Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

ТРАНСФОРМАЦИЯ ПУРИНОВЫХ И ПИРИМИДИНОВЫХСОЕДИНЕНИЙ ПОЧВЕННЫМИ МИКРООРГАНИЗМАМИ ПО ПАРАЛЛЕЛЬНЫМ ПУТЯМ МЕТАБОЛИЗМА

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "ТРАНСФОРМАЦИЯ ПУРИНОВЫХ И ПИРИМИДИНОВЫХСОЕДИНЕНИЙ ПОЧВЕННЫМИ МИКРООРГАНИЗМАМИ ПО ПАРАЛЛЕЛЬНЫМ ПУТЯМ МЕТАБОЛИЗМА"

' МИНИСТЕРСТВО СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА СССР

МОСКОВСКАЯ ОРДЕНА ЛЕНИНА ' И ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННАЯ АКАДЕМИЯ имени К. А. ТИМИРЯЗЕВА

- УДК 576.в09.Ю

На правах рукописи

МУЙЖНИЕКС Индрикнс Оскарович

ТРАНСФОРМАЦИЯ ПУРИНОВЫХ И ПИРИМИДИНОВЫХ СОЕДИНЕНИЙ ПОЧВЕННЫМИ МИКРООРГАНИЗМАМИ ПО ПАРАЛЛЕЛЬНЫМ ПУТЯМ МЕТАБОЛИЗМА (Спец. 03,00.07— микробиология)

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

москва — 1960

Г .

, Работа выполнена . на кафедре физиологии растений и -микробиологии Латвийского : государственного университета им. П. Стучки. . '

. Научные руководители: доктор биологических; наук профессор X. А. Мауриня,-кандидат биологических наук доцент М; Я. Внтолс.

Официальные оппоненты: доктор биологических .наук профессор Л. И. Воробьева, кандидат биологических наук доцент И. В. Асеева.

Ведущее учреждение — Институт микробиологии им. А, 'Кнрхенштейна АНЛатвийской ССР; г. Рига.

Защита состоится «ли.»''. (¿^М/. . . . .1980 г.

часов на .заседании' Специализированного совета К-120.35.06 в Московской сельскохозяйственной академии им. К. А. Тимирязева. Адрес: 127550, г. Москва, ул. Тимирязевская, 47. Ученый совет ТСХА.

С диссертацией можно ознакомиться в ЦНБ ТСХА.

Автореферат разослан « . . . 1980 г.

Ученый секретарь Специализированного совета доцент

В. Г. Марьенко.

ОВІЦАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Выяснение вопросов распространения и активности почвенных микроорганизмов, усваивающих нуклеиновые КИСЛОТЫ (Н'К) и их компоненты, является одним из подходов в комплексе проблем, решаемых с целью повышения плодородия ПОЧВ,НК и их компоненты составляют значительную часть органофосфатов гумуса (Паников, 1976, Anderson, 1958, 1961), которая становится доступної! для нужд питания растений только после микробиологического разложения, т. к. растения сам« не способны усваивать сложные вещества нуклеиновой природы (Ратнер, Самойлова, 1958, Williams, 1950, Szember, 1960). Аналоги компонентов НК '(например, триазины) содержатся в структуре широко применяемых в сельском хозяйстве гербицидов, пестицидов и инсектицидов. Их микробиологическая деградация необходима для самоочнстки лочвы.

Микроорганизмы почвы являются перспективной группой для поиска продуцентов необходимых в народном хозяйстве и медицине биологически активных соединений •—1 продуктов превращения компонентов НіК (кофермеитов, витаминов, стимуляторов роста растений) н ферментов, 'метаболнзирующих НК (Головлева, Скрябин, 1974).

Сравнительно меньше, чем другие этапы деградации НК, изучена трансформация, т. е. ферментативная перестройка, превращение частей молекул ннзкомолекулярных компонентов Н.К, В последнее десятилетие появился ряд работ, раскрывающих физиологические и биохимические особенности микроорганизмов, расщепляющих производные пурина и пиримидина (Внтол, 1968, Вилке, 1972, Вольский, 1974, Намнр, 1976, Лиш-мане, 1977, Бабайцева; 1978, Гринберг, 1978). Все же сведения о распространении н систематической принадлежности микроорганизмов, усваивающих пур.иновые и пнримидиновые соединения, а также данные о разветвлении путей биохимических реакции деградации этих соединений—об лх трансформации по параллельным путям—до сих пор фрагментарны и недостаточны.

Центр, щучш бн6п;:отш Иое;;. орд. Язіиіиа сзглїіз. «від, км, К, A. Ttiï'iWîîi:

Цель к задачи исследования. В работе была поставлена цель: в качестве модели трансформации органических веществ в почве исследовать деградацию внеклеточных пуриновых и пиримидиновых соединений микроорганизмам}! и изучить влияние различных факторов среды на регуляцию протекания этого процесса по параллельным путям катаболизма.

Для выполнения работы были поставлены следующие задач»:

1. Разработать методику ускоренного выделения и определения биохимических свойств почвенных микроорганизмов, превращающих внеклеточные производные пурина и пиримидина.

2.'Изучить распространение и систематическую принадлежность микроорганизмов, усваивающих низкомолекулярные компоненты Н<К в различных типах почв.

3. Выявить среди почвенных микроорганизмов штаммы, у которых трансформация некоторых ключевых продуктов взаимопревращения пуриновых и пиримидиновых соединений — адениловой, цптндилоаой, гуаниловой и оротовой кислот, а также урацила, — протекают по параллельным путям катаболизма.

4. »Исследовать особенности ферментативных систем штаммов микроорганизмов, деградирующих компоненты НК по параллельным путям катаболизма, и регуляцию этого процесса под влиянием среды культивирования (состава, кислотности, наличия ингибиторов),

5. Выяснить возможности деградации по параллельным путям катаболизма цнтотоксическнх аналогов структуры пн-римидинов—6-азауридина и 6-азаурацила.

Научная новизна. Впервые обнаружено гидролитическое дезаминирование гуаниловой и цитндиловой кислот и их деградация по параллельным путям катаболизма. Впервые установлена возможность деградации по параллельным путям катаболизма 6-азаурацила—1 триазниового аналога естественных пиримидиновых соединений. Впервые выявлен двухфазовый характер деградации урацила по параллельным путям* Показано, что так же, как высокополнмерные НК и другие органические соединения (например, сахара), и низкомолекулярные производные пурина и -пиримидина могут быть дегра-дированы по параллельным путям катаболизма, и что этот процесс регулируется как физиологическим состоянием клеток и особенностями их ферментных систем, так и физико-химическими факторами среды.

Научно-методическое и прикладное значение. Разработанный метод ускоренного выделения и определения биохимических свойств почвенных микроорганизмов мо^ жет быть применен для анализа метаболизма- других типов 2 .. ."

органических вёществ в почве, для изучения обмена низкомолекулярных компонентов Н;К у микрофлоры человека и животных. Выделенный нами штамм Pénicillium lanoso-viride 8 рекомендован для производственного получения инозина и фермента аденилатдезаминазы, которые необходимы в медицинской практике и в биохимической -промышленности. Данные о деградации 6-азаурацила показывают необходимость повышенной концентрации природных пирнмиднновых соединений в случае необходимости микробиологической детокси-кации почвы после применения гербицидов и пестицидов, со* держащих в своей структуре триазиновое кольцо, что важно для сельскохозяйственной практики.

Апробация работы. Основные положения диссертации доложены;

1. На 6 научных конференциях ЛГУ им. П. Стучки (1973— 1979 гг.).

2. На конференциях молодых ученых по проблемам микробиологии и вирусологии (Рига, 1973, 1975, 1977 гг.).

3. На республиканском совещании «Регуляция микробиологических процессов в почве» (Рига, 1978).

4. На III съезде Всесоюзного биохимического общества (Рига, 1974).

5. На XII международном конгрессе микробиологии (Мюнхен, 1978).

6. На VII международном конгрессе по химии гетероциклических соединений (Тампа, 1979).

Публикации. Основное содержание диссертации опубликовано в 10 работах:

Объем работы. Диссертация состоит из' введения, содержащего краткую аннотацию роботы, пяти глав, заключения, выводов и 3-х приложений. Материалы диссертации .изложены на 102 страницах печатного текста, в 32-х таблицах и 21-м рисунке. Список литературы включает 94> наименований отечественных и '2БЙ зарубежных рабог.

В I главе обзора отечественной и зарубежной литературы просмотрены сведения о встречаемости производных пурина и пиримидина (-ПОП) и усваивающих их микроорганизмов в почве.

1 II глава посвящена описанию процессов деградации низкомолекулярных компонентов НК микроорганизмами. •

Глава IIL Объекты и методы исследований

В работе изучалась аэробная микрофлора дернового горизонта почв трех типов, которые наиболее широко используются в народном хозяйстве Латвийской ССР: дерново-карбонатная и дерново-подзолистая окультуренные, подзолистая лесная, а также огородный компост. Паше внимание было скон-

центрировано на изучении способности утилизировать пурино-вые II пнрнмнднновые соединения почвенными бактериями и мицелиальными .грибами, т, к. об участии актнномицетов н дрожжей в этом процессе недавно 'ПОЯВИЛИСЬ обширные работы (Вилке, 1972; Вольский, 1974). В качестве единственных или дополнительных источников питания к средам культивирования микроорганизмов нами были добавлены урацнл, гн-поксаитин, адснозин, урндин, адсниловая, цитнднловая и гуа-ннловая кислоты, которые обнаруживаются в почве в результате растепления РНК, а также оротовая кислота, попадающая туда со сточными водами молочной промышленности. Изучалась трансформация по параллельным путям аденило-вой и оротовой кислот, а также урацнла, т. к. эти соединения занимают ключевые положения в метаболизме нурнновых и пиримнлиновых соединений и участвуют в регуляции многих процессов в клетке. Деградация по параллельным путям цити-диловой и гуаниловой кислот изучалась после обнаружения их гидролитического дезаминнрованнн.

Для количественного подсчета микрорганнзмов почва подготавливалась по рекомендациям Д. Г. Звягинцева и сотр. (1973), Статистическая обработка данных велась по описанному методу (Ыера, 1976).

. С' целью ускорения процесса выделения чистых культур микроорганизмов, трансформирующих ППП в среде культивирования, и получения некоторых данных о биохимических свойствах штаммов уже и ходе выделения нами была разработана методика агаризованпых элективных сред питания (рис. 1).

В сравнении с известным методом жидких элективных сред выделения (Э1атег, 1947) наш метод позволяет примерно вдв^ое сократить время выделения штамма и изучения его биохимических свойств.

Для характеристики продуктов трансформации ППП из зоны роста культуры на чашке Петри (VI рнс. 1) вырезали диск агара н элюнроволи его на хроматографнческой бумаге, Качественное изучение динамики трансформации широкого спектра ТШ.П проводилось в минимальных объемах жидкой 'питательной среды. Количественный анализ продуктов превращения ¡ППП и препаративное их выделение с целью идентификации были осуществлены из жидких сред культивировании объемом 50—"100 мл. Температура выращивания всегда равнялась 28°С. За приростом биомассы микроорганизмов И изменениями рН среды культилнрования следил II общепринятыми методами.

Для разделения и идентификации продуктов трансформации ППП в среде культивирования были применены методы хроматографии на бумаге и и тонком слое, электрофореза на

бумаге, УФ-спектрофогометрии н .характерных цветных реакции (р1лк е1 а1. 1954; Куделпн и др. 1978).

Для идентификации аминокислот применяли реагент шш-гидрина (Хайс, .Чацек, 1962),

Определение изменений концентрации оротовой кислоты и среде проводилось методом полярографии (1сЬа, 1959) на приборе ЬР-60 (ЧССР).

Активность дезаминаз производных аденипа, цитознна и гуанина определялась спектрофотомегрнчески.

Изучение фосфомоноэстеразнон активности велось но методике X. Вантли и М. Оишн (Whitciy, СНэЫ, 1906).

5'нуклеотндазную активность определяли по разности расщепления изучаемыми клетками 2'(3') пуклеотидов и 5'нук-леотидов (Неррс!, НПшое, 1951).

Активность оротат- и урацнлфосфорнбозплтрансфераз, а также уридннкпназы была определена, применяя нзотопные соединения по ранее описанным методам (ЭкоМ, 1960, С^ак (Л а1., 1968).

Экстракты бактериальных и грибных клеток были получены ультразвуковой обработкой суспензий с последующим центрифугированием остатков клеток при 40—100 тыс.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИИ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Глава IV. Распространение, систематическая принадлежность н биохимические особенности 'почвенных микроорганизмов, утилизирующих пурнновые и пнрнмиднновые соединения,

В различных типах почвы было определено количество микроорганизмов, вырастающих на синтетических средах, содержащих ППП. Кроме общего числа микроорганизмов, вырастающих на средах с ППП (Нпп), было определено и соотношение Кпп/Нм*Ю0%, где Нм—число микроорганизмов, растущих на синтетических средах с легкоуснанваемымн источниками питания (янтарная к-та, глицерин, сульфат аммония) без добавления ППП (АН, БII). Полученные результаты представлены в табл. 1 и 2,

Среды, где ППП служили единственными источникам» углеродного п азотного питания, обозначены буквами А (для бактерии) ,н Б (для грибов). Среды, где ШТП были добавлены в качестве источников азотного питания или в качестве дополнительных источников питания, обозначены А I, Б I или А II и Б II соответственно. ППП, добавленное в среду, обозначено сокращением: гипоксантпн-Гнп, урацил-Ура, оротовая кнслота-Оро, аденознн->А, уриднн-У, о'-аденнловая, цитндило-вая и гул ни лов а я кислоты соответственно — АМФ, ЦМФ, ГМФ. Например, среда для выращивания грибов, где един-

Таблица 1

Количество клеток бактерий (на I г почвы), вырастающих на агаризованных средах, содержащих производные пуринов и лиримндинов

Типы почвы

Среда дерново-карбонатная дерново-подзол ік тая подзолистая огородная

I* 11** I II I II I II

1 2 3 4 5 6 7 8 9

—Ура Ш 6.1 173 6,9 103 7,0 302 6.3

— Гил 2ІС 7,2 186 7,4 122 8,2 346 7,2

Л —Л 158 5,3 150 6,0 91 6.1 222 4,6

—АМФ 152 5,0 143 5,7 85 5.7 246 5,1

—Ору 142 4,7 128 5.1 80 5.3 204 4*3

—Ура 451 15,1 432 17.3 282 18,8 686 14,3

—Гнп бок 20,2 6.50 26,0 406 27,1 1032 21.5

Л I —Л 611 20,5 538 22,3 420 28,0 нее 24,3

—ЛМФ 546 18,2 156 18,2 322 21.4 1138 23,7

—Оро 570 19,0 332 21.3 282 18.8 782 16.3

—Ура 2955 38,3 2623 105,0 ■1515 101.0 4608 96,0

. —Гни 325« 108,5 3306 92,2 1516 103.1 4992 1М,0

Л п —Л 276!) 92,3 2188 99,5 .1440 •96,0 4968 103.5

—АМФ 3195 106.5 2562 102.5 1522 101,5 5184 108,0

—Оро 2831 94,5 2762 108,1 1382 105.5 4618 96.2

* В абсолютных числах. ** В % от числа колоний, выросших на средах А III.

ственным источником азотного питания служит гипоксантин, обозначена Б 1-гип.

Дисперсионный анализ показал, что наиболее существенно на числовое соотношение микроорганизмов, растущих на средах с ППП и на средах типов А II и Б II без ППП, влияет наличие легкоусваиваемых источников азота и углерода в среде. Удельный вес влияния этого фактора т)5 = 97% для бактерии и л2 — 91% для гри-бов. На соотношение Нпп/Нм • 100% существенно, при уровне вероятности Р = 0,99, влияют и природа добавленного в среду ППП, и тип почвы, из которой проводится выделение. На средах, где ППП добавлены в качестве единственных источников питания (А, Б, А I, Б1), природа добавленного ППП влияет на соотношение .Нпп/Нм • 100% более существенно = 40— 60%), чем тип почвы (|)! = 6—10%).

Из отдельных колоний микроорганизмов, выросших на средах с ППП, нами было выделено около 350 штаммов, кото-

Таблица 2

Количество микроскопических грибов, вырастающих на агарнзованных сред ад, содержащих производные пуринов и пиримидимов

Типы почвы

Среда дерново-карбонатная дерново-подзолистая подзолистая огородная

I* II** I 11 I [I I П

1 2 3 4 Е> 6 7 8 9

—Гип 4 3,1 2 0.5 6 1,7 0

—У 12 0.3 зТ 7,8 29 8.4 21

—Л 22 17,0 26 6,5 61 17,6 16

—ЛМФ 18 14,0 30 12.6 42 12,1 23

—Гнп 84 65.1 168 42,3 190 34,9 100

—У 102 79,0 254 61,0 224 05,7 91

—Л 78 60.5 306 77,1 258 74.6 88

—ЛМФ 103 83,7 300 75,6 282 81,5 •112

—Гнп 162 125,6 420 105,8 360 104,0 140 77,9

—У 138 107,0 360 92.2 372 107,5 128 89,5

—Л 105 81,4 390 98,2 312 90,1 156 109.1

—ЛМФ 150 116.3 378 93,2 402 111,2 182 127,3

Обозначения см, в табл. 1,

рых ориентировочно определяли по культуральным признакам и микроскопическим данным. 'При этом не были замечены достоверные качественные различия в систематическом положении микроорганизмов, выделяемых из различных типов почв. Следовательно, существенные различия соотношения Нпп/Нм- 100% в некоторых типах почвы вызваны не качественными различиями микрофлоры почв, а изменением структуры микробной популяции.

■Преин куба пня почвы в естественных условиях с оротопой кислотой (засорение сточными водами молочноперерабаты-вающего цеха) и в модельных опытах с урацилом и ЛМФ приводит к увеличению как абсолютного, так н относительного числа (Нпп/Нм) микроорганизмов, усваивающих эти соединения.

На агаризованной среде питания нами были охарактеризованы продукты трансформации ПИП более чем у 2000 штаммов микроорганизмов. При выделении микроорганизмов на средах с ППП в качестве основных источников литания нами получены в основном штаммы, катаболизирующие этн соедн-

нения. На средах, где ПОП служит источником азотного или дополнительными источниками питания,, сравнительно чаше обнаруживаются микроорганизмы, накапливающие продукты анаболических превращений ППП, а также расщепляющие их по параллельным путям. С другой стороны, активность разложения гетероциклического соединения более выражена у культур, выделенных на строго элективных средах (Л-, Б-), у них шире спектр усваиваемых в качестве источников питания ППП.

Глава V. Параллельные пути расщепления внеклеточных производных пуринов и пиримидмнов почвенными микроорганизмами

5.1, Трансформация экзогенной 5'адениловой кислоты по параллельным путям метаболизма

Параллельное накопление ннозиловон кислоты и аденозн-на среди продуктов трансформации внеклеточной адениловон кислоты было обнаружено у 43-х штаммов микроорганизмов. С наивысшей активностью ЛМФ был дезамннирован грибом Pénicillium lonoso-viride S, которого мы избрали для более подробного исследования трансформации ЛМФ но параллельным путям метаболизма.

Соотношение удельной активности ферментов, дезампни-руюших и дефосфорнлирукицих ЛМФ, менялось в зависимости от условий культивирования Pénicillium lanoso-vîricle 8. Так, пониженная концентрация неорганического фосфата в среде активировала фосфатазы гриба, а ионы молибдата и вольфрамата проявляли ингибирующий эффект на действие этих ферментов. В обоих случаях удельная активность адени-латдезаминазы существенно не менялась, но этот фермент сильно репрессировался наличием Сахаров в жидкости культивирования.

Изменения в активности ферментов, катализирующих деза-минирование и дефосфорнлирование АМФ, происходит и в процессе развития гриба, В экстракте клеток дезаминаза появляется примерно в середине лог-фазы, когда начинается обильное образование конидий (рис. li). У гриба, который выращивался в условиях, где полностью подавлено формирование конидий, нам не удалось обнаружить активность адени-латдезаминазы.

Активность ферментов, ответственных за расщепление внеклеточного ЛМФ по параллельным путям, у Pénicillium lonoso-viriile 8 регулируется как факторами внешней среды, так и генетически обусловленными процессами развития гриба.

м ...

> ; 1 I Ж. ЕГ Е

* ** . ' ' * * 4 ' ' 1

■■'-Рис.' I. Выделение микроорганизмов методом агаризованннх

Ч элективных сред. '

I ~ экстракт почвы; П- разведение экстракта почвы; III -высев 0.1-0.2 ил разведения на чашку Натри с агаризован-нойэлективвой средой; ГУ - пересев из отдельных характер; колоний' на чашку Петря; У - пересев чистых, культур в ; пройирки для хранеш1я; У1 - пересев чистых культур ва сек" ■ тора чашки Петра ; р: элективной средой для: проверка. их. йио-химической активности и изучения продуктов трансформации < добавленного соединвния.

ь

г

Рис. 2. Динамика адеюиатдезаминазной активности на

различных стадиях роста гриба Реп1с1111шг..

1опояо-"Р1т1(Зв 8

Х - влажная биомасса гриба, 2 « число свободных конидий в '. среде, 3 - активность фермента в экстракте гиф гриба (Ш/ мг. бедка)». 4 "- активность фермента в среде культивирования . (ЦЕ/ыг биомассы).

1 1 з А 5 6 СУТКИ

Рис. 3. Дйнамика росте и трансформации урацила культурой Paétadcmcoas iluotèecena 57 ■

Изменение концентрація- в среде: I) - урадила; 2) - <Зар<5итуро-вой кислоты; 3)-^-урвидопропионовоЙ кислоти; 4)-^-алашша * 5):-ЯйСт культуры по ФЭКтУ-рН среди в началу культивации — 7,5. •

! : J- ч -, соон.

f .ксон:. ... ... H .. . •• / Hy

H . « V

. V-f V ' соон* соон.

но o» w 4> ...

W'»" h,N'n

' . HtN-CHrODOH 5 /C00H.

■ . V • ; HN—ÇH,

Рис.4, Сгема расщешіения 6-азауридяна микроскопичес-

■ кеш грибами: v'

—дуть катаболизш, ^наруженана у, ї^оіііітао вррі' 19»46¿55, Aepereliies ер» 2 і —• путь катаболизма, одяар^енннй у Verttcimrä elancte^úál .

5.2. Дезаминирование цитидиловой и гуаниловой кислот микроскопическими грибами

Гидролитическое дезаминирование гуаниловой кислоты (ГМФ) с образованием ксантозиловой кислоты (КМФ) было обнаружено при выращивании грибов Pénicillium lonoso-vî-ride 26 и Aspergillus fumigatus 9 в среде Б l-ГМФ. Дезаминирование цитидиловой кислоты в урнднловую (УМФ) было найдено у грибов Pénicillium lonoso-viride 14 и Pénicillium vï-ridicatum 7 в среде Б 1-ЦМФ.

Эксперименты с суспензиями гиф грибов подтвердили наличие УМФ и КМФ среди продуктов трансформации ЦМФ н ГМФ.

В экстрактах клеток P. viridtcatum 7 и А> fumigatus 9 не было отмечено накопление УМФ н КМФ. Сохранение в экстрактах способности дезамнннровать нуклеозиды или основания н потеря нуклеотиддезамннирующей активности косвенно свидетельствуют о ТОМ,' что эти превращения у грибов P. viridicatum 7 и Л. fumigatus 9 катализируются разными ферментами.

В экстрактах Pénicillium lonoso-viride M и 26 происходит дезаминирование как нуклеозндов, так н нуклсотидов гуанина и цитозина (табл. 3).

Тайлица 3

Относительная активность дезамнннрования различных производных гуанина и цитозина бесклеточнымн экстрактами Pénicillium lonoso-viride >14 и 26

Субстрат Штамм № H Субстрат Шгамч Лг 26

ЦМФ 0,75 ГМФ 0.80

ЦТФ 0.35 ГТФ 0.30

2'3'цЦМФ 0,10 2'3'иГМФ 0,05

Дезоксн ЦМФ 0,35 Д«зоксн ГМФ 0.25

Питндш! 1.00 Гуанозин 1,00

ПНТОЗИН 0,<Й Гуанин 0,05

ГМФ 0,00 ЦМФ 0,00

Сравнивая активность неспецнфнческих дезамнназ, фос-фомоэстераз, 5'нуклеотидазы и киназ экстрактов Pénicillium lonoso-viride, было установлено, что активность последних трех ферментов недостаточна для образования того количества дезамннироваиных нуклеотидов, которое наблюдается в экспериментах.

Трансформация экзогенных ГМФ и ЦМФ в штаммах Pénicillium lonoso-viride 14 и 26 протекает по параллельным пу-

тям с дезамнннрованием науровне нуклсотидов й нуклеози-дов, а также дефосфориллрованием нуклеотндов, благодаря наличию высокой активности ннзкоспецифнческнх дезамнназ и низкой активности нуклеотидаз и фосфомоноэстераз.

В средах с пониженным содержанием фосфора у штаммов P. lonoso-viride 14 л 26 происходит дерепресснрование фос-фомоноэстеразной активности: ' В этом случае в процессе трансформации экзогенных нуклеотидов над дезамннпрованием доминирует путь их расщепления в нуклеозиды.

5.3. Деградация почвенными бактериями экзогенного урацила по параллельным путям метаболизма

. На средах Л-Ура и Л!-Ура нами были выделены 6 штаммов бактерий родов 'Pseudomonas и 'Mycobacterium, которые, деградируя, урацил, накапливали как продукты окисления, так и продукты восстановления этого соединения.

Более подробно расщепление урацила было изучено ,у штамма Pseudomonas fluorescens 57, где было показано, что этог процесс имеет хорошо выраженный двухфазовый характер (рис. 3).

Характер накопления продуктов трансформации ураинла здесь сходен с двух-фазностью процессов пропионовокислого и маслянокислого сбраживания углеводов у бактерии родов Propionobacterium и Clostridium (Шапошников, 1960). Насколько нам известно, подобные явления из примере превращения пиримндиновых соединений до сих пор не были обнаружены. Наличие урацила в среде стимулирует скорость развития культуры при. исходном pH 5,5- При этом быстрее протекает и фаза его окислительной трансформации. В средах с исходным pH выше 7,5 присутствие урацила растягивает лаг-фазу роста и первую фазу собственной трансформации.

В бесклеточных экстрактах Р. fluorescens 57 было обнаружено, что ферменты, катализирующие первые этапы катаболизма урацила, ингибируются конечными продуктами открываемых ими последовательностей реакций расщепления,

5.4. Трансформация оротовой кислоты почвенными бактериями по параллельным путям метаболизма

У целого ряда штаммов бактерий —Pseudomonas fluorescens 96, 219, 227, Pseudomonas spp. 3, 59, Mycobacterium lac-ticolum 192, M. album 2, M. Ilavum 107, Mycobacterium spp. 29, 47, 53, 62, 79, Ii23, 191 в качестве продукта трансформации оротовой кислоты обнаружен урацил. В некоторых из этих случаев были получены прямые доказательства, что урацил, 10

аккумулированный в культуралытй жидкости, образовался посредством некоторых реакции анаболизма, расщепляя УМФ, синтезированного из оротовой кислоты (например, P. fluorescens 86),

Были обнаружены 9 штаммов бактерий, чей рост и использование оротовои кислоты не ннгибироналнсь 6-азаурацилом (бЛзаУра). Резистентность штаммов Pseudomonas sp. 114, P. ftuorescens 227, Mycobacterium sp. 129 обусловлена низкой активностью ферментов, превращающих 6-азаураинл в активную форму ннгибитора — 6-АзаУМФ. Штаммы Pseudomonas sp. 92, Mycobacterium sp. 43 и M. flavum 107 были резистентны к воздействию 6-азаураинла, но чувствительны к 6-азауриди-ну, у них найдена пониженная активность урацилфосфорнбо-знлтрансферазы, в это же время урндннкнназа штаммов достаточно активна.

Штаммы Mycobacterium sp. 129, М. tlavum 107 и Bacillus adhaerans 9, у которых была обнаружена активность ураннл-фосфорнбозплтрансферазы и сниженная активность орогат-фосфорибозилтрансферазы, росли на средах с азаураинлом при наличии о ротовой кислоты. Разделяя методами бумажной хроматографии инкубационные смеси бесклеточных экстрактов выращенного в среде AI-Оро-бЛзаУра Bacillus adhaerans 9, найдено, что в присутствии бЛзаУра из Оро-2иС образовывается нендентификнрованнын нами продукт X, отличающийся <>г УМФ и ОМФ, который в присутствии фосфорибо-зилпнрофосфата превращается в Ура. Очевидно, у В. adhaerans 9 в присутствии аза-аналогов пиримидиновых соединений трансформация оротовой кислоты в урацпл проходит минуя стадии ОМФ и У-МФ, что и обуславливает механизм рези-тентностн этого штамма к 6-азаурацнлу.

5.5. Расщепление 6-азаурацила по параллельным путям метаболизма

>На средах с добавкой урацнла способность расщеплять 6-азаурацил была обнаружена и у 5 из 200 проверенных штаммов почвенных микроскопических грибов. Все выделенные на 6-азаурацнле грибы при росте в жидкой среде культивирования дерибозидировали 6-азауридин (рис. 4-1).

Из сред культнвнрования грибов, содержащих 6-азаурн-цил, были выделены 6 различных соединений. После их идентификации можно было заключить, что катаболизм 6-азаурацила (рис. 4-2) у грибов Penicillium spp, 19, -16, 55 л у Aspergillus sp. 3 протекает по такому же пути, как у Pseudomonas putida, где расщепление 6-азаурацила нами было обнаружено впервые с накоплением семикарбазона глноксиловой кислоты,

гидразона глиоксиловой кислоты, гидразина уксусной кислоты и глицина (рис, 4-3, 4, 5, 6 — соответственно) (Lismane et а)., 1977). У гриба VertictlHum glaucum 112 параллельно с накоплением семикарбазона глиоксиловой кислоты отмечено и образовать семнкарбазнда уксусной кислоты (рис. 4-7). Такая схема катаболизма 6-азауриднна у микроскопических грибов была подтверждена и исследованием расщепления этого соединения в суспензиях гиф.

Выводы

Разработанным нами методом ускоренного выделения микроорганизмов и скрининга' их биохимических свойств на агаризрванных питательных средах из почвы было выделено около 2000 штаммов, трансформирующих внеклеточные производные пуринов и пирнмидинов. Более чем - у 350 штаммов определена систематическая принадлежность до рода, у 50— до вида. Особенности биохимических превращений компонентов нуклеиновых кислот исследованы более чем у 150 штаммов. Полученные экспериментальные данные позволяют сделать следующие выводы.

I. Относительное число микроорганизмов, растущих на средах с пуриновыми и пирнмидиновыми соединениями к числу микроорганизмов, растущих на полной синтетической среде без этих соединений, в первую очередь зависит от наличия легкоусванваемых источников питания в среде (ti2— 90%), а при остальном равном составе среды на это число более влияет природа добавленного пурина нл-и пиримидина (Т)2~40—60%), чем тип почвы, из которой проводилось выделение (Т)г~6—'10%). .

' 2. Среди идентифицированных до рода микроорганизмов, усваивающих производные пурина и пиримидина в различных типах почв, 68% всех бактерий принадлежали к роду Pseudomonas и 59% всех мнцелиальных грибов—к роду Pénicillium, что указывает на ведущую роль этих групп почвенной микрофлоры в минерализации компонентов нуклеиновых кислот.

3. Способность усваивать основания пуринов и пирнмидинов,* а также оротовую кислоту в качестве единственных источников питания характерна для бактерий родов Pseudomonas и Mycobacterium; микроскопические грибы в качестве источников питания этим соединениям предпочитают нуклеозиды и адениловую кислоту.

■4. Быстрое катаболическое ращепление широкого спектра производных пурина и пиримидина свойственно для микромикроорганизмов, полученных на средах, где эти соединения служат основными источниками питания, а для штаммов, ис-

пользующих компоненты нуклеиновых кислот в качестве Д0-полнительных источников питания, характерно менее глубокое расщепление добавленного в среду соединения, большее раз* нообразне путей биохимической трансформации.

5. Преиикубаиия почвы в естественных условиях с орото-вой кислотой, а также в модельных опытах с урацилом и аде-виловой кислотой увеличивала число микроорганизмов, усваивающих эти соединения в пробах.

6. Выделено 43 штамма микроорганизмов родов Pénicillium, Monilîa, Aspergillus, Acremoniales, Bacillus и Pseudomonas, параллельно дезаминирующих и дефосфорилирующих внеклеточную 5'адениловую кислоту; у штамма Pénicillium lonoso-vîride 8 показано, что активность фосфомоноэстераз индуцируется нехваткой неорганического фосфора в среде, а проявление неспецифической аденилатдезаминазы связано со способностью гриба образовывать конидии.

7. Впервые обнаружены параллельные пути трансформации экзогенных гуаниловой и цитидиловой кислот и гидролитическое дезаминирование этих соединений у грибов Pénicillium viridicatum 7, Pénicillium lonoso-virîde M и 26, Aspergillus fumigatus 9.

8. Изучая трансформацию экзогенного урацила штаммом Pseudomonas ïluorescens 57 но параллельным путям, впервые установлено, что этот процесс имеет двухфазовый характер — в первой фазе преимущественно накапливается продукт окисления урацила — барбитуровая кислота, а во второй фазе трансформации преобладает восстановительный ■ путь деградации с образованием дигидроурапнла .и ß-уреидопропионо-вой кислоты,

9. Показано, что у многих штаммов бактерий родов Pseudomonas и Mycobacterium в качестве продукта трансформации оротовой кислоты параллельно с накоплением ли* глдрооротовой кислоты посредством деградации урнднловой кислоты образуется и урацил, а у Bacillus adhaerans трансформация оротовой кислоты в урацил может протекать и минуя стадии оротидиловой и уридиловой кислот,

10.'Впервые выявлена деградация 6-азаурндина почвенными микроскопическими грибами; обнаружено, что гриб Verti-cillium glaucum 112 расщепляет 6-азаурацил по параллельным — окислительному и восстановительному — путям катаболизма.

Основное содержание и результаты диссертации отражены в следующих работах:

1. Муйжниекс И. О. Метаболизм оротовой кислоты почвенными бактериями родов Pseudomonas и Mycobacterium.

В'кн.: Использование к трансформация пурииовых и пнримн-днновых соединении микроорганизмами. Рига, изд. ЛГУ, 1978, с. 4—22. • ...

2, Муйжниекс И. О., Витолс М. Я. Трансформация экзогенных цитидин- и гуанозин-5'-монофосфатов почвенными микроскопическими грибами, Там же, с. 23^33. ■ ■ 3; Buric L., Grinbcrg Л„ Muizniek I., Novak F., Vitot M., Dienstbier Z, Uracil metabolism irr golden hamster after irradiation. Internat. J. Radiat. Biol., v. 31, 1977, p, 2161—2169. " 4. Lismane A., Muizriieks I., Vitols M., CihakA., Skoda Л. Catobolic dégradation of 6-azauridine by Pseudomonas putida. Collect. Czech. Chem. Comm: v. 42, 1977,p. 2586—2593.

5. Muiznîcks I., Vitols M„ Maurina H- Hydrolitic deamina-tion of iree aminogroup containing nucleotides, Abstracts of thc 12/ft International Congress of Microbiology. München, 1978, p. 139. ■ '

6. -Витол M; Я, Вилке С. Р., Вольский В; Х„ Дакш Л. В., Лишман А. Я- Вульф'Л. Ял Муйжниекс И. О. Накопление микроорганизмами различных продуктов трансформации экзогенных пурнновых и лнримидиновых соединений. 3-й Всесоюзный биохимический съезд. Рефераты научных сообщений. Рига; 1974, т. 2, с; 235. ■■ - - - 1

■7. Медведева Л. В„ Муйжниекс И. О., Богданова H. Е. Окислительный и восстановительный путь катаболизма ура-цнла' бактериями рода Pseudomonas.*Te3HCbr докладов конференции молодых ученых по проблемам микробиологии и вирусологии, Рига, нзд. «Знатне», 1973, с. 40. ■" '8. Муйжниекс И. О.', 'Парумс Г. Я., -Шафранский А. Б. Выделение почвенных микроорганизмов, накапливающих ура-цнл в культурной среде. Тезисы докладов конференции молодых ученых по проблемам микробиологии и вирусологии. Рига, «Зкнатне», 1975, с. 5.'

9. Муйжниекс И, 0„ Стуре'А. >К. Катаболизм 6-азауридина п-почвенных .микроскопических грибах. Тезисы докладов 7-й конференции молодых ученых по проблемам микробиологии II вирусологии. Рига, изд. «Зинатне», 1977, с. 156—157.

10. Муйжниекс И. О., Ревелння В. Р., Фрейвалде В. А. Утилизация адениловых нуклеотидов я полинуклеотндов в почвенных микроскопических грибах. Там же, с. 157—15S.

л 418-го о/к-"—80 г.

Объем I к, л. Заказ 725. Тираж 10(1

Типография Московской с.-х. академии им. К. Л. Тимирязева 127550, Москва И-550, Тимирязевская ул., 44