Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Цитогенетическая нестабильность и активность лейкоцитарных ферментов у млекопитающих

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Амбурладзе, Роман Вячеславович, Санкт-Петербург

> г> .'' 1.)

I I * /"Ч / "}

ч / V / V

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ НАУК ВСЕРОССИЙСКИЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ГЕНЕТИКИ И РАЗВЕДЕНИЯ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ ЖИВОТНЫХ

На правах рукописи

РОМАН ВЯЧЕСЛАВОВИЧ АМБУРЛАДЗЕ

Цитогенетическая нестабильность и активность лейкоцитарных ферментов у млекопитающих.

Специальность 03.00.15 - Генетика

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научные руководители: доктор биологических наук, профессор, Лауреат премии Совета Министров СССР, заслуженный деятель науки Р.Ф.

А. Ф. Яковлев кандидат биологических наук, старший научный сотрудник

Ю.В. Мясников

Санкт-Петербург 1999 год

Содержание

Список сокращений ................................................................................4

Введение ..................................................................................................5

1. Обзор литературы ............................................................................10

1.1. Анализ состояния стабильности генома с помощью

микроядерного анализа ..................................................................................10

1.2 Использование микроядерного теста при.радиационном поражении млекопитающих ..............................................................................13

1.3 Размер микроядер ..........................................................................27

1.4. Показатели состояния иммунитета ..........................................29

1.4.1 Организация иммунного ответа на клеточном уровне .. 29

1.4.2 Показатели состояния иммунной системы дегидрогиназы лимфоцитов ..............................................................................32

2. Собственные исследования ............................................................40

2.1. Материалы и методы ....................................................................40

2.1.1 Объект исследования ..................................................................40

2.1.2. Методика приготовления препаратов периферической

крови ..................................................................................................................41

2.1.3. Предмет и проведение микроядерного анализа ................42

2.1.4. Определение активности дегидрогеназ лимфоцитов .. 43

2.1.5. Определение активности 1И- гена ......................................46

2.1.6. Определение размера ядер Т- и В- лимфоцитов ..............47

2.1.7. Статистические методы ..........................................................48

2.2. Результаты исследований ..........................................................50

2.2.1.Частота полихроматофилов с микроядрами у самцов

мышей после радиоактивного облучения и размер микроядер ..............50

2.2.2. Размер микроядер эритроцитов быков производителей и их иммунологические показатели ..............................71

2.2.3. Размеры ядер Т- и В- лимфоцитов у трансгенных

свиней...................................................................................................77

Обсуждение ..............................................................................................81

Выводы и практические предложения ..............................................95

Список литературы ..................................................................................97

- 4 -Список сокращений. СДГ- сукцинатдегидрогеназа

а-ГФДГ(м) - альфа- глицерофосфатдегидрогеназа лтохондриальная)

ДНК- дезоксирибонуклеиновая кислота.

Гр. - Грей

Г - 6 - ФДГ - глюкоза - 6 - фосфат,дегидрогеназа

НАД Н - никотинамидденуклеотид дегидрогеназ

НАДФ Н - никотинамидденуклеотидфосфат дегидрогеназа

мкм- микрометры мл- милилитры

Введение.

В последние десятилетия центральной задачей биологии, без решения которой невозможно представить глубокое понимание всей сложности организации живой материи, стало комплексное, всестороннее и многоуровневое изучение геномов живых организмов. Одно из направлений данных исследований представляет собой изучение хроматина в динамике различных стадий клеточного цикла. На сегодняшнее время наиболее эффективные шаги по этому пути связаны с различными физическими, химическими и биологическими воздействиями на геном с последующим анализом процессов, происходящих в связи с реакцией живого организма в целом на индуцирующие агенты. Как раз к таким методам и относиться изучение радиобиологического эффекта с помощью сопоставления изменений, которые происходят в интерфазном хроматине и структурных изменениях хромосом. Для этих целей самым подходящим объектом являются организмы, наиболее изученные с молекулярной,генетической и цитогенетической .точек зрения; к числу которых относится, прежде всего, мышь.

Кроме того в настоящее время остро стоит проблема необходимости проведения эффективного, быстрого и недорогого генетического мониторинга с целью оценки стабильности генома при различных мутагенных воздействиях на человека и сельскохозяйственных животных.

В настоящее время ощущается недостаток доступных, быстрых и эффективных тестов для конструирования

универсальных биоиндикаторных систем оценки нестабильности генома на предмет генетической опасности. Это приобретает важное значение при проведении биологической дозиметрии, особенно после крупных аварий, когда необходимо сделать заключение о биологической дозе облучения больших популяций человека и животных. Сложными методами такой мониторинг провести невозможно, средства, необходимые для этого равняются примерно годовому бютжету самой крупной страны мира - США. Та же проблема стоит, при необходимости контроля биологической дозы облучения и характера повреждающего воздействия радиации, когда проведение широкомаштабного анализа не позволяют условия, например на подводных и надводных ядерных кораблях.

Одним из таких походов для этих целей мог бы стать микроядерный тест, если бы не его существенные недостатки. Показано, что после окраски красителем Романовского- Гимза, особенно после значительных мутагенных воздействий, трудно бывает отличить истинные микроядра от артефактов. Применение же окраски флюорохромами делает тест дорогим, и для анализа препаратов необходима сложная микроскопическая техника. Кроме того установлено, что у млекопитающих эритроциты с микроядрами имеют неправильную форму в следствии чего исключаются из кровотока, что снижает возможности применения данного подхода. К тому же, микроядерный тест не способен, в большинстве случаев, выявлять индивидуальные различия у животных и человека после радиационного воздействия.

В связи с этим весьма перспективна разработки более эффективный методики на основе микроядерного теста который

бы не имел указанных недостатков. С другой стороны, большой интерес представляет одновременное выявление стабильности генома и состояния иммунной системы. Знания полученные таким образом могут оказать весьма ценные услуги в коррекции иммунной системы у экономически важных видов животных.

Иммунная недостаточность является одной из наиболее распространённых форм патологии новорождённого молодняка с/х животных, определяющая риск развития многих заболеваний: инфекционных, аллергических, аутоимунных, злокачественных и других. В постнатальный период иммунная недостаточность усугубляется в условиях воздействия неблагополучных экологических факторов, что проявляется в действии индуцирующих агентов (химических, физических, биологических) на живой организм в целом и геном, в частности.

Таким образом неслучайно, в законе об охране продуктивных животных подписанным целым рядом стран Европы в Страсбурге в 1990 году предусматривается разработка и применение имеющихся биоиндикаторных тестов для контроля за состоянием энергетического метаболизма клеток иммунной системы и процессов структурного изменения хромосом, которые происходят в интерфазном хроматине. В месте с тем, целесообразно и' разработка систем иммуннокоррекции у животных с иммунологической недостаточностью.

Данные, которые могут быть получены с помощью биоиндикаторных систем состояния иммунной системы и генома сельскохозяйственных животных могут использоваться в селекции. Многие селекционеры уже считают очевидным, что необходимо вести селекцию не только по хозяйственно -

полезным признакам, но и по генетической резистентности к заболеваниям и стабильности генома животных.

Совершенно очевидно, что данный мониторинг должен быть многоуровневым и включать в себя все данные, известные о селектируемых животных. Что касается биологической дозиметрии, то важно иметь дело с показателями, отражающими индивидуальную реакцию организма, поскольку последствия различных воздействий сильно зависят от состояния организма з момент этих воздействий.

Целью работы является изучение взаимосвязи мутационных событий и иммунологического статуса животных.

В задачи настоящего исследования входило:

- определить характер изменения "частоты полихроматофилов периферической крови мышей с микроядрами" и "размера микроядер полихроматофилов" мышей при различных дозах радиационного воздействия;

- определить нормативный фон и изменчивость и изменчивость размера микроядер, реакции иммунной системы по активности Ш- гена и активности некоторых ферментов митохондрий лимфоцитов в различные возрастные периоды быков - производителей;

- установить степень влияния иммунизации свиней на размер Т - и В- лимфоцитов свиней.

Научная новизна работы. Впервые показана криволинейная зависимость размера микроядер полихроматофилов самцов мышей ^т доза радиационного воздействия, размер микроядер у мышей увеличивается до дозы облучения 3 Грея, а затем снижается. Гакие изменения свидетельствуют, вероятно, о том, что при

высоких дозах облучения на ряду с поражением веретена деления происходит вторичное разрушение микроядер.

В отличии от признака "частота клеток с микроядрами" показатель размера микроядер в большей степени зависит от индивидуальных особенностей организма, что дает основание к разработке нового теста биологической дозиметрии.

Установлены показатели нормы и изменчивости частоты полихроматофилов с микроядрами и размеров микроядер полихроматофилов, а также состояния ферментов митохондрий лимфоцитов быков- производителей.

Показано влияние процедуры иммунизации на увеличение размера ядер Т- лимфоцитов свиней.

1.Обзор литературы.

1.1. Анализ состояния стабильности генома с помощью микроядерного анализа.

При исследовании влияния на хромосомный аппарат животных и человека факторов различной природы в последнее время широко используется метод, который называют микроядерным тестом или микроядерным анализом (а micronucleus assay, в англоязычной литературе). Он основан на подсчете частоты встречаемости клеток с микроядрами величина которой отражает частоту возникновения клеток с измененным кариотипом по отношению к норме ( H.H. Ильинских, В.В. Новицкий, H.H. Ванчугова и др., 1992). Установлено, что микроядра могут образоваться в клетках в процессе митоза из хромосомного материала, утратившего контакт с веретеном митотического аппарата. Материал этот может представлять собой как целую хромосому или даже несколько хромосом так и их фрагменты. Микроядра могут образоваться в следствии разрушения ядра при апоптозе или же в следствии разрушения ядра под воздействием радиации.

Микроядра давно и хорошо известны в гематологической практике как тельца Хоувела- Жюли (Howell- Jolly). Уже тогда было установлено, что микроядра наблюдаются чаще у животных с геморрагической анемией (после потери крови) и по свойствам окрашивания микроядер было установлено, что они имеют ядерное происхождения (Howell W, 1890). Было

- И -

установлено, что микроядра появляются в результате хромосомных нарушений ( Wilson Е. V., 1925; Evans Н. J., Neary G. J., Williamson F. S., 1959; Fliender Т. M., et all, 1964).

Интерес к микроядрам резко возрос в 70-е годы в связи с предложением использовать микроядерный тест для анализа стабильности генома, в частности с возможностью быстрого скрининга больших популяций человека и животных (Boller К., SchmidW., 1970; Heddle J. А., 1970; Miller R. С., 1973).

Как показало исследование Дж. Форда с соавторами (Forde J. Н., Schultz С. J., Corell А. Т., 1988) отставание хромосом (хроматид) в анафазах и телофазах, культивируемых лимфоцитов человека, происходит со спонтанной частотой 2,4 %, частота же двуядерных лимфоцитов (после цитокинетического блока) с микроядрами составляет 1,6 %, то есть, имеет место быть соответствие частот формирования микроядер с частотами патологических митозов.

Однако практическое использование микроядерного теста на сегодняшний день для оценки возможных генетических последствий сдерживается в виду его низкой чувствительности при слабых воздействиях (Muller М.-U., Streffer G. 1995).

Большая часть исследований, посвященных микроядерному анализу проведено на мышах, поскольку они являются наиболее удобным объектом для этих исследований. Мыши сравнительно хорошо доступны и изучены, легко можно получить гематологические препараты из крови, взятой из хвостовой вены животного, они имеют достаточно высокую частоту встречаемости эритроцитов с микроядрами, составляющую по

разным источникам от 0,1 до 0,6 % клеток. У человека частота появления эритроцитов с микроядрами значительно ниже, и это усложняет анализ, поскольку приходится просматривать большее число клеток.

Однако объектом микроядерного анализа служат не только мыши, но и самые разнообразные представители животного мира: обезьяны (Ильинских H. Н. Ильинских И. Н. 1982), лабораторные белые крысы (Bradford I. С., Naismith R. W., Sorg R. M., 1983), собаки (Benz R. D., Beltz P. A., 1980), рыбы- теляпии (Гришанин А. К., Степанов В. А., Павлов Д. Ф., Чуйко Г. М., 1993) и карликовые евдошки (Hoffman R. N., Raat de W. R., 1982).

Большое количество исследований проведено так же и на растениях: корешках конских бобов (Degrassi Е., Tanzarella С. А. 1986), кончиках корней Vica faba (de Marco A., de Agazlo M. et. al., 1984) и Alleum сера (de Marco A., de Agazio M. et. al., 1984).

В настоящее время микроядерный тест широко используется для самых различных тестов состояния генома: стабильности генома, генетической опасности. В частности, для тестирования пищевых мутагенов (Loprieno N; Boncristiani G; Loprleno G, 1991), оценки деятельности активных веществ -протекторов, которые способствуют защите целостности генома от радиоактивных поражений (Flores MJ; Pinero J; Ortiz T; et al. 1996), сравнительной оценки действия различных мутагенов (Routledge MN; Garner RC; Kirsch-Volders M , 1992), оценки доз связанных воздействий потенциальных мутагенов на геном (Schiffmann D; Hieber L; Schmuck G; et. al., 1988), оценки

генотоксического эффекта у потенциальных мутагенов (Fiedler DM; Eckl РМ; Krammer В, 1996; Tikkanen L; Kronberg L 1990), для мониторинга состояния генома у людей, проживающих на загрязненных территориях (Kubiak R; Rudek Z; Cieszkowskl J; Garlicki S 1993), в исследованиях новых болезней человека, связанных с делециями хромосом (Duba НС; Weirich HG; Weirich-Schwaiger H; et. al., 1997), изучения возможных генетических механизмов возникновения лейкимии у человека ( Не LZ; Lu LH; Chen ZZ, 1994), оценки радиочувствительности различных тканей человека (Khan MA; Hill RP; Van Dyk J, 1998).

1. 2. Использование микроядерного теста при радиационном поражении млекопитающих.

Поскольку образование микроядер индуцируется особенно сильно при радиационных поражениях генома, то именно в связи с радиационными поражениями организмов микроядерный тест и чаще всего используется.

После обработки эндотелиальных клеток аорты быка различными дозами радиации Райку с соавторами (Raicu M; Vrai A; Thierens H; De Ridder L 1993) обнаружили резкое возрастание числа клеток с микроядрами уже после небольших доз облучения (< 0.25 Грей). После дозы облучения 1 Грей наблюдалось сравнительно небольшое увеличение числа клеток с микроядрами. Таким образом, кривая доза- зависимость резко поднималась, а после дозы облучения 1 Грей росла

незначительно. Авторы справедливо связали такое поведение кривой доза- зависимость с разной чувствительностью клеток, находящихся на разных стадиях клеточного цикла. Для доз, больших чем 1 Грей, появление микроядер связывалось авторами с повреждением веретена деления и, как следствие, задержкой деления большинства клеток. Из этого следует, что микроядерный тест особенно чувствителен при облучении в дозах до 1 Грея.

Анализ частоты микроядер для выявления отдаленных последствий облучения так же может оказать весьма ценные услуги и при оценки поражения животных электромагнитной радиацией. В частности Балоде (Baiode Z, 1996) проводил оценку силы электромагнитной радиации с помощью микроядерного теста. Учитывалась частота эритроцитов периферической крови быков с микроядрами. Было показано, что в следствии воздействия электромагнитического радара частота эритроцитов периферической крови быков повышена в сравнении с контролем (0.1 %) и составляет 0,6 % при вероятности Р<0, 01.

Использование микроядерного теста для биологической дозиметрии в случае гомогенного и негомогенного облучения ионизирующей радиацией проводилось Хоанг Хунгом с соавторами (Hoang Hung Т; Gerber GB; Leonard ED; et. al., 1995)

Они исследовали соотношение доза-эффект после гомогенного облучения гамма лучами лимфоцитов человека In vitro и после имитации негомогенного облучения лимфоцитов путем добавления в культуру нормальных лимфоцитов уже облученных клеток. Было показано, что при увеличении дозы

радиоактивного облучения как частота дицентрических аббераций хромосом, так и частота микроядер в лимфоцитах увеличивалась. При этом, частота аббераций хромосом (ди�