный путь обеспечивает активацию фосфатидилинозитидного цикла. В этом случае лиганд, взаимодействуя с рецептором, активирует фосфоинозитид - 3-киназу (PI3K), которая, в свою очередь, запускает каскад киназ Ras-Raf-Mek-ERK. Киназа ERK способна фосфорилировать более 50 различных субстратных молекул, включая цитоплазматические факторы транскрипции (Хаитов P.M. и др., 2005). Другой возможной точкой приложения PI3K является протеинкиназа B-Akt, которая тормозит процессы апоптоза (Yin D., et al., 2006; Olianas M.C. et al., 2011). Еще один сигнальный путь опосредуется благодаря активации NF-kß — одного из основных транскрипционных факторов, ускоряющего процессы пролиферации в десятки раз (Tegeder I., Geisslinger G., 2004). Следует отметить, что сам по

себе NF-kß и организуемый им сигнальный путь является редокс-чувствительным (Зенков Н.К. и др., 2010).

Второй сигнальный путь, обеспечивающий стимуляцию клеточного деления опиоидами, связан со способностью лиганда активировать кальмодулины с последующей активацией рецепторов эпидермального фактора роста и ERK каскада, а также фактора роста фибробластов (Miyatake M., et al., 2009).

Третий сигнальный путь реализации митогенного эффекта лигандов опиоидных рецепторов связан с вовлечением системы NOS-NO и опосредован Gßy-PI3K-Akt-NOS-NO сигнальным каскадом, где Akt стимулирует активность эндотелиальной NOS.

АТИ, так же как и опиоиды, является лигандом GPCR (G-protein с receptor). Эндогенных лигандов этого семейства рецепторов насчитывается свыше ста.

Активация пролиферативных процессов этими лигандами осуществляется посредством PI3K-ERK и PI3K-Akt каскадов, а также активации рецептора фактора роста эпителия (Jia G. et al, 2010; Kim J.S. et al., 2012), экспрессии фактора роста фибробластов TGF-ßl (Li L. et al., 2011).

Таким образом, сигнальные пути реализации митогенного сигнала опиоидных пептидов и ATII имеют общий характер. Однако различный эффект опиоидов и ангиотензина II позволяет подчеркнуть важность оксидативного статуса для процессов пролиферации.

Ангиотензин стимулирует внутриклеточное формирование АКМ (супероксид-радикала и перекиси водорода) в культурах гладкомышечных клеток сосудов (Lassegue В., et al. 2001), эндотелиальных клеток (Lang D. et al., 2000), фибробластов (Pagano P.J. et al. 1998) и кардиомиоцитов (Griendling К.К., 2004). Важную роль в ATII-зависимой генерации АКМ играет NAD(P)H-оксидаза, широко представленная фактически во всех живых организмах (Brooks S.E., Schneider D.L., 1985). Установлено, что инкубация культуры гладкомышечных клеток сосудов с ATII ведет к увеличению концентрации О2-(Zhang H. et al., 1999). Этот эффект реализуется посредством ATi рецепторов и сопровождается повышением активности ЫАО(Р)Н-оксидазы (Griendling К.К., 2004).

Сдвиг баланса ПОЛ-АОРЗ в сторону формирования оксидативного стресса в ткани желудка новорожденных и половозрелых крыс имел место в исследованиях В.М. Пикаловой, выполненных в нашей лаборатории. Было показано, что ATII-индуцированная стимуляция синтеза ДНК в ткани желудка новорожденных и половозрелых крыс сопровождалась нарушением баланса в редокс-системе. Помимо повышения интенсивности процессов перекисного окисления липидов, имело место истощение неферментативного звена АОРЗ.

Изменение биохимических показателей, характеризующих состояние ПОЛ и АОРЗ желудка, подтверждали данные ХМЛ. На фоне введения ангиотензина II в желудке обнаружено повышение уровня активности свободнорадикальных процессов (Scn), угнетение активности антиоксидантной антирадикальной защиты (Н), сопровождающееся повышением потенциальной способности ткани к перекисному окислению (S„„a. 2) (Пикалова В.М., 2003). Кроме того, ATII обеспечивает митохондриальную генерацию АКМ посредством МАРК (Bedard К., Krause К.Н., 2007). Косвенное влияние пептида на изменение редокс-статуса может быть установлено через индуцибельный гипоксией фактор 1-a (HIF-1 а), экспрессия которого связана со стимуляцией АТ2 (Wu S. et al., 2005).

Активация образования АКМ под влиянием ATII, сочетающаяся со стимуляцией пролиферативных процессов в СОЖ, может служить иллюстрацией к представлениям о вовлеченности активных форм кислорода в регуляцию различных функций. Первоначально участие свободных радикалов оценивалось как необходимый фактор антибактериальной защиты. Под влиянием бактериальной стимуляции происходит активация NADPH-оксидазы фагоцитирующих клеток, что ведет к гиперпродукции АФК - «кислородному взрыву» (Robinson J.M., 2009). Образующиеся при этом свободные радикалы окисляют самые различные классы органических веществ. На АФК приходится до 90% микробноцидного действия фагоцитов (Меньшикова Е.Б. и др., 2008). Оказалось, что NADPH-оксидазы присутствуют практически во всех клетках эукариот (Brooks S.E., Schneider D.L., 1985). Они оцениваются не только как фактор токсичности, но и, являясь «вторичными мессенджерами», принимают участие в формировании сигнальных путей (Меньшикова Е.Б. и др., 2008; Лабас Ю.А. и др., 2010). Участие окислительного стресса в процессах повреждения СОЖ при индометацин- и этанол-индуцируемой ульцерации и ослабление проявлений нарушения равновесия «прооксиданты <-> антиоксиданты» при заживлении эрозий и язв согласуются с традиционным мнением об участии свободных радикалов в патологических процессах.

Стимуляция пролиферации, сочетающаяся с усиленным образованием свободных радикалов, может служить иллюстрацией к представлениям о вовлеченности АКМ в регуляцию событий клеточного цикла. Мы уже приводили данные В.М. Пнкаловой (Пикалова В.М., 2003), выполненные параллельно с нашими исследованиями, о формировании оксидативного стресса при введении ATII. Подтверждением значимости активации пролиферации при оксидативном стрессе могут служить результаты С.Г. Сапунцовой. При атопическом дерматите и красном плоском лишае в дерме имеет место гиперрегенераторный процесс — индекс Ki-67 увеличивается в 3-4 раза, сопровождающийся выраженным локальным оксидативным стрессом

(увеличивается уровень спонтанной люминесценции, возрастает продукция супероксид- и гидроксил-радикалов). После лечения нормализации пролиферативных процессов соответствует достоверное снижение всех ХМЛ-параметров (Сапунцова С.Г. и др., 2010).

Аналогичная картина — сочетание оксидативного стресса и избыточной активации пролиферативных процессов - имела место в подвздошной кишке при болезни Крона в исследованиях, выполненных нами совместно с Е.В. Ожеговым. Наличие гиперрегенераторной реакции подтверждалось увеличением индекса Кл-67 в 2,15 раза. В пользу формирования локального оксидативного стресса свидетельствовало повышение интенсивности свободнорадикального окисления, увеличение концентрации гидроперекисей и скорости образования перекисных радикалов на фоне снижения активности антиоксидантной антирадикальной защиты и перекисной резистентности (Ожегов Е.В. и др., 2011).

Проведенное комплексное лечение, включающее даларгин, обеспечило не только статистически значимое снижение показателей, характеризующих активность процессов пролиферации, но и коррекцию редокс-статуса. Доказательством этому служило достоверное снижение всех ХМЛ-параметров в 1,5-2 раза и их фактическое соответствие аналогичным значениям группы сравнения (Ожегов Е.В. и др., 2011).

Стимуляция синтеза ДНК в условиях оксидативного стресса имеет приспособительный характер. В основе этой стимуляции лежат физиологические механизмы, рассмотренные нами ранее - АКМ—»стимуляция пролиферативных процессов. По данным ТЬапшска1 V. и БапЬищ В. (2000), усиление образования АКМ предшествует остальным событиям во внутриклеточных сигнальных путях, индуцирующих синтез ДНК. Активация клеточного деления под воздействием АКМ направлена на поддержание целостности эпителиального пласта. В тех случаях, когда при воспалительных процессах в слизистой оболочке ЖКТ отсутствует гиперрегенераторная реакция, высока вероятность формирования эрозивно-язвенного процесса (Боровская Т.Ф., Тимошин С.С, 1983). Это положение лежит в основе способа прогнозирования возникновения язвенно-эрозивного процесса (Евсеев АН, Тимошин С.С, 2003).

Эти данные литературы являются еще одним свидетельством того, что для оптимизации восстановления тканевого гомеостаза стимуляции пролиферативных процессов недостаточно. Необходимым условием является адекватное соотношение прооксидантов и антиоксидантов. Так, ангиотензин II, являющийся стимулятором пролиферативных процессов, в условиях стресса, обеспечив активацию СРО, вносит свой вклад в индукцию повреждения слизистой оболочки желудка (Вггогошвкд Т. е1 а!., 2012).

Представления об участии свободнорадикальных процессов в регуляции клеточного деления уместно дополнить положением Е.Б. Меныциковой (и др., 2008) о том, что редокс-регуляция процессов пролиферации и роста филогенетически возникла раньше, чем факторы роста и ферментативные каскады, регулирующие синтез ДНК и митоз (Меньщикова Е.Б. и др., 2008).

Важным звеном реализации действия свободных радикалов на тканевой гомеостаз является их способность индуцировать процессы апоптоза (Лю Б.И. и др., 2006). Механизмы индукции апоптоза разнообразны (Ganguly К., Swarnakar S., 2009). Применительно к настоящим исследованиям представляется наиболее вероятным положение о том, что уменьшение выраженности апоптоза при введении даларгина происходит благодаря снижению выраженности оксидагивного стресса. Уменьшение апоптошческого индекса в этом случае, как мы указывали ранее, является показателем эффективности лечения (Ивашкин В.Т. и др., 2002).

Напомним, что в наших исследованиях с даларгином, а также в работах, выполненных совместно с М.Ю. Флейшман по анализу гастропротективного действия дерморфина, установлено, что эффективны оказываются только аргинин-содержащие опиоиды, такие, как седатин (H-Arg-Tyr-D-AIa-Phe-Gly-ОН). У безаргининовых аналогов защитный эффект выпадает или минимизируется (Флейшман М.Ю. и др., 2009). Одним из возможных объяснений этому может быть взаимодействие аргининсодержащих опиоидных пептидов с рЗ рецепторами (Cadet et al., 2007). При этом утрата аргинина ведет к потере возможности взаимодействовать с рецепторами этого типа. Другим возможным механизмом образования NO является его синтез из молекулы аргинина, отделяющейся от даларгина в ходе метаболизма последнего (Исакова О Л. и др., 1986).

Оксид азота является одним из самых мощных вазодилататоров и именно он опосредует гастропротективный эффект опиоидов (Поленов С.А., 1998). Согласно общепринятой точке зрения, одним из основных механизмов защитного действия NO является оптимизация локального кровообращения.

При этом следует отметить, что стимуляция пролиферативных процессов под влиянием даларгина происходит и без улучшения местного кровообращения. В пользу этого свидетельствуют эксперименты, выполненные в нашей лаборатории на культуре фибробластов, где внесение даларгина в культуру фибробластов стимулировало синтез ДНК (Сазонова E.H. и др., 2010). Аппликация даларгина на бессосудистую роговицу также стимулировала пролиферативные процессы (Панькова Т.Д., 1992).

Особо следует подчеркнуть значение стабильности свободнорадикального статуса для реализации физиологических эффектов NO. При введении даларгина имеет место и повышение емкости антиоксидантного буфера, и снижение образования супероксида (Лебедько O.A., 2003). Это может служить объяснением механизмов микроциркуляторных изменений под влиянием

даларгина (Сиротин Б.З., Жмеренецкий К.В., 2010), который в сочетании с действием NO на гладкие миоциты артериол оптимизирует локальную микроциркуляцию (Титов В.Н., 2010). На первый взгляд, вазодилатационный эффект аргинина можно воспроизвести введением самой аминокислоты. Однако для получения такого эффекта при введении per os необходимо несколько граммов вещества (Титов В.Н., 2010). Присутствие аргинина в молекуле опиоидных пептидов позволяет ему целенаправленно (за счет усиленной экспрессии опиоидных рецепторов в очаге повреждения) транспортироваться в зону повреждения и именно здесь оптимизировать микро циркуляцию.

Восстановление тканевого гомеостаза при НПВП и этанол-индуцированном повреждении СОЖ под воздействием пептидов во многом имеет общий характер и складывается из неспецифических составляющих, которые, согласно представлениям A.M. Уголева (1990), можно охарактеризовать как универсальные функциональные блоки. Концепция A.M. Уголева подразумевает возможность разделения любого физиологического процесса (в том числе и специализированного) на цепь последовательных событий, которые, в свою очередь, можно рассматривать как совокупность простых операций и элементарных функций.

Система NOS-NO может служить примером универсального функционального блока, вовлеченного в регуляцию различных процессов (Altura М.А. et al., 2011; Moro C.F., 2012).

Программа регенерации, «организуемая» регуляторными пептидами, включает в себя целый ряд универсальных функциональных блоков:

1. Увеличение в клетках очага повреждения количества рецепторов к опиоидным пептидам.

2. Создание под воздействием регуляторных пептидов, в частности даларгина, оптимального для регенерации эндокринного фона.

3. Активация в очаге повреждения системы NOS-NO.

4. Оптимизация микроциркуляции в очаге повреждения.

5. Универсальным функциональным блоком может служить редокс-статус клетки. Изменения соотношения прооксиданты<->антиоксиданты способно регулировать экспрессию факторов транскрипции, «включать» процессы пролиферации или апоптоза.

6. Следует отдельно выделить функциональный блок, организуемый даларгином, запускающий синтез ДНК и угнетающий процессы апоптоза.

Способность даларгина нормализовать процессы восстановления тканевого гомеостаза определяется его свойством оптимизировать широкий спектр универсальных функциональных блоков.

выводы

1. Лиганд б- (х-опиоидных рецепторов даларгин и вазоакгивный пептид ангиотензин II вовлечены в регуляцию тканевого гомеостаза эпителия слизистой оболочки желудка.

2. Лиганд 5- ц-опиоидных рецепторов даларгин обладает способностью стимулировать синтез ДНК, повышать антиоксидантную антирадикальную защиту в слизистой оболочке желудка, а также активировать систему NOS-NO.

3. В ряду лей-энкефалина и его аналогов даларгин является наиболее эффективным средством профилактики и заживления при индометацин-индуцированном повреждении слизистой оболочки желудка.

4. Эффективность даларгина для профилактики и заживления язв и эрозий определяется его сродством к опиатным рецепторам, устойчивостью к действию эндопептидаз, способностью повышать пролиферативный потенциал и нормализовать оксидативный статус.

5. Важным механизмом протективного действия даларгина при эрозивно-язвенном процессе в слизистой оболочке желудка является формирование условий, ослабляющих проявления оксидативного стресса и индуцированных оксидативным стрессом процессов апоптоза.

6. Заживление язв и эрозий слизистой оболочки желудка, индуцированных индометацином и этанолом, происходит благодаря включению процессов репарации, состоящей из ряда универсальных функциональных блоков. Одним из таких универсальных блоков является система NOS-NO. Подавление активности этой системы ликвидирует протективный эффект даларгина и ингибитора ангиотензинпревращаюшего фермента на слизистую оболочку желудка.

7. Важным универсальным функциональным блоком, вовлеченным в процесс заживления язв и эрозий слизистой оболочки желудка, является оптимизация реакций свободнорадикального окисления.

8. Свидетельством универсальности механизмов поддержания тканевого гомеостаза даларгином и ингибитором ангиотензинпреврашающего фермента является общность ряда факторов (нормализация синтеза ДНК, оптимизация свободнорадикального статуса, активация системы NOS-NO).

9. Результаты собственных исследований, а также данные, полученные в лаборатории, дают основание для расширения показаний для применения даларгина как фактора, способствующего восстановлению тканевого гомеостаза в различных тканях.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Публикации в изданиях, рекомендуемых ВАК Минобрнауки РФ:

1. Влияние ангиотензина II на синтез ДНК в миокарде и эпителиальных тканях новорожденных крыс / С. С. Тимошин, Е. Ю. Животова, Е. Н.Гончарова, М. Ю. Флейшман // Бюлл. эксп. биол и мед. - 1998. - Т. 126, № 12. - С. 643-645.

2. Влияние регуляторных пептидов на синтез ДНК в гладкой мышечной ткани двенадцатиперстной кишки белых крыс в раннем постнатальном периоде / С. С. Тимошин, Е. Ю. Животова, Е. Н. Сазонова, М. Ю. Флейшман // Бюлл. эксп. биол и мед. - 1999. - Т. 127, № 6. - С. 651-653.

3. Животова, Е. Ю. Участие компонентов системы ангиотензина II в регуляции синтеза ДНК в эпителии пилорического отдела желудка белых крыс / Е. Ю. Животова, С. С. Тимошин // Бюлл. эксп. биол и мед. - 2000. - Т. 129, № 2.-С. 214-216.

4. Мельникова, Н. П. Изменение процессов синтеза ДНК и морфометрических параметров миокарда белых крыс при введении ангиотензина II / Н. П. Мельникова, Е. Ю. Животова, С. С. Тимошин // Бюлл. эксп. биол. и мед. - 2003. - Т. 135, № 3. - С. 287-290.

5. Применение даларгина для профилактики и лечения НПВП-гастропатий / Н. А. Болоняева, Е. Ю. Животова, М. Ю. Флейшман [и др.] // Дальневост. мед. журн. — 2005,- № 2. - С. 62-66.

6. Анализ механизмов влияния аргинин содержащего аналога дерморфина на процессы пролиферации в слизистой оболочке желудка белых крыс / М. Ю. Флейшман, Е. Ю. Животова, В. И. Дейгин [и др.] // Бюлл. эксп. биол. и мед. - 2007. - № 9. - С. 282-285.

7. Влияние даларгина на процессы синтеза ДНК в слизистой оболочке желудка белых крыс / Е. Ю. Животова, М. Ю. Флейшман, О. А. Лебедько [и др.] // Бюлл. эксп. биол. и мед. - 2007. - № 9. - С. 288-291.

8. Гастропротективный эффект даларгина при гастропатии, вызванной приемом нестероидных противовоспалительных препаратов / Е. Ю. Животова, М. Ю. Флейшман, О. А. Лебедько [и др.] // Бюлл. эксп. биол. и мед. - 2009. - № 4. - С. 422-426.

9. Протективное действие аналога дерморфина седатина на индуцируемое индометацином повреждение слизистой оболочки желудка / М. Ю. Флейшман, Е. Ю. Животова, О. А. Лебедько [и др.] // Бюлл. эксп. биол. и мед. - 2009,- № 7. - С. 726-729.

10. Роль аминокислоты аргинин в механизмах влияния даларгина на регенерацию слизистой оболочки желудка / Е. Ю. Животова, Н. А. Болоняева, Е. Н. Сазонова, С. С. Тимошин // Морфология. - 2009. - № 4. - С. 57.

11. Влияние даларгина на репаративную способность слизистой оболочки желудочно-кишечного тракта при различных гастроэнтерологических заболеваниях / С. А. Алексеенко, Н. А. Болоняева, С. С. Тимошин, М. Ю. Флейшман, Е. Ю. Животова //Дальневост. мед. журн. - 2010. - № 3. - С. 15-18.

12. Морфогенетические эффекты аналогов дерморфина в различных клеточных популяциях (от экспериментов к практике) / С. С. Тимошин, М. Ю. Флейшман, О. А. Лебедько, Е. Ю. Животова // Дальневост. мед. журн. - 2010. -№ 3. - С. 62-66.

13. Состояние пролиферативных процессов и выраженность оксидативного стресса в слизистой оболочке подвздошной кишки при болезни Крона / Е. Ю. Животова, Е. В. Ожегов, О. А. Лебедько [и др.] // Бюлл. эксп. биол. и мед. - 2011.- № 10. - С. 400-403.

14. Влияние ингибитора HMG-CoA-редуктазы на процессы синтеза ДНК на свободнорадикальное окисление в слизистой оболочке желудка в норме и при индуцируемом индометацином язвенно-эрозивном поражении желудка у белых мышей / Е. Ю. Животова, В. В. Брагина, О. А. Лебедько [и др.] // Бюлл. эксп. биол. и мед. - 2011,- № 9. - С. 265-268.

15. Система NOS-NO — универсальное звено в реализации гастропротективных эффектов опиоидных пептидов / Е. Ю. Животова, М. Ю. Флейшман, O.A. Лебедько [и др.] // Дальневост. мед. журн. -2011-№4. С. 83-86.

16. Влияние даларгина при лечении и профилактике НПВП-гастропатий на выраженность оксидативного стресса и процессов апоптоза в слизистой оболочке желудка (экспериментально-клиническое исследование) / Е. Ю. Животова, Н. А. Болоняева, М. Ю. Флейшман [и др.] // Дальневост. мед. журн. - 2011,- № 4. - С. 29-32.

17. Животова, Е. Ю. Участие системы ренин-ангиотензина в поддержании тканевого гомеостаза в различных клеточных популяциях / Е. Ю. Животова, С. С. Тимошин // Современ. технол. в медиц. -2011-№4.-С. 120-125.

18. Животова, Е. Ю. Влияние структурных аналогов лей-энкефалина на процессы синтеза ДНК и свободнорадикальное окисление в слизистой оболочке желудка белых крыс / Е. Ю. Животова, С. С. Тимошин, О. А. Лебедько // Дальневост. мед. журн. - 2012. - № 1. - С. 109-112.

19. Участие регуляторных пептидов в регуляции тканевого гомеостаза слизистой оболочки желудка / Е. Ю. Животова, О. А. Лебедько, М. Ю. Флейшман [и др.] // Дальневост. мед. журн. - 2013. - № 1. - С. 101-105.

Публикации в зарубежных изданиях:

20. Does angiotensin II affect cellular growth in gastric mucosa? / A. Avilova, E. Jivitova, M. Fleishman [et al.] // Br. J. Clin. Pharmacol. - 2002. - Vol. 53.-P. 447-448.

21. Angiotensin-II activates apoptosis, proliferation and protein synthesis in the left heart ventricle of newborn albino rats / N. P. Mel'nikova, S. S. Timoshin, E. Y. Jivotova [et al.] // Internation. Jörn, of Cardiol.-2006.-Vol. 112, № 2.-C. 219-222.

Работы, опубликованные в материалах всероссийских конференций с международным участием:

22. Животова, Е. Ю. Участие гистамина в реализации гастропротективных эффектов регуляторных пептидов / Е. Ю. Животова, Е. Н. Сазонова, С. С. Тимошин // Вопросы патогенеза типовых патол.: труды Всерос. научно-практ. конф. с междун. участ,- Новосиб., 2009. - С. 133-135.

23. Влияние ингибитора ангиотензин-превращающего фермента эналаприла на тканевой гомеостаз / Е. Ю. Животова, М. Ю. Флейшман, О. А. Лебедько, С. С. Тимошин. // Фундамент, и прикл. исслед.: сб. статей XI междун.. научн.-практ. конф.-СПб.: Изд,-во Политехи, универ,2011.-С.221-223.

24. Животова, Е. Ю. Протективный эффект даларгина при этанол-индуцированном повреждении слизистой оболочки желудка в эксперименте / Е. Ю. Животова, О. А. Лебедько, С. С. Тимошин // Фундамент, и прикл. исследов.: сб. статей XII междунар. научн.-практ. конфер. - СПб.: Изд.-во Политехи, универ., 2012 - С. 227-233.

25. Животова, Е. Ю. Влияние компонентов ренин-ангиотензиновой систем на состояние тканевого гомеостаза слизистой оболочки желудка / Е. Ю. Животова, О. А. Лебедько, С. С. Тимошин // Фундамент, и прикл. исследов.: сб. статей IV междун. научн-практ. конфер. — СПб.: Изд.-во Политехи, универ., 2012-С. 187-193

Работы, опубликованные в научных журналах, сборниках трудов и материалах конференций:

26. Алексеенко, С. А. Влияние ангиотензина II и эднита на синтез ДНК в эпителии слизистой оболочки желудка белых крыс / С. А. Алексеенко, С. С. Тимошин, Е. Ю. Животова // Российск. журн. гастроэнтер., гепатол., колопроктол.: матер. 2-й Российской гастроэнтерол. недели. - 2000. - Т. 10, № 5. -Прилож. №11.-С. 78.

27. Коррекция опиоидными пептидами эрозивно-язвенного поражения слизистой оболочки желудка / С. С. Тимошин, М. Ю. Флейшман, Е. Ю. Животова, Е. Н. Сазонова // Клинико-эпидемиол. и этно-экологические проблемы заболеваний органов пищеварения: сб. науч. трудов 7-й ВосточноСибирской гастроэнтерологической конференции. - Красноярск, 2007. - С. 185.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АКМ - активные кислородные метаболиты

АОРЗ - антиоксидантная антирадикальная защита

АПФ - ангиотензинпревращающий фермент

ATII - ангиотензин П

АТЬ АТ2 - рецепторы ангиотензина

ВЭЖХ - высокоэффективная жидкостная хроматография

ГП - гидроперекиси липидов

ИМ - интенсивность метки

ИМЯ - индекс меченых ядер

НАЛЭ - неопиатный аналог лей-энкефалина

НПВП - нестероидные противовоспалительные препараты

ПГ - простагландины

ПОЛ - перекисное окисление липидов

РАС - ренин-ангиотензиновая система

РП - регуляторные пептиды

СРО - свободнорадикальное окисление

СОЖ - слизистая оболочка желудка

ХМЛ - хемилюминесценция

ЦОГ - циклооксигеназа

EGF - epidermal growth factor

Erk - extracellular-regulated kinase - mitogen-activated protein (MAP) kinase

GRK - G-protein-coupled receptor kinase

JNK. - c-Jun-N-terminal kinase

L-NAME - NG-nitro-L-arginine methyl ester

NK-кВ - nuclear factor kappa В

NO - nitric oxide

NOS - nitric oxide sinthase

cNOS - constitutive NOS

iNOS - inducible NOS

OGF - Opioids Growth Factor

Животова Елена Юрьевна

УЧАСТИЕ РЕГУЛЯТОРНЫХ ПЕПТИДОВ В ПОДДЕРЖАНИИ ТКАНЕВОГО ГОМЕОСТАЗА СЛИЗИСТОЙ ОБОЛОЧКИ ЖЕЛУДКА

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

Подписано в печать 16.12.2013. Формат 60x84/16. Бумага офсетная. Усл. печ. л. 2,0 Тираж 100 экз. Заказ № 70.

Издательство ГБОУ ВПО ДВГМУ. 680000, г. Хабаровск, ул. Пушкина, 31.

Отпечатано в типографии Издательства ГБОУ ВПО ДВГМУ. 680000, г. Хабаровск, ул. Муравьева-Амурского, 35.

Текст научной работыДиссертация по биологии, доктора медицинских наук, Животова, Елена Юрьевна, Владивосток

Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего

профессионального образования «ДАЛЬНЕВОСТОЧНЫЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ

УНИВЕРСИТЕТ»

МИНИСТЕРСТВА ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

На правах рукописи

05201450729 УДК: 612.015.13:611.33-018.73

Животова Елена Юрьевна УЧАСТИЕ РЕГУЛЯТОРНЫХ ПЕПТИДОВ В ПОДДЕРЖАНИИ ТКАНЕВОГО ГОМЕОСТАЗА СЛИЗИСТОЙ ОБОЛОЧКИ ЖЕЛУДКА

03.03.04 - клеточная биология, цитология, гистология

Диссертация на соискание ученой степени доктора медицинских наук

Научный консультант: заслуженный деятель науки РФ, доктор медицинских наук, профессор С.С. Тимошин

Владивосток - 2014

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.....................................................................................8

ВВЕДЕНИЕ..............................................................................................................9

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.......................................................................19

1.1. Регуляторные пептиды как особый класс биологически активных веществ................................................................................................................19

1.2. Участие опиоидных пептидов в процессах поддержания тканевого гомеостаза...........................................................................................................28

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ...............................................................35

2.1. Характеристика исследуемых веществ.....................................................35

2.2. Характеристика исследуемых клеточных популяций.............................36

2.3. Методика проведения экспериментов.......................................................38

2.4. Метод индометацин-индуцированного повреждения слизистой оболочки желудка...............................................................................................41

2.5. Метод этанол-индуцированного повреждения слизистой оболочки желудка................................................................................................................43

2.6. Определение площади поражения слизистой оболочки желудка..........45

2.7. Гистологическая обработка экспериментального материала................46

2.8. Метод авторадиографии............................................................................46

2.9. Иммуногистохимический метод определения уровня экспрессии Ю-67 .............................................................................................................................49

2.10. Иммуногистохимический метод детекции апоптоза......................50

2.11. Определение гистамина флюориметрическим методом................51

2.12. Хемилюминесцентный анализ................................................................52

2.13. Статистическая обработка экспериментальных данных.......................52

ГЛАВА 3. ВЛИЯНИЕ ЛЕИ-ЭНКЕФАЛИНА И ЕГО АНАЛОГОВ НА СОСТОЯНИЕ ТКАНЕВОГО ГОМЕОСТАЗА СЛИЗИСТОЙ ОБОЛОЧКИ ЖЕЛУДКА В ФИЗИОЛОГИЧЕСКИХ УСЛОВИЯХ........................................54

3.1. Состояние вопроса......................................................................................54

3.1.1. Участие синтетического лиганда опиоидных рецепторов даларгина в регуляции физиологических процессов.......................................................54

3.1.2. Участие даларгина в регуляции тканевого гомеостаза.....................61

3.2. Влияние лей-энкефалина и его аналогов на процессы синтеза ДНК в слизистой оболочке желудка белых крыс........................................................64

3.2.1. Влияние пятикратного введения лей-энкефалина Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu на процессы синтеза ДНК в СОЖ белых крыс.......................................65

3.2.2. Влияние пятикратного введения [D-Ala] -лей-энкефалина Tyr-D-Ala-Gly-Phe-Leu на процессы синтеза ДНК в СОЖ белых крыс...............66

3.2.3. Влияние пятикратного введения НАЛЭ Phe - D - Ala - Gly - Phe — Leu - Arg на процессы синтеза ДНК в СОЖ белых крыс.............................66

3.2.4. Влияние пятикратного введения даларгина Туг - D-Ala - Gly - Phe - Leu - Arg на процессы синтеза ДНК в СОЖ белых крыс..........................68

3.3. Влияние даларгина на фоне блокады NOS на синтез ДНК в СОЖ белых крыс.............................................................................68

3.4. Влияние лей-энкефалина и его аналогов на процессы свободно-радикального окисления в слизистой оболочке желудка белых крыс.........69

3.4.1. Влияние лей-энкефалина Туг - Gly - Gly - Phe - Leu на процессы свободнорадикального окисления в слизистой оболочке желудка белых крыс.....................................................................................................................69

3.4.2. Влияние [D-Ala] -лей-энкефалина Tyr-D-Ala-Gly-Phe-Leu на процессы свободнорадикального окисления в слизистой оболочке желудка белых крыс.........................................................................................................70

3.4.3. Влияние НАЛЭ Phe-D-Ala-Gly-Phe-Leu-Arg на процессы свободно-радикального окисления в слизистой оболочке желудка белых крыс........72

3.4.4. Влияние даларгина Туг - D-Ala - Gly - Phe - Leu - Arg на процессы свободнорадикального окисления в слизистой оболочке желудка белых крыс.........................................................................................................73

3.5. Влияние лей-энкефалина и его аналогов на процессы свободно-

радикального окисления в сыворотке крови белых крыс..............................73

ГЛАВА 4. ВЛИЯНИЕ ОПИОИДНЫХ ПЕПТИДОВ НА СОСТОЯНИЕ ТКАНЕВОГО ГОМЕОСТАЗА СЛИЗИСТОЙ ОБОЛОЧКИ ЖЕЛУДКА В УСЛОВИЯХ ПАТОЛОГИИ.................................................................................82

4.1. Состояние вопроса......................................................................................82

4.2. Механизмы поддержания тканевого гомеостаза при НПВП-гастропатиях.......................................................................................................84

4.2.1. Участие центрального звена интегративных систем в поддержании тканевого гомеостаза слизистой оболочки желудка при НПВП-гастропатиях.......................................................................................................84

4.2.2. Участие местных факторов в поддержании тканевого гомеостаза слизистой оболочки желудка при НПВП-гастропатиях................................85

4.2.3. Состояние свободнорадикальных процессов при НПВП-гастропатиях.......................................................................................................90

4.3. Механизмы нарушения тканевого гомеостаза под влиянием этанола..92

4.4. Современные направления профилактики гастропатий.........................97

4.5. Влияние лей-энкефалина и его аналогов на состояние тканевого гомеостаза слизистой оболочки желудка в условиях патологии................100

4.5.1. Влияние лей-энкефалина и его аналогов на площадь повреждения слизистой оболочки желудка, индуцируемого индометацином................100

4.5.2. Влияние лей-энкефалина и его аналогов на процессы синтеза ДНК в слизистой оболочке желудка животных, получавших индометацин........112

4.5.3. Влияние лей-энкефалина и его аналогов на свободнорадикальный статус в слизистой оболочке желудка и крови животных, получавших индометацин.....................................................................................................114

4.5.4. Влияние даларгина на процессы синтеза ДНК в слизистой оболочке желудка животных, получавших индометацин на фоне блокады NOS ....121

4.5.5. Влияние лей-энкефалина и его аналогов на концентрацию гистамина в гомогенатах желудка белых мышей, получавших индометацин ...........................................................................................................................123

4.6. Влияние даларгина на тканевой гомеостаз слизистой оболочки желудка при НПВП-гастропатии у больных остеоартрозом......................................125

4.6.1. Влияние даларгина на процессы пролиферации слизистой оболочки желудка при НПВП-гастропатии у больных остеоартрозом......................125

4.6.2. Влияние даларгина на процессы апоптоза слизистой оболочки желудка при НПВП-гастропатии у больных остеоартрозом......................132

4.7. Влияние даларгина на тканевой гомеостаз на модели этанол-индуцированного повреждения слизистой оболочки желудка...................134

4.7.1. Влияние даларгина на площадь повреждения слизистой оболочки желудка, индуцируемого этанолом...............................................................135

4.7.2. Влияние даларгина на процессы синтеза ДНК в слизистой оболочке желудка животных, получавших этанол.......................................................138

4.7.3. Влияние даларгина на свободнорадикальный статус в слизистой оболочке желудка животных, получавших этанол......................................139

Глава 5. ВЛИЯНИЕ РЕНИН- АНГИОТЕНЗИНОВ ОЙ СИСТЕМЫ НА ПРОЦЕССЫ СИНТЕЗА ДНК И СВОБОДНОРАДИКАЛЬНОЕ ОКИСЛЕНИЕ

В СЛИЗИСТОЙ ОБОЛОЧКЕ ЖЕЛУДКА........................................................142

5.1. Состояние вопроса....................................................................................142

5.1.1. Система ренин-ангиотензина, ее участие в морфогенетических процессах..........................................................................................................142

5.2. Влияние ангиотензина II на состояние тканевого гомеостаза в различных клеточных популяциях белых крыс............................................153

5.2.1. Влияние ангиотензина II на ДНК-синтетические процессы эпителиоцитов слизистой оболочки желудка белых крыс..........................154

5.2.1.1. Влияние ангиотензина II на ДНК-синтетические процессы эпителиоцитов слизистой оболочки желудка половозрелых белых крыс .....................................................................................................................154

5.2.1.2. Влияние ангиотензина II на ДНК-синтетические процессы в эпителиоцитах желудка новорожденных белых крыс..........................155

5.3.1. Влияние эналаприла на состояние тканевого гомеостаза слизистой оболочки желудка в физиологических условиях.........................................159

5.3.1.1. Влияние эналаприла на процессы синтеза ДНК в слизистой оболочке желудка в физиологических условиях...................................159

5.3.1.2. Влияние эналаприла на процессы свободнорадикального окисления в слизистой оболочке желудка животных в физиологических условиях.....................................................................................................160

5.4.1. Влияние эналаприла на состояние тканевого гомеостаза слизистой оболочки желудка при этанол-индуцированном повреждении слизистой оболочки желудка............................................................................................161

5.4.1.1. Влияние эналаприла на площадь повреждения слизистой оболочки желудка, индуцированного этанолом....................................161

5.4.1.2. Влияние блокады NOS на площадь повреждения слизистой оболочки желудка, индуцированного этанолом, у животных, получавших эналаприл.............................................................................165

5.4.2. Влияние эналаприла на процессы синтеза ДНК в слизистой оболочке желудка животных, получавших этанол......................................167

5.4.3.1. Влияние эналаприла на процессы свободнорадикального окисления в слизистой оболочке желудка животных, получавших этанол..........................................................................................................168

5.4.3.2. Влияние блокады NOS на процессы свободнорадикального окисления в слизистой оболочке желудка у животных, получавших

этанол на фоне введения эналаприла......................................................171

5.5. Влияние ингибиторов АПФ на процессы пролиферации у больных с

хроническим гастритом, сочетающимся с артериальной гипертонией......172

ГЛАВА 6. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЯ..................180

ВЫВОДЫ.............................................................................................................194

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ...................................................................................196

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АКМ - активные кислородные метаболиты

АОРЗ - антиоксидантная антирадикальная защита

АПФ - ангиотензинпревращающий фермент

ATII - ангиотензин II

АТЬ АТ2 - рецепторы ангиотензина

ВЭЖХ - высокоэффективная жидкостная хроматография

ГП - гидроперекиси липидов

ИМ - интенсивность метки

ИМЯ - индекс меченых ядер

НАЛЭ - неопиатный аналог лей-энкефалина

НПВП - нестероидные противовоспалительные препараты

ПГ - простагландины

ПОЛ - перекисное окисление липидов

РАС - ренин-ангиотензиновая система

РП - регуляторные пептиды

СРО - свободнорадикальное окисление

СОЖ - слизистая оболочка желудка

ХМЛ - хемилюминесценция

ЦОГ - циклооксигеназа

EGF - epidermal growth factor

Erk - extracellular-regulated kinase - mitogen-activated protein (MAP) kinase

GRK - G-protein-coupled receptor kinase

JNK - c-Jun-N-terminal kinase

L-NAME - NG-nitro-L-arginine methyl ester

NK-кВ - nuclear factor kappa В

NO - nitric oxide

NOS - nitric oxide sinthase

cNOS - constitutive NOS

iNOS - inducible NOS

OGF - Opioids Growth Factor

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы. Широкое внедрение в клиническую практику эндоскопических методов исследования выявило значительную распространенность эрозивно-язвенных поражений верхних отделов пищеварительного тракта [106, 300]. Нарушения целостности слизистой оболочки желудка (СОЖ) и двенадцатиперстной кишки встречаются от 4 до 20-30% случаев эндоскопических обследований [96, 300], причем в пожилом возрасте частота эрозивных поражений возрастает до 73% [14].

Клиническое и социальное значение нарушений целостности СОЖ определяется не только их широкой распространенностью, но и тяжелыми осложнениями. Эрозивно-язвенные поражения слизистой оболочки желудка являются основной причиной желудочно-кишечных кровотечений, а показатель летальности при этой патологии составляет более 10% [6, 96]. Усугубляет опасность осложнений факт бессимптомного латентного течения эрозивных поражений СОЖ. Более 50% больных, госпитализированных в связи с желудочными кровотечениями, имели бессимптомное течение гастропатии [520, 605].

Этиологические факторы и патогенетические механизмы развития эрозивно-язвенных поражений желудка сложны и многообразны. Острые эрозивно-язвенные поражения желудка чаще всего являются следствием стрессового состояния организма - психогенного стресса, травмы, ожогов, хирургического вмешательства. Эрозивно-язвенные поражения СОЖ у пострадавших с травмами наблюдаются в 24-89% случаев, осложнения острых язв кровотечениями - от 13,8 до 86,3% случаев. Летальность при кровотечениях составляет около 64% [50].

Острые эрозивно-язвенные поражения слизистой оболочки желудка характерны для тяжелой почечной, сердечной, печеночной и легочной недостаточности, для гиповолемического шока [572, 592]. Эрозивно-язвенные поражения желудка выявляют в первые часы пребывания в отделениях интенсивной терапии у подавляющего большинства больных [591].

В качестве причины эрозивно-язвенных поражений СОЖ также называют алкоголь и лекарственные препараты (нестероидные

противовоспалительные препараты (НПВП), кортикостероиды, дигиталис и т.д.). НПВП - самая распространенная группа лекарственных средств, используемых в клинической практике и повседневной жизни [86]. При этом у пациентов регистрируется НПВП-гастропатия с выраженными эндоскопическими и клиническими проявлениями: субэпителиальными геморрагиями, эрозиями, язвами [238].

Эрозии и язвы СОЖ присущи синдрому Золлингера-Эллисона, некоторым эндокринным заболеваниям, болезни Крона. Хронические эрозии СОЖ зачастую являются следствием геликобактерного гастрита [14].

Ранее главной причиной изъязвления СОЖ считали чрезмерную продукцию соляной кислоты желудочного сока. Действительно, у больных эрозивными гастритами и дуоденитами, как правило, кислотопродуцирующая функция желудка повышена [14]. Однако в настоящее время превалирует мнение, что высокий уровень кислотности желудочного сока превращается в повреждающий фактор лишь при снижении защитной способности СОЖ.

Нарушение целостности желудочного эпителия - это ежедневный процесс. В норме восстановление целостности эпителия происходит за 15-60 мин [663]. Быстрое восстановление целостности СОЖ осуществляется за счет комплекса протективных факторов.

Совокупность компонентов защиты слизистой составляет иерархию. Первый уровень защиты слизистой представлен факторами, секретируемыми в просвет желудка (бикарбонаты, слизь, поверхностно-активные фосфолипиды, иммуноглобулины и др.). Второй уровень - это собственно желудочный эпителий. При постоянном физическом или химическом повреждении эпителиоцитов их высокий регенераторный потенциал является важнейшим механизмом защиты. Третий уровень - это микроциркуляторное русло слизистой оболочки в сочетании с ее афферентной иннервацией. Повреждение слизистой через афферентную иннервацию увеличивает кровоток в микроциркуляторном русле, что ограничивает повреждение и ускоряет регенерацию. И, наконец, четвертый уровень - это сторожевые клетки, такие, как тучные клетки и макрофаги, которые способны обеспечить адекватный воспалительный ответ на проникновение чужеродного материала в СОЖ [662].

Несмотря на многочисленность факторов, обеспечивающих защиту СОЖ от повреждения, критическую роль в этом процессе играют простагландины и NO. Эти медиаторы влияют на все компоненты защиты слизистой оболочки желудка: ингибируют секрецию кислоты, стимулируют секрецию бикарбонатов и слизи, повышают кровоток в слизистой, ускоряют процессы репарации. Оба медиатора ингибируют активность тучных клеток и адгезию лейкоцитов к сосудистому эндотелию. Кроме того, они способны действовать как иммуномодуляторы. Супрессия синтеза простагландинов и N0 значительно увеличивает чувствительность СОЖ к повреждению. К дополнительным факторам, поддерживающим целостность СОЖ, относят системы кальцитонин-ген-родственного пептида и белков теплового шока [187, 395]. Таким образом, защита СОЖ - это не статический, а динамический процесс [662].

По-видимому, независимо от этиологии, нарушение целостности СОЖ возникает вследствие дисбаланса факторов агрессии и факторов защиты. Если в отношении язвенной болезни терапевтические подходы разработаны на уровне стандартных рекомендаций, подкрепленных огромным клиническим опытом, то в отношении симптоматических гастропатий такого значительного опыта не существует. Очевидно, что задачей терапии должно быть комплексное повышение устойчивости СОЖ к повреждающим факторам - развитие адаптивной цитопротекции [420].

Имеющиеся в распоряжении клиницистов терапевтические подходы позволяют в той или иной степени корригировать о

Информация о работе

Животова, Елена Юрьевна
доктора медицинских наук
Владивосток, 2014
ВАК 03.03.04

Диссертация

Участие регуляторных пептидов в поддержании тканевого гомеостаза слизистой оболочки желудка - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы