Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Цитогенетические подходы к изучению межхромосомного и межиндивидуального полиморфизма ядрышкообразующих районов хромосом человека

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Цитогенетические подходы к изучению межхромосомного и межиндивидуального полиморфизма ядрышкообразующих районов хромосом человека"

Р Г Б ОД

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХ НАУК Медико-генетический Научный Центр

На правах рукописи УДК: 575.113:576.316:591

Кравец Ирина Александровна

Цитоген етичеекие подходы к изучению межхромосомного и межнндивидуального полиморфизма ядрышкообразующих районов

хромосом человека.

03.00.15-Генетика

Автореферат

дпссертащш на соисханне ученой степени кандидата биологических наук

5

Москва —1994

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РЛПОТЫ

Актуальность темы. К настоящему времени известно, что рРНК—гены человека локализованы в ядрышкообразующих районах коротких плеч 5-ти пар акроцентрических хромосом: 13, 14, 15, 21, 22. С введением п 70-х голах в цитогенетичсскую практику метола окраски ядрышкообразующих районов серебром (Ag-метод), возникла возможность изучения экспрессии рибосомнмх гепоп непосредственно на хромосомных препаратах (Bloom, Goodpasture, 1976; Howell, Black, 1980). Было показано, что характер серебрения ЯОР зависит не только от наличия рибосомных генов на хромосоме, но и от их функционального состояния, и, что только транскрипцнонно активные в предшествующей интерфазе блоки генов окрашиваются серебром (Miller et at., 1476: Pathak, Elder, 1980; Härtung et al., 1983). Разработаны подходы к охарактеризованы различия индивидов но количеству транскрипцнонио активных рибосомнмх генов в ЯОР (Мхйтарова и др., 1988; Ляпунова и др., 1988). Часть копий гена рРНК находится в репрессированном состоянии. Их выявление может быть осуществлено путем сопоставления относительного числа генов рРНК в каждом ЯОР (гибридизация in situ с зондом рДНК) с размером Ag-ЯОР тех же хромосом данного индивида. Однако, лишь в единичных случаях сделаны попытки выявления репрессированных копий гена в индивидуальных ЯОР (Tantravahi et al., 1981; Мхйтарова и др., 1988; Garkavtsev etal., 1988). Существующие данные не дают представления о разнообразии геномов по наличию репрессированных генов рРНК в отдельных ЯОР и геноме в целом. Не ясно, могут ли репрессированные копии гена рРНК быть реактивированы в измененных условиях функционирования клетки. А именно эти признаки генома могут быть особенно важными для адаптивных способностей организма при изменениях факторов внутренней и внешней природы.

В последние годы появилась тейденцня использовать цитогенетическин показатель— участие акроцентричеЛнх хромосом (АХ) в ассоциациях (АсАХ) — для диагностических и прогностических целей при острых заболеваниях, затрагивающих иммунную систему (Фролов, 1985; 1989) и при развитии опухолей (Miller et al,, 1978; Pedrazzini and Slavutsky, 1991). Известно, что способность АХ вступать в ассоциации так же, как интенсивность серебрения их ЯОР, отражает функциональной состояние ЯОР. Показана связь между этими параметрами (Warburton et al., 1976; Miller etal., 1977; de Capoa et al., 1978). Показано также, что ассоциативный индекс (АИ), определяемый кик процент мета-фаз с АсАХ, ь,лвисит от длительности интерфазы и/ми скорости пролиферации клеток (Жданова, Дерягин, 1974; Sigmund, 1979; Созанский 1983; Фролов, 1985). Наряду с этим, в ряде работ на основе снижения АИ в клетках под воздействием облучения или химических мутагенов делается вывод о йовреж-

дении ЯОР и снижении уровня транскрипции рибосомн'ых генов (Kirsch-Volders et al., 1978; Hens, 1978; Verschaeve el al., 1979; di Lernia et al., 1981; 1982). В связи с этим, важной задачей является выяснение вопроса — действительно ли снижение АИ сопровождается уменьшением активности ЯОР.

Все вышесказанное определило цель и задачи предлагаемого исследования. Цель'и задачи исследования. Целью настоящего исследования было выделение морфо-функциональных вариантов ядрышкообразующих районов хромосом человека на основе сравнительного анализа представленности активных и неактивных копий генов рРНК в ЯОР с помощью цитогсиетических методов исследования; изучение встречаемости вариантов ЯОР в разных парах акро-центрических хромосом и в хромосомных наборах разных индивидов; изучение некоторых функциональных свойств вариантов ЯОР человека.

Для достижения поставленной цели в работе решались следующие задачи:

1. Изучить Ag—варианты ЯОР с одновременной идентификацией хромосом в выборке кариотипически нормальных индивидов.

2. Провести сравнительную оценку количества копий гена рРНК (интенсивность гибридизации с рДНК) в ЯОР тех же индивидов.

3. Оценить частоту встречаемости в популяции генетически нормальных индивидов вариантов ЯОР, содержащих заметное количество "молчащих" генов рРНК. 1

4. Провести сравнительный анализ показателей ассоциативных способностей акроцентрических хромосом и интенсивности их окраски серебром (размер Ag-ЯОР), выяпить степень взаимосвязи между этими признаками.

5. Осуществить попытку реактивирования "молчащих" генов рРНК в клетках индивидов, имеющих ЯОР с запасными копиями гена.

ны 4 морфо-функциональных варианта ЯОР, различающихся по присутствию копий рибосомного гена и относительному количеству активных и неактивных копий. Охарактеризованы межиндивидуальные различия по встречаемости разных вариантов ЯОР. Обнаружена неравномерность их межхромосомного распределения: выявлена высокая частота хромосомы 15 с полным отсутствием копий гена рРНК; показано, что ЯОР хромосомы 21 существенно чаще других имеют запасные копии рибосомного гена. Впервые осуществлена верификация разделения гомологов в парах акроцентрических хромосом после Ag-oкpacки на основе сравнения методом хи-квадрат теоретических и эмпирических частот парных событий. На основе использования культур клеток индивидов, для которых охарактеризованы свойства всех 10 ЯОР, впервые предложен цитогене-, тический метод, позволяющий изучать модификацию активности генов рРНК. Подтвердив тог факт, что вероятность участия акроцентрической хромосомы в ассоциации коррелирует с размером расположенного на ней Ag-ЯOP, мы пока-

¡. В результате проведенного исследования впервые выделе

зали, что снижение ассоциативного индекса, сопровождающее укорочение интерфазы, не связано с уменьшением транскрипции генов рРНК и ЯОР.

Практическая ценность работы. Предложенный в работе цитогенетический подход для описания комплекса рибосомных генов в индивидуальных ЯОР и в геноме в целом позволяет: (а) характеризовать геномы отдельных индивидов по набору генов рРНК, что может быть важным для оценки адаптивных возможностей организма; (б) проводить сравнение геномов по этим признакам у индивидов в пределах популяции, в разных популяциях в связи с условиями существования и пр. Это предоставляет новые возможности дня популяцнон-ной генетики человека. Выявленная особенность ЯОР хромосом 21 пары (вы- . сокая частота хромосом с запасными копиями гена рРНК) может быть использована для поиска новых возможностей объяснения причин нерасхожденна хромосом 21 пары, приводящей к появлению трисомии 21 (синдром Дауна). Предложенная экспериментальная модель для изучения регуляции активности рибосомных генов открывает неограниченные возможности для выявления факторов, способных модифицировать работу генов рРНК. Установление того факта, что снижение частоты участия акроцентрических хромосом в ассоциациях не сопровождается уменьшением активности генов рРНК в ЯОР, позволит более корректно использовать ассоциативные признаки хромосом в диагностических и прогностических целях.

Основные положения, выдвигаемые на защиту:

1. Функциональные варианты ЯОР хромосом человека полиморфны по присутствию копий рибосомного гена и относительному количеству активных и неактивных копий гена. Могут быть выделены 4 морфо-функциональных варианта ЯОР.

2. Наборы ядрышкообразующих районов хромосом разных индивидов различаются по присутствию 4-х морфо-функциональных вариантов ЯОР.

3. Существуют различия в межхромосомном распределении вариантов ЯОР.

4. Ассоциативный индекс отражает общее количество активных генов рРНК в геноме, но только в том случае, если анализируются быстро про.тифериру-ющие клетки. При этом частота участия в ассоциациях данного ЯОР пропорциональна размеру его Ад-ЯОР.

Апробация работы. Материалы диссертационной работы были представлены на II Всесоюзной конференции "Геном человека" (Переславль-Залесскин, 1991); на Всесоюзном совещании "Функциональная морфология клетки" (С.Петербург, 19ГЧ); на 26 ежегодной конференции Европейского общества генетиков человека (Париж, 1994); на объединенном научном семинаре Института генетики человека МГНЦ РАМН (1994).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 6 печатных работ. Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, полученных ре-

-з-

зультатов и их обсуждения, общего заключения, выводов и списка цитированной литературы. Работа изложена на/^страницах'машинописного текста, содержит 15 таблиц и 6 рисунков. Список литературы включает 162 источника, из которых 42 отечественных и 120 зарубежных.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

Объект исследования. Работа выполнена на хромосомных препаратах, полученных в результате культивирования лимфоцитов периферической кроим 26 здоровых, кариотипически нормальных индивидов и возрасте от 25 до 55 лет. Среди них 17 женщин и 9 мужчин. Поскольку ни по одному из изученных параметров между женщинами и мужчинами не было выраженных различий, все данные объединены в единую выборку.

Для культивирования лимфоцитов использовали микрометод, когда применяется цельная периферическая кровь (Hungerford, 1965). Для идентификации хромосом во всех случаях проводили G-окраску. Мы использовали два варианта G-окраски с предобработкой хромосом трипсином или хлористым цезием. Отобранные метафазные пластинки зарисовывали и идентифицировали 10 ак-роцентрических хромосом (АХ) до проведения Ag-окраски. После этого препараты отмывали в спиртах и подвергали Ag-окраске по модифицированному методу Howell and Black (1980), который состоял в следующем: на стекло наносили 50 мкл деионизированной воды, 150 мкл 50%-го раствора нитрата серебра (вес/объем) и 100 мкл 2%-го раствора желатины. Препарат накрывали покровным стеклом и инкубировали в термостате в течении 10 мин при 56С . Покровное стекло и красящий раствор смывали в струе водопроводной воды, препарат окрашивали 1%-ым раствором красителя Гимза и анализировали под световым микроскопом при увеличении 100x10. Для исключения из анализа клеток с неполноценной Ag-окраской ЯОР серебром, отбирали только метафазные пластинки с завершенной Ag-окраской, пользуясь критериями, предложенными Созанским (1983). Для каждого индивида анализировали Ag-ЯОР в 20-80 клетках. Размер Ag-ЯОР оценивали визуально по 5—ги балльной системе. Для сравнения геномов индивидов по количеству активных копий ри-босомных генов определяли среднюю сумму баллов всех 10 ЯОР (Ляпунова

и др., 1988).

Анализ ассоциаций АХ проводили на препаратах, фиксированных на 48 и 72 ч культивирования клеток. Для описания АсАХ использовали следующие критерии: (1) Ассоциативный индекс (АИ)-процент клеток с Ас, рассчитанный на основе наблюдения не менее 100 метафаз; (2) число хромосом в Ас на клетку, содержащую Ас; (3) частоту участия в Ас каждого из 10 ЯОР у каждого индивида (% от общего числа хромосом данного гомолога); (4) долевое участие в Ас данного ЯОР (% от общего числа хромосом в Ас).

Для гибридизации нуклеиновых кислот на хромосомных препаратах п качестве молекулярного зонда использовали плазмиду pBR325, в которую по сайту рестрикции EcoRl был вставлен фрагмент гена 1SS рДНК, длиной 5.7 т. п. а. Тритиевую метку в ДНК-зонд вводили с помощью реакции пик-трансляции, используя стандартный Nick-translation kit 5500 (Aniersham). Удельная радиоактивность меченого зонда составляла 1-5*106 имп/мин/мкг. Гибридизацию меченой пробы с метафазными хромосомами проводили по методу, предложенному Harper и Saunders (1981). Препараты покрывали фотоэмульсией фирмы Ilford и экспонировали в темноте от трех до пяти недело. Препараты проявляли проявителем D19 и подсчитывали число зерен метки над ЯОР 10-ти АХ, кото-, рые либо до гибридизации, либо после проявления препаратов были идентифицированы с помощью G-окраски. Дчя анализа выбирали метафазы с суммарным количеством метки над короткими плечами АХ в интервале от 20 до 150 зерен.

Реактивирующее действие диметилсульфоксида (ДМСО) на "молчащие" копии гена рРНК изучали на культивируемых клетках крови двух индивидов (002 и 034), у которых в нескольких ЯОР нами были выявлены "молчащие" гены рРПК. Опыты проводили по следующей схеме. В культуральиые флпконы через 24 ч после начала культивирования клеток вносили ДМСО в концентрациях 100—1000 мкг/мл. Фиксирование клеток и приготовление хромосомных препаратов проводили на 72 ч обычным методом. Для каждого индивида были получены два контроля: вариант К-1 получен одновременно с опытными вариантами, а К-2 в независимых, попторно посаженных культурах. Но всех опытах анализировали шифрованные препараты.

Методы м ате м ати ч сс к о й об ра ботк 11. Данные обрабатывали стандартными методами вариационной статистики. Для сравнения средних значений использовали t-критернй Стыодента. Оценку связи между размером Ag-ЯОР и участием АХ в ассоциациях осуществляли с го мощью регрессионного анализа (.пшенная корреляция). Для выявления резервных копий рибосомного гена в индивидуальных ЯОР акроцентрических хромосом применяли двуступенчатый регрессионный анализ. Эту математическую обработку проводили с помощью стандартного пакета программ STATGRAPHICS на компьютере IBM PC/AT 286.

Вопрос о различиях гомологов в парах АХ после Ag-окраски решали на основе сравнения методом хи-квадрат теоретических и эмпирических частот парных событий. Для этой цели Спиридоновой была составлена специачь-ная программа для компьютера, за что выношу ей большую благодарность.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

1. Морфо-функциональные варианты ядрышкообразующнх районов акроцентрических хромосом человека.

Задача данного раздела исследования состояла в том, чтобы охарактеризовать ЯОР индивидуальных хромосом по триаде признаков: (I) количество ко- . пий гена рРНК; (II) относительное количество транскрибируемых копий гена и (III) присутствие запасных, резервных копий (PK) гена рРНК.

Анализ проведен на хромосомных препаратах 17 кариотипически нормальных индивидов. Изучена корреляция между интенсивностью'Ag-окраски ЯОР и интенсивностью гибридизационного мечения, косвенно отражающей число копий генов рРНК. Для того, чтобы иметь возможность охарактеризовать мор-фо-функциональные варианты ЯОР в каждой из акроцентрических хромосом, независимо от присутствия специфических маркеров, мы должны были различать гомологи в пределах каждой из 5 пар АХ. В опубликованных работах для идентификации гомологов используют разные подходы. Одни авторы проводят исследование на хромосомах индивидов, у которых удается выявить морфологические маркеры одного из гомологов (Vcnna, Rodriguez, 1985). Группа итальянских исследователей опубликовала серию работ (de Сароа et <;!., 1985; 1988; 1991), выполненную на хромосомах одной пациентки, у которой во всех 5-ти парах акроиентриков удалось установить различия гомологов при последовательном использовании двух флюоресцентных окрасок (хромомицин А, акрихин). Для идентификации гомологов авторы проводили последонатсльпую окраску и повторное фотографирование каждой метафазы перед Лц—окраской или гибридизацией in situ. Такой методический подход может влиять на результат эксперимента. В частности, в одной из работ (de Сароа et al., 1988), авторы получили труднообъяснимый результат, когда хромосомы 14 пары проявили интенсивную Ag-окраску при относительно низкой интенсивности гибридизационного мечения. Другой подход различия гомологов состоит в разделении хромосом с большим размером Ag-ЯОР (гомолог "а") и с меньшим размером (гомолог "б"). Правомочность такого подхода обоснована многими авторами, которые использовали выборочные случаи, когда гомологи могли быть достоверно идентифицированы, например, по размеру спутника или прицентромер-ного гетерохроматина (Jotterand-Bellomo and Melle, 1981; Мхитарова, 1988). Мы также использовали такой подход. Однако, в ряде случаев при слабо выраженных различиях в размерах Ag-ЯОР оставались сомнения: не создаются ли искусственные различия гомологов "а" и "б", когда на самом деле они имеют практически одинаковые значения? Именно поэтому, как указано в разделе "Материалы и методы", была разработана специальная программа для решения вопроса о различии гомологов в парах АХ после Ag-окраски. Мы решали этот вопрос на основе сравнения методом хи-квадрат теоретических и эмпирических частот парных событий. Заключение о реальности различия гомологов "а" и "б" делали, основываясь на достоверном (уровень значимости 95% и более) отличии эмпирического распределения парных значений размеров Ag-ЯОР от теоретического распределения. Проверяемая "0"-гипотеза заключалась в том,

что гомологи не различаются между собой по размеру Ag-ЯOP (имеют одинаковый балл Ас-ЯОР). В результате такого анализа оказалось, что из 85 (5x17) пар ЛХ в 60 (70.6%) парах гомологи различаются по размеру Ае~ЯОР, а п 25 (29.4%) гомологи имели одинаковые размеры Лg-Я01'. В этих случаях значения размеров Ag-ЯOP в двух гомологах усредняли. Так же поступали дня этих пар гомологов с числом гнбридмзационных зерен. Усреднение числа гпбридизл-ционных зерен было проведено для всех не различающихся по размеру Аг— ЯОР пар АХ, за исключением одного случая, когда по количеству гибридизаци-онных зерен гомологи не подлежали объединению.

Были получены данные о размере Аб~ЯОР и относительном числе копий гена рРНК (число гибридизационных зерен) для каждой из 10 ядрышкообразу-ющих хромосом всех- 17 индивидов. При сопоставлении размера Ад^ЯОР и интенсивности гибридизационного мечения в коротких плечах идентифицированных хромосом одного и того же индивида было замечено, что в большинстве

Таблица I

Морфо-функционалыше варианты ЯОР у человека

Вариант Характер Аг-окраскн Характер гибридиздцнон-ного мечения (ГМ) Наличие резервных 1 э-пий (РК) гена рРНК

1. Ае-/РК- Аокраска отсутствует ГМ практически отсутствует копни гена рРНК отсутствуют (практически полная аелеция ЯОР)

2. АГ7РК+ Аг~окраска отсутствует ГМ присутствует, сю интенсивность соответствует I баллу Ае-ЯОР или более все имеющиеся в ЯОР копни гена рРНК неактивные (РК)

3. ае+/РК+ Аг-окраска присутствует ГМ интенсивное; в соответствии с числом гибрид. зерен, размер А£-ЯОР должен бить не менее, чем нз 1 балл выше наблюдаемого наряду с актирными генами рРМК есть РК

4. Л8+/РК- Ле-окраска присутствует ГМ примерно соответствует баллу Л£-ЯОР РК гена рРНК нет

случаев существует связь: чем больше размер Ag-ЯOP, тем выше интенсивность гибридизационной метки.Как правило, при отсутствии Лg-oкpaeки отсутствовало и гибридизационное мечение ЯОР. Но в некоторых случаях наблюдались отклонения от этого правила, а именно: некоторые хромосомы при отсутствии Ag-oкpacки содержали заметное количество гибридизационных зерен; некоторые хромосомы с маленьким размером Ag—ЯОР (1-2 балла) отличались высокой интенсивностью гибридизационного мечения, соответствующей 2-3

баллам Аз~ЯОР. Мы выделили 4 морфо-функциональных варианта ЯОР у человека, характеристики которых приведены в таблице 1.

Для того, чтобы выявить ЯОР с запасными копиями гена рРНК, мы изучили корреляции (линейная регрессия) между размерами Ag-ЯOP и числом гибри-дизационных зерен по всем 10 ядрышкообразующим хромосомам для каждого из 17 индивидов. На'рисунке 1 в качестве примера приведены линии регрессии

Рис 1. Корреляции между размером Ад-ЯОР и числом гиб-ридизационных зерен (зачерненные символы соответствуют двум неразличающимся гомологам).

для 3-х индивидов. Можно видеть, что у индивида 0?0 (рис. 1А) все 10 точек лежат близко к линии регрессии; это означает, что во всех ЯОР существует сильная связь между интенсивностью гибридизационного мечения и размером

Ag-ЯОР, коэффициент корреляции равен 0.977. Это в свою очередь означает, что практически все копии гена рРНК во всех ЯОР активны, т.е. данный индивид не имеет хромосом с резервными копиями. У некоторых индивидов отдельные точки удалены влево от линии регрессии. В том случае, когда точка удалена больше чем на 1 балл Ag-ЯОР по оси абцнсс, полагали, что в ЯОР имеются запасные копии гена рРНК. Так, у индивида 015 (рис. 1 Б), положение точки

Таблица 2

Коэффициенты корреляции (г) между числом гибридизациоиных зерен и размером Ag-ЯОР

Индивид По всем ЯОР Без ЯОР с РК гена рРНК

Уро- Уро-

N9 п/п Шифр вень Rsq вень Rsq ЯОР с РК

п г п г

значимости <%> значимости <%>

1 001 10 0.649 0.042 42.2 7 0.928 0.002 S6.2 15з. 226, 216

2 002 10 0.868 0.001 75.3 9 O.S0O 0.001 79.2 21Г>

3 003 10 0.711 0.021 50.5 7 0.9J6 0.001 91.3 146, 22а, 226

4 012 10 0.829 0.003 68.8 8 0.859 0.006 73.8 13а, 146

5 013 - - - - 10 0.882 0.001 77.7 -

6 015 10 0.919 0.000 84.5 9 0.9S7 0.000 97.4 15а

7 017 10 0.815 0.004 66.4 8 0.027 0.001 85.9 146, 15а

8 028 10 0.452 0.190 20.4 7 0.950 0.001 90.3 lía, 21а, 216

9 030 - - - ' - 10 0.977 0.000 95.4 -

10 032 10 0.719 0.019 51.7 8 0.856 0.007 73.2 21а, 216

И 033 - - - - 10 0.812 0.004 65.9 -

12 034 10 0.675 0.032 45.6 7 0.944 0.001 89.2 13а, 136, 21а

13 035 10 0.485 0.156 23.5 8 0.8S5 0.003 78.3 21а, 216

14 038 - - - - 10 0.931 о.ооо S6.6 -

15 051 - - - - 10 0.893 0.001 79.8 -

16 799 10 0.932 0.000 86.9 9 0.975 0.000 95.2 216

17 814 10 0.805 0.005 M.9 9 0.874 0.002 76.4 13а

Среднее +/- S. Е. Статист, сходства

хромосомы 15а показывает, что размер Ag-ЯОР (1.7 балла) больше чем на 1 балл ниже ожидаемого в соответствии с интенсивностью гибридизационного мечения. То '■сть, можно предположить, что в этой хромосоме имеются резервные копии рибосомного гена. Приняв такое решение, мы провели повторный корреляционный анализ после исключения хромосомы 15а (рис.1 В). При этом коэффициент корреляции с 0.919 увеличился до 0.987, зависимость признаков возрасла с 84.5 до 97.4%. У индивида 017 резервные копии выявлены в 2-х хромосомах (14б, 15а) (рис. 1Г,Д).

0.73S +/- 0.045

+/-

5 6.7 6.25

0.913 +/- 0.012

+/-

83.6 2.18

р<0.001

р<0.001

В таблице 2 приведены суммарные результаты корреляционного анализа для 17 индивидов. В левой части таблицы внесены данные только для тех индивидов, у которых были выявлены хромосомы с запасными копиями. Коэффициенты корреляции у этой группы индивидов варьируют от 0.452 до 0.932. Показатель характеризующий взаимосвязь изучаемых признаков, колеблется от 20% до 86%. В правой части таблицы приведены коэффициенты корреляции после исключения хромосом с запасными копиями рибосомного гена. Можно видеть, что коэффициенты корреляции заметно возрастают и варьирует в пределах от 0.812 до 0.987, при этом возрастает уровень значимости коэффициента корреляции и зависимость признаков друг от друга. В последней графе таблицы 2 указаны хромосомы, в которых в результате анализа линейной регрессии выявлены резервные копии гена и которые были исключены при определении повторной корреляции.

На основе такого анализа были выявлены 24 ЯОР из 170 (14,1%) с резерв-

Таблица 3

Встречаемость вариантов ЯОР у разных индивидов

Инливид Варианты ЯОР Число ЯОР с РК(2+3/

N9 п/п Шифр 1 Ае-/РК+ 2 РК+ 3 Ае+/РК-4

1 001 1 (22)* - 3(15,21,22) 6 3

2 002 - 1 (21) - 9 1

3 003 - - 3 (14, 22, 22) 7 3

4 012 1 (15) • 1 (14) 1 (13) 7 2

5 013 2 (14, 22) - - 8 0

6 015 2(21,22) - 1 (15) 7 1

7 017 I (15) - 2 (14, 15) 7 2

8 028 - - 3 (15, 21, 21) 7 3

9 030 1 (15) - - 9 0

10 032 1 (15) - 2(21,21) 7 2

11 033 - - - 10 0

12 034 1 (22) 1 (13) 2 (13, 21) б 3

13 035 1 (14) - 2 (21, 21) 7 2

14 038 1 (15) - - 9 0

15 051 - - - 10 0

16 799 1 (15) 1 (21) - 8 1

17 814 - - 1 (13) 9 1

Всего: 13 4 20 133 24

% из 170 7.65 2.35 11.8 78.2 14.1

■ Примечание: * В скобках указаны номера хромосом, несущих соответствующий вариант ЯОР

ными копиями рибосомного гена. Среди 17 индивидов 5 не имели ЯОР с РК, по 4 индивида имели один, два или три ЯОР с РК. Частоты морфо-функциональ-иых вариантов ЯОР (1), (2), (3) и (4) в изучаемой выборке (170 хромосом)

составили соответственно 7.65, 2.35, 11.8, 78.2% (табл. 3). В таблице 4 приведены данные по распределению вариантов ЯОР по разным парам акроцентри-ков. Заслуживает внимания тот факт, что почти половина (6 из 13) встреченных вариантов А^/РК- (практически полное делетирование ЯОР) относятся к хромосоме 15 (17.6% хромосом в сравнении с 7.6% в среднем). Другое интересное с нашей точки зрения наблюдение состоит в том, что ЯОР хромосомы

Таблица 4

Распределение вариантов ЯОР по хромосомам

Варианты ЯОР

ЯО-хромо- Число хро- Ag-/PK- Ag-/PK+ Ag+/PK+ Ag- РК+

сомы мосом 3 1+2 2+3

п % п % п % n % n %

Всего 170 13 7.6 4 2.4 20 11.8 17 10.0 24 14.1

Группа D 102 8 7.8 2 2.0 9 8.S 10 9.8 11 S.S

хр. 13 34 0 0.0 1 2.9 3 8.8 1 2.9 4 IIS

хр. 14 34 2 5.9 1 2.9 2 5.9 3 8.8 3 8.3

хр. 15 34 6 17.6 0 0.0 4 IIS 6 17.6 4 1 !S

Группа G 68 5 7.4 2 3.1 11 16.2 7 10.3 13 19.1

хр. 21 34 1 2.9 2 5.9 8 235 3 8.8 10 29.4

хр. 22 34 4 11.8 0 0.0 3 8.8 4 11.8 3 8.8

21 чаше других, а именно, в 10 из 34 случаев, имели PK (29.4% в сравнении с 14.1% в среднем или с 10.3% по всем хромосомам, кроме 21).

Полученные нами результаты — это первая попытка охарактеризовать мор-фо-функциональные варианты структурно-нормальных ЯОР человека. Важным выводом из всего выше сказанного яиляется то, что индивиды различаются по присутствию среди 10 АХ ЯОР с резервными копиями гена рРНК. Открытым остается вопрос, могут ли резервные копии гена рРНК включаться в работу (транскрибироваться) под действием фахторов внутренней и внешней среды? Первые попытки экспериментального изучения возможности реактивации резервных копий гена рРНК будут описаны в следующем разделе.

2. Подходы к изучению реактивации "резервных" копий i-ена рРНК.

Исходя из работы Lau с сотр. (1978) , в качестве реактивирующего агента мы выбрали диг тгилсульфокспд (ДМСО). Авторы цитируемой работы наблюдала в клетках эритролейкимии мыши увеличение количества глобиновой мРНК в тотальной РНК клеток, а также увеличение количества мРНК, связанной с фракцией активного хроматина клеток обработанных ДМСО (1.2%) по сравнению с контрольными клетками.

Мы изучили Ад-окраску ЯОР в обработанных ДМСО клетках у индивидов 002 и 034. У первого из них было показано наличие запасных копий гена рРНК на хромосоме 216 (вариант Ag-/PK+), а у второго на хромосомах 13а, 21а (Ае+/РК+) и 136 (Ag-/PK+). В разных вариантах опытов ДМСО использовали в концентрациях 100 мкг/мл и 500 мкг/мл для индивида 002 и 200 мкг/мл, 600 мкг/мл, 1мг/мл для индивида 034. Результаты опытов приведены в таблице 5.

Таблица 5

Влияние ДМСО на экспрессию гена рРНК, оцененную по размеру А§-ЯОР в баллах

Индивид 034

Вариант опыта Хромсома Сумма бал-

13а * 136 • 14а 146 15а 156 21а * 216 22а 226 лов 10 Ag-ЯОР

К-1 К-2 2.6 2.2. 0 0 3.2 3.0 0.3 0.3 3.0 2.9 2.1 2.0 2.2 2.2 0.7 1.0 3.1 2.9 0 0 17.2 16.2

200 мкг 600 мкг 1000 мкг 2.6 2.6 2.8 0 0 0 3.1 3.4 3.2 0.2 0.4 0.5 ООО 2.2 2.0 2.3 2.5 2.2 2.2 1.1 1.1 0.8 2.9 3.1 3.0 0 0 0 17.6 17.8 17.9

Индивид 002

13а 136 На,6 # 15а 156 21а 216 • 22а,б #

К-1 К-2 2.1 2.3 0.5 0.8 2.3 2.3 3.0 3.0 1.7 1.7 2.9 3.0 0.15 0.1 1.9 1.9 18.7 19.3

100 мкг 500 мкг 2.1 2.3 0.7 0.8 2.4 2.4 3.1 3.0 1.7 1.6 3.0 3.0 0 0 1.9 1.9 19.2 19.3

Примечание: * Хромосомы в которых есть резервные копии гена рРНК.

# Гомологи а и 6 не различаются; приведены средние значения по двум ЯОР.

Из таблицы видно, что ни в одном ЯОР в эксперименте не наблюдалось изменения интенсивности Ад-окраски в сравнении с контролем. Особенно показательно то, что неизмененными оказались и размеры Лg-ЯOP, имеющих РК. Таким образом, в выбранных концентрациях и режимах обработки ДМСО не вызывает реактивации "молчащих" копий гена рРНК.

Целью данного раздела диссертации было показать, каким образом клетки индивидов с охарактеризованными вариантами Ад-ЯОР могут быть использованы для изучения реактивации "молчащих" копий рибосомного гена. Предложенный здесь экспериментальный подход позволяет вести направленный поиск агентов и условий, способных модифицировать активность генов рРНК. В данном случае, мы должны сделать вывод, что либо ДМСО не является фактором, вызывающим реактивацию рибосомных генов, и тогда можно предположить, что механизмы реактивации структурных генов (по крайней мере глобинового

гена) отличны от механизмов реактивации рибосомных генов, либо должен быть найден другой режим воздействия.

3. Ассоциация акроцентрических хромосом человека: зависимость от разме-р.'| Лд-ЯОР и длительности интерфазы.

Таблица б

Размеры Ag-ЯОР, ассоциативным индекс (ЛИ) к число акроцентрнческих хромосом в ассоциациях на клежу с ассоиилшими » лимфоцитах кропи, фиксированных на 4S и 72 ч культивирования (в cVooiax — число клеток)

Индивид 48 час 72 час

№ п/п Шифр Сумма 10 Ag-ЯОР баллы АИ (%) Число хр. в асс/кл с лее. Сумма 10 Ag-ЯОР балл и Ail <%) Число AX В .lii/кЛ с

1 004 18.4 (30) 89 4.8 (18) 18.3 (IS) 76 .1.4 (IS)

2 006 20.2 (20) 87 3.4 (20) 19.7 (20) SO 3.7 (20)

3 013 15.5 (11) 93 4.0 (11) 15.3 (21) 73 2.7 (21)

4 015 18.5 (15) 92 4.3 (15) 17.0 (15) 76 2.9 (15.

5 037 17.5 (30) 97 4.6 (30) 16.8 (34) 65 3.1' (34)

6 038 18.0 (30) 95 4.2 (34) 18.4 (47) 83 3.6 (47)

7 039 16.8 (21) 82 4.2 (21) 16.4 (22) 70 3.1 <22)

8 050 17.9 (29) 85 4.2 (29) 17.9 (39) 78 2.0 (39)

9 051 21.0 (12) 91 4.3 (12) 20.9 (20) 89 3.5 (20>

10 '054 18.4 (25) 88 3.8 (25) 18.3 (20) 71 3.0 (20)

11 055 19.7 (26) 97 4.5 (26) 19.9 (20) 65 3.2 (20)

12 780 17.1 (11) 90 3.1 (11) 18.7 (14) 75 2.9 ( 8)

13 799 16.8 (44) 89 3.8 (44) 17.5 (30) so 3.1 (30)

14 800 19.3 (19) 92 4.7 (19) 19.6 (19) 79 3.0 (19)

15 814 18.3 (10) S9 4.1 (10) 18.2 (10) SO 2.6 (10)

Среднее +/-S.F.. Статист, сходства

18.23 +/-0.38

90.4 +/-1.11

4.17 +/-0.13

I

р-0.940

18.19 +/-0.39

р<0.01

р<0.01

76.0 +/-1.74

3.13 +/-O.OS

Исследование проведено на клетках крови 15 здоровых индивидов. При этом отдельные ЯОР на АХ были идентифицированы с точностью до гомолога в зависимости от размера Ag-ЯОР. За ассоциацию мы понимали только такое состояние коротких плеч АХ, когда между ними наблюдалась окрашенная серебром связь. Мы изучали ассоциативные свойства ЯОР в лимфоцитах, фиксированных на 48 и 72 ч культивирования. В первом случае клетки проходят 1-е деление после ФГА-стимуляции, т. е. они длительное время находились в интерфазе (значительно больше 48 часов); во втором — значительная часть кле-

ток проходит 2-е, а некоторые 3-е деление в условиях культивирования, т.е. их циклы характеризуются короткой интерфазой (12 ч и менее).

В таблице 6 приведены характеристики хромосом изученных индивидов по суммарной активности ЯОР и ассоциативным свойствам акроцентриков. Можно видеть, что сумма баллов Ад-ЯОР у 15 индивидов варьирует в пределах 16-21 балла, что соответствует опубликованным данным для выборки здоровых инди-

Таблица 7

Корреляции между суммарной активностью ЯОР и ассоциативными характеристиками АХ

у 15 индивидов

Переменные Варианты (срок фиксации час) Статистические показатели

Независимые Зависимые коэфф. корр. уровень значимости К 54, %

Сумма размеров 10 Аг-ЯОР АИ 48 0.112 0.690 1.26

72 0.437 0.103 19.06

Сумма размеров ЮАе-ЯОР Число АХ в асс./клетку с ассоц. 48 0.193 0.490 3.72

72 0.551 0.033 30.41

АИ Число АХ в асс./клетку с ассоц. ■48 0.334 0.223 11.21

72 0.354 0.195 12.54

видов г. Москвы (Ляпунова и др., 1988). Ни у одного индивида сумма.баллов не изменяется на 72 ч в сравнении с 48 ч, и, соответственно, нет различий между средними групповыми суммами баллов, которые составляют 18.23 на 48 ч и 18.19 на 72 ч. Ассоциативный индекс на 48 ч, весьма высокий у всех индивидов, варьирует в пределах 82-97% (среднее 90.4%) и высокодостоверно (р<0.01) снижается на 72 ч, варьируя в пределах 65-89% (среднее 76.0%). Одновременно в клетках с ассоциациями существенно уменьшается число АХ, находящихся в ассоциациях: с 4.17 на 48 ч до 3.13 на 72 ч (р<0.01). Приведенные данные свидетельствуют о том, что при групповом сравнении снижение ассоциативной активности АХ не сопровождается снижением транскрипционной активности совокупности 10 ЯОР. ^

В таблице 7 показаны результаты регрессионного анализа. Сравнивали ассоциативные признаки и активность ЯОР у 15 индивидов на 48 и 72 ч культивирования клеток крови. Анализ этих данных показывает, что связь как между АИ, так и чистом АХ в ассоциациях на клетку с ассоциациями, и суммарной . активностью ЯОР практически отсутствует на 48 ч и заметно проявляется на 72 ч. Это может быть объяснено тем, что на протяжении длинной интерфазы АХ максимально ассоциируют, образуя чаще всего одно общее ядрышко. В течение короткой интерфазы, в быстро следующих друг за другом 2-х и 3-ьих делениях, ассоциации, распавшиеся во время митоза, не успевают восстано-

виться. С большей вероятностью в ассоциациях сохраняются ЯОР с большим количеством активных генов рРНК (крупные А$-ЯОР). Это проявляется в увеличении коэффициента корреляции с 0.11 (48 ч) до 0.44 (72 ч); взаимная обусловленность изучаемых признаков возрастает с 1.3% (48) до 19.1% (72). Существует, хотя и слабая, сглзь между числом ассоцирующих хромосом в клетках с ассоп"ациямн и ассоциативным индексом. Она практически не разли-

0 0.5 1 1.5 2 2.5 3

У'/

■ /V •¿ИэЬ 13аЬ . '

- vr / i' /, ■"! у* У

jS У А В

1.5

бои t

50

40

30

20 ■ у У

10 с*

0 о о!Г * i Хъ

/ ь £

>

В

~г!1Г

Г

1*?

'■•AT .,'■ j

1

Рис 2. Корреляции (линейная регрессия у = а + Ьх) между размером Ag-ЯОР (б;1ллы) и частотой участия несущей его АХ в ассоциациях (% от общего числа данной АХ в клетках с Ас) для индивидов 013 (А, Б) и 055 (В, Г) на 48 (Л, В), 72 (Б, Г) часу культивировання клеток (зачерненные символы соответствуют двум, в случае В — четырем, неразличающимся гомологам).

о

чается на 48 и 72 ч.

В нашей работе мы имели возможность изучить ассоциативные свойства каждого отдельного ЯОР, поскольку мы проводили анализ на хромосомах, идентифицированных с точностью до гомолога. Были получены данные о размерах Ая~ЯОР и о частоте участия в ассоциациях всех 10 АХ у каждого из 15 индивидов на 48 и 72 ч культивирования. Сравнение этих параметров па 48 н

72 ч показало, что размеры Ag-ЯOP индивидуальных АХ практически не изменяются, а частота их участия а АсАХ уменьшается на 72 ч в сравнении с 48 ч. Мы провели корреляционный анализ и получили коэффициенты корреляции (линейная регрессия) для каждого индивида. Выборочные примеры таких корреляций показаны на рисунке 2. Можно видеть, что во всех случаях линии регрессии проходят через "О" осей координат; наклон линии на 72 ч (В, Г)

Таблица 8

Коэффициенты корреляции (г) между размером Ag-ЯOP и частотой участия АХ в

ассоциациях

Индивид 48 час 72 час

№ п/п Шифр г Уровень значимости г Уровень значимости <%)

1 004 0.873 0.001 76.19 0.619 0.056 38.33

2 006 ,0.939 0.000 88.25 0.823 0.003 67.76

3 013 ' 0.985 0.000 97.02 0.946 0.000 89.48

4 015 0.964 0.000 93,00 0.937 0.000 87.89

5 037 0.975 0.000 91.13 0.966 0.000 93.39

б <538 0.912 0.000 83.18 0.934 0.000 87.15

7 039 0.896 0.000 87.27 0.967 0.000 93.44

8 050 0.939 0.000 88.14 0.898 0.000 80.65

9 051 0.623 0.055 38.75 0.824 0.003 67.91

10 054 0.941 0.000 88.64 0.991 0.000 98.18

11 055 0.908 0.000 82.53 0.972 0.000 94.45

12 780 0.856 0.002 73.22 0.861 0.001 74.10

13 799 0.965 0.000 93.08 0.901 0.000 81.10

14 800 0.904 0.000 81.66 0.747 0.013 55.79

15 814 0.934 0.000 87.32 0.943 о.ооо 88.89

Среднее ♦/-Б. Е. Статист, сходства

0.908 +/-0.023

83.29 +/-3.70

0.889 +/-0.026

79.90 +/-4.42

р-0.585

р-0.548

меньше, чем на 48 ч (А, В). Коэффициенты корреляции выше 0.9 и высоко достоверны. В таблице 8 приведены суммарные данные для 15 индивидов, которые демонстрируют высокую связь между размером Ag-ЯOP и частотой участия данного ЯОР в ассоциациях как на 48 ч, так и на 72 ч. При этом различий в коэффициентах корреляции между 48 и 72 ч практически нет. Следует обратить внимание на два наблюдения. У индивида 051 встретился интенсивно серебрящийся ЯОР, оцененный баллом выше 3-х; а у индивида 006 хромосома 14а имела двойной ЯОР. Эти ЯОР оказываются в ассоциациях реже ожидаемого, что приводит к некоторому снижению коэффициента корреляции у этих индивидов. Такое же явление было отмечено Фроловым (1981) и Викто-

ponoii с соавторами (1494). Причина такого поведения высокоактивных Я01' не ясна. Другое наблюдение мы смогли сделать благодаря тому, что среди 17 иидмвндои у 6-гн (013, 015, 03S, 051, 70<) и S14) были охарактеризованы варианты Ag-ЯОР (см. табл. 3). По полученным нами данным у 3-х индивидов имеются ЯОР с резервными копиями гена pI'HK, а именно: хромосома 15а у индивида 01" и хромосома 13а у индивида 814 представлены вариантом Ag+/PK+, а хромосома 21б индивида 799 — вариантом Ag-/PK+. Во всех случаях, как на 48, так и на 72 ч частоты участия этих хромосом в ассоциациях соответствовали их баллу Ag-МОГ, а не общему количеству копий гена рРНК. Особенно показательно в атом отношении то, что хромосома 21 б индивида 799 пи разу не была встречена в ассоциациях, несмотря на то, что поданным гибридизации ¡н silii п ее ПОР имеется заметное количество неактивных рибосомных генон. В некоторых работах ранее отмечалось, что отдельные ЯОР человека, имеющие очень большое количество генов pl'l 1К (гпбрплнаацня ¡n sllii) не проявляют повышенной ассоциативной активности (Evans el al., 1974; Waibunon el al., 1976). Эти работы выполнены до появления Ag-окраски ЯОР. Rernstein с сотруд. (19S1) опубликовали работу, п которой изучали поведение г> ассоциациях одной маркерной хромосомы 22р+. Авторы показали присутствие большого количества метилированной ДНК в области ЯОР и слабое серебрение на дистальпом н проксимальном концах короткого плеча этой хромосомы. При этом частота участия в АсАХ хромосомы 22р+ не отличалось от частот других ЯОР у изученного индивида. Цитированные работы позволили сделать вывод о том, что участие ЯОР в лссоциацнях связано скорее с их функциональной активностью, выявляемой Ag-окраской, чем с количеством генов рРНК, выяатя-емом гибридизацией in silu. Наши наблюдения полностью согласуются с этим выводом. В нашем исследовании впервые анализ всех трех параметров проведен в отношении полного набора структурно-нормальных ЯОР, на идентифицированных с точность! > до гомолога хромосомах.

Таким образом, нам удалось однозначно показать, что снижение АIÍ не сопровождается уменьшен 1ем транскрипции рибосомных генов. Этот вывод опровергает предположен ля ряда цитированных авторов, и позволяет отказаться от ошибочной интерпретации механизмов действия мутагенных агентов, предполагающих поврежде! i е кластеров генов рРНК в ЯОР и снижение транскрипции рибосомных генов Паше заключение представляется нам особенно важным, поскольку весьма продуктивными кажутся представления о том, что реакция клетки на стрессовые воздействия (такие как ингибиция белкового синтеза, действие ядов, гормонов, биостимуляторов, хит—шок, облучение и др.) должна быть направлена на защитную (адаптивную) перестройку белковых синтезов, направленных на сохранение или восстановление меточного гомеостаза. Это должно сопровождаться и нтенсивной транскрипцией генов рРНК и формированием рибосом для обеспечения синтеза новых наборов белков (Тодоров, 1986).

выводы

1. На основе анализа морфо-функциональных признаков ядрышкообразую-щих районов (ЯОР) хромосом человека выделены 4 варианта ЯОР, характеризующихся разной представленностью активных и резервных ("молчащих") копий рибосомного гена: (1) копии гена рРНК отсутствуют (Ag-/PK~); (2) все имеющиеся в ЯОР копии гена рРНК неактивные (Ag-/PK+); (3) наряду с активными генами есть "молчащие" (Ag+/PK+); (4) все имеющиеся в ЯОР копии гена рРНК активны (Ag+/PK-). Частота встречаемости этих вариантов соответственно 7.65, 2.35, 11.8 и 78.2%.

2. Индивиды различаются по присутствию "молчащих" копий гена рРНК в ЯОР: в изученной выборке (17 человек) четверть индивидов не имеет ЯОР с запасными копиями, и по одной четверти индивидов имеют 1, 2 или 3 ЯОР с "молчащими'* копиями.

3. В разных парах акроцентрических хромосом 4 варианта ЯОР представлены неравномерно: хромосома 15 чаще других имеет вариант (1), характеризующийся полным отсутствием рибосомных генов; хромосома 21 существенно чаще других имеет ЯОР с запасными копиями рРНК (вариан т,12 и 3).

4. Предложен экспериментальный подход, основанный на использовании культур клеток от индивидов, в хромосомах которых имеются ЯОР с запасными копиями (морфо-функциональные варианты 2 и/или 3), для поиска условий и факторов, способных модифицировать транскрипционную активность рибосомных генов.

5. Участие данного акроцентрика в ассоциациях пропорционально размеру его Ag-ЯОР. Снижение ассоциативного индекса не сопровождается уменьшением транскрипции рДНК в ЯОР (не изменяется разм:р Ag-ЯОР).

Список работ, опубликованных по теме , ;чссертации.

1. Барановская Л. И., Цветкова Т. Г., Кравец И. А. Ляпунова Н. А. "Выявление активных и репрессированных копий рибосомного гена в индивидуальных ядрышкообразующих районах хромосом человек.'. // II Всесоюз. конференция "Геном человека", Переславль-Залесский, — 1991. — тезисы докл. — С. 72.

2. Барановская Л. И., Цветкова Т. Г., Кравец И. А., Ляпунова Н. А. "Характеристика функционального состояния ядрышкообразующих районов хромосом человека". // Цитология. 1991. Т. 33. № 9. — тезисы докл. — С. 51.

3. Грабовская И. Л., Глухова Л. А., Цветкова Т. Г., Кравец И. А., Мамаева С. Е.; Кущ А. А. "Использование гибридизации ДНК ¡г situ для идентификации хромосомных перестроек при кариотипировании кле!очных линий". // Цитология. Т. 34. № 7. С. 41-46.1992

4. Liapunova N., TsvetVnvn T., Krnvets 1., Victorov V. "Morpho-functional varianls of human N'ORs: identification, interindividual and chromosomal distribution". // European socictu of human genctics, i'aris, 26-th annual meeting.

5. Крапец И. Л., Ляпунова Н. А. "Ассоциация акроиентрическнх хромосом человека: завис [мость от размера Ag-ЯОР и длительности интерфдзы. 1(111) Росс, съезд мед. генет., Москва 1994, Тезисы докл. с. 84.

6. Ляпунова Н. А., Цветкова Т. Г., Кравец И. А., Спиридонова Т. А. "Мор-dio-tbv и тискальные варианты ядрышкообпазующих районов хромосом чело-

1994. 272.

Заказ №1175 Тираж 100 экз. АООТ "Экспостроймаш"