Триптофангидроксилаза - ключевой фермент биосинтеза серотонина: генетический контроль и ассоциация с наследственной изменчивостью защитного поведения

Куликов, Александр Викторович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Триптофангидроксилаза - ключевой фермент биосинтеза серотонина: генетический контроль и ассоциация с наследственной изменчивостью защитного поведения
ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Триптофангидроксилаза - ключевой фермент биосинтеза серотонина: генетический контроль и ассоциация с наследственной изменчивостью защитного поведения"

На правах рукописи

КУЛИКОВ АЛЕКСАНДР ВИКТОРОВИЧ

ТРИПТОФАНГИДРОКСИЛАЗА - КЛЮЧЕВОЙ ФЕРМЕНТ БИОСИНТЕЗА

СЕРОГОИИНА : ГЕНЕТИЧЕСКИЙ КОНТРОЛЬ И АССОЦИАЦИЯ С НАСЛЕДСТВЕННОЙ ИЗМЕНЧИВОСТЬЮ ЗАЩИТНОГО ПОВЕДЕНИЯ

(03.00 15-генетика)

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Новосибирск 2005

Работа выполнена в лаборатории нейрогеномики поведения Институте цитологии и генетики СО РАН, г. Новосибирск

Научный консультант- доктор медицинских наук, профессор

Попова Нина Константиновна Институт цитологии и генетики СО РАН г. Новосибирск

Официальные оппоненты- доктор биологических наук, профессор

Бородин Павел Михайлович Институт цитологии и генетики СО РАН г. Новосибирск

доктор биологических наук, профессор Савватеева-Попова Елена Владимировна Институт физиологии им И.П. Павлова РАН г. Санкт-Петербург

член-корр. РАМН, профессор Афтанас Любомир Иванович Институт физиологии СО РАМН г. Новосибирск

Ведущее учреждение - Московский государственный университет

им. М.В. Ломоносова г. Москва.

Защита состоится " %ß ""20QÎ"r. на утреннем заседании диссе1ационного совета по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора наук (Д-003 011 01) в Институте цитологии и генетики СО РАН в конференц-зале Института по адресу пр. академика Лаврентьева, 10, 630090, г. Новосибирск, т/ф (383) 333-12-78, e-mail: dissov@bionet.nsc .ru

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института цитологии и генетики СО РАН.

Автореферат разослан " /У "" ¿НС"*-. 200

Ученый секретарь диссертационного Совета, доктор биологических наук

ЛШЗ ЦОШЪ

ВВЕДЕНИЕ

Актуальной проблемой генетики поведения, нейрогенетики и нейробиологии является изучение молекулярного механизма развертывания информации, записанной в молекуле ДНК, в сложный поведенческий признак (Бензер, 1975; Crabbe, 1999; McClearn, 1999; Boguski, Jones, 2004). В настоящее время не вызывает сомнения ключевая роль медиаторов головного мозга в регуляции поведения животных и человека в норме и патологии. Одним из классических медиаторов является серотонин (5-гидрокситриптамин). Серотониновые нейроны лидируют по числу синаптических контактов (Jacobs, Azmitia, 1992). Кроме того, медиатор действует на 14 различных типов рецепторов, сопряженных со всеми основными механизмами внутриклеточной трансдукции сигнала (Saudou, Hen, 1994; Barnes, Sharp, 1999). Эти два фактора определяют удивительную полифункциональность серотонина - способность его контролировать большое количество различных процессов в ЦНС и форм поведения (Saudou, Hen, 1994; Попова, Куликов, 2003). С помощью фармакологических методов показано участие серотониновой системы в регуляции агрессивного, полового, пищевого и других форм поведения (Попова и др., 1978; Jacobs, Fornal, 1995; Lucki, 1998). Интерес к серотониновой системе мозга обусловлен еще и тем, что трансмембранный транспортер серотонина (Blakely et ai., 1994, 1998; Blakely, 2001) и рецепторы 5-HTia и 5-НТгА типов (Lucki et al., 1994; Blier, de Montigny, 1994; Eison, Mulins, 1996; Pineyro, Blier, 1999) вовлечены в молекулярный механизм действия антидепрессантов и анксиолитиков.

Ключевым ферментом биосинтеза серотонина является триптофангидроксилаза (1111), катализирующая гидроксилирование триптофана в 5-гидрокситриптофан, -первую и лимитирующую стадию биосинтеза медиатора (Fitzpatrick, 1999).

В 2003 году было показано существование двух изоформ ТПГ - ТПГ-1 и 1111-2, которые кодируются генами tphl и lph2 (Walther et al., 2003). Изоформа, кодируемая геном tphl, экспрессируется только в периферических тканях, эпифизе и тучных клетках. В мозге синтез серотонина осуществляется изоформой, кодируемой геном tph2 (Walther et al., 2003; Zhang et al., 2004).

Открытый в 2004 году ген tph2 сразу же стал предметом интенсивного изучения. Были выявлены около 25 различных однолокусных мутаций в гене tph2 человека и показана ассоциация некоторых из этих мутаций с предрасположенностью к аффективным психозам (Breidenthal et al., 2004; De Luca et al., 2004; Harvey et al., 2004, 2004; Zill et al., 2004; Zhang et al., 2005). Однако до настоящего времени связь этих мутаций с активностью ТПГ в мозге установлена не была.

Несмотря на ключевую роль ТПГ в биосинтезе серотонина и в механизме передачи сигнала в серотониновом синапсе и на постулируемую связь изменений активности фермента с наследственными изменениями (и нарушениями) поведения, очень мало было известно о генетическом контроле активности фермента в мозге. Имеющиеся публикации демонстрируют только наличие межлинейных различий в активности фермента у мышей (Barchas et al., 1974; Diez et al., 1976; Natali et al., 1980; Knapp et al., 1981).

Ген, кодирующий ТПГ в мозге, традиционно рассматривается как ген-кандидат, вовлеченный в регуляцию поведения и психики (Nielsen et al., 1994; 1996; Veenstra-VanderWeele et al., 2000; Gingrich, Hen, 2001, De Luca et al., 2004; Zill et al., 2004; Zhang etal., 2005).

Особое внимание привлекает возможная ассоциация ТПГ с выраженностью защитного поведения. Защитное поведение представляет собой комплекс эволюционно закрепленных врожденных реакций на неодушевленные и одушевленные угрожающие стимулы внешней среды. Можно выпеттть тяк-ир рязигтипипп-и зятитнпго поведения как защита самцом территории (или социа тьЖЖЬ йОДИвМАДОНЗД] ызванная страхом

БИБЛИОТЕКА

1 »if

оборонительная агрессия, реакция активного избегания и реакция замирания (затаивание) (Dixon, 1998; Popova, 1999; Попова, 2004).

Генетико-молекулярные механизмы межеамцовой агрессии традиционно изучают на линейных мышах и гибридах (Maxson, 1992; 1999) Для изучения наследственных механизмов вызванной страхом агрессии на человека были созданы две модели доместикации - на серебристо-черных лисицах (Трут, 1978; 1981) и серых крысах-пасюках (Беляев, Бородин, 1982; Никулина и др., 1985) Классической моделью изучения реакции активного избегания являются Римские линии крыс RHA и RLA, различающиеся по выраженности реакции активного избегания в челночной камере (Overstreet, 1992) Наконец, для исследования генетического контроля реакции замирания (каталепсии) была создана линия крыс ГК (Колпаков, 1990; Kolpakov et al, 1996) Другой моделью естественной каталепсии является щипковая (pinch-induced) каталепсия мышей (Amir et al., 1981; Ornstein, Amir, 1981).

Цель и задачи исследования. Основной целью исследования было изучение закономерностей генетического контроля активности ТПГ в мозге и выяснение роли фермента в генетическом и молекулярном механизмах регуляции выраженности различных форм защитного поведения. Были поставлены следующие задачи-

1 Изучить закономерности генетического контроля активности ТПГ в мозге мышей.

2 Исследовать генетический контроль межеамцовой агрессии у мышей и связь межеамцовой агрессии с активностью ТПГ в мозге.

3. Проанализировать участие ТПГ в процессе доместикации серебристо-черных лисиц и серых крыс-пасюков.

4. Исследовать роль Till мозга в механизме регуляции генетически детерминированных различий в проявлении реакции активного избегания у крыс

5. Изучить генетический контроль каталепсии мышей.

6 Выяснить связь ГПГ с наследственно детерминированными различиями в предрасположенности к каталепсии мышей и крыс.

Научная новизна. Были выявлены два типа наследственной изменчивости активности ТПГ в мозге мышей' конститутивный и регуляторный Конститутивная изменчивость обусловлена C1473G полиморфизмом в 11-ом экзоне гена tph2, а регуляторная изменчивость - наследственным полиморфизмом по степени фосфорилирования фермента

Выявлена ассоциация интенсивности драк с полиморфизмом C1473G в гене tph2 мышей. Интенсивность драк была снижена у мышей с генотипом 1473G/G по сравнению с животными 1473С/С.

Установлено увеличение активности ТПГ в среднем мозге серебристо-чсрных лисиц и крыс-пасюков в процессе доместикации.

Выявлена ассоциация слабой выраженности реакции активного избегания со сниженной активностью ТПГ в среднем мозге крыс.

Показана связь наследственной предрасположенности к каталепсии с повышенной активностью ТПГ в стриатуме . мышей и крыс.

Ген, определяющий высокую предрасположенность к каталепсии, локализован в дистальном фрагменте хромосомы 13 мыши.

Теоретическая и практическая значимость работы. Основным вкладом данного исследования в генетику и нейрогенетику поведения является экспериментальное доказательство генетической ассоциации активности ТПГ в мозге с наследственно детерминированным полиморфизмом по выраженности различных форм защитного поведения. Другим важнейшим теоретическим положением, продемонстрированным в работе, является экспериментальное доказательство того, что в основе селекции на выраженность защитного поведения лежит отбор генетических факторов, регулирующих активность ТПГ в головном мозге.

Показано существование связанной с геном фИ2 (конститутивной) и не связанной с ним (регуляторной) изменчивости активности ТПГ в мозге. Установлена связь конститутивной и регуляторной изменчивости с наследственным полиморфизмом основных типов защитного поведения. Выявление ассоциации 014730 полиморфизма в гене 1рИ2 с интенсивностью драк у самцов мышей имеет существенное эвристическое значение для понимания молекулярно-генетического механизма регуляции агрессии и жестокости. Показана ассоциация наследственно детерминированных особенностей агрессии на человека, активного избегания и каталепсии с регуляторной, но не конститутивной изменчивостью ТПГ в мозге. Полученные данные указывают на существенную роль генов, контролирующих посттрансляционную модификацию ТПГ, в регуляции наследственного полиморфизма по выраженности этих форм защитного поведения.

Обнаружена линия мышей СВА с чрезвычайно высокой предрасположенностью к каталепсии. Эта линия может использоваться как модель для изучения генетико-молекулярных механизмов естественной защитной реакции замирания. Разработан чувствительный флуориметрический метод измерения активности ТПГ в тканях.

Положения, выносимые на защиту.

1. Выявлены два типа наследственной изменчивости активности ТПГ в мозге: конститутивный и регуляторный Конститутивная изменчивость обусловлена С14730 полиморфизмом в 11-ом экзоне гена (рА2, кодирующего ТПГ. Регуляторная изменчивость связана с различиями в механизме обратимого фосфорилировании уже синтезированных молекул фермента.

2. Активность ТПГ в мозге ассоциирована с наследственной изменчивостью по выраженности различных форм защитного поведения у разных видов животных. Конститутивная изменчивость активности фермента ассоциирована с интенсивностью межсамцовой агрессии мышей. Регуляторная изменчивость - с выраженностью агрессии на человека, реакцией активного избегания и каталепсией.

3. Изменчивое гь порога (уровня, предрасположенности) и интенсивности (числа драк) межсамцовой агрессии мышей в значительной степени определяется генетическими факторами. Однако эти два показателя межсамцовой агрессии регулируются разными генетическими механизмами. В то время как доминирует низкий порог агрессивной реакции, интенсивность драк имеет промежуточный тип наследования. Обнаружена ассоциация числа драк между самцами мышей с полиморфизмом С1473в в гене 1рИ2.

4. Селекция серебристо-черных лисиц и серых крыс-пасюков на отсутствие агрессии на человека (доместикация) приводит к сходному увеличению активности ТПГ в среднем мозге.

5. Наследственно детерминированное отсутствие реакции активного избегания у крыс линии ЯЬА ассоциировано со сниженной активностью ТПГ в среднем мозге.

6. Предрасположенность к реакции замирания (каталепсии) у мышей контролируется в основном геном, локализованным в дистальном фрагменте хромосомы 13.

7. Наследственная каталепсия у мышей каталептической линии СВА и крыс линии ГК, селекционированной на каталепсию, сопровождается локальным увеличением активности ТПГ в стриатуме.

Апробация работы. Результаты данной работы были представлены и обсуждены на Ученых Сессиях Института цитологии и генетики в 1988, 1991, 2000, 2003 годах, Всесоюзной конференции "Химия, биохимия и фармакология производных индола" (Тбилиси, 1986), Всесоюзной конференции «Медиаторы в генетической регуляции поведения» (Новосибирск, 1986), XV съезде Всесоюзного физиологического Общества им. И.П. Павлова, (Ленинград, 1987), 5-ом съезде ВОГИС (Москва, 1987), конференции "Медиаторы и поведение" (Новосибирск, 1988), 3 школе-семипаре по генетике и селекции животных (Бийск, 1989), Всемирном конгрессе по психиатрической генетике (Новый Орлеан, 1993, США), 4-ой Международной конференции Общества Нейробиологии Поведения (Сантьяго де Компостела, Испания. 1995), XIX съезде Российского физиологического Общества им. И.П. Павлова (Екатеринбург, 2004) и на конференции Российского нейрохимического общества «Нейрохимия: фундаментальные и прикладные аспекты» (Москва, 2005).

Публикации. Материал диссертации изложен в 54 публикациях в отечественных (31) и международных (23) реферируемых журналах

Структура и объем работы. Диссертация включает введение, обзор литературы, описание используемых методик, 5 глав результатов исследования, общее обсуждение, выводы, список цитируемой литературы (771 работа) и список публикаций автора по теме диссертации (54 работы) Работа изложена на 221 страницах машинописного текста, содержит 46 рисунков и 21 таблицу.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Животные. Эксперименты проведены на мышах 12 инбредных линий А/Нс, A/Y, AKR/J, BALB/c, СЗН/Не, CBA/Lac, C57BL/6J, CC57BR, DBA/1, DD, РТ и YT Было проведено три гибридологических анализа 1) на линиях BALB/c (С) и C57BL/6 (В6), включающий реципрокных гибридов Fi(CxB6) и Fi(B6xC), F2(B6xC)x(B6xC) и бэккроссов ВС(СхВ6)хС; 2) на линиях AKR (АК) и СВА (СВ), включающий реципрокные гибриды Fi(AKxCB) и Fi(CBxAK) и F2(CBxAK)x(CRxAK) и 3) также на линиях AKR и СВА, их реципрокных гибридах Fi и бэккроссах ВС(СВх(АКхСВ))

Опыты проводили на самцах крыс аутбредных линий Вистар и ГК, прошедших 16-25 поколений селекции на высокую предрасположенность к каталепсии; самцах крыс линий Roman High and Low Avoidance (RHA/Verh и RLA/Verh), селекционированные по выраженности реакции активного избегания в челночной камере, а также самцы серых крыс-пасюков 24-27 поколений селекции на высокую (агрессивные) и низкую (ручные) агрессию на человека

Часть исследований выполнена на самцах серебристо-черных лисиц из неселекционированной совхозной популяции (дикие) и прошедших 20 поколений селекции на высокую (агрессивные) и низкую (ручные) агрессию на человека

Поведенческие тесты. Выраженность естественной межсамцовой агрессии мышей изучали на разработанной нами модели «спонтанной агрессивности» и оценивали по 1) уровню агрессивности - проценту агрессивных животных и 2) интенсивности агрессии - числу драк (Куликов, Попова, 1980; Popova, Kulikov, 1986). Проявление щипковой каталепсии у мышей исследовали по стандартной методике и выражали процентом животных, проявляющих не менее трех раз замирание, длящееся более 20 с (Куликов и др., 1989; Kulikov et al., 1993). Поведение крыс в тестах приподнятого крестообразного лабиринта и свет/темнота изучали по стандартной методике и оценивали числом заходов в открытые рукава лабиринта и освещенный отсек и временем пребывания там (Kulikov et al., 1995).

Аналитические методы. Активность 1111 в мозге определяли с помощью разработанных нами высоко чувствительной флюориметрии (Куликов и др., 1988) и жидкостной хроматографии высокого давления с электрохимическим детектором (Kulikov et al., 1995) и выражали в пикомолях 5-гидрокситриптофана, образующегося в мин на мг белка (пмоль/мг/мин).

Полиморфизм C1473G в гене tph2 мыши изучали с помощью ПЦР образцов ДНК с праймерами предложенными Zhang et al (2004). Картирование гена, определяющего высокую предрасположенность к каталепсии, проводили с помощью ПЦР образцов ДНК с 65 полиморфными микросателлитными маркерами, покрывающими 19 аутосом мыши.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Генетический контроль активности 1111' в мозге мышей.

Таблица 1 Активность HIT в стволе и в полушариях мозга мышей инбредиых линий

Выявлены существенные межлинейные различия в активности фермента в полушариях (F6,4i = 42.9, р<0.001) и в стволе головного мозга (Fn.106 = 45.5, р<0.001, Табл.1). С помощью метода множественных сравнений Шеффе (1980) все линии были разделены на две контрастные группы: у животных линий DBA/1, CC57BR, А/Не и BALB/c, принадлежащих к первой группе, активность ТПГ в стволе вдвое, а в полушариях вчетверо ниже, чем у мышей второй группы (DD, A/Y, YT, AKR, РТ, СЗН/Не, СВА, C57BL/6). Различия между двумя любыми линиями из разных групп достоверны, тогда как линии из одной группы не различаются по данному признаку. Обнаружена высокая межлинейная корреляция между активностью фермента в стволе и полушариях мозга (г = 0.89, р<0.01).

Линии Активность ТПГ (пикомоль/мг/иин)

Ствол Полушария

DBA/1 13.8 ±0.5 33 ±03

CC57BR 15 0 ±0.9

А/Не 16 8 ±0.5

BALB/c 175 ±05 34 ±02

DD 25 1 ±11 10 3 ± 18

A/Y 25 5 ±14

YT 25 7 ±12

AKR 26 0 ±10 130 ±04

C3H/He 27 7 ±12 13 6 ±19

РГ 27 8 ±0.8

СВА 289 ±07 14 0 ±0.7

C57BL/6 32.0 ±0 8 114 ±06

Мыши разных линий отличаются также по константе Михаэлиса (Км) и максимальной активности фермента (Ут„) (Табл 2) Кинетические характеристики 1111, выделенной из ствола мозга мышей первой группы, почти вдвое ниже, чем у фермента, выделенного из мозга животных второй группы Известно, что в общем случае эти две характеристики зависят от значения каталитической константы, отражающей эффективность фермента как катализатора, - чем более эффективным катализатором является фермент, тем выше значения его Км и Утах (Фершт, 1980)

С помощью гибридо-

Таблица 2 Значения максимальной активности (Ущщ) логического анализа,

и константы Михаэлиса (Км) ТПГ из мозга мышей проведенного на двух

контрастных линиях ВАЬВ/с и С57В1У6, показано промежуточное наследование активности фермента (Рис.1) Отсутствие реципрокных различий у гибридов первого поколения свидетельствует о контроле данного признака аутосомными генами

Лиши Утис (пмоль/мг/мин) Ких Ю'М

ВАЬВ/с 18 3 ±09 0 9 ±0 1

СС57ВВ. 24 3 ± 1 5 1 2±02

СБА 32 4 ± 3 8 2 3 ± 0.4

ОБ 35 5 ± 2 2 2 2 ± 0 3

С57В1/6 36 3 ±2 0 1 8 ±0 2

СЗН/Не 38 9 ± 3 3 2 1 ±0 3

I ствол ■ полушария

£ 4»

| 30

£ г* | 2»

£ « ««

£ 5

Р1(С)

Р?(В6) М(СхВ6) Р1(В6хС)

Р2

Рис. 1. Активность триптафангидроксилазы (ТПГ) в стволе и полушариях мозга мышей линий ВАЬВ/с (С), С57В1./6 (В6) и гибридов

Нами совместно с Э X Гинзбургом проведена статистическая проверка гипотезы о контроле активности фермента в мозге одним двухаллельным локусом Эта проверка основана на оценке согласия эмпирических распределений активности ТПГ в стволе и полушариях (Рис 2) мозга с теоретическими распределениями, построенными на основании проверяемой гипотезы (Гинзбург, 1984) Материал представлен тремя изогенными совокупностями Р1 (ВАЬВ/с), р1 и Р? (С57ВЬ/6), которые соответствуют трем генотипам - двум гомозиготам и одной гетерозиготе Фенотипическое проявление признака - активность ТПГ - задано тремя гауссовскими модификационными распределениями с некоторыми генотипическими значениями и дисперсиями Совокупность р2 является генетически гетерогенной и состоит из особей трех генотипов в соответствии с классическим Менделевским соотношением (1 2 1)

Поэтому распределение фенотипов в ^ представляет суперпозицию модификационных распределений для трех генотипов, взятых с коэффициентами 0 25, 0.5 и 0 25

X ш

2 с:

ш <

о со н

ш у

BAl.BJc.rt-25

С67В1_«,п-15

2 4 5 8 10 12 14 16 18 АКТИВНОСТЬ ТРИПТОФАНГИДРОКСИЛАЗЫ. ПМОЛЫМГ1МИН

Рис.2. Распределение активности триптофангидроксилазы ГГПП в полушария* мозга мышей линий ВА1.В/с, С57В1. 6 и их гибридов.

Гипотеза проверялась в два этапа. На первом этапе оценками I енотипических значений и дисперсий служили средние и дисперсии признаков у Р|, Ь | и Рг (Табл 3, вариант 1). На втором этапе выбирались такие оценки, коюрые минимизировали функцию %2, построенную на всех четырех распределениях (оценки минимума -¿2) (Табл.3, вариант 2). Оказалось, что при использовании более корректных оценок минимума у2 гипотеза о моногенном наследовании согласуется с эмпирическим материалом. Следует отметить, что уточненными оказались только оценки дисперсий, оценки генотипических значений не изменились (Табл.3). Полученный результат означает, что исходя из имеющихся данных и используемого критерия, мы не можем отвергнуть эту гипотезу, а, следовательно, на данном этапе можем использовать ее как рабочую гипотезу.

Таблица 3 Статистическая оценка параметров гипотезы о моногенном контроле активности ТПГ в стволе и полушариях мозга мышей и значения критерия согласия X2 в гибридологическом анализе

Варианты ВАЬВ/с Оцениваемые параметры Ба С57В1/6 X2 Р

?1 Ъ ° з Ъ

СТВ ОЛ

1 17 5 70 28 0 184 33 0 32 0 39 0 6 <0 01

2 17 4 84 27 7 7 9 30 3 ПОЛУШАРИЯ 35 5 92 б >0 1

1 34 07 78 3 1 114 47 12 3 3 <0 01

2 34 3 1 75 12 117 63 08 3 >0 8

Условные обозначения у-генотипические значения, о -дисперсии

Для проверки влияния С14730 полиморфизма в гене 1рИ2 на активность фермента в мозге было изучено распределение аллелей 1473С и 14730 у 10 инбредных линий мышей. Установлено, чго 7 из исследованных линий мышей (С57В1_/6, СВА, СЗН/Не, АКИ., 00, РТ и УТ) были гомозиготами по 1473С аллелю, тогда как три линии (ВА1.В/с, А/Не и СС57ВЯ) - гомозиготами по 14730 аллелю (Рис.3).

Сопоставление активноеги 4„ .кш^^^^щтарщрвр ТПГ (Табл.1) и С14730 »2* — ... _ е. р полиморфизма (Рис.3) выявило

______^^ более высокую активность

» ЧГ" фермента в стволе мозга у мышей линий, несущих 1473С аллели в

2 3 « о » Ч ■ я » о

ш —•

О гомозиготном состоянии, по

сравнению с животными,

С * (Г ■ гомозиготными по 14730 аллелю

* Использование дисперсионного

Рис.3. Распределение С14736 полиморфизма в анализа выявило существенный

гене 1рИ2 у мышей 10 инбредных линий. Яркие вклад полиморфизма в

верхние полосы, присутствующие у всех линий - вариабельность активности ТПГ в

ПЦР продукты ДНК мыши с контрольными среднем мозге (Р] 8 = 35.9, р<0.001)

лраймераии. Нижние более слабые полоски - Это позволяет утверждать, что

продукты ПЦР с праймерами, специфическими обнаруженные нами различия в

для 1473С Ю или 14736 6) аллелей. а

активности фермента в мозге

мышей определяются в основном С14730 полиморфизмом в 11-ом экзоне гена фермента. Мыши линии ВАЬВ/с являются гомозиготными по 14730 аллелю, в то время как животные линии С57В176 - гомозиготны по 1473С аллелю Следовательно, С14730 полиморфизм определяет моногенное наследование активности фермента в гибридологическом анализе, включающем эти линии и их гибриды (Табл.3) Данный полиморфизм расположен в домене фермента, регулирующем его четвертичную структуру, которая влияет на активность ТПГ. Изменчивость в активности фермента, связанная с С14730 полиморфизмом, была названа нами конститутивной, поскольку она обусловлена существенными изменениями структуры (конституции) фермента.

Конститутивная изменчивость является главным, но не единственным, источником генетически детерминированной вариабельности активности ТПГ в мозге мышей. Действительно, с помощью дисперсионного анализа было обнаружено существенное генетически детерминированное разнообразие в активности фермента у мышей, гомозиготных по 1473С аллелю СР8,94 = 8.82, р<0.001). Другим механизмом, определяющим активность фермента, является обратимое фосфорилирование молекул

фермента кальций, кальмодулин зависимой протеинкиназой II в присутствии АТФ и ионов кальция Дня выяснения роли обратимого фосфорилирования в механизме генетически детерминированных различий в активности ТПГ в мозге мышей изучалось влияние трехминутной преинкубации при 37°С с АТФ и ионами Са2+ и М^(фосфорилирование) или с экзогенной щелочной фосфатазой (дефосфорилирование) на активность ТПГ, выделенную из ствола головного мозга мышей линий ВАЬВ/с с низкой и С57ВЬ/6 - с высокой активностью фермента

Преинкубация фермента у мышей линии ВАЬВ/с в фосфорилирующих условиях не вызывает изменения его активности В то же время, преинкубация ТПГ у мышей этой линии со щелочной фосфатазой вызвала достоверное снижение его активности (Рис 4, р<0 001) Иными словами, в стволе головного мозга мышей ВАЬВ/с ТПГ уже полностью фосфорилирована Иная картина наблюдается при изучении фосфорилирования ТПГ из ствола головного мозга мышей линии С57ВЬ/6. Преинкубация фермента в фосфорилирующих условиях заметно повышает (р<0 01), тогда как преинкубация со щелочной фосфатазой - снижает активность ТПГ (Рис 4, р<0 01) Следовательно, ТПГ в мозге мышей линии С57В176 в норме не фосфорилирована полностью и ее активность может быть изменена с помощью фосфорилирования/дефосфорилирования фермента

ВАЬВ/с С57ВЦ/6

Рис.4. Влияние фосфорилирования и дефосфорилирования на активность ТПГ из ствола головного мозга нышей линий ВА1_В/с и С57В1. 6. *р<0.01 по сравнению с активностью нативного фермента (контроль).

Изменчивость, обусловленная наследственными факторами, не сцепленными с геном 1рИ2, в том числе обратимым фосфорилированием ТПГ, была нами названа регуляторной изменчивостью

Одним из ключевых положений исследования является экспериментальная демонстрация двух источников наследственной изменчивости активности ТПГ в мозге конститутивной, связанной с геном ¡рИ2, и регуляторной, обусловленной другими генами Основной характеристикой конститутивной изменчивости ТПГ является то, что она синхронно проявляется во всех структурах мозга Регуляторная изменчивость носит локальный характер и затрагивает, обьгчно, один из отделов мозга

Дальнейшая часть работы посвящена выявлению связи конститутивной и регуляторной изменчивости активности ТПГ в мозге с наследственно детерминированным полиморфизмом по выраженности таких форм защитного поведения как защита территории (межсамцовая агрессия), вызванная страхом агрессия на человека, реакции активного избегания и реакции замирания (каталепсии).

Ассоциация активности ТПГ с полиморфизмом по выраженности межсамцовой агрессии у мышей. У самцов девяти инбредных линий определены как интенсивность, так и уровень спонтанной агрессивности (Рис.5). Отмечены существенные межлинейные различия по числу нападений на чужака (Fg n4 = 6.52, pcO.OOl) и по проценту агрессивных животных в линии (Fsm — 6.9, р<0.001). Наивысшая интенсивность уже возникшей агрессии отмечена для мышей линий C57BL/6 и YT. Эти животные, начав драться, нападают на чужака в среднем 9 раз за 2 мин теста. Наименьшей агрессивностью характеризовались мыши линии DBA/1, они нападали на чужака в среднем 3 раза за 2 минуты (Рис.5). По уровню агрессивности все 9 исследованных линий можно разделить на две группы. В линиях DBA/1, CC57BR, AKR, СЗН/Не и C57BL/6 половина самцов нападают на подсаженного чужака, в то время как в линиях BALB/c, А/Не, DD и YT агрессивным является каждый пятый самец (Рис.5).

Не было отмечено межлинейной (генотипической) корреляции между числом драк за время наблюдения и процентом агрессивных животных в линии (г = -0.01, р>0.05). Действительно, несмотря на низкую интенсивность агрессии, характерную для животных линий DBA/1 и CC57BR, уровень их агрессивности высок - на чужака нападало около половины животных этих линий. Линии C57BL/6 и YT, сходные по выраженности уже возникшего агрессивного поведения, резко отличаются по его уровню: в линии C57BL/6 на чужака нападало вдвое больше самцов, чем в линии YT. Следовательно, интенсивность и уровень характеризуют разные стороны межсамцовой агрессии мышей. Уровень характеризует высоту порога агрессивной реакции, вспыльчивость мышей данной линии, тогда как интенсивность - выраженность начавшего агрессивного поведения.

Изучение закономерности наследования интенсивности и уровня агрессивности проводили на двух контрастных по этой форме поведения линиях - BALB/c (С), характеризующейся сравнительно невысокими величинами интенсивности и уровня спонтанной агрессивности, и C57BL/6 (В6), одной из наиболее агрессивных среди изученных линий, а также на их прямых (СхВб), обратных (ВбхС) гибридах Fj и бэккроссах (СхВб)хС (Табл.4). Оказалось, что интенсивность агрессии, характеризуемая средним числом драк, на одного дерущегося самца, у реципрокных гибридов Fi не различалась (Fiji = 0.18, р>0.05). Уровень спонтанной агрессивности у этих гибридов также сходен (%2 = 3.65, р>0.05). Поэтому при дальнейшем статистическом анализе они были объединены как реципрокные гибриды F], характеризующиеся средним числом драк (5.77 ± 0.45) и уровнем спонтанной агрессивности, равным 70%.

12 10

о с о

5 4

2 0 -1-

МЙШн

С57В1. СЗН АКЯ УТ 00 ВД1.В Л/Не СС57ВГ ОВАН

Рис.5. Интенсивность агрессии {число драк) и уровень агрессивности (% агрессивных мышей) сдмцов мышей 9 мнбредных линий.

Таблица4 Интенсивность и уровень агрессивности самцов мышей линий ВАЬВ/с (С), С57ВЬ/6(В6) и их гибридов

Генотип Число Число % агрессивных

животных драк мышей

ВАЬВ/с 101 39+06 21

С57ВЬ/6 52 89 + 06 55

Р1(СхВ6) 46 5 6 ±0 6 61

Р1(В6хС) 27 6 0+07 85

ВС(СхВб)хС 75 5 1 ±0 5 55

Установлено, что уровень спонтанной агрессивности у животных линии ВАЬВ/с существенно ниже по сравнению с таковым у мышей линии С57ВЬ/6 (х2 = 17.3, р^0.001), реципрокных гибридов Б] (х2 = 40.1, р<0 001) и бэккроссов (х2 = 20.2, р<0 001). В то же время, уровень агрессивности у животных линии С57ВЬ/б не отличался достоверно от такового у гибридов первого поколения и бэккроссов. Иными словами, доминирует высокий уровень агрессивности. Иное наблюдается при сравнении родительских линий и их гибридов по интенсивности спонтанной агрессии. Число нападений на чужака у реципрокных гибридов первого поколения составляет 5.74 ± 0,47 и очень близко к средней арифметической значений признака у родительских линий (равной 5.6, р>0.05). В то же время, интенсивность драк у Р| достоверно выше по

сравнению с ВАЪВ/с (Б] 172 = 5.61, р<0.001) и значительно ниже по сравнению с С57ВЬ/6 (?! 123 - 17.7, р<0.001) Следовательно, наблюдается промежуточное наследование числа драк, отражающего интенсивность уже начавшегося агрессивного поведения

В таблице 5 представлены полиморфные варианты гена а также значения активности ТПГ в стволе головного мозга, интенсивности агрессии и уровня агрессивности у 8 инбредных линий мышей Обнаружена высокая межлинейная корреляция между активностью ТПГ и числом драк (г = 0.89, р<0.01). Дисперсионный анализ показал существенный вклад С147ЭО полиморфизма в гене в проявление интенсивности спонтанной агрессии: число нападений на чужака у мышей с генотипом С/С составляет 8.4 ± 0.5, а с генотипом О/в существенно меньше 4.4 + 0 4 (р[ 6 = 20 0, р<0.01). В то же время, не выявлена корреляция между активностью ТПГ в стволе мозга и уровнем агрессивности (г = 0.35, р>0.05) Влияние полиморфизма в гене Гр/г.2 на процент агрессивных животных также не обнаружено (Г] 6 = 0.2, р>0.05)

Таблица 5 Полиморфные варианты гена фк2, значения активности ТПГ в стволе мозга, числа драк и процента агрессивных с амцов мышей 8 инбредных линий

Линия фк2 Активность ТПГ Число % агрессивных

(пмоль/ мг/мин) Драк мышей

СС57ВВ. а/а 15 0 ±09 5 0±0 9 50

А/Не а/в 16 8 ± 0 5 4 3±0 7 20

ВАЬВ/с а/а 17 5 ±0 5 А 3±0 4 22

ЭО ас 25 1 ± 1 1 7 0+1 6 16

ГГ с/с 257 ± 1 2 9 5±2 9 18

АКБ. ас 26 0 ± 1 0 7 3±1 5 51

СЗН/Не ас 27 7 ± 1 2 7 8±2 0 44

С57ВЬ/6 с/с 32 0 ± 0 8 8 9±0 6 55

Таким образом, конститутивная изменчивость активности ТПГ в мозге, обусловленная С14730 полиморфизмом, ассоциирована с наследственной вариабельностью интенсивности межсамцовой агрессии мышей. Не обнаружено ассоциации активности ТПГ с уровнем агрессивное ги, что является еще одним доказательством того, что интенсивность и уровень агрессии конгролируются разными генетическими и молекулярными механизмами.

Активность ТПГ в мозге животных, различающихся по выраженности агрессии на человека. Многие дикие животные испытывают естественный страх перед человеком, стремятся избежать контакта с ним, а когда бегство невозможно, яростно себя защищают Такой вид агрессии можно рассматривать как разновидность агрессии, вызванной страхом (Куликов, Попова, 1991). Длительный процесс одомашнивания значительно подавляет у животного чувство страха перед человеком (Трут, 1978). Имеются многочисленные доказательства того, что процесс доместикации - глобальное биологическое явление, включающее перестройку поведения на генетическом уровне Потомки доместицированнных особей уже при первом контакте с человеком демонстрируют менее выраженное агрессивное поведение по сравнению с их дикими предками (Беляев, 1972; Трут, 1978). Согласно гипотезе, сформулированной Н.К. Поповой (1980), в ходе процесса доместикации происходит отбор животных с определенным типом функционирования серотониновой системы мозга. В рабо1е изучено влияние доместикации серебристо-черных лисиц и серых крыс-пасюков на активность ТПГ головного мозга.

Наименьшая активность фермента обнаружена в гипоталамусе и среднем мозге у лисиц из популяции, селекционируемой в течение 20 поколений на высокую агрессию на человека (агрессивные), а наибольшая - у животных, прошедших 20 поколений селекции на отсутствие агрессии на человека (доместицированные) (Рис 6). Различия в активности ТПГ между агрессивными и домесгицированными животными были высоко достоверны в среднем мозге (t9 = 4 4, р<0 01) и гипоталамусе (tn = 3 6, р<0 01) Особи из неселекционируемой совхозной популяции (дикие), характеризующиеся трусливо-оборонительных типом поведения (60%), имели промежуточное значение активности фермента в среднем мозге и гипоталамусе.

Не выявлено достоверных различий по максимальной активности ТПГ в среднем мозге у исследуемых групп лисиц Однако наблюдается значительное снижение константы Михаэлиса фермента у ручных животных по сравнению с дикими и агрессивными лисицами (Табл 6) Поскольку величина константы Михаэлиса обратно пропорциональна сродству фермента к субстрату (триптофану), можно утверждать, что в процессе доместикации происходит увеличение сродства ТПГ к триптофану Увеличение сродства и является причиной высокой активности ТПГ в мозге у доместицированных животных Действительно, при низкой концентрации триптофана в мозге скорость синтеза серотонина будет в значительной степени определяться сродством ТПГ к триптофану Это увеличение сродства ТПГ к триптофану является естественной причиной наблюдаемого увеличения уровня серотонина в мозге у доместицированных животных по сравнению с агрессивными Наиболее вероятной причиной уменьшения константы Михаэлиса ТПГ в среднем мозге ручных лисиц может бьгть обратимое фосфорилирование фермента Действительно, фосфорилирование ТПГ вызывает резкое уменьшение константы Михаэлиса (Boadle-Biber, Phan, 1986)

Таблица б Значения максимальной активности и константы Михаэлиса (Км) ТПГ из среднего нозга различающихся по выраженности агрессии на человека серебристо-черных лисиц

Группа V.„„ (пмоль/мг/мин) Кмх1СГвМ

Ручные 8 1+04 10 0 ± 2 0**

Дикие 11 8 ± 0 9 72 0 ± 21 0

Агрессивные 97± 1 1 84 0 ± 24 0

**р<0 01 по сравнению с агрессивными и дикими

В эксперименте, проведенном на серых крысах-пасюках, прошедших 24-27 поколений на высокую агрессию (агрессивные) и на отсутствие агрессии (ручные) на человека, также бьио показано увеличение активности ТПГ в среднем мозге ручных животных по сравнению с агрессивными = 3.6, р<0 01, Рис 7) Однако в гипоталамусе активность ТПГ у ручных и агрессивных пасюков не различалась Увеличение активности фермента в среднем мозге можно рассматривать как наиболее вероятную

гшю гтшмус средний MOW

Рис.6. Активность ТПГ в гипоталамус« •> и среднем мозге агрессивных (белые

столбики), диких (штрихованные столбики) и ручных (черные столбики) серебристо-черных лисиц. • "р<0.01 по сравнению с агрессивными

причину повышенного содержания серотонина в мозге ручных животных по сравнению с агрессивными (Naumenko et al., 1989; Popovaet al, 1991)

¡1*1

- ¿1 и ■ 1И

гилотдомк сждиий моэг

Рис.7. Активность ТПГ ■ гипоталамусе и среднем мозге агрессивных (белые столбики) и ручных (черные столбики) серых крыс-пасюков. "р<0.01 по сравнению с агрессивными.

у лисиц связано с изменением сродства фермента, можно предположить, что оно носит скорее регуляторный характер и связано с накоплением в ходе процесса доместикации аллелей генов-модификаторов, активирующих ТПГ Отбор на высокую агрессию на человека, напротив закрепляет аллели, снижающие активность фермента

Активность 1111 в мозге крыс, различающихся по выраженности реакции активного избегания. Активное избегание является самым распространенным и эффективным видом защиты от неблагоприятных природных факторов, хищников и агрессивных сородичей (Dixon, 1998) Реакция активного избегания лежит в основе большинства лабораторных тестов на тревожность (тест приподнятого крестообразного лабиринта) и на депрессию (выученная беспомощность) (Willner, 1990)

Классической моделью для изучения генетических и молекулярных механизмов, вовлеченных в регуляцию реакции активного избегания, являются линии Римских крыс, селекционированные на высолю (RHA) и низкую (RLA) выраженность реакции избегания в челночной камере У крыс линии RLA очень трудно выработать условную реакцию избегания удара электрического тока, тогда как крысы RHA очень быстро обучаются покидать отсек челночной камеры сразу после предъявления условного сигнала В работе мы исследовали поведение в тестах приподнятого крестообразного лабиринта и свет/темнота, которые считаются наиболее распространенными тестами на тревожность, а также активность ТПГ в структурах мозга у крыс линий RHA и RLA

Крысы линии RHA реже заходили в открытые рукава приподнятого крестообразного лабиринта (Fi^t = 7 2, р<0 05) и проводили там меньше времени (F124 = 8 4, р<0 01) по сравнению с животными линии RLA (Рис 8) Сходная картина наблюдалась в тесте свег/темнота Будучи помещенные в светлый отсек животные этих линий одинаково быстро (в течение 10-15 с) перебегали в темный отсек Различий между крысами RHA и RLA по латентному времени перемещения в темный отсек не обнаружено Однако крысы RHA, попав в темный отсек, оставались в нем в течение всего теста и очень редко покидали его В то же время крысы RLA достоверно чаще покидали темный отсек (F1|24 = 112, р<0 001) и более длительное время пребывали в светлом отсеке (Fi.n = 9 2, р<0 01) (Рис 9)

Таким образом, в процессе доместикации животных двух разных видов серебристо-черных лисиц и серых крыс-пасюков - наблюдается гомологичное увеличение активности ключевого фермента биосинтеза серотонина - ТПГ - в среднем мозге у животных с наследственно запрограммированным дружелюбным типом поведения Это увеличение активности ТПГ, по-видимому, является основной причиной ранее выявленного возрастания уровня серотонина в ряде отделов мозга у ручных лисиц и крыс-пасюков.

Судя по тому, что увеличение активности ТПГ не велико, проявляется локально в среднем мозге и, по крайней мере,

£ 40

3 30

О 10

2 0

£ 30

к 20

а а 10

ЯНА

■

3 2 1 О

ЯНА

Рис.8. Число заходов в открытые рукава приподнятого крестообразного лабиринта и время пребывания тан у крыс ЙНА и ША. 'р<0.05. "р<0.01 по сравнению с МА.

Рмс.9. Число выходов в светлый отсек и время пребывания таи в тесте свет'темнота у крыс 1?НА и (НА.

"р<0.01, —р<0.0а1 по сравнению с [*НА.

Полученные результаты хорошо согласуются с ранее опубликованными данными (СКаоЫоГГ е1 а1 , 1994) Наблюдаемое увеличение числа заходов в открытые рукава лабиринта и в светлый отсек у крыс ЯЬА не является следствием их повышенной двигательной активности Напротив, крысы ЯЬА менее подвижны по сравнению с животными ЯНА (Са&апоп е! а!, 1992) Возможной интерпретацией полученных данных является предположение, что высокое число заходов в открытые рукава и светлый отсек и времени пребывания там является проявлением отсутствия нормальной защитной реакции избегания у крыс ЯЬА Действительно, открытые и освещенные пространства вызывают нормальную реакцию страха у крыс и животные ИНЬ с нормально выраженной защитной реакцией избегают появляться в открытых рукавах крестообразного лабиринта и в светлом отсеке

Значения Утки Км фермента в коре, гиппокампе и гипоталамусе не различались у животных ЯНА и ЯЬА (р>0 05, Табл 7) В то же время, максимальная активность ТПГ в среднем мозге крыс линии ИНА существенно выше, чем у ЯЬА (И^ю = 21 6, р<0 001) Однако константа Михаэлиса ТПГ у крыс 1ША также превышала таковую у ИЬА (Р110 = 4 9, р<0 05) В настоящее время не ясен молекулярный механизм этого генетически детерминированного снижения активности ТПГ в среднем мозге крыс Ы-А Маловероятно, что оно связано с изменением в степени его фосфорилирования, поскольку уменьшение максимальной активности фермента сопровождается увеличением его сродства к субстрату Вероятнее всего, в ходе селекции наблюдается изменение наследственных механизмов, регулирующих экспрессию гена фИ2 локально в среднем мозге О регуляторном характере изменчивости активности ТПГ в среднем мозге крыс свидетельствуют следующие факты 1) слабая выраженность этих изменений, 2) их локализация исключительно средним мозгом и 3) длительная изоляция вызывает значительное повышение активности ТПГ в среднем мозге у ЯЬА крыс (КиШсоу е1 а1„ 1995).

Таблица 7 Значения максимальной активности (Уяжх, пмоль /мг/мин) и константы Михаэли с а (Кц. х10'® М) ТПГв отделах мозга крыс КНА и ЯЬА.

Структура Параметр RHA

RLA

Средний моэг Vmx 244 ± 14

Кы 95 ± 14

Кора 124 ± 10

Км 158 ±21

Гнппокамп V„„ 96 ± 12

Кы 198 ±25

61 ±6* 120 ± 10 135 ± 14 97 ±3 172 ± 28 135 ±9 244 ± 18

169 ± 8***

Гипоталамус Vat* 163 ±11 _Кы_245 ± 20

*р<0 05. »««peo 001 по сравнению с RHA

Таким образом, в результате селекции крыс на отсутствие реакции активного избегания происходит увеличение числа заходов в открытые рукава крестообразного лабиринта и в светлый отсек в тесте свет/темнота Эти изменения в поведении не связаны с каким-либо анксиолитическим эффектом селекции на уменьшение реакции избегания, а, скорее всего, являются проявлением отсутствия реакции активного избегания у крыс RLA В процессе отбора на сниженную реакцию активного избегания наблюдается накопление аллелей генов-модификаторов, снижающих активность ТПГ в среднем мозге крыс RLA по сравнению с RHA

Следует отметить, что подобная положительная ассоциация реакции активного избегания с активностью ТПГ в среднем мозге была отмечена у крыс линий SHR и Lewis (Kulikov et al., 1997)

Геиетвческая ассопвадвя ТПГ с выраженностью реакпви замирания (каталепсии'). Каталепсия (тоническая неподвижность, животный гипноз, мнимая смерть) рассматривается как эффективная пассивно-оборонительная реакция в ответ на внешнюю угрозу со стороны хищника или агрессивного сородича (Попова, 2004, Dixon, 1998) Действительно, затаивание животного уменьшает вероятность быть обнаруженным хищником и снижает интенсивность атак со стороны агрессивного соперника В работе исследовалась генетическая регуляция предрасположенности к каталепсии у мышей и ассоциация активности ТПГ в мозге с генетически детерминированными различиями в предрасположенности к каталепсии у мышей и крыс

Каталепсия исследована у мышей 9 инбредных линий и выявлены существенные межлинейные различия по предрасположенность к реакции замирания (у2% = 40 5, р<0 001, Рис 10) Каталепсию невозможно вызвать ни у одного животного линий AKR, C57BL/6, DBA/1 и CC57BR Незначительный процент каталептиков (10-20%) обнаружен в линиях DD, BALB/c, А/Не и СЗН/Не И только в одной из исследованных линий, СВА, обнаружено 56% животных-каталептиков, время замирания которых превышало минуту Не выявлено половых различий в проявлении каталепсии у мышей СВА (х2 = 1 94, р>0.05) и у мышей AKR (каталепсии не было обнаружено ни у одного самца и ни у одной самки AKR). Поэтому при изучении генетического контроля предрасположенности к каталепсии данные, полученные на самках и самцах, объединялись.

eo,%

50' ■ 40- I 30 ■

lliii.

СВАСЭН/Н» А/Не BALB/t DD CS7BL AKR DBA1 СС57ВГ Рис.10. Процент каталептиков у мышей 9 инбредных линий.

У мышей линии СВА число каталептиков в потомстве родителей-каталептиков (57% самцов и 75% самок) не отличался от такового в потомстве родителей-некаталептиков (50% самцов, tj9 = 0 26, р>0 05 и 78% самок, t25 = 0 27, р>0 05) Этот результат служит доказательством генетической однородности линии СВА Процент каталептиков в этой линии отражает генетически детерминированную пенетрантность признака.

Поскольку каталепсия является пассивно-оборонительной реакцией, вовлеченной в механизм защиты от нападения агрессивного сородича во внутривидовых взаимоотношениях, связанных с установлением иерархии, можно предположить, что на проявление каталепсии будет существенно влиять индивидуальный опыт социальных взаимоотношений Мы, совместно с НН Кудрявцевой, исследовали влияние опыта побед и поражений в разработанной ею модели сенсорного контакта на выраженность каталепсии у самцов СВА В клетках, разделенных пополам прозрачной перегородкой с отверстиями, содержались по два самца в условиях постоянного сенсорного контакта При ежедневном (в течение 15 дней) удалении перегородки на 10 мин происходили агонистические столкновения, в которых у побеждавших животных вырабатывался агрессивный тип поведения, а у проигравших - субмиссивный (подчиненный) тип Контролем служили мыши, рассаженные поодиночке для снятия группового эффекта Было установлено, что мыши с субмиссивным типом поведения проявляли хорошо выраженную каталепсию и не отличались от контроля, тогда как ни у одного из 12 самцов с выраженным агрессивным типом поведения не удалось вызвать реакции замирания (х2 = 11 5, р<0 001)

Следующим этапом исследования было изучение закономерностей наследования предрасположенности к щипковой каталепсии, проведенное на мышах двух контрастных по данному признаку линий СВА(СВ) и AKR(AK), Fi(CBxAK), Fi(AKxCB), и F2(CBxAK)x(CBxAK)

Таблица 8 Наследование процента каталептиков Не было обнаружено ни

а гибридологическом анализе одного каталептика среди 70 (35

самцов и 35 самок) реципрокных

Генотип Число животных % каталептиков гибридов Р] (Табл 8), что

СВА 27 56 свидетельствует о рецессивном

АКЪ 26 0 характере наследования высокой

и, 70 0 предрасположенности к каталепсии

106 16 у мышей В то же время, среди 106

мышей Рз от скрещиваний Р] было

обнаружено 17 животных каталептиков (Табл 8) С учетом неполной (56%) пенегрантносги признака, такое количество каталептиков очень близко к ожидаемому при моногенном контроле предрасположенности к каталепсии (106 х 0 56 х 0 25 = 14 3, X2 = 0.64, р>0.05).

Следующим этапом анализа наследования признака было проведение возвратных скрещиваний самцов-каталептиков из Рз с самками каталептической линии СВА Семьи отцов-каталептиков оказались однородными по доле каталептиков в них (х2з = 7 8, р>0 05) Это позволяет предполагать, что все животные-каталептики в Иг изогенны по признаку Таким образом, полученные результаты свидетельствуют 1) о полной рецессивности признака в Иг, 2) о расщеплении 13 в и 3) об изогенносги животных-каталептиков в Рг Это позволяет сформулировать гипотезу о том, что каталепсия наследу ется как один аутосомный локус с неполной пенетрантностью

Для проверки данной гипотезы прежде всего необходимо как можно точнее вычислить величину пенетрантности признака Доля каталептиков в линии СВА, равная 0 56, может служить только ее грубой оценкой, поскольку она сделана на небольшой выборке Разумно использовать для получения более точной оценки пенетрантности данные по числу каталептиков в линии СВА, в Рг, в семьях отцов-каталептиков и отцов-некаталептиков Общее количество животных в эксперименте было 212 В таблице 9 поэтапно представлена процедура вычисления частот генотипов и фенотипов, исходя из гипотезы о моногенном контроле признака Полученная методом наибольшего правдоподобия уточненная оценка пенетрантности равна 0 54, что лишь незначительно отличается от грубой оценки Ожидаемые численности каталептиков в исследованных группах хорошо согласуются с их эмпирическими значениями, поэтому гипотеза о моногенном наследовании каталепсии не отвергается

Одиннадцать лет спустя гибридологический анализ наследования каталепсии был повторен, но с использованием бэккроссов, полученных при скрещивании гибридов первого поколения между АКЛ и СВА на СВА Получено 296 бэккроссов (161 самец и 135 самок), из которых 79 (26 7%) проявляли выраженную каталепсию, что очень хорошо согласуется с расщеплением 1 1 при пенетрантности признака равной 51% (%2 = 0 35, р>0 05) Следовательно, на основании имеющихся экспериментальных данных можно с высокой вероятностью утверждать, что аномально высокая предрасположенность к каталепсии, наблюдаемая у мышей линии СВА, контролируется одним аутосомным геном, рецессивные аллели которого (высокая предрасположенность) присутствуют у животных линии СВА

Таблица 9 Проверка гипотезы о моногенном наследовании каталепсии у мышей по данным гибридологического анализа

Параметр СВА й СВАхй/К СВАхИ/В

Генотипы с/с с/с с/+ +А- с/с с/с с/+

Частоты генотипов 1 0 25 05 025 1 ДГ г 4.»

Фенотипы К Н К Н К Н К Н

Частоты фенотипов Эмпирические 15 1-7Г 12 тя/4 17 1-^/4 89 W 17 21 {1-ЧГуСК 12 е-чг 29

численности

Ожидаемые 15 12 14 92 21 17 10 31

численности_

0 54, X2 =2 9, (й-= 3, р>0 05 Условные обозначения с -аллель каталепсии, + - аллель нормального поведения, V/ - пенетрантность, К - каталещ-ики, Н - некаталептшси

На следующем этапе исследования мы картировали главный ген, регулирующий предрасположенность к каталепсии, с помощью набора полиморфных микросателлитных маркеров Поскольку информации о размерах микросателлитных маркеров у линии СВА не имелось в существующих базах данных, на первом этапе исследования был проведен поиск маркеров, различающихся по размеру у мышей СВА и АК11 Для этого ДНК мышей этих линий была генотипирована с 256 парами праймеров, покрывающих все 19 аутосом мыши, и бьшо выявлено 93 (37%) полиморфных маркеров Для картирования гена каталепсии, из этих 93 полиморфных маркеров было выбрано 65 равномерно покрывающих 19 аутосом (Рис 11) Дачее 77 бэккроссов ВС(СВх(СВхАК)), проявляющих каталепсию, были генотипированы с этими 65 полиморфными маркерами

Согласно моногенной гипотезе, сформулированной выше, каталепсия будет проявляться только у бэккроссов гомозиготных по аллелю каталепсии, полученному от СВА При тесном сцеплении между геном каталепсии и полиморфным микросателлитным маркером среди бэккроссов-каталептиков число животных, гомозиготных по СВА-аллелю маркера, будет достоверно превышать число гетерозиготных по этому маркеру особей Равенство частот гомо- и гетерозигот по маркеру у бэккроссов-каталептиков будет свидетельствовать об отсутствии сцепления В качестве меры превышения числа гомозигот над числом гетерозигот был выбран стандартный тест %2 с одной степенью свободы Критическое значение х2 при уровне значимости, равном 0 05, для проверки гипотезы о сцеплении, скорректированное на число маркеров (равное 65) бьио 11 3 (Куликов и др, 2003, Куликов, Баловкина, 2003)

Оказалось, что нулевая гипотеза об отсутствии сцепления строго отвергается только для одного маркера Э13МЦ78 (х2 =17 8, р<0 001), локализованного в теломерном фрагменте (75 сМ) хромосомы 13 (Рис 12) Действительно, из 77 исследованных бэккроссов-каталептиков 57 особей (74%) несли оба аллеля этого маркера, полученные от СВА Близкое к критическому значению %2 (10 92, р<0 058) было получено для маркера 013М1176, расположенного на расстоянии 61 сМ на хромосоме 13 Для других маркеров, локализованных проксимальнее на хромосоме 13 или на других 18 аутосомах, значения х2 были ниже критического (не более 5 0)

ti f2

♦5 *6 *? »8

til

12 *13 «14 fl5

16 flS f 19 -feM

■3D 40 60

"t80 -i-ICO

Рис.11. Локализация 65 полиморфных микросателлитных маркеров, выбранных для картирования главного гена, контролирующего предрасположенность к каталепсии, при скрещивании мышей линий СВА и AKR.

аиГ 1816 н

12" ю-8 -G -4 -2 -О

D13MH78 **

■■''I ' д

Jjll

Т-—I ' * * f i' "i ' Г i'" Г Г—Г "i '1—I" i" I' |"|'"Г'1

1 2 3 4 5 6 7 8 Э 1011121314 1516171819

ХРОМОСОМЫ

Рис. 12. Значения критерия х2 для проверки сцепления предрасположенности к каталепсии с полиморфными мнкросателлитными маркерами у бэккроссов между линиями СВА и АКР!, проявляющих каталепсию. Номера и относительные размеры хромосом отложены по оси абсцисс. **р<0.01

Полученные данные позволяют выявить и однозначно локализовать в теломерном фрагменте хромосомы 13 главный ген, ответственный за различия по выраженности в предрасположенности к каталепсии между СВА и AKR. Наличие значительного числа особей, гетерозиготных по маркеру D13Mit78, сцепленому с геном каталепсии (20 из 77), и, тем не менее, проявляющих выраженную каталепсию, свидетельствует о том, что имеются и другие гены, вовлеченные в детерминацию каталепсии, которые и определяют оставшуюся вариабельность признака.

Не было обнаружено сцепления предрасположенности к каталепсии с маркером D9Mitl29, локализованным на растоянии 2 сМ от гена D2 рецептора дофамина. Следовательно, генетико-молекулярный механизм регуляции естественной оборонительной реакции, какой является щипковая каталепсия, отличается от механизма, определяющего чувствительность к каталептогену галоперидолу, тесно сцепленную с геном D2 рецептора (Kanes et al., 1996; Patel, Hitzemann, 1999).

Не выявлено сцепления предрасположенности к каталепсии с маркером D10MitlQ3, локализованным на хромосоме 10, на расстоянии 8 сМ от гена tph2. Следовательно, маловероятно, что наблюдаемая высокая склонность к реакции каталептического замирания у мышей СВА вызвана мутацией в гене Iph2.

Несмотря на то, что исследования, проведенные на мышах, не обнаружили сцепления предрасположенности к каталепсии с геном tph2, определяющим активность ТПГ в головном мозге, участие фермента в детерминации наследственно обусловленной изменчивости в предрасположенности к каталепсии исключить нельзя.

Удобной моделью для изучения ассоциации между активностью фермента и наследственной каталепсией являются крысы линии ГК, селекционированные из популяции крыс Вистар на высокую выраженность каталепсии. Не было обнаружено различий в активности фермента в среднем мозге и гиппокампе у крыс линии Вистар и животных линии ГК с наследственно обусловленной высокой предрасположенностью к каталепсии (Рис.13). В то же время, активность ТПГ была достоверно выше в стриатуме крыс ГК (13.6 ± 0.7 пмолей/мг/мин, Fyg = 6.1, р<0.05) по сравнению с Вистар (11.2 ± 0.7 пмолей/мг/мин).

Измерение кинетических характеристик ТПГ из мозга крыс ГК и Вистар показало, что наблюдаемое увеличение активности фермента в стриатуме крыс ГК обусловлено снижением величины константы Михаэлиса (Км) и увеличением сродства фермента к субстрату, а не увеличением его удельной активности (Vraax) (F1 = 4.5, р<0.05, Табл. 10).

Такое увеличение сродства фермента к субстрату без изменения его максимальной активности позволяет предполагать, что оно обусловлено обратимым фосфорилированием ТПГ в стриатуме ГК. Преинкубация фермента из стриатума ГК с щелочной фосфатазой вызывает снижение его активности с 8.5 ± 1.0 до 4.9 ± 0.5 пикомоль/мг/мин (tg = 4.5, р<0.01, Рис.14А). Активность ТПГ в стриатуме ГК после дефосфорилирования становится близкой к нативной активности фермента в этой структуре у крыс Вистар (5.8 ± 0.5 пмоль/мг/мин, Fj.ig = 3.2, р>0.05). В то же время, щелочная фосфатаза не влияет на активность фермента в стриатуме крыс Вистар (t? = 1.3, р>0.05, Рис.14А). Выявлено значительное межлинейное различие в действии щелочной фосфатазы на активность ТПГ в стриатуме ГК и Вистар (Fj,i8 = 9.0, р>0.01).

СТРИАТУМ СРЕДНИМ мозг гиппокдмп

Рис. 13. Активность ТПГ в структурах мозга крыс Вистар (белые столбики) и ГК (черные столбики). *р<0Л5 по сравнению с Вистар.

Таблица 10 Значения и К»,ТПГ из стриатума и среднего мозга 1фыс ГК и Вистар

Генотип Стриатум Средний мозг

V,», Км У^.» Км

Вистар 1851 14 0 18 ±0 03 146 7 ± 7 0 0 28 ± 0 03

ПС 157 + 07 0 10 + 001* 137 5 ±74 0 36 ±0 03

Р<0 05 по сравнению с Вистар

Активность ТПГ из стриатума крыс ГК и Вистар при фосфорилирующих условиях увеличивается до одного и того же уровня (14 6 + 14 пмоль/мг/мин у ГК и 14 6 ±10 пмоль/мг/мин у Вистар), но это увеличение более выражено у Вистар, чем у ГК (?\,\г = 4 5, р<0 05) В то же время, активность фермента из среднего мозга крыс ГК и Вистар увеличивается до одного и того же уровня при фосфорилировании и снижается до близких значений при дефосфорилировании (Рис 14Б) Полученный результат является экспериментальным доказательством ключевой роли обратимого фосфорилирования фермента в механизме наследственно детерминированного увеличения активности ТПГ в стриатуме крыс ГК по сравнению с Вистар

Другим экспериментальным доказательством связи активности ТПГ с выраженностью каталепсии у крыс является угнетающее влияние необратимого ингибитора ТПГ п-хлорфенилаланина на проявление каталепсии у крыс ГК Препарат вводили в/б в физиологическом растворе в дозе 300 мг/кг Контрольной группе крыс вводили физиологический раствор Длительность каталептического замирания измеряли через 72 часа после введения, затем животных декапитировали и активность фермента определяли в стриатуме и среднем мозге. Однократное введение п-хлорфенилаланина вызывает шестикратное уменьшение времени замирания у крыс ГК по сравнению с животными этой линии, которым ввели физиологический раствор (Т^! = 90 3, р<0 001, Рис 15) п-Хлорфенилаланин вызывал значительное снижение активности фермента в стриатуме ^,21 = 141.6, р<0.001) и среднем мозге (Рщ = 44.9, р<0 001, Рис 15)

3 "

X о

£ •»

гь:

си.

Рис.14. Изменения в активности ТПГ из стриатума (А) и среднего мозга (Б) крыс Вистар (белые столбики) и ГК (черные столбики) после фосфортировоиия и дефосфорияировамм. *р<0.05. "р<0.01 по сравнению с Вистар.

е ш

|ио м и

100 I-«

етриАГУМ

СРЕДНИЙ МОЗГ

Рис. 15. Влияние однократного введения п-хлорфенилалаиина (300 мг/кг, в/б) на время каталептического замирания и активность ТПГ в мозге крыс ПС Светлые столбики • контроль, черные ■ п»хлорфенилаланин. *"р<0.001 по сравнению с контролем.

Положительная ассоциация наблюдается между предрасположенностью к каталепсии и активностью ТПГ в стриатуме мышей инбредных линий (Рис.16). Самая высокая активность фермента в этой структуре мозга была выявлена у мышей каталептической линии СВА. При этом активность фермента в стриатуме мышей СБА существенно выше, чем у животных любой из остальных пяти некаталептических линий (Рис.16). Не обнаружена ассоциация предрасположенности к каталепсии с С14730 полиморфизмом в гене Действительно, из пяти некаталептических линий три были гомозиготны по 1473С аллелю (АКЯ, С57В1У6, 00), а две - по 14730 аллелю (СС57ВЯ, ВАЬВ/с). Это подтверждает обнаруженное нами отсутствие сцепления между каталепсией и геном 1рН2 в гибридологическом анализе.

Данные по влиянию социального статуса в модели сенсорного контакта на активность ТПГ в стриатуме подтверждают ассоциацию предрасположенности к щипковой каталепсии с высокой активностью фермента в стриатуме (Рис.17). Закрепление у самцов СВА агрессивного типа поведения сопровождается достоверным снижением активности фермента б стриатуме по сравнению с контролем (17.8 ± 0.9 ^ пмоль/мг/мин у контроля и 12.8 ± 1.8 пмоль/мг/мин у агрессивных, Р^в = 7.5, р<0.05,

, Рис.17А). В то же время, активность ТПГ в стриатуме не различалась у контрольных

животных и мышей с закрепленным субмиссивным типом поведения (16.8 ± 2.0 пмоль/мг/мин, р11)8 = 0.3, р>0.05, Рис.17А). Не было обнаружено влияния социального "ц статуса на активность фермента в среднем мозге самцов СВА (Рис.17Б). Как было

показано выше, выработка субмиссивного типа поведения не влияла на предрасположенность к каталепсии, тогда как закрепление агрессивного типа поведения полиостью подавляло каталепсию у самцов СВА. Сопоставляя данные по влиянию социального статуса на активность ТПГ в мозге и на каталепсию у мышей линии СВА, можно сделать вывод о том, что для проявления каталепсии у мышей необходима высокая активность ТПГ в стриатуме.

I )

)

1 (

«i

0 л

X § а Е

? о

Е *

1 i

* * i

***

*** ***

СВА

AKR

DD C57BL CC57Br BAL В/с

Рис.16. Активность ТПГ в стриатуме у мышей 6 инбредных линий. "р<0.01, "*р<0.001 по сравнению с СВА.

Следующим доказательством положительной связи активности ТГ1Г в стриагуме с выраженностью каталепсии у мышей служит эксперимент по изучению действия на эти показатели другого ингибитора ТПГ, п-хлорметамфетамина Через гри часа послс введения препарата в дозе 15 мг/кг 32 самцам СВА, проявляющим выраженную каталепсию, наблюдается полное подавление каталепсии (t3i = 111, р<0.001, Рис 18) Введение физиологического раствора не влияло на выраженность каталепсии у 15 самцов СВА (t¡4 = 0.31, р>0.05). Это подавление каталепсии сопровождается достоверньм снижением активности фермента в стриатуме (Fijo = 5.3, р<0.05, Рис.18)

Таким образом, выявлена функциональная связь между повышенной активностью ТПГ локально в стриатуме и выраженностью естественной каталепсии у мышей и крыс Действительно, селекция крыс на выраженность каталепсии сопровождается увеличением активности фермента в стриатуме У мышей наибольшая активность 1Ш выявлена в стриатуме единственной каталептической линии СВА. Наконец, воздействия, снижающие активность фермента (введение ингибиторов ТПГ, выработка агрессивного поведения у мышей) оказывают выраженный антикаталептический эффект у мышей и крыс.

Установлено, что наследственно детерминированное локальное повышение активности ТПГ в стриатуме у мышей и крыс является регуляторным и обусловлено действием генов-модификаторов. Возникает закономерный вопрос о природе генов-модификаторов, регулирующих активность ТПГ в стриатуме. В области возможной локализации гена, определяющего склонность к каталепсии у мышей, расположен ген, кодирующий 5-H1ia рецептор (58 сМ). Следовательно, ген 5-HTiA рецептора может рассматриваться как вероятный кандидат на роль гена, регулирующего активность ТПГ Действительно, рецепторы этого типа являются ауторецепторами и регулируют спайковую активность серотонинового нейрона. Имеются экспериментальные доказательства важной роли рецепторов этого типа в регуляции наследственной каталепсии у крыс (Kulikov et al, 1994) и мышей (Попова и др , 1994). Наследственную регуляцию естественной каталепсии можно представить следующей схемой- изменения в гене 5-HTia рецептора вызывают локальное увеличение активности ТПГ в стриатуме, которое, в свою очередь, ведет к усилению передачи в серотониновых синапсах в этой структуре, что облегчает развитие реакции замирания.

млгая спмиссипмс яггассмшш

Рис.17. Активность ТПГ в стриатуме (А) и сред нем мозге (Б) у самцов СВА с закрепленным субмиссивиым и агрессивным типами поведения в социальном контакте. Контроль-животные, содержащиеся в изоляции.

■р«0.01 по сравнению с контролем.

д18

КОНТРОЛЬ

»ХМА

Рис. 18. Влияние п-хлорметамфетамина (п-ХМА, 15 ur/кт, в/б) на время замирания и активность ТПГ в стрватуие у самцов СВА Контролю вводили физиологический раствор.

*р<0.05. *"р<0.001 по сравнению с контролем.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Одной из важнейших проблем современной генетики поведения, нейрогенетики и нейробиологии является выявление молекулярной цепи декодирования информации, записанной в ДНК, в сложный поведенческий признак. Учитывая ключевую роль медиатора головного мозга серотонина в регуляции многих форм поведения, особое внимание исследователей привлекает связь полиморфизма в гене 1рИ2, кодирующем ключевой фермент биосинтеза серотонина триптофангидроксилазу, с проявлением наследственно детерминированных особенностей поведения и психики. В последние два года за рубежом проводятся интенсивные исследования по выявлению генетической ассоциации между полиморфизмом в гене 1рИ2 и риском депрессивных психозов и суицида у человека. Однако связь полиморфных вариантов в гене ¡рк2, используемых в исследованиях этих авторов, с активностью фермента в мозге остается не выясненной, что затрудняет понимание и интерпретацию полученных результатов.

В работе использован принципиально иной, а именно функциональный подход, к решению данной задачи. Сущность этого подхода заключается в изучении генетико-молекулярных механизмов регуляции активности ТПГ в мозге и в выявлении ассоциации наследственного полиморфизма по активности фермента с выраженностью Л генетически детерминированных особенностей проявления защитного поведения.

Существенным вкладом нашего исследования в нейрогенетику является детальное изучение молекулярного механизма регуляции наследственного разнообразия по активности lili в мозге Впервые установлено существование двух основных типов наследственной изменчивости активности Till в мозге, названных нами конститутивной и регуляторной. Основным различием этих типов изменчивости является то, что конститутивная обусловлена мутацией самого гена tph2, тогда как регуляторная связана с активностью ряда генов-модификаторов Мы выявили ключевую роль C1473G полиморфизма в 11-ом экзоне гена tph2 в детерминации активности фермента в мозге мышей В настоящее время C1473G полиморфизм остается единственным известны.« примером конститутивной изменчивости активности Till в мозге

Регуляторный тип изменчивости активности 1111 в мозге встречается чаще и был нами обнаружен у представителей трех видов млекопитающих - мышей, крыс и серебристо-черных лисиц Регуляторная изменчивость может включать различные молекулярные механизмы, наиболее изученным из которых является обратимое фосфорилирование молекул ТПГ Показан существенный вклад обратимого фосфорилирования в определение наследственной изменчивости активности ТПГ в мозге мышей и крыс На основании полученных результатов было высказано предположение о роли фосфорилирования в регуляции активности ТПГ в мозге серебристо-черных лисиц Проведенные эксперименты на мышах показали отсутствие сцепления между конститутивной и регуляторной изменчивостью активности ТПГ в мозге Это служит доказательством, что регуляторная изменчивость обусловлена действием генов-модификаторов

Фундаментальным вкладом проведенного исследования в генетику поведения и нейрогенетику является экспериментальное доказательство ассоциации наследственного полиморфизма по активности ТПГ в мозге с генетически детерминированными особенностями основных типов защитного поведения, а именно защита территории (и социального статуса), вызванная страхом агрессия, реакция активного избегания и реакция замирания Эти формы защитного поведения входят в комплект поведенческих адаптаций абсолютно необходимых для выживания в естественных условиях и, следовательно, являются продуктом длительной эволюции.

Выявлен единственный случай ассоциации конститутивной изменчивости с поведением - снижение интенсивности драк у самцов мышей гомозиготных по 1473G аллелю по сравнению с животными гомозиготными по 1473С Эта ассоциация соответствует литературным данным о положительной связи активности 1111 с интенсивностью драк (Welch, Welch, 1968, Benkert et al, 1973, Malick, Barnett, 1976, Popova et al, 2001), а также о колокализации гена tph2 и гена Aggrl, регулирующего агрессивное поведение мышей (Brodkm et al, 2002), в дистальном фрагменте хромосомы 10 мыши

Во всех остальных исследованных случаях выявлена ассоциация наследственно детерминированной изменчивости защитного поведения с регуляторной изменчивостью активности 1111 в мозге.

Селекция серебристо-черных лисиц и серых крыс-пасюков на отсутствие агрессии на человека сопровождается гомологичным увеличением активности 1111 локально в среднем мозге Наиболее вероятным механизмом этого увеличения активности является усиление фосфорилирования фермента, которое, по-видимому, контролируется генами, не сцепленными с tph2. Можно предположить, что в ходе селекции на ручной тип поведения происходит накопление аллелей, усиливающих фосфорилирование фермента в среднем мозге, приводящее к подавлению агрессивной реакции на человека Ассоциация агрессии на человека со сниженной активностью 1111 является генетическим доказательством того, что этот тип защитного поведения контролируются другими молекулярными механизмами, чем межсамцовая агрессия, ассоциированная с высокой активностью фермента Серотонин мозга и ключевой

фермент его биосинтеза, ТПГ, играют существенную роль в детерминации наследственных различий по выраженности этих форм поведения, но действуют они в противоположных направлениях Более того, в регуляции межсамцовой агрессии мышей значительную роль играет ген tph2, тогда как различия в агрессии на человека у мышей обусловлены изменениями в генах-модификаторах.

Выявлена положительная связь активности ТПГ в мозге с выраженностью реакции активного избегания у крыс. Направленная селекция на слабую выраженность реакции избегания приводит к наследственно обусловленному снижению активности ТПГ в среднем мозге. Активность ТПГ значительно меньше в мозге крыс линий SHR с низкой выраженностью реакции активного избегания по сравнению с активностью фермента у животных Lewis с высокой выраженностью реакциии избегания.

Реакция каталептического замирания является еще одним видом поведения, ассоциированным с генетически детерминированным уровнем активности ТПГ в мозге. Реакция замирания является одной из форм пассивного оборонительного поведения. Не смотря на то что, внешне каталепсия проявляется как отсутствие какой-либо оборонительной реакции - агрессии или избегания, сама неподвижность является активной (Klemm, 1990). Нами предложена схема регуляции естественной (природной) реакции замирания, включающая два нейробиологических механизма: 1) запуск реакции замирания, контролируемый серотонином, и 2) регуляцию мышечного тонуса, осуществляемую дофаминовой и серотониновой системами. Одним из достижений проведенного нами исследования является установление ключевой роли серотониновой системы мозга в механизме запуска реакции замирания. Предрасположенность к естественной каталепсии у крыс и мышей связана с регуляторным локальным увеличением активности ТПГ в стриатуме.

Существует еще одна естественная адаптация довольно близкая к каталепсии -зимняя спячка млекопитающих (гибернация). Некоторые животные (суслики, бурундуки, хомяки, сурки, медведи) с наступлением холодов впадают в оцепенение, температура их тела снижается и энергетические затраты резко снижаются. Эта адаптация позволяет животным выжить в период бескормицы. Н.К. Поповой с соавторами (1978) впервые была показана ключевая роль серотонина мозга в механизме зимней спячки сусликов. При засыпании еще у нормотермных животных наблюдается резкое увеличение активности ТПГ в гиппокампе, стриатуме и среднем мозге. Эта повышенная активность фермента сохраняется у гибернирующих животных. При пробуждении наблюдается постепенное снижение активности фермента в среднем мозге (Popova et al., 1993).

Таким образом, приведенные в работе данные демонстрируют, что связь активности ТПГ с выраженностью основных типов защитного поведения присуща многим видам млекопитающим и сложилась в результате эволюции защитного поведения. В основе формирования защитной реакции лежит закрепление определенного типа функционирования серотониновой системы мозга. Это положение является экспериментальным подтверждением и развитием гипотезы Н.К. Поповой о том, что в основе отбора на выраженность агрессивного поведения лежит отбор на определенный тип функционирования медиаторных систем мозга (Попова и др , 1980).

Центральным звеном в процессе формирования оборонительного поведения является система генов, контролирующих активность ключевого фермента биосинтеза серотонина - ТПГ. Это не кажется удивительным, если учесть роль фермента в процессе синтеза серотонина. При этом формирование различных типов защитного поведения сопровождается направленными изменениями конститутивных и/или регуляторных характеристик фермента. Более того, можно с большой вероятностью предположить, что в ходе естественной эволюции оборонительного поведения шел скрытый отбор генов и аллелей, регулирующих активность ТПГ.

В конце 2004 года - начале 2005 года появился ряд статей об ассоциации мутаций в гене tph2 с риском депрессивных психозов (Breidenthal et al, 2004; De Luca et al., 2004; Harvey et al, 2003, 2004, Zill et al, 2004; Zhang et al, 2005) Представленные в работе данные демонстрируют, что связь ТПГ и аффективными психозами может быть значительно сложнее. Полагают, что животные с генетически измененной реакцией активного избегания (Driscoll, 1992; Жуков, 1997) или замирания (Колпаков и др , 2004) могут быть использованы для изучения генетико-молекулярных механизмов аффективных психозов. Выявление ассоциации между нарушением реакций избегания и замирания и регуляторной изменчивостью активности ТПГ в мозге, позволяет сделать пракшчески важный вывод о необходимости более глубокое изучение генетического механизма регуляторной изменчивости активности ТПГ для поиска генов, определяющих наследственную предрасположенность к депрессии.

ВЫВОДЫ

1 Выявлены два основных генетико-молекулярных механизма, регулирующие изменчивость активности триптофангидроксилазы в мозге' 1) C1473G полиморфизм в 11 -ом экзоне гена tph2 - замена нуклеотида С на G в этом сайте приводит к значительному снижению активности фермента и 2) различия в механизме обратимого фосфорилировании молекул фермента.

2. Наследственный полиморфизм по выраженности основных видов защитного поведения (защиты территории, вызванной страхом агрессии, реакции активного избегания и реакции замирания) тесно ассоциирован с активностью ТПГ в головном мозге у животных разных видов.

3 Изменчивость порога (уровня, предрасположенности) и интенсивности (числа драк) межеамцовой агрессии мышей в значительной степени определяется генетическими факторами. Однако эти два показателя межеамцовой агрессии контролируются разными генетическими механизмами. В то время как доминирует низкий порог агрессивной реакции, интенсивность драк имеет промежуточный тип наследования Обнаружена ассоциация числа драк между самцами мышей с полиморфизмом C1473G в гене lph2. Не обнаружено связи между C1473G полиморфизмом и генетически детеримнированной выраженностью порога межеамцовой агрессии.

4. Селекция серебристо-черных лисиц и серых крыс-пасюков на отсутствие агрессии на человека (доместикация) приводит к сходпому увеличению активности ТПГ в среднем мозге.

5. Наследсхвенно детерминированное отсутствие реакции активного избегания у крыс линии RLA ассоциировано со сниженной активпостью ТПГ в среднем мозге по сравнению с животными линии RHA с нормальпой реакцией активного избегания.

6. Изменчивость выраженности реакции замирания (каталепсии) у мышей в значительной степени определяется генетическими факторами. Высокая предрасположенность к реакции замирания у мышей линии СВА контролируется в основном одним аутосомным рецессивным локусом С помощью набора полиморфных микросателлитных маркеров главный ген, кодирующий высокую предрасположенность к каталепсии, локализован в дистальном фрагменте хромосомы 13.

7. Высокая выраженность наследственной каталепсии у мышей каталептической линии СВА и крыс линии ГК, селекционированной на каталепсию, сопровождается локальным увеличением активности ТПГ в стриатуме. У мышей линии СВА это увеличение не сцеплено с геном tph2. У крыс линии 1К увеличение активности ТПГ в стриатуме обусловлено обратимым фосфорилированием молекул фермента в этой структуре.

ПУБЛИКАЦИИ АВТОРА ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Куликов А.В., Попова Н.К. Изучение генетического контроля "спонтанной" агрессивности мышей // Генетика, 1980. Т.16, С.526-531.

2. Куликов А.В., Макаренко B.C. Полуавтоматическое измерение интенсивности агрессивного поведения у мышей // Журн. Высш. Нервн. Деят., 1980. Т.30.

С.868-870.

3. Куликов А.В. Изучение закономерностей наследования интенсивности "спонтанной" агрессивности мышей // Изв. СО РАН, Сер. Биол.Наук, 1980. Вып.З. С.69-73.

4. Kulikov A.V , Popova N.K. Aggressiveness in mice // Soviet Genet., 1980. V. 16. P.339-343.

5. Куликов А.В. Быстрый неизотопный метод определения активности триптофангидроксилазы в головном мозге //Вопр. Мед. Химии., 1982. Т.28. Вып.1. С.135-138.

6. Гинсбург Э.Х., Куликов А.В. Проверка моногенных гипотез в гибридологическом анализе количественных признаков // Генетика, 1983. Т.19. С.571-576.

7. Куликов А.В., Попова Н.К. Генетический контроль активности триптофангидроксилазы в головном мозге мышей // Генетика, 1983. Т.19. С.784-788.

8. Попова Н.К., Куликов А.В Корреляция агрессивности поведения и активности триптофангидроксилазы // Журн. Высш. Нервн. деят., 1983. Т.ЗЗ. С.589-591.

9. Куликов А.В., Попова Н.К. Активность триптофангидроксилазы в головном мозгу мышей // Нейрохимия, 1983. Т.2. С.421-425.

10. Popova N., Kulikov A, Nikulina Е., Kudryavtzeva N. Genetico-physiological and neurochemical bases of complex forms of behavior // Mouse News Lett., 1983, V.69. P.41.

И. Попова H.K., Кудрявцева H.H., Куликов А.В. Наследование уровня серотонина у мышей первого поколения при скрещивании разных инбредных линий // Генетика, 1984. Т.20. С.233-238.

12. Корякина Л. А., Куликов А.В., Фигурнова М.Ю., Попова Н.К. Действие холода на серотониновую систему мозга и уровень кортикостероидов в крови мышей различных линий // Физиол. Журн. СССР, 1985. Т.71. С.422-427.

13. Куликов А.В., Корякина Л.А., Попова Н.К. Взаимодействие генетической и средовой компонент в детерминации активности триптофангидроксилазы в мозге мышей при стрессе // Генетика, 1985. Т.21. С.1680-1684.

14. Попова Н.К., Куликов А.В , Колпаков В.Г., Барыкина Н.Н., Алехина Т.А. Изменения в серотониновой системе мозга крыс, генетически предрасположенных к каталепсии // Журн. Высш. Нервн. Деят., 1985. Т.35. С.742-746.

15. Kolpakov V., Kulikov A., BarykinaN., AlekhinaT., Popova N. Catalepsy and increased tryptophan hydroxylase activity in rat striatum // Biogenic Amines, 1985. V.2. P.131-136.

16. Popova N., Kulikov A. Genetic analysis of "spontaneous" intermale aggression in mice //Aggressive Behav., 1986. V.12. P.425-431.

17. Popova N.K. Kulikov A.V. Genetic analysis of spontaneous aggression in mice // J.Genetic abstracts, 1987. V.19, P.87-92.

18.

19.

20.

21.

22.

23.

24,

26.

27.

28.

29.

30.

31.

32.

33.

34.

Kolpakov V., Gilinsky M., Alekhina Т., Barykina N., Nikulina E., Voitenko N., Kulikov A., Shtilman N. Experimental studies on genetically determined predisposition to catatonia in rats as a model of schizophrenia // Behav. Processes, 1987. V.14, P.319-341.

Куликов A.B., Воронова Э.М., Жанаева Е.Ю. Чувствительный флюориметрический метод определения активности триптофангидроксилазы в структурах мозга//Вопр. Мед. Химии., 1988. Т.34. Вып.2. С. 120-123. Куликов А.В., Козлачкова Е.Ю. Закономерности наследования каталепсии у мышей. Ш-я школа-семинар по генетике и селекции животных // Изв. СО АН СССР, Сер. Биол. Наук, 1989. Вып.2. С.21.

Попова Н.К., Куликов А.В. Нейрохимический подход к генетики поведения // Изв. СО АН СССР, Сер. Биол. Наук., 1989. Вып.2. С.24. Куликов А.В., Жанаева Е.Ю , Попова Н.К. Изменения активности триптофангидроксилазы в мозге серебристо-черных лисиц и серых крыс-пасюков в ходе селекции по поведенияю //Генетика, 1989. Т.25. С.346-350. Куликов А.В., Козлачкова Е.Ю., Попова Н.К. Генетический контроль каталепсии у мышей // Генетика, 1989. Т.25. С.1402-1408. Куликов А.В., Кудрявцева Н.Н., Козлачкова Е.Ю., Попова Н.К. Связь между активностью триптофангидроксилазы в головном мозге и проявлением каталепсии у мышей // Бюлл. Эксп. Биол. Мед., 1989, Т.108. № 9. С.269-271. Popova N., Kulikov A., Nikulina Е., Kozlachkova Е., Maslova G. Serotonin metabolism and serotonergic receptors in Norway rats selected for low aggressiveness to man // Aggressive Behav., 1991. V. 17. P.207-213.

Popova N., Voitenko N., Kulikov A., Avgustinovich D. Evidence for the involvement of central serotonin in mechanism of domestication of silver foxes // Pharmacol. Biochem. Behav., 1991. V.40. P.751-756.

Куликов A.B., Попова Н.К. Формы агрессивного поведения и их генетическая детерминация // В.кн.: Успехи современной генетики / Дубинин Н.(ред.). М.гНаука, 1991. Вып.17. С.131-151.

Kulikov A., Kozlachkova Е., Popova N. The activity of tryptophan hydroxylase in brain of hereditary predisposed to catalepsy rats // Pharmacol. Biochem. Behav., 1992. V. 43. P.999-1003.

Popova N, Nikulina E, Kulikov A. Genetic analysis of different kinds of aggressive behavior // Behav. Genetics, 1993. V.23. P.491-497.

Kulikov A, Kozlachkova E, Maslova G, Popova N. Inheritance of predisposition to

catalepsy in mice // Behav. Genetics, 1993. V. 23. P.379-384.

Popova N, Voronova I, Kulikov A. The involvement of brain tryptophan hydroxylase

into the mechanism of hibernation // Pharmacol. Biochem. Behav, 1993. V.46. P.9-

13.

Kulikov A, Kolpakov V, Maslova G, Kozintsev I, Popova N. Effect of selective 5-HT1A agonists and 5-HT2 antagonists on inherited catalepsy in rats // Psychopharmacology, 1994. V.114. P.172-174.

Kulikov A, Karmanova I, Kozlachkova E, Voronova I, Popova N. The brain tryptophan hydroxylase activity in the sleep-like states in frog. // Pharmacol. Biochem. Behav., 1994. V.49. P.277-279.

Попова H.K., Войтенко H.H., Куликов A.B., Никулина Э.М., Вишнивецкая Г.Б., Трапезов О.В. Влияние плейотропного действия однолокусной (рр) и двулокусной (аарр) мутаций генов окраски норок на метаболизм серотонина в мозге//Генетика, 1994. Т.ЗО. С.1513-1516.

35.

36.

37.

38.

39.

40.

41.

42.

43,

44.

45.

46.

47.

48.

49.

Попова Н.К., Куликов А.В., Августинович Д.Ф., Вишнивецкая Г.Б., Колпаков В.Г. Участие 5-НТ1А серотониновых рецепторов головного мозга в регуляции наследственной каталепсии // Бюлл. Эксп. Биол. Мед., 1994. Т.118. № 12. С.633-635.

Kulikov A, Kozlachkova Е, Kudryavtseva N, Popova N. Correlation between tryptophan hydroxylase activity in the brain and predisposition to pinch-induced catalepsy in mice // Pharmacol. Biochem. Behav., 1995. V.50. P.431-435. Popova N, Kulikov A. On the role of brain serotonin in expression of genetic predisposition to catalepsy in animal models // Am. J. Med. Genetics (Neuropsychiatric Genetics), 1995. V.60. P.214-220.

Kulikov A, Castanon N, Mormede P, ChaoulofT F. Central tryptophan hydroxylase activity, and 5-HT1A receptor, 5-HT2A receptor, and 5-HT transporter binding in grouped and isolated Roman RHA and RLA rats: relationships with behaviours in two models of anxiety // Psychopharmacology, 1995. V.121. P.385-395. Chaouloff F, Kulikov A, Sarrieau A., Castanon N, Mormede P. Male Fisher 344 and Lewis rats display differences in locomotor reactivity, but not in anxiety-related behaviours: relationship with the hippocampal serotonergic system // Brain Res.,

1995. V.693. P.169-178.

Куликов A.B., Воронова И.П. Роль обратимого фосфорилирования в генетически детерминированном полиморфизме по активности триптофангидроксилазы мозга // Бюлл. Эксп. Биол. Мед., 1995. Т.119. № 1. С.67-68. Kulikov A, Popova N. Association between intermale aggression and genetically defined tryptophan hydroxylase activity in the mouse brain // Aggressive Behav.,

1996. V. 22. P.lll-117.

Попова H.K., Куликов A.B., Августинович Д.Ф., Шиганцов С.Н., Особенности серотониновой системы мозга и тревожность у мышей линий C57BL и СВА // Журн. Высш. Нервн. Деят., 1996. Т.46. С.348-354.

Попова Н.К., Августинович Д.Ф., Шиганцов С.Н., Куликов А.В. Распределение серотониновых 5-НТ1А рецепторов в мозге крыс, генетически предрасположенных к развитию каталепсии //Журн. Высш. Нервн. Деят., 1996. Т.46. С.578-582.

Попова Н.К., Куликов А.В., Августинович Д.Ф., Барыкина Н.Н. Участие серотонергической системы в экспрессии генетической предрасположенности к каталепсии у крыс и мышей // Росс.Физиол. Журн., 1997. Т.83. С. 66-72. Попова Н.К., Куликов А.В., Августинович, Войтенко Н.Н., Трут JI.H. Влияние доместикации серебристо-черных лисиц на основные ферменты метаболизма серотонина и серотониновые рецепторы // Генетика, 1997. Т.ЗЗ. С. 370 - 374. Kulikov A., Aguerre S., Berton О., Ramos A., Mormede P. Chaouloff F. Central serotonin synthesis and pre- and postsynaptic 5-HT receptors in the SHR and Lewis rat strains that differ in the elevate plus-maze test of anxiety // J. Pharmacol. Exp. Ther., 1997. V.281. P.775-784.

Popova NX, Voitenko N.N., Kulikov A.V., Nikulina E.M., Trapezov O.V. The pleiotropic action of the one-locus pp and two-loci aapp coat color genes on the metabolism of brain neurotransmitters in mink (Mustela viiort). // Scientific, 1998. V.22. P. 211-217.

Popova N.K., Voitenko N.N., Kulikov A.V., Nikulina E.M., Trapezov O.V. The pleurotropic effects of the one-locus pp and two-loci aapp coat color genes on the metabolism of brain neurotransmitters in the mink (Mustella vison). // Reproductive physiology in fur animals: a cuirent research, 2000. P.41-49. Куликов A.B., Базовкина Д.В. Проверка гипотез о сцеплении в гибридологическом анализе альтернативных поведенческих признаков с неполной пенетрантностью // Генетика, 2003. Т.39. С.1066-1072.

50. Куликов А.В., Базовкина Д.В., Муазан М.П., Мормэд П. Картирование гена предрасположенности к каталепсии с помощью полиморфных микросателлитных маркеров //Докл. РАН, 2003. Т.293. С.134-137

51 Куликов А.В Наследственная каталепсия К вопросу о генетико-молекулярпых механизмах каталепсии у мышей // Генетика, 2004. Т.40 С.779-786

52 Колпаков В Г., Куликов А В., Алехина Т.А , Чугуй В.Ф , Петренко О.И , Барыкина H H Кататония или депрессия'' Линия крыс ГК - генетическая животная модель психопатологии//Генетика, 2004 Т40 С. 827-834

53 Куликов А В , Осипова Д В , Науменко В С , Попова H К. Полиморфизм C1473G в гене триптофангидроксилазы и выраженность агрессивного поведения мышей //Докл РАН, 2005. Т.402. С 571-573.

54. Kulikov А V., Osipova D V , Naumenko V S , Popova N К Association between Tph2 gene polymorphism, brain tryptophan hydroxylase activity and aggressiveness in mouse strains // Genes Brain Behav., 2005 (in press)

Подписано к печати 29 июля 2005 г.

Формат бумаги 60 х 90 Печ. л. 2. Уч. изд. л. 1.4.

Тираж 110 экз. Заказ 93.

Ротапринт Института цитологии и генетики СО РАН 630090, Новосибирск, пр. ак. Лаврентьева, 10.

»20546

РЫБ Русский фонд

2006-4 20617

Содержание диссертации, доктора биологических наук, Куликов, Александр Викторович

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ. СЕРОТОНИНОВАЯ СИСТЕМА

МОЗГА И ЗАЩИТНОЕ ПОВЕДЕНИЕ. ГЕНЕТИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ

1.1. Общие представления о серотонииовой системе мозга млекопитающих.

1.2. Триптофангидроксилаза - ключевой фермент биосинтеза серотопина.

Генетическая регуляция активности ТПГ.

1.3. Генетические и молекулярные основы серотониновой регуляции защитного поведения.

1.3.1. Основные подходы к анализу наследования поведения.

1.3.2. Межсамцовая агрессия

1.2.3. Агрессия по отношению к человеку

1.3.4. Реакция активного избегания

1.3.5. Реакция замирания (каталепсия)

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1. Животные.

2.1.1. Условия содержания экспериментальных животных

2.1.2. Гибридологических анализ

2.2. Поведенческие тесты.

2.2.1. Межсамцовая агрессия мышей.

2.2.2. Тестирование животных на выраженность каталепсии.

2.2.3. Тревожность у крыс.

2.3. Определение активности ТПГ в мозге.

2.3.1. Флюориметрическийметод.

2.3.2. Определение активности ТПГ с помощью жидкостной хроматографии высокого давления

2.4. Молекулярнобиологические методы.

2.4.1. Выделение геномной ДНК.

2.4.2. Выявление C1473G полиморфизма в гене tph2 мышей.

2.4.3. ПЦР с полиморфными микросателлитными маркерами.

2.5. Статистическая оценка полученных данных.

2.5.1. Проверка гипотезы о моногеппом наследовании.

2.5.2. Проверка гипотезы о сцеплении альтернативных признаков с неполной пенетрантностъю.

ГЛАВА 3. ГЕНЕТИЧЕСКИЙ КОНТРОЛЬ АКТИВНОСТИ ТПГ В МОЗГЕ МЫШЕЙ.

3.1. Межлинейные различия в активности ТПГ.

3.2. Гибридологический анализ наследования активности ТПГ в мозге.

3.3. Ассоциация С14730 полиморфизма в 11-ом экзоне гена 1рН2 с активностью ТПГ в мозге мышей.

3.4. Роль обратимого фосфорилирования в определении наследственных различий в активности ТПГ в головном мозге мышей.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Триптофангидроксилаза - ключевой фермент биосинтеза серотонина: генетический контроль и ассоциация с наследственной изменчивостью защитного поведения"

Актуальной проблемой генетики поведения, нейрогенетики и нейробиологии является изучение молекулярного механизма развертывания информации, записанной в молекуле ДНК, в сложный поведенческий признак (Гейто, 1969; Бензер, 1975; Попомаренко и др., 1975; Пономаренко, Лопатина, 1981; Ван Абилен, 1981; Фогель, 1981; Vogel, Motulsky, 1982; Полетаева, Романова, 1991; Crabbe, 1999; McCIearn, 1999; Boguski, Jones, 2004). В настоящее время пе вызывает сомнения ключевая роль медиаторов головного мозга в регуляции поведения животных и человека в норме и патологии. Одним из классических медиаторов является серотонин (5-гидрокситриптамип). Серотониновые нейроны лидируют по числу синаптических контактов (Audet et al., 1989; Jacobs, Azmitia, 1992). Кроме того, медиатор действует на 14 различных типов рецепторов, сопряжеппых со всеми основными механизмами внутриклеточной трансдукции сигнала (Saudou, Hen, 1994; Barnes, Sharp, 1999). Эти два фактора определяют удивительную полифупкциопальность серотонина - способность его контролировать большое количество различных процессов в ЦНС и форм поведения (Saudou, Hen, 1994; Попова, Куликов, 2003). С помощью фармакологических методов показано участие серотониновой системы в регуляции агрессивного, полового, пищевого и других форм поведения (обзоры Попова и др., 1978; Jacobs, Azmitia, 1992; Jacobs, Fornal, 1995; Lucki, 1998; Popova, Amstislavskaya, 2002a,b). Интерес к серотониновой системе мозга обусловлен еще и тем, что трансмембрапный транспортер серотонина (Blakely et al., 1994, 1998; Blakely, 2001; Horschitz et al., 2001) и рецепторы 5-HT,A и 5-HT2A типов (Gardner, 1988; Deakin, 1991; Lucki et al., 1994; Stahl, 1994; Blier, de Montigny, 1994; Kunovac, Stahl, 1995; Eison, Mulins, 1996; Barnes, Sharp, 1999; Pineyro, Blier, 1999; Попова, Куликов, 2003) вовлечены в молекулярный механизм действия многих антидепрессантов и анксиолитиков.

Ключевым ферментом биосинтеза серотонина является триптофангидроксилаза (ТПГ), катализирующая гидроксилирование триптофана в 5-гидрокситриптофан, -первую и лимитирующую стадию биосинтеза медиатора (Green, Sayer, 1966; Gal, 1974; Fitzpatrick, 1999).

В 2003 году было показано существование двух изоформ ТПГ - ТПГ-1 и ТПГ-2, которые кодируются генами tphl и tph2 (Walther et al., 2003). Первая изоформа, кодируемая геном tphl, клонированным и секвенированным Grenett et al.(1987), экспрессируется только в периферических тканях, эпифизе и тучных клетках (Walther et al., 2003). В мозге синтез серотонина осуществляется второй изоформой фермента, ТПГ-2 (Walther et al., 2003; Zhang et al., 2004).

Открытый в 2004 году ген tph2 сразу же стал предметом интенсивного изучения. Обнаружено около 25 мутаций гена tph2 человека и показана ассоциация некоторых из этих мутаций с предрасположенностью к аффективным психозам (Breidenthal et al., 2004; De Luca et al., 2004; Harvey et al., 2004; Zill et al., 2004a, 2004b; Zhang et al., 2005). Однако до настоящего времени связь этих мутаций с активностью ТПГ в мозге установлена не была.

Основным механизмом регуляции активности ТПГ в мозге является обратимое фосфорилирование молекул фермента, катализируемое кальций, кальмодулин-зависимой протеинкиназой II в присутствии Ca (Hamon et al., 1976; 1978; Kuhn et al., 1978; Boadle-Biber, 1982a; Kuhn, Lovenberg, 1982).

Несмотря на ключевую роль ТПГ в биосинтезе серотонина и в механизме передачи сигнала в серотониновом синапсе и на постулируемую связь изменений активности фермента с наследственными изменениями (и нарушениями) поведения, очень мало было известно о генетическом контроле активности фермента в мозге. Имеющиеся публикации демонстрируют только наличие межлипейпых различий в активности фермента у мышей (Barchas et al., 1974; Diez et al., 1976b; Natali et al., 1980; Knapp et al., 1981). На момент начала наших исследований не было данных о межлинейных различиях активности ТПГ в мозге крыс.

Ген, кодирующий ТПГ в мозге, традиционно рассматривается как ген-кандидат, вовлеченный в регуляцию поведения и психики (Nielsen et al., 1994; 1997; Veenstra-VanderWeele et al., 2000; Gingrich, Hen, 2001, De Luca et al., 2004; Zill et al., 2004a,b; Zhang et al., 2005).

Особое внимание привлекает возможная ассоциация ТПГ е выраженностью защитного поведения. Защитное поведение представляет собой комплекс эволюциопно закрепленных врожденных реакций на неодушевленные и одушевленные угрожающие стимулы внешней среды. Можно выделить такие разновидности защитного поведения как защита территории (или социального статуса в группе), оборонительная агрессия по отношению к хищнику, реакция активного избегания и реакция замирания (затаивание) (Попова, 1997; Dixon, 1998; Popova, 1999; Попова, 2004).

Имеются генетические модели для изучения генетико-молекулярных механизмов регуляции различных форм защитного поведения. Межсамцовую агрессию традиционно изучают па линейных мышах и гибридах (Maxson, 1992; 1999). Для изучения наследственных механизмов агрессии на человека были созданы две модели доместикации - на серебристо-черных лисицах (Трут, 1978; 1981) и серых крысах-пасюках (Беляев, Бородин, 1982; Никулина и др., 1985а). Классической моделью изучения реакции активного избегания являются Римские линии крыс RHA и RLA, различающиеся по выраженности реакции активного избегания в челночной камере (Overstreet, 1992). Наконец, для исследования генетического контроля реакции замирания (каталепсии) была создана линия крыс ГК (Колпаков, 1990; Kolpakov et al., 1996). Другой моделью естественной каталепсии является щипковая (pinch-induced) каталепсия мышей (Amir et al., 1981; Ornstein, Amir, 1981).

В то же время связь между активностью ТПГ и наследственным разнообразием по выраженности этих форм защитного поведения исследована не была.

Были поставлены следующие задачи:

1. Изучить закономерности генетического контроля активности ТПГ в мозге мышей.

2. Исследовать генетический контроль межсамцовой агрессии у мышей и связь межсамцовой агрессии с активностью ТПГ в мозге.

3. Проанализировать участие ТПГ в процессе доместикации серебристо-черных лисиц и серых крыс-пасюков.

4. Исследовать роль ТПГ мозга в механизме регуляции генетически детерминированных различий в проявлении реакции активного избегания у крыс.

5. Изучить генетический контроль каталепсии мышей.

6. Выяснить связь ТПГ с наследственно детерминированными различиями в предрасположенности к каталепсии мышей и крыс.

Научная новизна. Были выявлены два типа наследственной изменчивости активности ТПГ в мозге мышей: конститутивиый и регуляторный. Конститутивная изменчивость обусловлена C1473G полиморфизмом в 11-ом экзопе гена tph2, а регуляторная изменчивость - наследственным полиморфизмом по степени фосфорилирования фермента.

Выявлена ассоциация интенсивности драк с полиморфизмом С1473в в гене 1рк2 мышей. Интенсивность драк была снижена у мышей с генотипом 14730/0 по сравнению с животными 1473С/С.

Установлено увеличение активности ТПГ в среднем мозге серебристо-черных лисиц и крыс-пасюков в процессе доместикации.

Показана связь наследственной предрасположенности к каталепсии с повышенной активностью ТПГ в' стриатуме мышей и крыс.

Теоретическая значимость работы. Основным вкладом данного исследования в генетику и нейрогеномику поведения является экспериментальное доказательство генетической ассоциации активности ТПГ в мозге с наследственно детерминированным полиморфизмом по выраженности различных форм защитного поведения. Другим важнейшим теоретическим положением, продемонстрированным в работе, является экспериментальное доказательство того, что в основе селекции по поведению лежит отбор генетических факторов, регулирующих активность ТПГ в головном мозге.

Показано существование связанной с геном 1рЪ2 (конститутивной) и не связанной с ним (регуляторной) изменчивости активности ТПГ в мозге.

Установлена связь конститутивной и регуляторной изменчивости с наследственным полиморфизмом основных типов защитного поведения.

Выявление ассоциации С14730 полиморфизма в гене 1рЬ2 с интенсивностью драк у самцов мышей имеет существенное эвристическое значение для понимания молекулярно-генетического механизма регуляции агрессии и жестокости.

Практическая значимость работы. Показана ассоциация наследственно детерминированных особенностей агрессии на человека, активного избегания и каталепсии с регуляторной, но не конститутивной изменчивостью ТПГ в мозге. Полученные данные указывают на существенную роль генов, контролирующих посттрансляционную модификацию ТПГ, в регуляции наследственного полиморфизма по выраженности этих форм защитного поведения.

У мышей линии СВА выявлена чрезвычайно высокая предрасположенность к щипковой каталепсии. Эта линия может использоваться как модель для изучения гепетико-молекулярных механизмов естественной защитной реакции замирания.

Разработан чувствительный флуориметрический метод измерения активности ТПГ в тканях.

Полученные результаты используются в курсе лекций «Молекулярные основы регуляции поведения», читаемом для студентов кафедры физиологии Новосибирского Государственного университета.

Положения, выносимые на защиту.

1. Выявлены два типа наследственной изменчивости активности ТПГ в мозге: конститутивный и регуляторпый. Конститутивная изменчивость обусловлена С1473в полиморфизмом в 11-ом экзоне гена /р/г2, кодирующего ТПГ. Регуляторная изменчивость связана с различиями в механизме обратимого фосфорилировапии уже синтезированных молекул фермента.

3. Изменчивость порога (уровня, предрасположенности) и интенсивности (числа драк) межсамцовой агрессии мышей в значительной степени определяется генетическими факторами. Однако эти два показателя межсамцовой агрессии регулируются разными генетическими механизмами. В то время как доминирует низкий порог агрессивной реакции, интенсивность драк имеет промежуточный тип наследования. Обнаружена ассоциация числа драк между самцами мышей с полиморфизмом С14730 в гене /р/г2.

5. Наследственно детерминированное отсутствие реакции активного избегания у крыс линии 11ЬА ассоциировано со сниженной активностью ТПГ в среднем мозге.

7. Наследственная каталепсия у мышей каталептической линии СВА и крыс линии ГК, селекционированной па каталепсию, сопровождается локальным увеличением активности ТПГ в стриатуме.

Апробация работы. Результаты данной работы были представлены и обсуждены на Ученых Сессиях Института цитологии и генетики в 1988, 1991, 2000, 2003 годах, 1 Всесоюзной конференции "Химия, биохимия и фармакология производных индола" (Тбилиси, 1986), Всесоюзной конференции «Медиаторы в генетической регуляции поведения» (Новосибирск, 1986), XV съезде Всесоюзного физиологического Общества им. И.П. Павлова, (Ленинград, 1987), 5 Съезде ВОГИС (Москва, 1987), конференции "Медиаторы и поведение" (Новосибирск, 1988), 3 школе-семинаре по генетике и селекции животных (Бийск, 1989), Всемирном конгрессе по психиатрической генетике (Новый Орлеан, 11993 , США), 4 Международной конференции Общества Нейробиологии Поведения (Сантьяго де Компостела, Испания, 1995), XIX съезде Российского физиологического Общества им. И.П. Павлова (Екатеринбург, 2004) и на конференции Российского нейрохимического общества «Нейрохимия: фундаментальные и прикладные аспекты» (Москва, 2005).

Публикации. Материал диссертации изложен в 54 публикациях в отечественных (31) и международных (23) реферируемых журналах.

Благодарности. Автор выражает глубокую признательность своим соавторам д.б.н. В.Г. Колпакову, к.б.н. H.H. Барыкиной, к.б.н. Т.А. Алехиной (лаб. эволюционной генетики Института цитологии и генетики), Drs. F. Chaouloff, М.-Р. Moisan и Р. Mormede (INSERM, U471, Франция), а также старшим лаборантам В.И. Ребрик, Т.Ф. Денисовой (лаб. нейрогепомики поведения Института цитологии и генетики) и Т.А. Голдобиной (лаб. разведения животных Института цитологии и генетики) за помощь в проведении ряда экспериментов и получении материала.

Заключение Диссертация по теме "Генетика", Куликов, Александр Викторович

ВЫВОДЫ

1. Выявлены два основных генетнко-молекулярных механизма, регулирующие изменчивость активности триптофапгидроксилазы в мозге: 1) C1473G полиморфизм в 11-ом экзоне гена tph2 - замена нуклеотида С на G в этом сайте приводит к значительному снижению активности фермента 2) различия в механизме обратимого фосфорилирования молекул фермента.

3. Изменчивость порога (уровня, предрасположенности) и интенсивности (числа драк) межсамцовой агрессии мышей в значительной степени определяется генетическими факторами. Однако эти два показателя межсамцовой агрессии контролируются разными генетическими механизмами. В то время как доминирует низкий порог агрессивной реакции, интенсивность драк имеет промежуточный тип наследования. Обнаружена ассоциация числа драк между самцами мышей с полиморфизмом C1473G в гене tph2. Не обнаружено связи между C1473G полиморфизмом и генетически детеримиированной выраженностью порога межсамцовой агрессии.

5. Наследственно детерминированное отсутствие реакции активного избегания у крыс линии RLA ассоциировано со сниженной активностью ТПГ в среднем мозге по сравнению с животными линии RHA с нормальной реакцией активного избегания.

6. Изменчивость выраженности реакции замирания (каталепсии) у мышей в значительной степени определяется генетическими факторами. Высокая предрасположенность к реакции замирания у мышей линии СВА контролируется в основном одним аутосомным рецессивным локусом. С помощью набора полиморфных микросателлитных маркеров главный ген, кодирующий высокую предрасположенность к каталепсии, локализован в дистальном фрагменте хромосомы 13.

7. Высокая выраженность наследственной каталепсии у мышей каталептической линии СВА и крыс линии ГК, селекционированной на каталепсию, сопровождается локальным увеличением активности ТПГ в стриатуме. У мышей линии СВА это увеличение не сцеплено с геном 1рИ2. У крыс линии ГК увеличение активности ТПГ в стриатуме обусловлено обратимым фосфорилированием молекул фермента в этой структуре.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

На фоне повышенного числа заходов в открытые рукава лабиринта и в светлый отсек в тесте свет/темнота и времени пребывания в открытых рукавах и в светлом отсеке в парах крыс RLA/RHA и SHR/Lewis наблюдается наследственно детерминированное снижение активности ТПГ.

Крысы SHR характеризуются наименьшей, a Lewis - наибольшей предрасположенностью к реакции активного избегания (Ramos et al., 1997), крысы RLA и RHA были селекционированы на низкую и высокую выраженность реакции активного избегания в челночной камере. Сопоставление результатов, полученных па крысах RHA и RLA, с данными, полученными на животных SHR и Lewis, выявило отрицательную ассоциацию между выраженностью реакции избегания и активностью ТПГ в среднем мозге: чем выше активность фермента, тем ниже проявляется реакция активного избегания.

Следовательно, полученные нами результаты могут рассматриваться как экспериментальное доказательство генетически детерминированной ассоциации высокой активности ТПГ в среднем мозге с наследственно детерминированной предрасположенностью к реакции активного избегания аверсивных стимулов, осторожностью или пугливостью животного.

ГЛАВА 7. ИЗУЧЕНИЕ ГЕНЕТИЧЕСКОЙ АССОЦИАЦИИ ТПГ С РЕАКЦИЕЙ ЗАМИРАНИЯ.

Каталепсия (тоническая неподвижность, животный гипноз, мнимая смерть) рассматривается как эффективная пассивно-оборонительная реакция в ответ на внешнюю угрозу со стороны хищника или агрессивного сородича (Попова, 1997, 2004; Dixon, 1998; Popova, 1999). Действительно, затаивание животного уменьшает вероятность быть обнаруженным хищником и снижает интенсивность атак со стороны агрессивного соперника.

Имеются многочисленные фармакологические данные об участии серотонииа мозга в регуляции выраженности галоперидоловой каталепсии (Kostowsky et al., 1972; Invernizzi et al., 1988; Broekkamp et al., 1988; Hicks, 1990; Neal-Beleveau et al., 1993; Wadenberg et al., 1993; 1994; Prinssen et al., 2000, 2002).

В то же время, сведения о генетико-молекулярном механизме регуляции естественной реакции замирания скудны. В настоящее время имеются две лабораторные модели естественной каталепсии: крысы линии ГК, прошедшие длительную селекцию на высокую предрасположенность к каталепсии (Kolpakov et al., 1996), и щипковая каталепсия мышей (Amir et al., 1981; Ornstein, Amir, 1981).

Цель данного исследования - изучение генетически детерминированной связи каталепсии с активностью ТПГ в мозге мышей и крыс. Были поставлены следующие задачи:

1. Исследовать генетический контроль каталепсии у мышей

2. Изучить роль ТПГ в регуляции наследственной каталепсии у мышей и крыс.

7.1. Генетический анализ каталепсии у мышей.

Впервые межлинейные различия по выраженности щипковой каталепсии у мышей были показаны Ornstein и Amir (1981). Эти исследователи оценивали выраженность щипковой каталепсии по числу тестов, необходимых, чтобы вызвать неподвижность, длящуюся 90 с. Было показано, что необходимо значительно меньше тестов, чтобы вызвать каталептическое замирание у мышей BALB/c, чем у животных C57BL/6. Гибриды первого поколения между этими линиями проявляли низкую выраженность реакции замирания (как у C57BL/6).

В ходе исследования генетических механизмов регуляции каталепсии мы обнаружили, что критерий, предложенный Ornstein и Amir, не является достаточно воспроизводимым. Поэтому был разработан и предложен другой критерий (Куликов и др., 1989), в котором основной упор делался на воспроизводимость теста. Животное считалось каталептиком, если оно замирало в течение не менее 20 с в трех тестах из десяти. Легко видеть, что с помощью этого критерия отбираются действительно предрасположенные к каталепсии животные, в то время как мыши, которые замирали даже длительное время (до 90 с), но всего только один или два раза (случайные каталептики), не учитывались.

С помощью разработанного нами критерия исследована каталепсия у мышей 9 ипбредных линий и выявлены существенные межлинейные различия по данному признаку (х2в = 40.5, р<0.001, Рис.33). Как видно из рисунка 33, каталепсию невозможно вызвать ни у одного животного линий АКЯ, С57В1У6, БВА/1 и СС57В11. Незначительный процент каталептиков (10-20%) был обнаружен в линиях ББ, ВАЬВ/с, А/Не и СЗН/Не. И только в одной из исследованных линий, СВА, было обнаружено более 50% животных-каталептиков, время замирания которых превышало минуту. Исследования, продолжавшиеся в течение более 10 лет, показали устойчивость такого распределения признака у линий мышей. Высокая предрасположенность к каталепсии является атрибутом линии СВА: исследования, выполненные в разные годы и различные сезоны, показали, что процент каталептиков в линии СВА не опускался ниже 35% и не поднимался выше 60% (в общей сложности было протестировано 132 самца и 120 самок СВА). При этом повторяемость чрезвычайно высока: 87% самцов мышей этой линии воспроизводят каталепсию при повторном тестировании. В то же время, ни у одного из 35 самцов и пи у одной из 20 самок АК11 не удалось вызвать даже единичного замирания более 10 с. Аналогично, каталепсия не была обнаружена ни у одного из 47 протестированных самцов С57В1У6. Сложнее обстоит дело с мышами, проявляющими слабую каталепсию (10-20%). В выборках мышей линий ВАЬВ/с и СЗН/Не процент каталептиков колеблется от 0% до 40%, но в среднем остается на уровне 10-20%. Такая низкая воспроизводимость каталепсии у мышей этих линий, по-видимому, обусловлена слабостью генетических факторов и сильной паратипической вариапсой. Поэтому для дальнейшего изучения генетического контроля каталепсии были выбраны две контрастные по выраженности признака линии: СВА и АКЯ.

Не было выявлено половых различий в проявлении каталепсии у мышей СВА (%2| = 1.94, р>0.05) и у мышей АКЯ (каталепсии не было обнаружено пи у одного самца и ни у одной самки АКЯ). Поэтому при изучении генетического контроля предрасположенности к каталепсии данные, полученные на самках и самцах, объединялись.

У мышей линии СВА число каталептиков в потомстве родителей-каталептиков (57% самцов и 75% самок) не отличался от такового в потомстве родителей-некаталептиков (50% самцов, tig = 0.26, р>0.05 и 78% самок, t2s = 0.27, р>0.05). Этот результат служит доказательством генетической однородности линии СВА. Процент каталептиков в этой линии отражает генетически детерминированную пенетрантность признака.

СВА СЗН/Не А'Не BAL В/с DD C57BL AKR DBA1 СС57Вг

Рис.33. Процент каталептиков у мышей инбредных линий.

В каждой клетке, разделенной пополам прозрачной перегородкой с отверстиями, содержались два самца в условиях постоянного сенсорного контакта. При ежедневном (в течение 15 дней) удалении перегородки на 10 мин происходили агонистические столкновения, в которых у побеждавших животных вырабатывался агрессивный тип поведения, а у проигравших - субмиссивпый (подчиненный) тип. Контролем служили мыши, рассаженные поодиночке для снятия группового эффекта.

Было установлено, что мыши с субмиссивным типом поведения проявляли хорошо выраженную каталепсию и по проценту каталептиков не отличались от контроля. Однако ни у одного из 12 самцов с выраженным агрессивным типом

•л поведения не удалось вызвать реакции замирания (Рис.34., % = 11.5, р<0.001).

70 ■ м ео -о 50 ■ н

С 40 -ш

§ 30 • § 20 -^ 10 -0 •

КОНТРОЛЬ СУБМИССИВНЫЕ АГРЕССИВНЫЕ

Рис.34. Процент каталептиков среди контрольных и тренированных на субмиссивный и агрессивный типы поведения самцов СБА в модели сенсорного контакта.

Следовательно, кроме генотипа, существенным фактором, определяющим выраженность каталепсии у мышей СВА, является их социальный статус в группе.

Не было обнаружено ни одного каталептика среди 70 (35 самцов и 35 самок) реципрокных гибридов первого поколения между мышами линий AK.Il и СВА (Табл.17), что свидетельствует о рецессивном характере наследования высокой предрасположенности к каталепсии у мышей.

В то же время, среди 106 расщепляющихся мышей второго поколения (¥2) от скрещиваний гибридов первого поколения было обнаружено 17 животных-каталептиков (Табл.17). С учетом неполной (56%) пепетрантности признака у мышей СВА, такое количество каталептиков очень близко к ожидаемому при моногенном контроле высокой предрасположенности к каталепсии (106 х 0.56 х 0.25 = 14.3, у2 = 0.64, р>0.05). Таблица 17. Закономерности наследования процента каталептиков в гибридологическом анализе

Генотип Число животных Процент каталептиков

СВА (С) 27 56

АКЯ (А) 26 0

Р,(С х А) + РКА х С) 70 0

Р2 (Р. х Р,) 106 16

Следующим этапом анализа наследования признака было проведение возвратных скрещиваний самцов-каталептиков и самцов-некаталептиков из Бг с самками каталептической линии СВА. Всего исследовано 13 семей: 4 от отцов-каталептиков и 9 от отцов-иекаталептиков. Семьи отцов-каталептиков оказались однородными по доле л каталептиков в них (% з = 7.8, р>0.05). Это позволяет предполагать, что все животные-каталептики в Рг изогенны по признаку. Таким образом, полученные результаты свидетельствуют: 1) о полной рецессивности признака в Бь 2) о расщеплении 1:3 в Рг и 3) об изогенности животных-каталептиков в ¥2. Это позволяет сформулировать гипотезу о том, что каталепсия наследуется как один аутосомный локус с неполной пенетраптностыо.

Для проверки данной гипотезы прежде всего необходимо как можно точнее вычислить величину пенетраптности признака. Доля каталептиков в линии СВА, равная 0.56, может служить только ее грубой оценкой, поскольку она сделана на небольшой выборке. Разумно использовать для получения более точной оценки пенетрантности данные по числу каталептиков в линии СВА, в Рг, в семьях отцов-каталептиков и отцов-некаталептиков. Общее количество животных в эксперименте было 212. В таблице 18 поэтапно представлена процедура вычисления частот генотипов и фенотипов, исходя из гипотезы о моногенном контроле признака. Полученная методом наибольшего правдоподобия уточненная оценка пенетрантности равна 0.54, что лишь незначительно отличается от грубой оценки. Ожидаемые численности каталептиков в исследованных группах хорошо согласуются с их эмпирическими значениями, поэтому гипотеза о мопогенном наследовании каталепсии не отвергается.

Приведенное доказательство моногенного контроля предрасположенности к каталепсии получено при использовании относительно условного критерия этого состояния. Замирание считалось каталепсией, если оно длилось не менее 20 с и встречалось по крайней мере в 3 тестах из 10. Мы проанализировали материал при других временных критериях определения каталепсии: при более мягком, когда животные квалифицировались как каталептики, если они сохраняли приданную позу не менее 10 с, и при более жестком, когда учитывалась только неподвижность, длящаяся 40 с и более. В обоих случаях, хотя величина пенетрантности признака изменялась (увеличивалась в первом и уменьшалась во втором), наблюдается очень хорошее согласие ожидаемых на основании моногенной гипотезы численпостей каталептиков в исследуемых группах с экспериментально полученными значениями (Табл.19).

Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Куликов, Александр Викторович, Новосибирск

1. Авруцкий Г.Я., Недува A.A. Лечение психически больных. М.: Медицина, 1981. 528 с.

2. Банди Б. Методы оптимизации. Вводный курс. М.: Радио и связь, 1988. 128 с.

3. Барыкина H.H., Чепкасов И.Л., Алехина Т.А., Колпаков В.Г. Селекция крыс

4. Вистар на предрасположенность к каталепсии // Генетика, 1983. т.19. С.2014-2021.

5. Беляев Д.К. Биологические аспекты доместикации животных // Генетика иселекция новых пород сельскохозяйственных животных. Алма-Ата, 1970. С.30-44.

6. Беляев Д.К. Генетические аспекты доместикации животных. // Проблемыдоместикации животных и растений. 1972. М.: Наука. С. 39-45

7. Беляев Д.К. Дестабилизирующий отбор как фактор изменчивости придоместикации животных // Природа, 1979. Вып. 2. С.36-45.

8. Беляев Д.К., Бородин П.М. Влияние стресса на наследственную изменчивость иего роль в эволюции // Эволюционная генетика, Л.: Из-во ЛГУ. 1982. С.35-59.

9. Беляев Д.К., Трут Л.Н. Поведение и воспроизводительные функции животных. II.

10. Коррелятивные изменения при селекции на приручаемость // Бюлл. МОИП. Отд. Биол., 1964. т.69. Вып.4. С.5-14.

11. Бензер С. От гена к поведению // Актуальные проблемы генетики поведения /

12. Федоров В.К., Пономаренко В.В. (ред.), Л.: Наука, 1975. С.5-21.

13. Ван Абилеи Д. Этология и генетические основы поведения животных // Вопросыобщей генетики, М.:Наука. 1981. С.286-295.

14. Гейто Д. Молекулярная психобиология. М.:Мир, 1969. 275 с.

15. Гинзбург Э.Х. Генетический анализ количественных признаков у самоопылителей

16. Генетика, 1979. т.15. С.1443-1445.

17. Гинзбург Э.Х. О формулах для оценки числа генов // Генетика, 1982. т. 18. С. 960966.

18. Гинзбург Э.Х. Генетическое описание наследования количественных признаков.

19. Сообщение III. Формальное описание генетического анализа // Генетика, 1983. т.19. С. 126-135.

20. Гинзбург Э.Х. Описание наследования количественных признаков. Новосибирск :1. Наука, 1984. 249 с.1617,18,19,20,21.22,23,24.25,26,27,28.29,30,

21. Гинзбург Э.Х., Куликов A.B. Проверка моногенных гипотез в гибридологическом анализе количественных признаков // Генетика, 1983. т. 19. С.571-576.

22. Дьюсбери Д. Поведение животных. Сравнительные аспекты. М.: Мир, 1981. 479 с.

23. Жуков Д.А. Психогенетика стресса. Поведенческие и эндокринные корреляты генетичесикх детерминант стресс-реактивности при неконтролируемой ситуации. Санкт-Петербург, 1997. 176 с.

24. Кармапова И.Г. Эволюция сна. JL: Наука, 1977. 174 с.

25. Колпаков В.Г. Кататония у животных. Генетика, нейрофизиология, иейрохимия. Новосибирск :Наука, 1990. 168 е.

26. Колпаков В.Г., Куликов A.B., Алехина Т.А., Чугуй В.Ф., Петренко О.И., Барыкина H.H. Кататония или депрессия? Линия крыс ГК генетическая животиая модель психопатологии // Генетика, 2004. т.40. С.827-834.

27. Корниш-Боуден Э. Основы ферментативной кинетики. М.: Мир, 1979. 365 с.

28. Корякина Л.А., Куликов A.B., Фигурова М.Ю., Попова Н.К. Действие холода на серотониновую систему мозга и уровень кортикостероидов в крови мышей различных линий // Физиол. Жури., 1985. т.71, С.422-427.

29. Крамер Г. Математические методы статистики. М.: Мир, 1975. 648 с.

30. Кроукфорд П. Артур, Билл и другие (Все о мышах). М.: Мир, 1970. 158 с.

31. Кудрявцева H.H., Ситников А.П. Влияние эмоциональности, исследовательской активности и болевой чувствительности на проявление агонистического поведения у мышей //Журн. Высш. Нервн. Деят., 1986. т.36. С.686-691.

32. Куликов A.B. Быстрый неизотопный метод определения активности триптофангидроксилазы в головном мозге // Вопр. Мед. Химии, 1982, т.28. Вып.1. С.135-138.

33. Куликов A.B., Базовкина Д.В. Проверка гипотез о сцеплении в гибридологическом анализе альтернативных поведенческих признаков с неполной пенетрантпостыо // Генетика, 2003. т.39. С.1066-1072.

34. Куликов A.B., Базовкина Д.В,, Муазап М.-П., Мормэд П. Картирование гена предрасположенности к каталепсии у мышей с помощью полиморфных микросателлитиых маркеров //Докл. Акад. Наук, 2003. т.393. С. 134-137.

35. Куликов A.B., Воронова И.П. Роль обратимого фосфорилирования в генетически детерминированном полиморфизме по активности триптофангидроксилазы мозга// Бюлл. Экспер. Биол. Мед., 1995. т.119. № 1. С.67-68.31.

Информация о работе

Куликов, Александр Викторович
доктора биологических наук
Новосибирск, 2005
ВАК 03.00.15

Диссертация

Триптофангидроксилаза - ключевой фермент биосинтеза серотонина: генетический контроль и ассоциация с наследственной изменчивостью защитного поведения - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы