Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Цитофизиологические характеристики и реорганизация генома длительно культивируемой суспензии клеток Triticum timopheevii

ВАК РФ 03.00.12, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "Цитофизиологические характеристики и реорганизация генома длительно культивируемой суспензии клеток Triticum timopheevii"

На правах рукописи

Зоринянц Светлана Эдуардовна

"ЦЯТОФИЗИОЛОГИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ И РЕОРГАНИЗАЦИЯ ГЕНОМА ДЛИТЕЛЬНО КУЛЬТИВИРУЕМОЙ СУСПЕНЗИИ КЛЕТОК ТгШсит ЬторкееиН"

03. 00. 12 - физиология растений

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 1996

Работа выполнена в ордена Трудового Красного Знамени Институте физиологии растений им. К.А.Тимирязева РАН

Научные руководители: чл.-корр. РАН, акад. РАСХН, профессор

Р.Г. Бутенко

кандидат биологических наук

И.Н. Смоленская

Официальные оппоненты: доктор биологических наук В.В. Терских

кандидат биологических наук Н.В. Хадеева

Ведущее учреждение: Институт молекулярной биологии

им. В. А. Энгельгардта РАН

Защита состоится "14" мая 1996 г. в 13 часов на заседании Специализированного совета К 002.45.01 по присуждению ученой степени кандидата биологических наук при Институте физиологии растений им. К.А.Тимирязева РАН по адресу: 127276, Москва, ул. Ботаническая, 35

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИФР РАН.

Автореферат разослан "И" апреля 1996г.

Ученый секретарь Специализированного совета.

кандидат биологических наук

Азаркович

- 3 -

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. Интерес к закономерностям развития популяций клеток растений in vttro возник сравнительно недавно в связи с изучением физиологии, биохимии и генетики соматических клеток растений. Основными направлениями таких работ являются характеристика роста, оценка морфогенетического потенциала культур клеток и синтеза вторичных метаболитов, а также процессов старения организма. Эти направления находятся во взаимосвязи с исследованием кинетики клеточных популяций. Однако работ, проводящих параллели между всеми этими параметрами, к настоящему времени немного.

Анализ кинетики популяций в различных условиях выращивания, а также связь деления клеток с процессами первичного и вторичного метаболизма позволяет оценить влияние окружающей среды на пролифе-ративную активность клеток. Изучение факторов, регулирующих переход из одной фазы митотического цикла в другую, механизмов чередования периодов активной пролиферации и покоя, генетического контроля этих процессов дает представление о важнейших динамических состояниях на протяжении жизненного цикла клетки. В последние годы получили развитие работы, связанные с выявлением генов, ответственных за прохождение клеточного цикла.

Использование популяций, культивируемых на искусственных питательных средах, позволяет анализировать поведение отдельных клеток в стандартных условиях. Это определяется тем. что культуры клеток, выведенные из-под контроля интегрирующих систем целого растения, представляют собой относительно однородные по своим цито-физиологическим параметрам сообщества. Кроме того, переход к росту in vitro приводит к отбору популяций клеток, главными функциями которых являются активный рост и деление.

Длительное культивирование часто вызывает реорганизацию исходного кариотипа. При этом происходит изменение как числа хромосом, так и их структуры. Поэтому для использования культивируемых клеток в качестве моделей необходима полная информация как о цито-физиологических параметрах, так и о генетических модификациях, возникающих в таких популяциях. Кроме того, изучение вариабельности генома in vitro позволяет выявить основные механизмы эволюции и прогнозировать поведение как диплоидных, так и сложных полиплоидных геномов при длительном культивировании. Сравнение изменчивости генома in vivo и in vitro дает возможность выявить механизмы этого процесса и может служить основой для исследований цитоселекции.

Однако внимание исследователей часто привлекает какой-либо один из указанных выше аспектов. Так. анализ митотического цикла in vitro и факторов, участвующих в его регуляции, проводят без учета реорганизации генома культивируемых клеток. При изучении же изменений кариотипа подчас остаются вне поля зрения кинетика популяций клеток и ее взаимосвязь с модификацией генома.

Кроме того, большинство детально описанных к настоящему времени культур получено из тканей диплоидных двудольных растений. Число же однодольных видов, а также видов полиплоидной природы, используемых in vitro в качестве модельных систем, невелико.

Цель и задачи исследования. Целью нашего исследования является установление взаимосвязи между кинетикой пролиферации клеток и структурой кариотипа суспензионной культуры Т. timopheevii. В связи с этим в работе были поставлены следующие задачи:

1. Охарактеризовать физиологические параметры активно растущей длительно пассируемой суспензионной культуры клеток Т. timopheevii и определить возможную взаимосвязь между временной организацией митотического цикла и ростовой активностью.

2. Изучить особенности физиологического ответа клеток на изменения условий культивирования.

3. Охарактеризовать цитогенетический статус адаптированной к условиям in vitro суспензионной культуры Т.timopheevii.

Научная новизна работы. Проведено сравнительное изучение физиологических особенностей, в частности, пролиферативной активности и кинетики митотического цикла при переходе клеток Т. timopheevii из состояния in vivo к существованию in vitro. Впервые применен метод дифференциального С-окрашивания для исследования генома в условиях in vitro, с помощью которого были обнаружены изменения в структуре хромосом и выявлены основные тенденции реорганизации генома данного вида при длительном культивировании.

Теоретическое значение работы. Выполнение указанных задач позволило установить, во-первых, каким образом изменились параметры митотического цикла по сравнению с интактным растением при адаптации клеток Т.timopheevii к росту in vitro; во-вторых, какие изменения произошли в геноме при длительном культивировании клеток.

Апробация работы. Материалы диссертации были доложены на: 1-й, 3-й и 4-й Планово-отчетных конференциях по направлению "Генная и клеточная инженерия" (Пущино, 1990, 1993, 1994), VII Между-

народном конгрессе "Культура тканей и клеток растений" (Амстердам, 1990). V Международном симпозиуме молодых ученых "Регуляция метаболизма у растений" (Варна. 1991), II Российском симпозиуме "Новые методы биотехнологии" (Пущино, 1993), II Международной конференции "Биология культивируемых клеток растений и биотехнология" (Алматы, 1993).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 10 работ.

Структура диссертации. Диссертация состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты, обсуждение результатов, выводы, список литературы и приложение. Работа изложена на 146 страницах машинописного текста, содержит 20 рисунков, 32 таблицы, список литературы включает 294 наименования.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Объектом исследований была выбрана суспензионная культура клеток ТгШсит tímopheevíi (гьик.) гьик., полученная из каллуса, индуцированного на среде МБ (Мигавшее, Skoog. 1962) из незрелых зародышей. Каллус и семена Т.ЫторЬееиИ были предоставлены Ж.К.Джардемалиевым (Институт молекулярной биологии АН Казахстана).

Суспензионную культуру клеток выращивали на среде БН (БЬепк, НШеЬгапсН;. 1972) в присутствии 1мг/л 2.4 Д и 0.1 мг/л кинетина в стандартных условиях.

Митотический индекс (МИ) и число хромосом считали на давленных препаратах. Клетки фиксировали в экспоненциальной фазе роста после 12-ти часовой инкубации в 0.05% растворе колхицина, затем окрашивали по Фельгену или ацетолакмоидом (Дарлингтон, Ла Кур, 1980). Для каждого срока фиксации просчитывали по 3000 клеток. Подсчет числа хромосом проводили при проекции фотонегативов мета-фазных пластинок (увеличение 2000х).

Радиоавтографию применяли, определяя пролиферативный пул, продолжительность митотического цикла и его фаз, с помощью стандартного метода (Епифанова и др.,1977). Число меченых ядер и меченых митозов просчитывали в 3000 клеток для каждого срока фиксации.

Для получения синхронно делящихся популяций использовали ок-симочевину (ОМ) и колхицин в различных концентрациях.

Метод цитофотометрии был использован для определения количества ядерной ДНК, эу- и гетерохроматина на препаратах, окрашенных по Фельгену.

Дифференциальное С-окрашивание и идентификацию хромосом про-

водили методом Бадаева (Вабаеч еЬ а1. 1985). модифицированным нами для суспензионных культур клеток (гог1пуапЬэ еь а1.. 1995).

Морфометрию хромосом в клетках суспензионной культуры и корешков производили на фотографиях препаратов, окрашенных красителем Гимза, с помощью курвиметра.

Статистическую обработку результатов проводили стандартными методами (Рокицкий. 1963).

1. Цитофизиологические характеристики суспензионной культуры клеток ТгШсгап timoplleevii. К настоящему времени суспензионные культуры клеток растений широко используются в качестве моделей, позволяющих изучать физиологические, биохимические и генетические процессы, происходящие на уровне клеток. Несомненно, что для этих целей необходимо иметь суспензию клеток, отличающуюся высоким уровнем пролиферации, что достигается подбором оптимальных условий культивирования.

1.1. Характеристика роста суспензионной культуры клеток. Графическое изображение роста данной суспензии клеток, нанесенное в полулогарифмическом масштабе, представляет собой Б-образную кривую (рис.1). Культуру клеток характеризует относительно короткая лаг-фаза, продолжающаяся 1 сутки, затем наступает фаза экспоненциального роста, и на 7-е сутки клетки вступают в стационарный пери-

Рис. 1. Динамика роста числа клеток и митотический индекс суспензионной культуры Т. ЫторПееШ с трехнедельным циклом выращивания.

од. Жизнеспособность культуры в этой стадии составляет 9055. Время удвоения числа клеток составило 29 ч, удельная скорость роста -0.58 сут."1, индекс роста равен 32, максимальный МИ - 14.6+5.4%.

РЕЗУЛЬТАТЫ

1Л

| и-о0 5 10 15 ' 20 Сутки

Значительный прирост за время пассажа, высокая митотическая активность и непродолжительное время удвоения говорят о том, что суспензионная культура клеток Г. timopheevii хорошо адаптировалась в процессе культивирования к условиям in vitrer. Об этом свидетельствуют также данные о степени агрегированности клеток: в течение всего пассажа преобладали кластеры, состоящие из 1-5 клеток.

1.2. Изучение кинетики популяций. Динамика включения 3Н-тими-дина при непрерывной инкубации с клетками представлена в табл.1. Как видно из данных таблицы, меченые ядра появлялись уже в первые сутки культивирования (15.8±0.35?). Максимальный процент меченых

Табл. 1. Динамика включения 3Н-тимидина в ДНК ядер суспензионной культуры ,кле.т.ок T.. timopheeva при непрерывной инкубации

--1-1-1-

Сутки I Меченые ядра. % I Сутки I Меченые ядра, 7.

_1_I_|_

0 1.5 ± 0.3 3 79.7 + 3.9

1 15.8 ± 2.4 4 94.0 + 1.7

2 77.4 + 9.3 7 94.7 ± 0.7

S 20-

О 5 Ю 15 20 25 30 35 40 45 Время культивирования, часы

Рис.2. Динамика меченых митозов при кратковременной инкубации клеток Т. Ыторкееиа с 3Н-тимидином. 1-я (о). 2-я (■), 3-я (д) биологические повторности, средние значения (•).

ядер (пролиферативный пул культуры) составил 94.7+0.75?. Таким образом, почти 100% популяции обладают потенциальной способностью к пролиферации. Для определения продолжительности митотического цикла и его отдельных периодов анализировали динамику меченых митозов (Quastler. Sherman, 1959). Эксперимент проводили в 3-х биологичес-

ких повторностях.

Как видно на графике (рис.2), минимальная продолжительность G2 периода (tG2min) составила 10.5 ч. Средняя же продолжительность t(G2+0.5М) соответствует промежутку времени 13.5-15.2 ч. Общая продолжительность митотического цикла (ТМЦ) составляет 14.8-18.4ч. Продолжительность G,+0.5M рассчитывали следующим образом: t(Gj+0.5M)=TMU-tS-t(Gz+0.5M). Длительность митоза определяли в отдельном опыте. Для этого подсчитывали значение МИ в экспоненциальной фазе роста, а затем вычисляли величину данного параметра, используя формулу: tM=(МИ х ТМЦ)/100% (Davles, Rees, 1975). По нашим данным. tM= 0.8-14.

Табл.2. Параметры МЦ клеток корешков и суспензионной культуры

Т.timopheevii

I Длительность фаз МЦ, ч

Объект | МЦ Gj S G2 М

Культивиру- 14.8-18.4 0-2.3 2.3-3.7 13.5-15.2 0.8-1 емые клетки

Клетки 15.0 1.3 7.5 5.4 0.8

меристемы корня (Davles, Rees, 1975)

Таким образом, как видно из табл.2, суспензия Т. Итор?гееиИ характеризуется высоким (95%) пролиферативным пулом, непродолжительным митотическим циклом и очень коротким по времени периодом й!. Наряду с этим, в культуре клеток сокращается Б • период, по сравнению с клетками меристемы, и увеличивается период С2.

2. Оптимизация условий культивирования. Проведенный выше анализ показал, что суспензионная культура клеток Т. ИторПееуа обладает высокой потенциальной способностью к пролиферации. Значительная часть клеток синтезирует ДНК. но по тем или иным причинам в митоз не вступает. Однако, для изучения различных цитофизиологи-ческих и биохимических аспектов клеток растений удобно иметь быстрорастущую модельную систему с высоким митотическим индексом на протяжении всего цикла выращивания. Изменения скорости роста и ми-тотической активности клеток могут вызвать сокращение периода субкультивирования и модификация состава среды.

Изменение периода субкультивирования, исходного инокулята и модификация состава питательной среды. В настоящей работе с целью увеличения скорости роста и митотической активности применяли следующие подходы: 1) сокращение периода субкультивирования при увеличении исходного инокулята; 2) добавление в среду культивирования смеси 19 аминокислот (АН), разработанную в качестве заменителя кокосового молока (Koblltz, Hagen, 1962). Сравнительная характеристика цитофизиологических параметров суспензионной культуры Г. ti-mopheevii в различных условиях приведена в табл. 3.

Как видно из данных таблицы 3, ни сокращение продолжительности пассажа, ни модификация состава питательной среды не привели к повышению удельной скорости роста и митотической активности клеток Т. timopheevii.

Табл. 3. Цитофизиологические параметры суспензионной культуры клеток при выращивании в различных режимах

Режим выращивания 3 недели 2 недели 1 1 неделя | 1 1 неделя (среда с АК)

Число клеток 0.81Ю.05 3.1010.90 1.00+0.401 0.9010.20

х105кл/мл хЮ5кл/мл хЮ5 кл/мл | | XIО6кл/мл

лаг-фаза (сутки) 10 0 1

эксп.-фаза (сутки) 6 5 3 2

Удельная скорость 0.58 0.35 0.58 0.46 роста (сут."1)

Время удвоения, ч 29.0 48.0 29.0 35.0

Индекс роста 32.0 14.7 8.3 3.5

МИ шах (%) 14.6±5.4 - 6.3+2.7 6.5Ю.8

Таким образом, проведенный анализ позволяет сделать заключение, что трехнедельный цикл выращивания является оптимальным для данной линии. Сбалансированный состав среды SH. выбор определенного соотношения регуляторов роста и объема исходного инокулята способствовали хорошей адаптации клеток к условиям in vitro.

3. Получение синхронно делящихся популяций клеток. Эксперименты по синхронизации делений проводили с применением оксимочеви-ны (1мМ, 2.5мМ, 5мМ) и колхицина (0.1 и 0.05%). Наибольший процент

делящихся клеток был отмечен при действии ОМ в концентрации 1.0 мМ на фоне обеих исследуемых концентраций колхицина. Более высокие концентрации ОМ вызывали значительное подавление митотической активности. При добавлении этих соединений к культуре с периодом субкультивирования 3 недели значение митотического индекса по сравнению с контролем повышается в 5.5 раза, а для "недельной" культуры - в 3 раза. Эффективность синхронизации зависит от исходной пролиферативной активности клеток.

4. Цитогенетическое изучение. В условиях in vitro в клетках возникают различные изменения на уровне генома: меняется плоид-ность. появляются различные хромосомные перестройки, развивается анэуплоидия. Наряду с этим варьирует содержание ядерной ДНК в клетках. Для выяснения вопроса о реорганизации исходного кариотипа Т. timopheevii in vitro нами был проведен сравнительный анализ содержания ядерной ДНК, числа и структуры хромосом в клетках исходного растения и суспензионной культуры.

4.1. Определение содержания ДНК. Результаты, представленные в табл.4. показывают, что содержание ядерной ДНК варьировало в пределах от <0.5С до >8С. В большей части популяции наблюдалось уменьшение содержания ДНК в ядрах по сравнению с диплоидными клетками корешков интактного растения. По уровню плоидности ядра в клетках суспензии распределены следующим образом: наибольший процент - 42±7 % - соответствует уровню 1С. 22±6% - уровню 1.5С. на долю диплоидных клеток приходилось 12±5 %, остальные 24% клеток относились к уровням плоидности <0.5С, 4С. >8С. а также находились

Таблица 4. Распределение клеток по содержанию ядерной ДНК

Уровень плоидности | Оптическая плотность | Встречаемость

I (D). усл. ед.

I в популяции.%

< 0.5 С 1.0 С

D < 41.52

6±3 42±7 6±3 22±6 4±3 12±5 6±3 2+2

D = 43.26 - 73.08

1.0-1.5 С 1.5 С 1.5-2.0 С

2.0 С 4.0 С > 8.0 С

73.08 < D < 78.62 D = 78.62 - 103.62 103.62 < D < 114.81 D = 114.81 - 166.06 D = 173.04 - 332.13

D > 346.08

- и -

в интервалах между 1С и 1.5С, 1.5С и 2С. Таким образом, популяция высоко гетерогенна по содержанию ядерной ДНК.

Цитофотометрическое исследование показало, что клетки в стадии стационара с содержанием ДНК от 1С до 1.5С составляют 70 % популяции (табл. 4). Согласно кариологическим данным, число клеток, по уровню плоидности находящихся в пределах от 2х=1п до Зх=1.5п, составляет 75% (табл. 6). Практическое совпадение представленных выше данных дает основание полагать, что в стационарной стадии роста большая часть клеток Т. timopheevií находится в фазах С^И,.

Цитофотометрический анализ дает возможность также определить соотношение эу- и гетерохроматина в ядрах (табл.5). Коэффициент

Табл.5. Содержание гетерохроматина в ядрах клеток корешков исходного растения и суспензионной культуры Г. гЫорПееиИ

-1-1-1-

Объект IУровень!Среднее содержание | Коэффициент

|плоид- |гетерохроматина в ядрах,| вариации (V), % |ности |доли единицы I

_I_I__

Клетки

корешков 2. .0 С 0. .70 + 0.02 11.4

Клетки <0. .5 С 0. .54 + 0.03 9.6

суспен- 1. 0 С 0. ,48 + 0.07 59.3

зионной 1. 5 С 0. 55 + 0.05 25.9

культуры 2. 0 С 0. 64 + 0.05 19.1

М. 0 С 0. 72 + 0.08 22.5

вариации значений в пределах одного уровня плоидности для большинства культивируемых клеток выше, чем для клеток корешков. Особенно высокая гетерогенность по данному параметру выявлена в ядрах плоидности 1С, где он в 5.1 раза превышает значение, определенное для клеток исходного растения.

Таким образом, цитофотометрический анализ позволил выявить следующие изменения при длительном культивировании in vitro клеток Г. timopheevii: 1)гетерогенность по содержанию ядерной ДНК; 2)зна-чительное разнообразие по уровню гетерохроматина, свойственное как популяции в целом, так и клеткам одного уровня плоидности; 3)уменьшение содержания ядерной ДНК и фракции гетерохроматина для

большей части популяции.

4.2. Кариологический анализ. Для того, чтобы выяснить, связан ли феномен уменьшения содержания ядерной ДНК с изменением числа, размеров и структуры хромосом клеток суспензионной культуры, было проведено ее кариологическое изучение.

Число хромосом в клетках корешков Т. НторПеечи равно 28 (2п=4х=А1А'СО. Анализ состава популяции длительно пассируемой линии выявил большое разнообразие кариотипов. Как видно из результатов, приведенных в таблице 6, модальный класс был представлен клетками с числом хромосом 18-24. Его величина составила 61-66%. Кроме того, имелись 14% клеток, по числу хромосом близких к диплоидному уровню. В популяции присутствуют также клетки (1-2%) с числом хромосом <10 и несбалансированные полиплоиды. Таким образом, суспензионная культура клеток Г. ИторкееиИ является анэуплоидной с преимущественным проявлением уровня плоидности 1.5С=Зх. Хромосомы А' генома содержат небольшие гетерохроматиновые сегменты, локализованные главным образом в центромерных и интеркалярных районах. Для хромосом й генома характерны крупные комплексы гетерохроматиновых сегментов в прицентромерных районах, а также четкие С-сег-менты, расположенные в теломерных и интеркалярных районах. Хро-

Табл.6. Распределение клеток суспензионной культуры Т. ИторПееиа по числу хромосом

Число хромосом 1 I Частота встречаемости в популяции, % 1

1 I Длительность культивирования in vitro

1 3 года г 6 лет

< 10 1 ± 1 1 ± 1

11-17 7 ± 2 14 + 2

18-24 66 + 3 61 + 3

25-31 12 ± 2 12 ± 2

32-38 6 ± 2 6±2

39-45 6 ± 2 4+1

> 45 2+1 2 ± 1

мосомы Т.timopheevii относятся к семи гомеологичным группам.

В клетках суспензионной культуры были идентифицированы все хромосомы Т. timopheevii. Среди них представлены как хромосомы нормальной морфологии, идентичные по рисунку С-окрашивания хромосомам исходного растения (рис.3), так и измененные морфологически вследствие различных аберраций, присущие только клеткам Т.timopheevii in vitro (рис.4). Кроме того, в длительно культивируемых клетках наблюдалось также изменение абсолютных размеров хромосом.

4.3. Морфометрический анализ хромосом в клетках исходного растения и суспензионной культуры Г. timopTieevii показал, что: 1)длительное культивирование in vitro привело к достоверному уменьшению абсолютных длин хромосом как А1, так и G генома; 2)полиморфизм длин хромосом в клетках суспензионной культуры в среднем выше, чем в клетках интактного растения, причем для G генома эта тенденция выражена сильнее; 3)хромосомы 6-й гомеологичной группы существенно различаются по степени варьирования длин, что, возможно, связано с локализацией в них ядрышковых организаторов.

Рис.3. Хромосомы нормальной морфологии в клетках суспензионной

культуры Т. timopheevU: а) идИограммы А1 и в геномов Т.

timopheevii (Вайаеуа е1 а!.. 1994); б) хромосомы в клетках суспензионной культуры.

4.4. Распределение хромосом А' и С геномов. Для того, чтобы выяснить, как распределены хромосомы А1 и С геномов, было рассчитано число хромосом каждого генома в среднем на клетку суспензион-

Табл.7. Число хромосом А1 и в геномов в среднем на клетку

Уровень Число Число хромосом Коэффициент

плоидности хромосом А'Л]-генома в среднем вариации

на клетку

<1х=0.5п < 10 А' 2.7 ± 0.3 52.1±7.9

в 4.5 + 0.4 41.7+6.3

2х=1.Оп И - 17 А' 5.7 ± 0.3 . 32.4+3.7

й 7.1 + 0.2 18.3±2.1

Зх=1.5п 18 - 24 А1 9.0 ± 0.4 21.8+3.1

й 10.1 ±0.5 24.8±3.6

>4х=2.Оп > 25 А1 15.4 ±1.7 24.7±7.8

16.6 ±1.9 25.6+8.1

Примечание. Проанализировано пластинок: с числом хромосом <10 -22. 11-17 хр. - 38, 18-24 хр. - 24. >25 - 5 шт. соответственно.

Табл.8. Распределение хромосом семи гомеологичных групп в клетках модального класса суспензионной культуры Т. ЫторПееуИ

Группа 1 2 3 4 5 6 7

1 Геном | Частота встречаемости клеток. %

А1 | 75+9 92±6 83±8 71±9 88+7 96+4 88+7

С 1 96+4 92+6 92+6 75+9 92+6 75+9 79+8

А1.С I 100 96±4 100 92±6 100 100 100

х

Примечание. А1- частота встречаемости клеток, содержащих по крайней мере одну, нормальную или модифицированную, хромосому А' генома. относящуюся к данной группе, й - то же для й генома. А'.й -частота встречаемости клеток (%). в которых данная группа представлена хотя бы одной хромосомой любого из двух геномов.

- 15 -

ной культуры для различных уровней плоидности.

В клетках корешков пшеницы каждый из геномов представлен 14 хромосомами. Как видно из табл.7, в культивируемых клетках плоидности 1х=0.5п, 2х=1п и Зх=1.5п процесс элиминации затронул оба генома. Однако, в большей степени при длительном культивировании "теряются" хромосомы генома А1. В клетках более высокой плоидности (>25 хромосомам) среднее число хромосом любого из геномов больше, чем в клетках корешков. Тем не менее, число хромосом Ас генома для них в среднем меньше, чем G генома.

Частота встречаемости клеток, в которых представлены все семь гомеологичных групп, варьирует для различных уровней плоидности. Среди клеток модального класса (1.5п) все гомеологичные группы представлены у 88±5% клеток. Тем не менее, в клетках модального класса (табл. 8) наблюдается тенденция к сохранению "полного набора" гомеологичных групп, представленных хромосомами любого из двух геномов.

Клетки низкой плоидности, содержащие гомеологи всех групп или утратившие хромосомы 1-2 групп, вероятно, могут быть жизнеспособны в условиях in vitro. Существование таких клеток подтверждено данными цитофотометрии (1С, 0.5С).

Параллельно с элиминацией хромосом происходит и потеря их отдельных плеч в результате возникающих аберраций. Анализ тенденции к сохранению в клетках суспензионной культуры А' и G геномов в целом хромосом различных гомеологичных групп и их отдельных плеч позволили выявить следующие закономерности.

1. При длительном культивировании в клетках Т. timopheevti наблюдается потеря хромосом и их отдельных плеч. Для клеток различной плоидности данный процесс в большей степени затрагивал Ас геном.

2. Несмотря на потерю части генетического материала, в клетках различной плоидности наблюдалась тенденция сохранения полного набора гомеологичных групп как на уровне целых хромосом, так и их плеч.

3. "Среднее содержание" отдельных плеч хромосом некоторых гомеологичных групп А1 и G геномов поддерживается на высоком или низком уровнях. Для А1 генома с высокой частотой сохраняется плечо 2AlL, а с низкой - плечи 1A1S. 1АЧ, 4AlL, 4A'S. Для G генома характерно высокое содержание плеч хромосом 1GS, 3GS, 5GS, 5GL. Число же 6GL в среднем на клетку является низким. Данная закономер-

111

ни*

s a

: К

i il/

21

Рис.4, хромосомные аберрации . выявленные в клетках суспензионной культуры T. timopheevii:

1 - Ins 1АЧ: 7 - Т 1GL: 4GL; 13 - tel 3GL; 19 - Т 7GS:5GL;

2 - T 1GS:2A1L; 8 - die 1GL: 5GL; 14 - h 4GS; 20 - ISO 6GS;

3 - Ins бА'Б; 9 - del 2Gl¿; 15 - lso 4GS; 21 - lso 6GL;

4 - T 1GS:5GL; 10 - lso 3GS; 16 - del 4GL; 22 - del 7GS;

5 - die 1G+5G; 11 - T 3GS: ?; 17 - T 4GS:7GL; 23 - lso 7GL;

6 - T 1G1:5GS; 12 - T 3GS:4GS; 18 - tel 5GL; 24 - T 7GS:?Al

• 25.26, неидентифицированные аберрации. Обозначения: Ins, вставка дополнительного эухроматинового сегмента; Т. транслокация; die, дацентрическая хромосома; del, де-леция;. lso. изохромосома; tel. телоцентрическая хромосома: h, дополнительный интеркалярный гетерохроматиновый сегмент. ■

ность наблюдается в клетках разной плоидности. Возможно, это связано с поддержанием дозы генов, отвечающих за адаптацию клеток к условиям in vitro.

4.5. Характеристика хромосомных аберраций. Хромосомные перестройки. .обнаруженные в клетках суспензионной культуры Т. timop-heevii, можно отнести к 8 типам (рис. 4): делеции, транслокации с точкой разрыва в районе центромеры или в интеркалярном районе, ин-серции эухроматиновых сегментов, увеличение размеров гетерохроматиновых блоков, изохромосомы, телоцентрики, дицентрики и неиденти-фицированные хромосомы, являющиеся результатом нескольких последовательных аберраций. Клетки без нарушений составляли всего 17±4%. Наиболее распространены в популяции транслокации (7 вариантов) и изохромосомы (5 вариантов). Для остальных типов аберраций выявлено от 1 до 4 вариантов.

Анализ модифицированных хромосом показал, что аберрации в большей степени затрагивают G геном - 6555 выявленных нарушений приходится на долю хромосом данного генома.

Хромосомы различных гомеологичных групп существенно отличались друг от друга по частоте аберраций. Для А1 генома чаще всего наблюдали перестройки второй (27.0+4.2% проанализированных хромосом данной группы), реже всего - первой хромосомы (2.0±2.0%) Для 3-й, 4-й. 5-й и 7-й групп модификаций рисунка дифференциального С-окрашивания выявлено не было. Число вариантов хромосом А' генома невелико: их выявлено всего три (рис. 4, N 1, 2, 3).

Частота встречаемости и спектр аберраций хромосом G генома значительно разнообразнее. Нарушения в данном случае были выявлены для всех гомеологичных групп (рис. 4). Для хромосом G генома максимальная частота перестроек наблюдалась в 4-й группе (60.2+5.2%), а минимальная (2.0+1.4%) - во второй. Наибольшее разнообразие аберраций (6 вариантов) отмечалось для 1-й. 4-й и 5-й групп, наименьшее - для второй (1 вариант).

4.6. Изучение влияния оксимочевины на структуру хромосом.

Действие ОМ изменило частоту встречаемости различных типов

нарушений: 1)существенно увеличился процент делеций (в 4.5 раза по сравнению с контролем), 2)почти в два раза повысилась частота встречаемости хромосом, не сходных по рисунку С-окрашивания ни с одной из семи гомеологичных пар А1 или G генома и являющихся, вероятно, результатом нескольких последовательных перестроек. Действие ОМ привело и к расширению спектра хромосомных нарушений: вы-

явлены 4 новых варианта аберраций (рис.5). Таким образом, обработка ОМ привела к изменению соотношения типов перестроек и расширению их спектра. Кроме того, в популяции с максимальной частотой встречаются клетки, содержащие 3 аберрантных хромосомы, тогда как з контроле наиболее высока доля клеток с одной модифицированной хромосомой.

Итак, результаты проведенного нами исследования показали, что адаптация клеток Т. timopheevii к росту в условиях in vitro проявляется как на морфофизиологическом, так и на генетическом уровнях. В первом случае данный процесс выражается в поддержании клетками определенного уровня дифференцировки, в частности, в обогащении популяции мелкими агрегатами, состоящими из клеток меристематичес-кого типа, высокой скорости роста и митотической активности, что позволяет охарактеризовать культуру как интенсивно делящуюся.

Рис.5. Хромосомные аберрации, вызванные действием ОМ на клетки суспензионной культуры Г. timopheevii:1) del 2GS;2) 5G с уменьшенными размерами и числом С-сегментов; 3) Т 5GS:?L; 4) 6G с уменьшенными размерами и числом С-сегментов.

О способности данной линии к активной пролиферации говорят также показатели, характеризующие ее фракцию роста и кинетику ми-тотического цикла. Во втором случае процесс адаптации выражается в изменениях генома, которые затронули различные уровни организации ДНК. Однако, несмотря на потерю части генетического материала и кариотипическую гетерогенность, имеется тенденция поддержания в клетках полного набора гомеологичных групп.

- 19 -ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ Способность клеток культуры Т. timopheevii к активной пролиферации in vitro можно рассматривать в качестве критерия их адаптации к данным условиям. Как видно из представленных данных, максимальный МИ в течение пассажа составил 14.6±5.4%, пролиферативный пул культуры был равен 94.7±0.7%, а индекс роста числа клеток достигал 32. что значительно выше, чем у многих, описанных ранее в литературе культур клеток растений (King, 1981).

Продолжительность МЦ в клетках суспензии практически совпадает с его длительностью в клетках апикальной меристемы интактного растения (Davles, Rees. 1975). Однако временное соотношение фаз меняется, что выражается в удлинении в 2 раза фазы G2 и двукратном сокращении S периода. Совпадение продолжительности МЦ in vivo и in vitro довольно редкое явление. Как правило, при переходе клеток растений к росту на искусственных средах активность их пролиферации ниже, чем в меристемах. Это выражается в уменьшении величин пролиферативного пула и митотического индекса, а также в удлинении МЦ (Gould. 1984). Однако, в суспензионной культуре Т. timopheevii этого не произошло. Различия в соотношении отдельных периодов in vivo и in vitro при неизменности суммарной продолжительности МЦ было выявлено для длительно пассируемой суспензии Crepis capí lia-ris. полученной из каллуса опухолевого происхождения (Langrldge et al., 1970; Ashmore, Gould, 1979). Примечательно, что для культуры клеток С. capillaris. как и в случае Т. timopheevii. наблюдались высокие скорость роста и митотическая активность.

Таким образом, представленные данные о продолжительности МЦ и его периодов при переходе клеток к росту in vitro позволяет сделать заключение о том, что суспензия клеток Г. timopheevii хорошо адаптировалась к выбранным нами условиям и характеризуется высокой пролиферативной способностью.

Суспензионная культура клеток Т. timopheevii чувствительна к смене режима выращивания. Об этом свидетельствует изменение физиологических параметров при сокращении периода субкультивирования или добавлении аминокислот. Способность реагировать на внешние воздействия послужила предпосылкой для получения in vitro синхронно делящихся популяций клеток Т. timopheevii. Значительной степени синхронности удалось достигнуть с помощью оксимочевины и колхицина: митотический индекс увеличился в 5 раз по сравнению с контролем И был равен 22.2±0.8%.

По данным других исследователей, в зависимости от видовой принадлежности клеток растений, концентрации и времени инкубации с ОМ, МИ достигал 10-40%, а когда ОМ применяли в сочетании с колхицином, и 80% (Szabados et al., 1981; Hadlatczky et al. 1983; Смоленская и др. 1983, DeLaat , Blaas, 1984. ; Mil et al.. 1988; Co-nla et al., 1990; Lelch et al.. 1993).

Таким образом, суспензионная культура Т. timopheevii характеризуется. с одной стороны, стабильно высоким "пролиферативным" статусом, с другой стороны, способностью к синхронизации делений под действием химических агентов. Все это позволяет рассматривать данную линию клеток в качестве удобной экспериментальной модели.

Способность клеток Г. timopheevii адаптироваться к росту in vitro является результатом геном-средового взаимодействия. Это означает, что физиологический ответ клеток на изменение условий окружающей среды обусловлен организацией их генетического аппарата.

Суспензия Г. timopheevii характеризуется преобладанием клеток уровня плоидности 1. 5С=Зх и представлена анэуплоидными клетками с высоким полиморфизмом кариотипов. Кроме того, для большей части популяции было выявлено уменьшение количества ядерной ДНК, содержания гетерохроматина, числа и размеров хромосом по сравнению с клетками исходного растения.

Аналогичные проявления свойственны in vitro и другим видам Triticrn. Так, в клетках Т. aestivum происходило уменьшение числа и размеров хромосом, а также снижение содержания ДНК в отдельных хромосомах (Кагр et al.,1987; Leltchetal., 1993, Wlnfleld. 1995). Клетки с уменьшенным числом хромосом были обнаружены и в меристеме корней растений-регенерантов, полученных из каллуса Т. durum (Bennicl and D'Amato 1978) и Т. crassum (=Ае. crassa, 2n=6x) (Nakamura et al., 1981).

Использование в нашей работе метода дифференциального С-окра-шивания позволило: 1) установить, в какой степени процесс элиминации затрагивает А1 и G геномы в целом; 2) выявить закономерности изменения числа хромосом и их плеч для различных гомеологичных групп; 3) идентифицировать хромосомные перестройки в клетках суспензионной культуры Т. timopheevii.

Методом дифференциального С-окрашивания были идентифицированы хромосомы всех гомеологичных групп А' и G геномов. Популяции был свойствен высокий полиморфизм хромосомных наборов. Сопоставление данных цитофотометрии и дифференциального С-окрашивания подтверди-

- 21 -

ло наличие высокой кариологической вариабельности.

В клетках различной плоидности в большей степени элиминируются хромосомы генома А1 по сравнению с G геномом. Несмотря на потерю части ДНК в клетках модального класса Каждая гомеологичная группа представлена по крайней мере одной (нормальной или аберрантной) хромосомой, относящейся к А' или G геному. Тенденция сохранения "полного набора" гомеологичных групп наблюдалась и в клетках более низкой плоидности.

Высокая жизнеспособность клеток, утративших in vitro часть генетического материала, вероятно, объясняется тем, что гомеоло-гичные хромосомы полиплоидных видов Triticum содержат гены, контролирующие аналогичные функции, как это было установлено для Т. aestivvm (Mcintosh, Cuslck, 1987). Получение моносомиков и нулли-сомиков для растений данного вида (Sears. 1954; 1988; Моррис, Сире, 1970) позволяет предположить, что клетки, утратившие хромосомы одного из геномов, могут функционировать за счет гомеологичных хромосом другого генома, осуществляя деление, рост, реакции первичного метаболизма. Гомеология А1 и G геномов Т. timopheevli А и В геномам Т. aestivvm дает основание полагать, что "дублирование функций" присуще и хромосомам пшеницы Тимофеева.

Выше отмечалось, что частота элиминации существенно различалась для гомеологов отдельных групп. Определенный интерес представляет сопоставление порядка элиминации хромосом А' генома в суспензии Т. timopheevii, выявленного в нашей работе, с имеющимися в литературе данными о закономерностях стабилизации хромосом пшеницы при получении тетраплоидных тритикале (Lukaszeskl et al. 1987а, b; Badaeva et al. 1989). В обеих системах хромосомы 2-й и 4-й групп гомеологов были "контрастны" по изучаемому признаку . Так, хромосомы 4А1 Т. timopheevii in vitro элиминировались в клетках различной плоидности с высокой частотой, а частота элиминации хромосом 2А1 (нормальной морфологии или аберрантных) была низкой. В карио-типе тритикале хромосомы 4-й пары гомологов характеризовались самой высокой скоростью стабилизации, а 2-й пары - наиболее низкой. Представленные данные говорят о том. что давление отбора на отдельные пары хромосом не одинаково, причем наиболее различаются между собой хромосомы 2-й и 4-й пар.

Морфометрический анализ выявил достоверное уменьшение длины хромосом А1 и G геномов in vitro по сравнению с исходным растением. Эти данные согласуются с установленным ранее снижением содер-

- 22 -

жания ядерной ДНК в клетках большей части популяции.

Помимо хромосом нормальной морфологии, в клетках суспензии с высокой частотой встречались аберрантные. Многочисленные хромосомные аберрации различных типов отмечались в клетках суспензий Т. топососсит (Као et al.. 1970) и Т. aestivwn (Karp et al.,1987; Leitch et al., 1993).

Изменение исходной организации генома in vitro стабилизируется при длительном культивировании. Сопоставление в нашей работе данных о структуре популяции клеток Г. timopheevii. полученных через 3 года после инициации данной суспензионной культуры и через 6 лет ее поддержания in vitro, показало, что соотношение кариотипов, различающихся по числу хромосом, за этот период практически не изменилось.

Высокая кариологическая гетерогенность и значительное изменение организации генома в условиях in vitro, по сравнению с клетками интактного растения, может отражать следующие процессы. Во-первых, полиплоидная природа Т. timopheevii и наличие, "функциональной компенсации" для гомеологов различных групп обусловливает жизнеспособность клеток с различными наборами хромосом в пределах одной популяции. Во-вторых, в условиях длительного культивирования в процессе адаптации отбираются клетки, неспособные к морфогенезу, но активно пролиферирующие. В результате такого отбора накапливаются клетки с изменениями областей генома, функциональных в интак-том растении. Этот процесс сопровождается появлением большого разнообразия кариотипов и широкого спектра хромосомных перестроек. В-третьих, происходят изменения, направленные на создание жизнеспособной популяции клеток и адаптации к новым условиям существования.

Вероятно, описанные выше изменения свойственны в той или иной степени всем культивируемым клеткам растений. Поэтому определение характера подобных изменений необходимо при использовании систем in vitro в качестве моделей для изучения различных аспектов биологии клеток.

ВЫВОДЫ

1. Показано, что для культуры клеток Т. timopheevii характерны высокая скорость роста и митотическая активность при выращивании на среде Шенка-Хильдебрандта с периодом субкультивирования 3 недели и исходной плотностью высева 105 клеток/мл.

2. Установлено, что длительность МЦ in vitro варьировала в пределах 14.8-18.4 ч и практически соответствовала величине данного параметра в клетках меристемы корней in vivo. Однако, для суспензионной культуры характерны двукратное уменьшение S и удлинение G2 фазы. Данное соотношение фаз МЦ позволяет оценить суспензионную культуру клеток Т. timopheevii как активно пролиферирующую.

3. Митотический индекс культуры клеток повысился в 5 раз в результате синхронизации делений, проведенной с помощью оксимоче-вины и колхицина. Установлено, что степень синхронности .тем выше, чем больше пролиферативная активность клеток.

4. Установлено, что длительное выращивание клеток Т. timopheevii in vitro привело к значительной реорганизации исходного генома. Популяция высоко гетерогенна по содержанию ядерной ДНК и фракции гетерохроматина, числу, размерам хромосом и наличию перестроек. Основной тенденцией явилось уменьшение числа хромосом в клетках и снижение в них содержания ДНК.

5. Впервые применен метод дифференциального С-окрашивания для кариологического исследования длительно пассируемой культуры клеток Т. timopheevii. Установлено, что процесс элиминация хромосом в большей степени затронул А' геном. Показано,■что клетки различной плоидности имеют тенденцию к сохранению полного набора гомеологичных групп, что, вероятно, обеспечивает поддержание дозы генов, необходимых для сохранения высокой жизнеспособности клеток in vitro.

6. Показано, что помимо хромосом нормальной морфологии, в культивируемых in vitro клетках Т.timopheevii имеются и аберрантные. При этом число перестроек и разнообразие их вариантов больше для G генома, чем для генома А1.

По материалам диссертации опубликованы следующие работы:

1. Smolenskaya I.N., Zorlnyants S.Е..Nosov A.V. Resumption of suspension cell culture of T. timopheevii from protoplasts and obtaining of the synchronous cell populations. Abstr. VII-th Int. Congr. on Plant Tissue and Cell Culture, 1990, Amsterdam, p.37.

2. Zorlnyants S.E..Smolenskaya I.N..Nosov A.V. Cell population structure of Triticm timopheevii suspension culture. Proceed. V-th Int. Youth Symp. on Plant Metabolism Regulation, 1991, Sofia, pp. 288-291.

3. Jaslk J..Smolenskaya I.N..Zorlnyants S.E., Nosov A.V., Baullna 0.1., Kristin J. Cytologlcal study on wheat (Triticum timophee-

vii Zhuk.) protoplasts. Blologla plantarum, 1992, 34. (3-4), pp.193-201

4. Зоринянц С.Э.,Смоленская И.Н..Носов А.В. Быстрорастущая суспензионная культура клеток и протопласты пшеницы Тимофеева. Физиология растений. 1993, 40. N 2, 300-306

5. Зоринянц С.Э., Смоленская И.Н.. Бадаева Е.Д., Носов А.В. Суспензионная культура клеток Triticum timopheevii - модельная система для цитогенетических исследований. Новые методы биотехнологии растений, II Российский симпозиум, Пущино-на-Оке, 1993, Тезисы докладов, стр. 189

6. Зоринянц С.Э.. Носов А.В., Бадаева Е.Д., Смоленская И.Н. Цито-фотометрический и кариологический анализ суспензионной культуры клеток Triticum timopheevii. II Международная конференция "Биология культивируемых клеток растений и биотехнология", Алматы, 1993, Тезисы докладов, стр.13

7. Зоринянц С.Э., Смоленская И.Н., Бадаева Е.Д., Носов А.В. Действие оксимочевины на структуру хромосом суспензионной культуры клеток Triticum timopheevii. Конференция "Генетика соматических клеток в культуре", Черноголовка, 1993, Тезисы докладов, стр.11

8. Zorlnyants S.Е., Smolenskaya I.N., Nosov А. V., Badaeva E.D. New chromosome configurations of Triticum timopheevii provoked by in vitro conditions and drug treatment. Abstr. 8th Int. Wheat Genet. Symp., Beijing, 1993, p. 13

9. Смоленская И.Н., Носов А.В., Зоринянц С.Э. Взаимодействие донор-реципиент при введении чужеродного генетического материала. Молекулярная генетика, микробиология и вирусология, 1994, 4. стр. 23

10. Zorlnyants S.Е.,Nosov А. V.. Badaeva E.D., Smolenskaya I.N., Badaev N.N. Cytogenetic analysis of a long-term Triticum timopheevii (Zhuk.) Zhuk. cell suspension culture. Plant Breeding. 1995. 114. 5. pp 219-225