Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Топоизомераза II и ее участие в незаконной рекомбинации

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Топоизомераза II и ее участие в незаконной рекомбинации"

Российская Академия Наук Институт биологии гена

На правах рукописи УДК 576.315.42

Иванова Ольга Николаевна

ТОПОИЗОМЕРАЗАIIИ ЕЕ УЧАСТИЕ В НЕЗАКОННОЙ РЕКОМБИНАЦИИ: ЭКСПЕРИМЕНТЫ В МОДЕЛЬНОЙ СИСТЕМЕ

Специальность 03.00.03 - молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидате биологических наук

Москва _

2006 обязательный i

бесплатный

экземпляр /

Работа выполнена в лаборатории структурно-функциональной организации хромосом Института биологии гена Российской Академии Наук.

Научные руководители:

чл.-корр. РАН, доктор биологических наук, профессор Разин C.B. н.с., кандидат биологических наук Быстрицкий A.A.

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, Куханова М.К.

доктор медицинских наук, профессор Альтштейн А.Д.

Ведущая организация:

Институт биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН

Защита диссертации состоится_июня 2006 года в_час.

на заседании Диссертационного совета Д 002.037 01 при Институте биологии гена РАН

по адресу: 119334, Москва, ул. Вавилова, д. 34/5.

С диссертацией можно ознакомиться

в библиотеке Института молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН по адресу: 119991, Москва, ул. Вавилова, д. 32.

Автореферат разослан_мая 2006 года.

Ученый секретарь Диссертационного совета канд.фарм.наук

Грабовская JI.C.

гоо<£ ft

Щ4А

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы

За последние годы появилось много данных, свидетельствующих о том, что противоопухолевая обработка с использованием специфичных в отношении топоизомеразы II агентов часто вызывает вторичные лейкозы, для которых характерны определенные хромосомные перестройки Толоизомераза II относится к семейству ДНК-топоизомераз - ферментов-регуляторов топологического состояния ДНК. Этот фермент способен релаксировать кольцевые молекулы ДНК (или петельные домены эукариотической ДНК) и разделять катенаны путём внесения временных двуцепочечных разрывов в ДНК. В определенных условиях (в частности, при подавлении лигирующей активности фермента) такие разрывы могут привести к хромосомным аберрациям Клетка обладает двумя основными механизмами репарации двуцепочечных разрывов: один из них основан на гомологичной рекомбинации (homologous recombination, HR), другой - на негомологичном соединении концов ДНК (non-homologous end joining, NHEJ) Для гомологичной рекомбинации необходимы протяженные области гомологии между репарируемыми участками, при этом возможно полное восстановление последовательности Белковый комплекс, осуществляющий NHEJ, соединяет тупые или липкие концы ДНК, возникшие при разрыве, даже при полном отсутствии гомологии. Считается, что этот комплекс осуществляет процессинг концов двуцепочечных разрывов, который может вести к делеции, дупликации или инверсии фрагментов ДНК. Было высказано предположение, что в ряде случаев транслокации могут возникать из-за ошибок У(0)Л-рекомбинации, однако такой механизм, по-видимому, возможен только в лимфоидных клетках.

Топоизомераза II, по-видимому, способна осуществлять негомологичную (или незаконную) рекомбинацию in vitro. В настоящее время рассматривается два механизма возникновения рекомбинаций при участии ДНК- топоизомеразы П. В соответствии с первой моделью (модель «субъединичного обмена») топоизомераза II и вносит двуцепочечные разрывы в ДНК, и «репарирует» их за счет своей лигазной активности При этом в результате обмена субъединиц между молекулами топоизомеразы II, связанными с разными участками хромосомы (хромосом) может произойти рекомбинация, следствием которой будет возникновение тех или иных хромосомных перестроек. Согласно альтернативной, «индукционной» модели, топоизомераза II только вносит двуцепочечные разрывы, а их репарация происходит за счет других клеточных систем. Используемые в качестве противораковых средств ингибиторы топоизомеразы II (доксорубицин, амсакрин, тенипозид, этопозид) блокируют ее репетирующую активность и оставляют ДНК в состоянии двуцепочечного разрыва, скрытого молеку-

1 |РОС. НАЦИОНАЛЬНАЯ

БИБЛИОТЕКА

t • ¡'К -г

ОЭ ¿Ш) йит^ 3

пой фермента Такие разрывы, по-видимому, репарируются путем NHEI Известно, что при работе этой системы репарации часто происходит неправильное соединение концов ДНК (особенно в тех случаях, когда в ДНК имеется много разрывов).

Таким образом, топоизомераза П представляет большой интерес и с теоретической, и с практической точки зрения Механизм действия и клеточные функции этого фермента до конца неясны Кроме того, топоизомераза П представляет большой интерес как мишень противоопухолевых лекарств Все это определяет большую важность дальнейшего изучения то-поизомеразы П, и в первую очередь - топоизомеразы П человека.

Целя и задачи исследовании.

В работе были поставлены следующие задачи:

1 Изучить возможность участия топоизомеразы П в незаконной рекомбинации in vitro и in vivo и определить механизм незаконной рекомбинации, опосредованной топоизомеразой Q.

2 Изучить влияние ингибитора топоизомеразы П на частоту незаконной рекомбинации

3. Проанализировать вопрос о том, чем детерминируется специфичность рекомбннационных событий, происходящих в условиях ингибирования активности ДНК-топоизомеразы II в живых клетках

Научная новизна н практическое значение работы.

В работе впервые продемонстрировано, что топоизомераза П способна стимулировать незаконную рекомбинацию in vivo в условиях ингибирования ее лигирующей активности Создана тест-система, позволяющая выявить рекомбинационные события и оценить их частоту С помощью этой системы показано, что в условиях ингибирования активности топоизомеразы П в живых клетках незаконная рекомбинация происходит преимущественно по «индукционному» механизму. Впервые показано, что «кластеры точек разрыва» хромосом сами по себе не являются участками повышенной рекомбиногенносги вне хромосомного контекста Проанализированы рекомбинантные клоны, полученные после индукции незаконной рекомбинации в живых клетках и картированы сайты, чувствительные к обработке ингибитором топоизомеразы П.

Полученные данные косвенно свидетельствуют о важной роли высших уровней организации хроматина в развитии хромосомных перестроек. Кроме того, сведения о предпочтительности индукционного механизма образования хромосомных перестроек, в клетках, обра-

2

ботанных ингибиторами топоизомеразы П, могут оказаться полезными при разработке стратегии предотвращения вторичных лейкозов, которые часто наблюдаются у пациентов, прошедших курс химиотерапии с использованием ингибиторов ДНК топоизомеразы П

Апробация работы.

Результаты диссертационной работы были представлены на международной конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2005), на международной конференции «XIXth International Workshop on the Cell Nucleus» (Вюрцбург, Германия, 2005) и на международной конференции Keystone Symposia «Nucleic Acid Enzymes» (Taoc, С1ИА, 2006).

Публикации.

По материалам диссертации опубликовано 6 печатных работ. Из них статей 3, материалов конференций 3.

Структура и объем работы.

Диссертация изложена на 509 страницах, содержит 23 рисунка и 2 таблицы и состоит из разделов: «Введение», «Обзор литературы», «Постановка задачи и методические подходы», «Материалы и методы», «Результаты исследования и их обсуждение», «Выводы» Список литературы включает 154 источника.

Результаты исследования

1. Создание модельной системы для количественной оценки частоты незаконной рекомбинации

Нами была создана модельная система, позволяющая обнаружить факт незаконной рекомбинации, а также оценить ее частоту. Используемый метод анализа основан на позитивном отборе делеционных вариантов модельной плазмиды Нами был сконструирован плазмидный конструкт, содержащий расположенный между двумя потенциально рекомби-ногенными последовательностями ген-«убийцу», наличие которого позволяет осуществлять позитивную селекцию делеционных мутантов (рис 1). В этом качестве нами был использован входящий в состав системы поддержания F-фактора ген ингибитора бактериальной гира-зы ccdB (или «KIL») работающий под контролем индуцибельного /ас-промотора (Bernard, 1994). Экспрессия этого гена в бактериальных клетках приводит к гибели бактерий. Делеция

Topoisomerase II

oriR

Amp

A BCD

Рисунок 1. Молельная система для изучения незаконной рекомбинация.

(А) Модельный конструкт содержит ивдуцибельный ген-«убийцу» (КЩ, фланкированный двумя потенциально рекомбиногенными элементами (I и II), ген устойчивости к ампициллину (AmpR), прокариотиче-ский (OnRp) и зукариотический (ОпЯе) ориджины репликации (В) Топоизомераза II связывается с участками, фланкирущими KJL, и образует ковалекгный адцукг («cleavable complex») с ДНК (С) Две молекулы то-поизомеразы П взаимодействуют между собой (а соответствии с моделью субьединичиого обмена) (D) Обмен субьединицами топоизомеразы II приводит к незаконной рекомбинации. При этом образуются две плазмиды, одна из которых не содержит бактериального участка начала репликации, и, следовательно, не может реплицироваться в бактериальных клетках, а другая не содержит KIL и таким образом устойчива к ИПТГ Рекомбинационные события, не приводящие к элиминированию гена-«убийцы», не детектируются в данной модельной системе

ccdB в результате незаконной рекомбинации между фланкирующими последовательностями позволяет бактериям расти и образовывать колонии в присутствии индуктора экспрессии ccdB (изопропилтио-р-О-галактопиранозид, ИГЛ Г).

В качестве потенциально рекомбиногенных фрагментов были использованы последовательности, часто вовлеченные в хромосомные перестройки in vivo, а именно третий Ъсг (breakpoint cluster region - участок предпочтительной локализации точек разрывов) человеческого гена AML] и второй Ъсг человеческого гена ЕЮ. Именно по этим участкам генов AML] и ЕТО часто происходят реципроктные рекомбинации, приводящие к хромосомным перестройкам, ассоциированным с острой миелоидной лейкемией (Zhang et al, 2002) Выбранные Ьст были встроены в вектор pSP73. Наличие в плазмиде двух разных Ьст позволяет исключить возможность гомологичной рекомбинации. Также модельная плазмида содержала ген устойчивости к ампициллину и участок начала репликации вируса SV-40, обеспечивающий возможность эписомиой репликации плазмиды в эукариотических клетках. На последней стадии клонирования в плазмиду между двумя Ьст был встроен ген ccdB Полученная плазмида была названа pKIL2BCR-ori.

Для адекватной оценки рекомбиногенности выбранных Ьст необходим также контрольный модельный конструкт, в составе которого ген ccdB окружен нерекомбиногенными последовательностями ДНК Поскольку суммарная длина двух Ьст достигает почти 6 т п н, необходима потенциально нерекомбиногенная последовательность сравнимой длины В качестве такой последовательности мы использовали длинный процессированный псевдоген рТТСЗ (также называемый LOC286495). Две равные части этого псевдогена были клонированы в исходный вектор вместо двух Ьст, т.е. вокруг гена-«убийцы». Полученный конструкт был назван pKIL2TTC-on.

Необходимо заметить, что финальные плазмиды могут содержать небольшое число промежуточных продуктов клонирования, а именно, катенанов, состоящих из плазмиды, содержащей KIL, «сцепленной» с исходным вектором, не содержащим KIL (рис. 2). После обработки топоизомеразой II в присутствии ингибиторов, топологически связанные интерме-диаты будут высвобождаться. Соответственно, при отборе рекомбинантов такие интермедиа™ будут вести себя подобно делециониым мутантам, так как они также не содержат ccdB, и, следовательно, будут давать колонии клеток, растущих в присутствии ИПТГ. Разумеется, оценка частоты незаконной рекомбинации при этом будет искажаться. Поэтому полученный модельный конструкт был предварительно подвергнут декатенированию и затем трансформирован в бактериальные клетки, которые в дальнейшем выращивались в присутствии и в отсутствие ИПТГ. На чашках без ИПТГ наблюдался нормальный рост бактериальных колоний, тогда как в присутствии ИПТГ роста колоний не наблюдалось.

Катенан, содержащий исходный вектор

Дальнейшие эксперименты

-IPTG +IPTG

vj

-IPTG +IPTG

Рисунок 2 Схем* декатенации.

При лигировании вставки KJL могут образоваться катенаны, где плазмида со вставкой «зацеплена» за исходный вектор, не содержащий KJL *>гот исходный вектор может в дальнейшем бьггь источником ложных рекомбинантов, так как не метает бактериям расти на среде с IPTG После декатенации (1) образуется смесь исходного вектора и целевой штазмиды, которой трансформируют Е Coli (!) Колонии, несущие исходный вектор, растут на среде с IPTG После этого отбирают клоны (3), несущие целевую плазмиду. Если декатенация прошла полностью, то при повторной декатенации (4) такая плазмида не дает колоний на среде с IPTG.

Количественная оценка частоты незаконной рекомбинации проводилась после помещения декатенированных модельных плазмид в потенциально рекомбиногенные условия и дальнейшей трансформации полученного материала в бактериальные клетки Клетки выращивали в присутствии ИПТГ. Частота рекомбинации определялась отношением числа Иш Г-устойчивых колоний, к общему числу колоний, выросших на среде, не содержащей ИПТГ.

2. Индукция незаконной рекомбинации in vitro

В первую очередь мы проанализировали возможность осуществления незаконной рекомбинации в минимальной in vitro системе, содержащей только саму топоизомеразу II, ее ингибитор и субстрат (модельные плазмиды). Для индукции незаконной рекомбинации 0,1

мкг полученной плазмиды инкубировали с 200 ед. топоизомеразы П в присутствии ионов магния и АТФ. В параллельном эксперименте в реакционную смесь добавлялся ингибитор топоизомеразы П VM-26 (тенипозид) Реакцию останавливали добавлением ЭДТА до 250мМ и NaCl до 1М, после чего выделяли ДНК, и проводили описанный выше тест на наличие делеционных мутантов. В случае использования в качестве субстрата плазмиды pKIL2BCR-ori нам не удалось обнаружить продукты незаконной рекомбинации ни при эксперименте с тени-позидом, ни без него. Для pKIL2TTC-ori частота незаконной рекомбинации составила 0,06% в отсутствие тенипозида и 0,07% в его присутствии. Возможно, такие результаты связаны с недостаточной чувствительностью системы. Таким образом, для определения механизма незаконной рекомбинации были абсолютно необходимы эксперименты in vivo.

3. Эписомная репликация модельных плазмид в эукариотических клетках.

Для анализа способности модельных конструктов к эписомной репликации в COS-1 клетках мы провели определение статуса метилирования плазмид (McWhinney and Leffak, 1990). Как известно, ДНК в бактериальных клетках метилируется c/am-системой (метальная группа при этом вводится в аденин в последовательности GATC). При репликации такой ДНК в эухариотической клетке dam-метилирование не воспроизводится; таким образом, в клетке начинает накапливаться ДНК, лишенная rfam-метилирования. Эндонуклеазы рестрикции, узнающие последовательность GATC, по-разному чувствительны к dam-

7

Рисунок 3. Эписомная репликация трансфеци-рованных плазмид.

Степень эписомной репликации трансфецирован-ных плазмид рКП.2ВСЯ-оп (1) и рК1Ь2ЧТТС-оп (2)

определялась как отношение числа ОрпЬустойчивых колоний к числу МЪоТ-устойчивых колоний (более подробно см в тексте)

метилированию- Mbol расщепляет только неметилированную, a DpnT - только метилированную ДНК. Для установления того, реплицируются ли наши конструкты в COS-1 клетках, из трансфецированных клеток через разные промежутки времени после трансфекции выделяли плазмидную ДНК, половину ее обрабатывали Mbol, а половину - Dpnl Полученным материалом трансформировали клетки Е coli и сравнивали количество колоний в обоих случаях Уже через несколько часов после трансфекции начинали появляться Dpnl-устойчивые колонии (т е неметилированная ДНК), с течением времени их количество увеличивалось (рис 3) Таким образом, мы удостоверились, что модельные конструкты, действительно, автономно реплицируются в COS-1 клетках.

4. Нуклеосомяый статус трансфецированных модельных плазмид

Мы проанализировали, организована ли трансфецированная в С08-1 клетки плазмидная ДНК в нуклеосомы Ядра клеток, содержащих рК1Ь2ВСЯ-оп, обрабатывали микрококковой нуклеазой, полученные фрагменты ДНК разделяли в агарозном гейе и переносили на фильтр При гибридизации с плазмидой рК1Ь2ВСЯ-оп был получен типичный нуклеосомный пат-

MN

transacted control sonicated transrectal control sonicated

12 } 4 5 < 7 t I ltU13>3 12 345*789 10 1112 13

I'll 4 t

Рисунок 4 Плазмиды в СОМ клетках организованы в нуклеосомы.

Результаты электрофореза в агарозном геле (слева) и саузерн-гибриднзацни этого же геля с тотальной ДНК рКИЛВСЯ-оп (справа). 1, маркер (длины фрагментов в т.п н указаны слева), 2, очищенная линеаризованная ДНК рКД.2ВСЯ-оп, 3, тотальна» ДНК ядер клеток СОЗ-1, трансфецированных рКШВСЯ-оп, тотальна* ДНК «дер клеток СС№-1, трансфецированных рК1Ь2ВСЛ-оп, обработанная увеличивающимися количествами микрококковой нуклеазы; 7-9, ДНК нетрансфеци-рованных С05-1 клеток обработанная микрококковой нуклеазой; 10, разрушенная ультразвуком очищенная ДНК рК1Ь2ВСЯ-оп; 11-13, разрушенная ультразвуком очищенная ДНК рКД.2ВСЯ-ол, смешанная с обработанной микрококковой нуклеазой ДНК СОЯ-1 клеток

терн (рис 4) Однако существует возможность того, что наблюдаемая при гибридизации картина объясняется случайной сорбцией пробы на районы с наибольшим содержанием ДНК -т е на моно- и олигомеры нуклеосом геномной эукариотической ДНК Для проверки этого предположения ДНК плазмиду pKIL2BCR-ori, разрушенную ультразвуком на фрагменты размером 200-1000 п н, смешивали с нуклеосомным маркером из нетрансфецированных клеток Характерного нуклеосомного паттерна при этом не наблюдалось Таким образом, наблюдаемый при гибридизации нуклеосомный паттерн действительно отражает организацию плазмидной ДНК в нуклеосомы.

5. Индукция незаконной рекомбинации in vivo и влияние ингибиторов.

Следующим шагом работы было изучение частоты незаконной рекомбинации автономно реплицирующихся конструктов в COS-1 клетках Мы обнаружили, что уже через 12

часов после трансфек-ции в клетках начинает накапливаться реком-бинантная ДНК С течением времени, прошедшего от трансфек-ции до выделения ДНК, частота незаконной рекомбинации между Ьсг AML и ЕТО растет (рис. 5) При этом из модельных конструктов, аналогичных используемым, но не содержащих участка начала репликации, ре-комбинантных клонов получено не было Эти данные могут свидетельствовать о том, что репликация плазмид в COS-1 клетках стимулирует незаконную рекомбинацию.

Рисунок S. Частота незаконной рекомбинации зависит от времени.

Частота незаконной рекомбинации pKIL2BCR-on (I) и pKIL2TTC-оп (II), трансфеиированных в клетки COS-1, определялась в разные моменты времени после трансфекшш. Вертикальными линиями показано стандартное отклонение. Приведены результаты четырех независимых экспериментов

* 35 30 25

20

+VM-26

•tgq --

Д5»»>

-VM-2t

+VM-26

>Ъ-> К.

pKIMBCR-ori

pKIL2TTC-ori

В дальнейших экспериментах мы выделяли плазмид-ную ДНК через 16-18 часов после трансфекции. При этом, с одной стороны, проходит достаточное количество раундов эписомной репликации, обеспечивающей возможность получения достаточных для дальнейших манипуляций количеств выделяемой ДНК, а с другой стороны, частота незаконной рекомбинации еще относительно невелика (около 8%)

Чтобы определить, действительно ли наблюдаемая незаконная рекомбинация опосредована топоизомеразой П,

COS-1 клетки, трансфецированные различными модельными конструктами, инкубировали в течение 1 часа с ингибитором VM-26. После инкубации среду, содержащую ингибитор, заменяли на свежую и культивировали COS-1 клетки в течение еще 2 ч. Затем плазмидную ДНК выделяли по модифицированному методу Hirt (Hirt, 1967) и определяли частоту незаконной рекомбинации, как описывалось ранее. Задержка между обработкой клеток ингибиторов и выделением ДНК была введена для того, чтобы успела пройти репарация концов ДНК, соединенных с топоизомеразой П в ковалентный аддукт (в случае, если такая репарация необходима - как предсказывает одна из моделей процесса). Обработка клеток 40цМ VM-26 приводила к увеличению частоты рекомбинации в 1,6 раза по сравнению с необработанными клетками Это позволяет нам утверждать, что ингибирование активности топоизо-меразы П стимулирует процесс незаконной рекомбинации. Кроме того, было обнаружено, что частота незаконной рекомбинации как в отсутствие, так и в присутствии ингибитора то-поизомеразы Ü была выше в контрольном, предположительно нерекомбиногенном конструкте, чем в конструкте, содержащем Ьст.

Рисунок 6. Незаконная рекомбинация стимулируется ингибитором топоизомерязы П.

Приведены частоты рекомбинации конструкций рКП.2ВСЯ-оп и рКШ2ТТС-ол (трансфецированных в клетки СОв-1) в отсутствие и в присутствие ингибитора топоизомеразы II тенщто-зида (УМ-26) Показаны усредненные результаты 7 независимых экспериментов.

6. Картирование участков разрыва в рекомбинантных плазмидах.

А4

А5

« » •

» » « * ЗГ •

* * *

- * »

М >■ »

* - «V *

- * » »

• * а

■ • * ~

* К* Щ /г

Информация о нуклеотидной последовательности полученных ре-комбинантов, безусловно, очень важна для понимания механизмов репарации двуцепочечных разрывов. Однако протяженность каждого из Ьсг составляет около 3000 п.н., поэтому прямое секвенирование рекомбинан-тов не представлялось возможным Сначала необходимо провести приблизительное картирование позиций точек разрыва. Для такого оценочного картирования мы использовали метод чип-гибридизации. Учитывая, что для получения достоверных результатов нужно проанализировать существенное количество рекомби-нантных клонов, и, помимо этого проводить несколько независимых экспериментов, мы применили «инверсную» чип-гибридизацию: на фильтре иммобилизовали анализируемые ДНК, и гибридизовали такие фильтры с мечеными олигонуклеотидными пробами. Нами были подобраны олигонуклеотиды, равномерно распределенные по двум Ьсг с шагом около 300 п н Отсутствие гибридизации одной или нескольких проб рассматривалось как доказательство делеции соответствующего участка в рассматриваемом рекомбинанте

Анализ полученных данных показал наличие нескольких кластеров точек разрывов внутри каждого из Ьсг (рис 8) Интересно, что в некоторых участках частота делеций в присутствии и в отсутствие ингибитора была примерно одинаковой; в то же время в других областях Ьсг наблюдалась явная стимуляция рекомбинации в присутствии ингибитора Так, например, участки А5, А7, А9, и, возможно, А8 Ьсг гена АМЬ и участки Е1, Б4, Еб и Е8 Ьсг гена ЕЮ отличаются повышенной чувствительностью к обработке УМ-26.

Рисунок 7. Инверсная чип-гнбридимция.

Приведены результаты гибридизации дот-блота ДНК клонов-продуктов незаконной рекомбинации модельных конструкций с олигонуклеотидными пробами А4 и А5

Обсуждение результатов

В

AML-1 Ьсг

M Ai МММ ММ «ММ t t t t

ET© Ьсг

Разработанная нами тест-система представляет собой простой и удобный метод количественной оценки незаконной рекомбинации. Наличие в модельных плазмидах эукариотическо-

го участка начала репликации вируса SV-40 позволяет плазмидам автономно реплицироваться в COS-1 клетках. При разработке системы особенный интерес представляли потенциально рекомби-ногенные элементы, участвующие в транслокациях in vivo, а именно Ьсг генов AML и ЕТО человека. Эти участки генома принимают участие во множестве транслокаций, ассоциированных с лейкозами. Система позволяет детектировать рекомбинационные события и оценивать их частоту Следует отметить, что такая система может быть использована для тестирования рекомбиногенных событий, на любых последовательностях ДНК Для этого достаточно всего лишь заменить в нашей модельной системе Ьсг на интересующие последовательности ДНК Наша модельная система может быть использована для изучения реком-биногенного эффекта различных (в том числе лекарственных) соединений, не обязательно являющихся ингибиторами ДНК топои-зомеразы II. Тем не менее, система

» H « й б S t t t t

Рисунок 8. Распределение событий незаконной рекомбинации по длине участков Ьсг.

Темными и светлыми стобцами показаны частоты рекомбинации в отсутствие и в присутствии ингибитора то-поизомеразы П, соответственно Стрелками снизу показаны участки, незаконная рекомбинация в которых стимулируется при ингибировании топонзомеразы II Весторная часть плазмиды находится слева (пробы АО/ЕО), ген-«убийца» - справа (А9/Е8) Вертикальными линиями показано стандартное отклонение (для пяти независимых экспериментов)

имеет некоторые ограничения; так, рекомбинационные события, не приводящие к делеции гена ccdB, а также рекомбинация между двумя плазмидами, в данной системе не обнаруживаются Однако, вряд ли механизмы межмолекулярной и внутримолекулярной рекомбинации имеют принципиальные различия. Наша система, основанная на детекции внутримолекулярной рекомбинации, имеет одно важное преимущество: результаты количественного анализа рекомбинации не зависят от концентрации модельной плазмиды. В то же время, для обнаружения рекомбинационных событий, происходящих между двумя плазмидами (например, с различными маркерами), необходимо, чтобы концентрация используемых плазмид была абсолютно одинаковой.

В настоящее време в химиотерапии рака в качестве противоопухолевых средств широко применяются различные ингибиторы топоизомеразы II (Li and Liu, 2001; Fortune and Osheroff, 2000) Однако использование таких агентов часто приводит к вторичным лейкозам, возникающим, по-видимому, в результате хромосомных перестроек (Felix, 1998; Ratain and Rowley, 1992; Leone et al, 2001). В свою очередь, такие перестройки возникают как результат незаконной рекомбинации. Существующие модели предполагают, что топоизомераза П может быть вовлечена в индукцию незаконной рекомбинации либо напрямую (Bae et al., 1988), путем реципрокного обмена субъединиц фермента, либо косвенно, путем внесения двуцепо-чечных разрывов в ДНК и дальнейшей активации репарирующей системы NHEJ (Bystritstóy and Razin, 2004) Нам не удалось детектировать рекомбинационные события в in vitro системе. Напротив, проводя индукцию незаконной рекомбинации in vivo, мы обнаружили, что даже без ингибирования топоизомеразы И частота рекомбинации in vivo значительно превосходит таковую в минимальной in vitro системе По-видимому, в живых клетках основное количество рекомбинационных событий, возникающих в условиях ингибирования активности ДНК топоизомеразы П,происходит по «индукционному» механизму, те топоизомераза П только вносит двуцепочечные разрывы, неправильная репарация которых нередко приводит к хромосомным перестройкам. Это следует из того, что появление рекомбинационных событий происходит при переходе от минимальной in vitro системы к клеткам - т.е. когда появляется возможность репарации вносимых топоизомеразой II разрывов. Ингибирование топоизомеразы II тенипозидом повышало частоту рекомбинационных событий. Это позволяет нам утверждать, что топоизомераза П действительно может индуцировать незаконную рекомбинацию в живых клетках.

В настоящее время причины неравномерного распределения точек разрыва внутри хромосом неизвестны Для установления того, влияет ли на «рекомбиногенность» определенного участка ДНК его нуклеотидная последовательность, необходимо было сравнить частоты рекомбинации модельного конструкта, содержащего различные виды мишеней. Чтобы отве-

тить на вопрос, являются ли Ьсг сами по себе участками повышенной рекомбиногенности, нами был сконструирован контрольный конструкт, содержащий вместо Ьсг потенциально нерекомбиногенные последовательности. Однако заранее предсказать, какие именно последовательности не будут рекомбинироватъ, невозможно Мы исходили из следующей предпосылки- нахождение «горячих точек» рекомбинации (или каких-либо специфических реком-биногенных последовательностей) менее вероятно внутри последовательностей действующих генов (т.к такие варианты элиминируются действием отбора) Поскольку суммарная длина двух Ьсг достигает почти б т.п.н., нам была необходима кодирующая последовательность сравнимой длины В геноме человека столь протяженные открытые рамки считывания встречаются достаточно редко Кодирующую последовательность нужной длины можно получить с помощью RT-PCR из подходящей по размеру мРНК, однако подбор условий для амплификации столь длинных фрагментов весьма сложен технически. В то же время, человеческий геном содержит множество процессированных псевдогенов, имеющих длинные открытые рамки считывания. В большинстве случаев псевдогены не образуют функциональные транскрипты и таким образом не подвергаются действию отбора. Хотя такая ситуация приводит к накоплению большого числа мутаций (в том числе и повышающих рекомбино-генность), открытые рамки считывания в эволюционно недавних псевдогенах вряд ли значительно отличаются от них же в генах-прототипах Таким образом, они, по-видимому, должны быть менее рекомбиногеины, чем выбранные случайным образом фрагменты генома. Поэтому в качестве протяжённой кодирующей последовательности решено было использовать длинный процессированный псевдоген.

Поиск подходящего по размеру псевдогена осуществлялся в базе данных псевдо! енов человека (Zhang et al., 2003, http://biomfombb.vale.edu/genome/pseudogene'). По состоянию базы данных на момент поиска был найден только один псевдоген, длина которого превышала бы 6 т п н. - у/ТТСЗ (6,5 т.п.н) Псевдоген у/ТТСЗ (официальное обозначение LOC28649S) находится в Х-хромосоме (локус Xql3.3), его предковый ген расположен на 21-й хромосоме в области 21q22.2. Предковый ген кодирует белок под названием ТТСЗ. Функция этого белка неизвестна (Ohira et al, 1996). Псевдоген у/ТТСЗ отсутствует у ближайших родственников Н sapiens - шимпанзе и гориллы, то есть, по-видимому, является практически «новообразованным» псевдогеном. Сравнение последовательностей у/ТГСЗ и ТТСЗ показало, что они на 82% идентичны на уровне нуклеотидной послеовательности и на 92% - на белковом уровне Исходя из всего вышеперечисленного, мы решили, что данный псевдоген не должен отличаться повышенной рекомбиногенностью, и подходит для наших целей.

Анализ частот рекомбинации у двух различных конструктов показал, что Ьсг не являются элементами повышенной рекомбиногенности по сравнению с предположительно нейтраль-

ным псевдогеном В случае, если бы Ьст обладали характерными свойствами, делающими их предпочтительными мишенями для топоизомеразного расщепления, можно было бы ожидать заметной кластеризации точек разрыва внутри исследуемых Ьсг Однако проведенный нами анализ полученных рекомбинантов не выявил значительной концентрации точек разрыва внутри Ьсг. Мы предложили два возможных объяснения этого неожиданного результата Первое из них заключается в том, что Ьсг могут не являться участками кластеризации первичных рекомбинационных событий. Стоит заметить, что Ьсг являются частью функциональных генов, кодирующих белки, и то, как эти белки работают в клетке, не может не отражаться на функционировании кодирующих их генов. Кластеризация точек разрыва внутри Ьсг, наблюдаемая в предыдущих работах, может быть результатом клональной селекции, а не отражать особенности собственно рекомбинации (Уманская и соавторы, 2005). Второе возможное объяснение предполагает, что рекомбиногенные свойства Ьсг проявляются исключительно в нативном хромосомном окружении, т.е. что позиции предпочтительных точек рекомбинации определяются способом пространственной организации ДНК в ядре (Яагш, 1999).

Мы показали, что в СОБ-1 клетках трансфецированные модельные конструкты организованы в нуклеосомы. Однако, высшие уровни организации хроматина, в том числе упаковка 30 нм фибриллы в прикрепленные к ядерному матриксу петли не могут быть воспроизведены в нашей модельной системе.

Выводы

Создана тест-система для количественной оценки частоты незаконной рекомбинации в живых клетках.

Продемонстрировано, что подавление активности топоизомеразы П в живых клетках стимулирует процесс незаконной рекомбинации.

Показано, что в живых клетках основная часть событий незаконной рекомбинации, опосредованной топоизомеразой П, происходит по индукционному механизму.

Продемонстрировано, что на уровне первичной структуры ДНК Ьсг не несут никаких сигналов, определяющих их повышенную рекомбижиенность.

Список печатных работ, опубликованных по теме диссертации.

1. О.Н. Уманская. А.А Быстрицкий, С.В. Разин. Кластеризация точек разрыва при хромосомных перестройках' Влияние кпонально-селекционного механизма Мол. Биол., 2005, т. 39, №3: стр. 355 - 363.

2. О Н. Уманская. Е.С. Юдинкова, С.В. Разин, А.А. Быстрицкий. Ингибирование толои-зомеразы П в живых клетках стимулирует процесс незаконной рекомбинации. Докл. Акад. Наук, 2005, т. 405, №3: стр. 419 - 421.

3 OlgaN Umanskava. Svetlana S. Lebedeva, Alexey A. Gavnlov, Andrey A. Bystritskiy and Sergey V. Razin Inhibition of DNA topoisomerase П may trigger illegitimate recombination in living cells- experiments with a model system. J Cell Biochem, 2006, in press.

4. О H Уманская, А.А. Быстрицкий, Е.С. Юдинкова, С В. Разин. Незаконная рекомбинация, опосредованная топоизомеразой П при ингибировании ее противоопухолевыми агентами IX конференция молодых ученых, Пущино, 18-22 апреля 2005, стр. 57.

5. Umanskava O.N.. Bystritskiy А.А., Razin S V The illegitimate recombination of DNA mediated by topoisomerase II under its inhibition by the antitumor agents. XlXth International Workshop on the Cell Nucleus. Wueraburg, Germany, September 1-5,2005, p 43.

6. О Umanskava. S. Lebedeva, A. Bystritskiy, S Razin. DNA-Topoisomerase П Can Induce but not Accomplish Illegitimate Recombination Process. Keystone Symposia "Nucleic Acid Enzymes". Taos, NM, USA, February 11-16,2006, p.68.

06 1*21*

Напечатано с готового оригинал-макета

Издательство ООО "МАКС Пресс" Лицензия ИД N 00510 or01.12.99 г Подписано к печати 04.05.2006 г. Формат 60x90 1/16. Усл.печл. ! ,25. Тираж 70 экз. Заказ 327. Тел. 939-3890. Тел./факс 939-3891. 119992, ГСП-2, Москва, Ленинские горы, МГУ им. М В. Ломоносова, 2-й учебный корпус, 627 к.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Иванова, Ольга Николаевна

Содержание.:.

Список сокращений и терминов, использованных в работе.

Введение.

Обзор литературы.

Точки разрывов при хромосомных перестройках.

Хромосомные перестройки и ассоциированные с ними заболевания.

Группы химерных белков.

Кластеры точек разрыва.

Механизм рекомбинации.

Структура белка и кажущаяся кластеризация точек разрыва.

Роль ядерной архитектуры в образовании хромосомных перестроек.

Структура и механизм действия топоизомераз II типа.

Основные свойства топоизомераз II.

Структура белка.

Механизм действия.

Клеточная роль топоизомеразы II.

Репликация.

Транскрипция.

Конденсация хромосом.

Рекомбинация.

Ингибирование топоизмеразы II.

Постановка задачи и методические подходы.

Материалы и методы.

Приготовление и трансформация компетентных клеток Е. coli.

Трансформация бактериальных клеток.

Манипуляции с плазмидной ДНК.

Полимеразная цепная реакция.

Выделение бакмидной ДНК из бактерий.

Положительная селекция клонов, содержащих KIL.

Декатенация плазмид.

Индукция незаконной рекомбинации in vitro.

Трансфекция.

Выделение плазмидной ДНК из эукариотических клеток.

Радиоактивное мечение олигонуклеотидов и гибридизация их с ДНК.

Обработка ядер микрококковой нуклеазой и Саузерн-гибридизация.

Конструирование плазмид.

Результаты исследования и их обсуждение.

Создание модельной системы для количественной оценки частоты незаконной рекомбинации.

Проверка функционирования гена KIL.

Декатенирование модельных конструктов.72.

Количественная оценка частоты незаконной рекомбинации.

Индукция незаконной рекомбинации in vitro.

Эксперименты in vivo.

Эписомная репликация модельных плазмид в эукариотических клетках.

Индукция незаконной рекомбинации in vivo и влияние ингибиторов.

Предположительная модель действия топоизомеразы II.

Картирование участков разрыва в рекомбинантных плазмидах.81"

Нуклеосрмный статус трансфецированных модельных плазмид.

Выводы.

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Иванова, Ольга Николаевна

1. Создана тест-система для количественной оценки частоты

незаконной рекомбинации в живых клетках. 2. Продемонстрировано, что подавление активности

топоизомеразы II в живых клетках стимулирует процесс незаконной

рекомбинации. 3. Показано, что в живых клетках основная часть событий

незаконной рекомбинации, опосредованной топоизомеразой П, происходит

по индуьщионному механизму. 4. Продемонстрировано, что на уровне первичной структуры ДНК

Ьсг не несут никаких сигналов, определяющих их повышенную

рекомбиногенность.