Тканеспецифичная галактозидаза растительных волокон, формирующих клеточную стенку желатинозного типа

Мокшина, Наталья Евгеньевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Тканеспецифичная галактозидаза растительных волокон, формирующих клеточную стенку желатинозного типа
ВАК РФ 03.01.05, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "Тканеспецифичная галактозидаза растительных волокон, формирующих клеточную стенку желатинозного типа"

На правах рукописи

Мокшина Наталья Евгеньевна

ГКАНЕСИЕЦИФИЧНАЯ ГАЛАКТОЗИДАЗА

РАСТИТЕЛЬНЫХ ВОЛОКОН, ФОРМИРУЮЩИХ КЛЕТОЧНУЮ СТЕНКУ ЖЕЛАТИНОЗНОГО ТИПА

03.01.05 - физиология и биохимия растений

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

004(507060

Казань-2010

004607060

Работа выполнена в лаборатории механизмов роста растительных клеток Учреждения Российской академии наук Казанского института биохимии и биофизики Казанского научного центра РАН

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор Горшкова Татьяна Анатольевна

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Калебина Татьяна Сергеевна (МГУ, Москва)

доктор биологических наук, профессор Хохлова Людмила Петровна (КГУ, Казань)

Ведущая организация:

Институт фундаментальной биологии и биотехнологии Сибирского Федерального университета, Красноярск

Защита состоится 28 июня 2010 г. в 11 часов на заседании диссертационного совета Д 002.005.01 по защите докторских и кандидатских диссертаций при Учреждении Российской академии наук Казанском институте биохимии и биофизики КазНЦ РАН по адресу: 420111, г. Казань, ул. Лобачевского, д. 2/31, а/я 30, тел/факс (843)2927347.

С диссертацией можно ознакомиться в Центральной научной библиотеке Казанского научного центра РАН.

Автореферат разослан мая 2010 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук ^^ШёССС^ A.B. Иванова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Постановка проблемы и се актуальность. Клеточная стенка растительных клеток выполняет многообразные функции, среди которых наиболее выраженной является механическая. При этом клеточные стенки могут не только служить статичной опорой, но и обладать свойствами, способствующими перемещению частей растения в пространстве. Такие свойства характерны для вторичных клеточных стенок желатинозного типа, которые формируются только в растительных волокнах и отличаются от классического, ксиланового, типа вторичных клеточных стенок высоким содержанием целлюлозы, продольной ориентацией ее микрофибрилл, особым составом полисахаридов матрикса и низким содержанием лигнина (Горшкова, 2007). Особый состав и структура клеточной стенки желатинозного типа обуславливают наличие контрактильных свойств, которые основаны на создании в клеточной стенке натяжения (Clair et al., 2006).

Механизм создания натяжения в клеточных стенках желатинозного типа остро дискутируется. Основные предложенные гипотезы сводятся к пассивному набуханию клеточных стенок желатинозного типа при ограничении их объема окружающими слоями ксилановой клеточной стенки (Goswami et al., 2008), или к натяжению латерально взаимодействующих микрофибрилл целлюлозы при попадании между ними полисахаридов матрикса (Mellerowicz et al., 2008). Последний механизм подразумевает, что создание натяжения в клеточной стенке основано на активных метаболических процессах. Такие процессы предполагаются, в частности, для тканеспецифичного галактана, накопление которого сопряжено с формированием вторичной клеточной стенки флоэмных волокон льна и конопли (Gorshkova et al., 1996, 2004; Gorshkova, Morvan, 2006). Этот полисахарид построен как сложный рамногалактурокан I с боковыми цепочками, состоящими, в основном, из Р-(1—¡4)-связанной галактозы, составляющей основную массу полимера. После встраивания галактана в клеточную стенку происходит значительное уменьшение его молекулярной массы (Gurjanov et al., 2008), что может быть связано с укорочением боковых цепочек полимера. Гидролиз боковых цепочек галактана in vivo теоретически возможен в результате действия эндогенной галактозидазы и/или эндогалактаназы. Выявление и характеристика фермента, осуществляющего постсинтетические модификации тканеспецифичного галактана, позволит существенно дополнить картину процессов, происходящих при формировании вторичной клеточной стенки желатинозного типа и выявить ключевые элементы в механизмах ее функционирования.

Цель и задачи исследования. Целью работы было выявление и характеристика фермента, обеспечивающего постсинтетические модификации галактана в ходе формирования клеточной стенки желатинозного типа.

Были поставлены следующие задачи:

1. Оценить эндогалактаназную и галактозидазную активность в тканях стебля льна, содержащих волокна на разных стадиях развития.

2. Выделить и очистшъ фермент, идентифицировать и охарактеризовать его методами протеомики и биоинформатики.

3. Получить антитела к анализируемому белку. Установить субклеточную локализацию фермента в тканях стебля льна. Определить наличие и локализацию белка в тканях других растений, волокна которых формируют клеточную стенку желатинозного типа

4. Охарактеризовать особенности формирования клеточной стенки желатинозного типа у трансгеняых растений льна с антисмысловой конструкцией к гену выявленного фермента.

Научная новизна работы. С помощью комплекса подходов впервые охарактеризован тканеспецифичный бачок волокон желатинозного типа, который идентифицирован как (3-галактозидаза. Выявлена активация экспрессии гена этого фермента при переходе волокон к формированию клеточной стенки желатинозного типа. С помощью наработанных антител продемонстрирована локализация фермента во флоэмных волокнах льна, где он обнаруживается совместно с тканеспецифичным галактаном в секретируемых пузырьках аппарата Гольджи и во вторичной клеточной стенке желатинозного типа. Установлено наличие аналогичной Р-галакгозидазы в клеточной стенке желатинозного типа волокон растений различной таксономической принадлежности и образуемых различными меристемами, что указывает на наличие у них сходных механизмов формирования клеточных стенок желатинозного типа и существенную роль в них {3-галактозидазы. Снижение уровня экспрессии тканеспецифичной [5-галактшидазы путем введения антисмысловой конструкции к соответствующему гену приводит к нарушению нормального хода трансформации слоев клеточной стенки, что доказывает ключевую роль фермента в формировании ее надмолекулярной структуры и свидетельствует о необходимости активной метаболической составляющей в функционировании клеточной стенки желатинозного типа.

Научно-практическая значимость работы. Представленные в работе результаты вносят вклад в понимание механизмов образования и функционирования вторичной клеточной стенки желатинозного типа, которая характерна для многих хозяйственно ценных культур. Полученные представления об участии тканеспецифичного фермента в формировании надмолекулярной структуры клеточной стенки позволяют развить биотехнологические подходы для целенаправленного изменения свойств клеточной стенки и, следовательно, качества волокна. Разработанная совокупность подходов для идентификации, характеристики и установления роли индивидуального фермента может быть использована при исследовании других белков растительной клетки.

Связь работы с научными программами и собственный вклад автора в исследования. Исследования проводились в соответствии с планами НИР КИББ КазНЦ РАН (номер госрегистрации 0120.0 408625); частично поддержаны грантами РФФИ № 06-04-48853, № 08-04-00845, № 09-04-97038. Научные положения и выводы диссертации базируются на результатах собственных исследований автора

Апробация работы. Материалы диссертации докладывались на итоговой научной конференции КГУ (Казань, 2005), VI съезде Общества физиологов растений России (Сыктывкар, 2007), Di Международной конференции по клеточной стенке (Копенгаген, Дания, 2007), Международной конференции «Pectins and Pectinases» (Вагенинген, Нидерланды, 2008), IV съезде Российского общества биохимиков и молекулярных биологов (Новосибирск, 2008), Международной конференции по астительным полисахаридам «PPW 2008» (Сигтуна, Швеция, 2008), Международном симпозиуме по углеводам «ICS 2008» (Осло, Норвегия, 2008), Гордоновской конференции по растительной клеточной стенке (Смитфилд, США, 2009), годичном обрании общества физиологов России (Апатиты, 2009), IV Российском симпозиуме Белки и пептиды» (Казань, 2009), Международной конференции по растительным олокнам «Plant fibers: view of fundamental biology» (Казань, 2009), итоговых онференциях КИББ КазНЦ РАН (2009,2010).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 16 работ. Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 136 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания объектов методов исследования, изложения и обсуждения результатов, заключения, выводов списка литературы. В работе представлено 5 таблиц и 42 рисунка Список итерагуры включает 155 источников, в том числе, 138 - иностранных.

1. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 1.1. Объекты исследований. Объектом исследований служили растения льна-олгунца (Linum usitatissimum L.) сорта Могилевский из коллекции ВНИИ льна (г. оржок). Растения выращивали в условиях вегетационного опыта в ящиках со слоем очвы 50 см на открытом воздухе при естественном освещении и ежедневном поливе, i качестве ориентира при фиксации образцов было выбрано положение на стебле точки слома», которая служит маркером перехода волокон от стадии интрузивного алинения (выше «точки слома») к стадии формирования вторичной клеточной стенки (ниже «точки слома») (Gorshkova et al., 2003). В большинстве экспериментов образцы фиксировали на стадии быстрого роста растений (30-40 дней после посева), когда на стебле четко определялась «точка слома».

Для получения препаратов галактана и ассоциированного с ним белка участки стебля льна ниже «точки слома» разделяли на волокнистую и ксилемную части и использовали волокнистую часть (10 см) участков стебля. Для определения р-

галактозидазной активности с помощью о-нитрофенил-р-0-галактопиранозида использовали участки стебля длиной 5 см выше и ниже «точки слома». Для обработки срезов флуорогенным субстратом и анализа методами микроскопии фиксировали участки стебля, отобранные в средней части отрезков стебля выше и ниже «точки слома».

Для установления локализации ß-галактозидазы в гетерологичных растениях использовали участки из средней части стебля конопли (Cannabis sativa L.) (растения были выращены на экспериментальном поле НИИСХ г. Цивильска, Чувашия) и древесины натяжения тополя (Populus trémula L х P. tremuloides Michx.) (образцы были отобраны сотрудниками Университета Умеа, Швеция).

Трансгенные растения льна (семена были предоставлены сотрудниками Университета Алберты, Канада), выращивали в тех же условиях, что и немодафициованные растения. Для анализа ß-галактозидазной активности, содержания свободной галактозы, фракционирования клеточной стенки, а также оценки уровня экспрессии ß-галактозидазы использовали волокнистые участки стебля ниже «точки слома» длиной 15 см. Для анализа растений с помощью методов микроскопии фиксировали участки стебля длиной 0.5 см, отобранные в середине отрезка от «точки слома» до основания стебля.

Количество биологических повторносгсй во всех экспериментах - 3, аналитических повторов - 2-3.

1.2. Анализ низкомолекулярных углеводов. Для определения содержания свободных моносахаридов использовали супернатант гомогената тканей участков стебля льна после осаждения нерастворимого растительного материала центрифугированием (осветленный гомогенат). Моносахаридный анализ проводили без гидролиза и после гидролиза (2М ТФУ при 120°С в течение 1 ч) методом высокоэффективной анионообменной хроматографии на колонке CarboPac РА 1 (4x250 мм) с пульс-амперометрическим детектором (Dionex, США).

U. Измерение ß-галактозидаиюй активности с помощью искусственных субстратов. Для определения ß-галакшзидазной активности в анализируемых фракциях в качестве субстрата использовали о-нитрофенил-р-О-галактопиранозид. Высвобождение о-нитрофенола (o-NP) фиксировали при 420 нм на спектрофотометре (Perkin Elmer, США). Одна единица ß-галактозидазной активности соответствовала количеству фермента, необходимого для гидролиза субстрата с образованием 1 нМ о-NP за 1 мин в условиях реакции.

Для установления ß-галактозидазной активности на срезах использовали флуорогенный субстрат резоруфин-Р-О-галактопиранозид. Субстрат растворяли в ДМСО до 10 мМ, затем в PBS (pH 7.4). Концентрация рабочего раствора составляла 10 мкМ. Препараты просматривали на конфокальном лазерном микроскопе LSM 510 Meta (Carl Zeiss, Германия). Для регистрации флуоресценции был использован HeNe-

лазер с длиной волны возбуждения 543 нм, запирающий фильтр - 560 - 615нм.

1.4. Выделение тканеспецифичного галактана и ассоциированного с ним белка. Пробы растительного материала гомогенизировали в жидком азоте с добавлением 10 мМ Na-ацегатного буфера (pH 5.5). Полимеры, попадающие в супернатаят гомогената ткани, осаждали 80% этанолом. Фракцию полимеров, содержащую тканеспецифичный галакган, экстрагировали из осадка 1 мл 10 мМ Na-ацетатного буфера (pH 5.5). Разделение полученной фракции проводили на колонке с сефарозой CL-4B (0.9x90 см, Pharmacia, Швеция) при 8°С. В ходе выделения галактана и ассоциированного с ним белка на всех этапах во фракции добавляли коктейль ингибиторов протеаз (Sigma, США). Для определения содержания углеводов во фракциях использовали фенольный метод определения моносахаридов Дюбуа (Dubois et al., 1956). Концентрацию белка определяли по методу Бредфорд (Bradford, 1976). Белки из препарата высокомолекулярного галактана осаждали 80% ацетоном и разделяли с помощью одномерного электрофореза.

1.5. Постановка одномерного электрофореза по Лэммли. Электрофорез белков проводили в денатурирующих условиях в 8.5% Na-ДЦС-ПААГ (Laemmli, 1970) с использованием мини-камеры VE-1M (Хеликон, Россия). Гели фиксировали, окрашивали Кумасси бриллиантовым синим R-250.

1.6. Идентификация белков методами протеомики. После проведения одномерного электрофореза вырезанный кусочек геля подвергался трипсинолизу. Далее проводили ВЭЖХ МС/МС анализ с использованием ионной ловушки ХСТ 1100 (Agilent Technologies, США) (Hotte, Deyholos, 2008). Идентификация белка осуществлялась при помощи программы Mascot (www.matrixscience.com).

1.7. Анализ аминокислотной последовательности белка с помощью методов иоинформатики. Нуклеотидную последовательность выявленного гена ß-галактозидазы транслировали в программе по работе с иуклеотидными последовательностями (www.molbiol.ru/scripts/01_13.html). Поиск консервативного омена вели в базе сайта www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wTpsb.cgi. Наличие сигнального пептида устанавливали с помощью программ TargetP ittp://www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/) и SignalP (www.cbs.dtu.dk/services/ Signall'/), эансмембранного домена - ТМНММ (http://\vww.cbs.dtu.dk/services/TMIlMM/).

1.8. Получение антител к выделенному белку. В качестве антигена спользовали кусочки полиакриламидного геля, содержащие очищенный гследуемый белок, который вводили мышам подкожно или внутрибрюшинно. Для зутривенной реиммунизации антиген вводили после элюирования белка из кусочков :ля. При введении пробы использовали коммерческий препарат ПАФ (полный хьювант Фрейнда, Gibco, США). Специфичность полученных антител подтверждали помощью иммуноферментного анализа после переноса белков из геля на ироцеллюлозную мембрану. Фракцию растворимых белков, используемую для

сопоставления, получали путем их осаждения 80% ацетоном с 10% ТХУ из осветленного гомогената волокнистой части стебля льна.

1.9. Анализ срезов стебля растений методами микроскопии и иммуноцитохимии. Иммуноцитохимическую локализацию галастана проводили на ультратонких срезах стебля льна, конопли и древесины натяжения тополя. Фиксацию растительного материала осуществляли по стандартной методике с доработками (Viere, 1998). В качестве первичного антитела использовали полученные поликлональные мышиные антитела N1, специфичные к ß-галактозидазе, или коммерческие антитела LM5 (Plant Probes), специфичные к ß-(l—>4)-галактанам (Jones et al., 1997). Срезы просматривали на трансмиссионном электронном микроскопе модели JEM-1200 EX (Япония). Для оценки толщины слоев клеточной стенки волокон делали поперечные срезы стебля толщиной 2-3 мкм на ультратоме LKB 8800. Срезы просматривали и фотографировали на конфокальном микроскопе Axiovert 200М (Carl Zeiss, Германия). Толщину слоев клеточных стенок волокон трансгенных растений измеряли при помощи программы AimlmageBrowser. Исследования с помощью микроскопии и иммуноцитохимии проводились при методической поддержке сотрудников КИББ КазНЦ РАН д.б.н. В.В. Сальникова, к,б.н. М.В. Агеевой, к.б.н. A.B. Снегиревой.

1.10. Оценка содержания мРНК методом ПЦР в реальном времени. Выделение тотальной РЖ проводили с использованием кита KNeasy Plant Mini Kit (Qiagen, Германия). Затем с использованием обратной транскрипции нарабатывали кДНК, которую использовали в качестве матрицы для проведения ПЦР в реальном времени. Амплификацию и детекцию ПЦР продуктов проводили на ICycler IQ-4 (BioRad, США). Праймеры конструировали с помощью VECTOR NTI8:

прямой праймер 5 ' - GCC AGAGTGTGAAGCTAAAT-3 ', обратный праймер 5'-GGTTGGTGTACAAGGTGAAA-3', зонд 5 '-(FAM-G)CGCCTCTG(BHQl -T)TGGTCTTGCGA-3 '.

1.11. Выделение полимеров, слабо связанных с микрофибриллами целлюлозы клеточной стенки. Из осадка, оставшегося после выделения полимеров, попадающих в супернатант при гомогенизации ткани в буфере, фракционировали клеточную стенку по методике Талмадж (Talmage et al., 1973). Фракцию полимеров, слабо связанных с целлюлозой, получали из осадка, полученного после обработки глюкоамилазой, путем кипячения в 0.5% оксалате аммония на водяной бане в течение 1 ч. Разделение полимеров, экстрагируемых оксалатом аммония, проводили на колонке с сефарозой CL-4B. Моносахаридный анализ проводили после объединения и гидролиза фракций, соответствующих высокомолекулярному пику.

Статистический анализ данных во всех экспериментах проводили с применением стандартных математических методов пакета программы Microsoft Excel-2003 (расчет среднеквадратического отклонения).

900

2. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 2.1. Оценка галактаиазной активности в тканях стебля льна на разных стадиях развития волокон.

2.1.1. Анализ низкомолекулярных углеводов в тканях стебля льна. Одним из подходов для характеристики фермента является анализ продукта его реакции. Нами был проведен анализ содержания низкомолекулярных углеводов в участках стебля льна на разных стадиях развития флоэмных волокон. При этом имели ввиду, что в результате действия эндогалактаназы должны появляться олигомерные и мономерные а я формы галактозы, а галактозидазы - только

мономерные.

Анализ осветленных гомогенатов участков стебля льна методом высокоэффективной анионообменной хроматографии выявил несколько различных низкомолекулярных Сахаров. На хроматограммах идентифицировали пики глюкозы, галактозы, сахарозы, арабинозы и ксилозы (рис. 1). В гомогенате участка стебля, где волокна приступили к формированию вторичной клеточной стенки (ниже «точки слома») (рис. 1 а), отмечали высокое, по сравнению с участком стебля, где волокна удлиняются (выше «точки слома») (рис. 1 б), содержание галактозы. При разделении участка стебля ниже «точки слома» на внутреннюю (ксилемную) и внешнюю (волокнистую), содержащую флоэмные волокна, галактозу обнаруживали именно в волокнистой части стебля, где ее пик относился к числу основных (рис. 1 а). Олигомерных форм галактозы не выявлено, о чем свидетельствовало отсутствие пиков в области выхода олигомеров, а также не изменяющаяся концентрация галактозы до и после гидролиза 2М ТФУ.

Общая концентрация галактозы в участках стебля ниже «точки слома» достигала 10.2 мМ, в верхней части стебля - 0.3 мМ; при этом концентрация других выявленных

низкомолекулярных углеводов в анализируемых участках стебля существенно не отличалась.

Время удерживания, мин

Рис. 1. Профиль элюции низкомолекулярных углеводов осветленного гомогеиата различных участков стебля льна после разделения на колонке СагЬоРас РА 1. а - волокна на стадии формирования вторичной клеточной стенки; б -волокна на стадии интрузивного роста; в - ксилемная часть стебля ниже «точки слома».

Подобные закономерности отмечали в течение всего периода формирования волокнами вторичной клеточной стенки желатинозного типа.

Выявление в участках стебля, содержащих волокна на стадии формирования вторичной клеточной стенки, высокой концентрации мономерной галактозы и отсутствие ее олигомеров позволяет предположить наличие в тканях стебля льна ниже «точки слома» р-галактозидазной активности и отсутствие эндогалактаназной.

2.1.2. Оценка р-галактозидазной активности в тканях стебля льна с помощью искусственных субстратов. Анализ Р-галактозидазной активности в участках стебля

втс нтс нтс

Рис. 2. Выявление р-галактозидазной активности в тканях стебля льна с помощью искусственных субстратов, а - схема фиксации растительного материала, пунктиром на стебле обозначены места поперечных срезов; б - Р-галактозидазная активность в тканях стебля льна, хромогенный субстрат о-нитрофенил-Р-галактопиранозид; в - локализация активности в тканях стебля льна, флуорогенный субстрат резоруфин-р-О-галактопиранозид. ВТС - участок стебля выше «точки слома», НТС - участок стебля ниже «точки слома»; В - волокнистая часть стебля НТС, К - ксилемная часть стебля НТС; Вп - волокна с первичной клеточной стенкой ВТС, Вв - волокна со вторичной клеточной стенкой НТС. Масштабная линия 20 мкм. Фото Агеевой М.В.

льна, содержащих волокна на разных стадиях развития, с помощью хромогенного субстрата (о-нитрофенил-Р-галактопиранозид) показал (рис. 2 б), что р-галактозидазная активность (в расчете на единицу длины стебля) в несколько раз возрастает при переходе волокон от удлинения клетки к формированию вторичной клеточной стенки. При разделении участков стебля ниже «точки слома» на волокнистую и ксилемную части, практически вся активность обнаруживалась в волокнистой части (рис. 2 б).

Локализацию р-галактозидазной активности оценивали путем окрашивания поперечных срезов стебля льна флуорогенным субстратом (резоруфин-р-Б-галактопиранозид) с последующим анализом срезов на конфокальном микроскопе, р-Галактозидазная активность была выявлена преимущественно во флоэмных волокнах льна на стадии формирования вторичной клеточной стенки (рис. 2 в). В ксилемной части стебля проявлялось неспецифичное окрашивание, наблюдавшееся и в отсутствии субстрата.

2.2. Выявление и идентификация фермента, осуществляющего модификации тканеспецпфичного галактана волокон льна.

2.2.1. Анализ Р-галактозидазной активности во фракции, содержащей тканеспецифичный галактан. Одним из наиболее вероятных субстратов для действия анализируемого фермента в волокнах льна является ткане- и стадия-специфичный галактан, присутствующий в волокнах на стадии формирования вторичной клеточной стенки. Этот полимер попадает в буфер при гомогенизации тканей и, благодаря значительной молекулярной массе (700-2000 кДа), может быть отделен от других полимеров, осаждаемых из супернатанта гомогената 80% этанолом (ОогеЫюуа Л а1., 1996). В связи с этим нами был проведен анализ общей и специфической р-галактозидазной активности на разных этапах выделения галактана: в осветленных гомогенатах, во фракции полимеров, осаждаемых из гомогената 80% этанолом, а также во фракции высокомолекулярного галактана

Существенная часть общей р-галакгозидазной активности была обнаружена во фракции высокомолекулярного галактана, в которой отмечали максимальное значение удельной активности (рис. 3). Профили элюции, оцененные по активности фермента и содержанию углеводов, в высокомолекулярной области имели сходный характер (рис. 4). Это побудило нас проанализировать наличие в высокомолекулярной фракции белков, оценить их количество и состав.

2.2.2. Белковый состав фракции, содержащей тканеспецифичный галактан. При анализе белков, входящих в состав высокомолекулярной фракции, методом одномерного электрофореза, было выявлено наличие доминантной полосы белка с молекулярной массой около 70 кДа.

Элюция белка в столь нехарактерной для основной массы белков области (7002000 кДа) свидетельствует об ассоциации его с полимером, а отделение от полисаха-

Рис. 3. ¡3- Г ал актоз идазн ая активность в участках стебля льна, содержащих волокна на стадии формирования вторичной клеточной стенки (в расчете на единицу длины стебля), субстрат о-нитрофенил-р-В-галактопиранозид. Слева - общая активность в образце, справа - специфическая активность в расчете на мг белка; 1 -осветленный гомогенат, 2 - фракция полимеров, осаждаемых из гомогената 80% этанолом, 3 - фракция высокомолекулярного галактана.

Номер фракции Акгивносгь галактозидазы (опт. пл. 420 нм) —.— Содержание углеводов, мы /мл

Рис. 4. Профиль элюции полимеров, осаждаемых из гомогената волокнистой части стебля льна 80% этанолом, построенный по содержанию углеводов, и активность (3-галактозидазы в отдельных фракциях после хроматографирования на колонке с сефарозой СЬ-4В. Субстрат о-нитрофенил-|3-галактопиранозид. В низкомолекулярной части профиля активность (З-галактозидазы не оценивалась из-за возможной неспецифики ввиду окрашивания эндогенными соединениями. Объем фракций - 1.8 мл.

I 80

| 60 I

| 40

1 20

I О

Рис. 5. Изменения в профиле элюции галактана при хроматографировании на колонке с сефарозой СЬ-4В после инкубации с ферментом, а - исходный профиль полимеров, осаждаемых из гомогената 80% этанолом, б - профиль элюции препарата высокомолекулярного галактана после 5 часов воздействия эндогенной |3-галакгозидазы, в - профиль элюции препарата высокомолекулярного галактана после 48 часов воздействия (З-галактозидазы. Пунктиром отмечены фракции, соответствующие галактану, которые отбирали для инкубации с ферментом и повторного хроматографирования.

рида при обработке ионным детергентом - о нековалентном характере связи белка и галактана Ассоциация белка с высокомолекулярным галактаном позволила отделить его от всей совокупности растворимых белков волокнистой части стебля и получить чистый препарат белка.

2.2.3. Характеристика выявленного во фракции тканеспенифичного гаяактана белка методами протеомики и биоинформатики. Полоса геля, соответствующая анализируемому белку, была вырезана и пептиды, содержащиеся в ней, после предварительного трипсинолиза были проанализированы с помощью масс-спектрометрии. В ходе идентификации был выявлен пептид, имеющий существенную гомологию с растительной Р-галактозидазой (Скег апеНпит Ь.). Пептидов, соответствующих другим белкам, не обнаружено.

Дополнительным аргументом, позволяющим идентифицировать анализируемый белок, служит сопоставление обнаруженного олигопептида с нуклеотидной последовательностью гена р-галактозидазы льна, полный сиквенс которого был получен в ходе исследований изменения профиля экспрессии генов в тканях стебля льна при смене стадии развития волокон (нашей лабораторией совместно с коллегами

из Международного института исследований растений Вагенингена, Нидерланды). При трансляции нуклеотидной последовательности гена в аминокислотную обнаруживали фрагмент, последовательность которого совпадала с аминокислотной последовательностью фрагмента, полученного в результате трипсинолиза белка, выделенного из препарата тканеспецифичного галакгана, по которому прошла идентификация.

Для подтверждения идентификации белка необходимо продемонстрировать его ферментативную активность на нагивном субстрате. Для этого после фракционирования полимеров, осаждаемых из гомогената волокнистой части стебля льна 80% этанолом, на колонке с сефарозой CL-4B сггбирали фракции, соответствующие времени выхода высокомолекулярного галакгана, и выдерживали при 8'С в течение 5 и 48 ч, после чего проводили повторное хроматографирование. При этом в низкомолекулярной области появлялся дополнительный пик (рис. 5), моносахаридный анализ которого (без предварительного гидролиза) выявлял только мономерную галактозу. Гидролиз содержимого этого пика (2 М ТФУ, 1 ч, 120°С) не приводил ни к появлению других моносахаридов, ни к увеличению выхода галактозы. Это значит, что продуктом расщепления галактана является исключительно мономерная галактоза. Действие этого фермента выявлялось и по изменению соотношения галактозы и рамнозы в высокомолекулярном пике. Если до повторного хроматографирования это соотношение составляло 14, то через 5 ч инкубации с эндогенным ферментом снижалось до 10, а через 48 ч - до 3.

Таким образом, на основании а) выявления фрагмента белка, гомологичного р-галактозидазе, б) наличия в геноме льна соответствующего гена, экспрессия которого активируется в ходе интенсивного синтеза галактана, в) демонстрации р-галактозидазной активности с помощью искусственных субстратов, г) отщепления мономерной галактозы при гидролизе высокомолекулярного галактана, анализируемый белок может быть идентифицирован как р-галактозидаза, а тканеспецифичный галактан - как ее нахивный субстрат. В ходе дальнейшей характеристики транслированной аминокислотной последовательности гена {$-галактозидазы с помощью программ Target?, SignalP, ТМНММ, BLAST было установлено, что белок является секретируемым, не содержит трансмембранных доменов и последовательностей, ответственных за закрепление в эндомембранной системе, и принадлежит к семейству гликозидгидролаз GH35 по классификации CAZY (http://www.cazy.org).

2.3. Субклеточная локализация р-галактозидазы в тканях растений, волокна которых формируют клеточную стенку желатинозного типа.

2.3.1. Получение поликлональных антител к исследуемому белку. Для установления локализации исследуемого белка в тканях стебля льна нами были получены поликлональные мышиные антитела (N1) к исследуемому белку. Для

оценки степени специфичности полученных антител, наряду с высокомолекулярной фракцией ткане-специфичного гадактана, из которой выделяли исследуемый белок, нами была получена общая фракция растворимых белков, содержащихся в волокнистой части стебля льна (рис. 6 а, 1).

Полученные поликлональные антитела обладали высокой степенью специфичности, т.к. в ходе иммунохимической реакции с использованием полученных антител на мембране в анализируемых фракциях выявлялась одна полоса, соответствующая белку с молекулярной массой около 70 кДа (рис. 6).

2.3.2. Иммуноцитохимическая локализация р-галактозидазы в тканях стебля льна и других растений. С помощью полученных поликлональных антител установили, что обнаруженная р-галактозидаза локализована в волокнах льна, формирующих вторичную клеточную стенку, а именно - в пузырьках аппарата Гольджи и в желатинозных слоях вторичной клеточной стенки (рис. 7). Локализация белка полностью совпадала с локализацией тканеспецифичного галактана, что подтвердили двойным мечением антителами на галактан (ЬМ5) и белок (N1) (рис. 7).

С помощью полученных нами поликлональных антител к |5-галактозидазе льна было установлено наличие аналогичного фермента в тканях других растений, формирующих волокна с клеточной стенкой желатинозного типа: в первичных и вторичных флоэмных волокнах конопли и в ксилемных волокнах древесины натяжения тополя (рис. 8). При этом исследуемый белок обнаруживался только в желатинозных слоях клеточной стенки волокон и не выявлялся ни в других слоях клеточной стенки (срединной пластинке, первичной клеточной стенке, в ксилановом слое вторичной клеточной стенки), ни в клетках других тканей.

Выявление р-галактозидазы во всех проанализированных растениях, формирующих волокна с клеточной стенкой желатинозного типа, указывает на наличие сходных механизмов формирования клеточных стенок такого типа и существенную роль в них Р-галактозидазы у растений различной таксономической принадлежности и у волокон, образованных различными меристемами.

Ряс. 6. Характеристика специфичности полученных антител (N1). а - электрофорез экстракта, содержащего растворимые белки волокнистой части стебля льна (1), и белка, содержащегося во фракции тканеспецифичного галактана (2), б - мембрана после вестерн-блотгинга и иммунохимической реакции с полученными поликлональными антителами.

Рис. 7. Слева - иммуноцитохимическая локализация Р-галактозидазы с помощью полученных антител (N1) в волокнах льна, формирующих вторичную клеточную стенку желатинозного типа Для усиления мечения вторичные антитела дополнительно связаны с серебром. Справа - совместная локализация тканеспецифичного галактана (ЬМ5) и идентифицированного белка (N1) во флоэмных волокнах льна, формирующих вторичную клеточную стенку желатинозного типа (для возможности различия вторичные антитела сшиты с частицами золота разного размера). ВКС - вторичная клеточная стенка, йп - слой ВКС, ЦП - цитоплазма, ВГ - везикулы Гольджи. Масштабная линия 1 мкм. Фото Сальникова В.В.

Рис. 8. Слева - локализация р-галактозидазы (N1) во флоэмных волокнах конопли (Cannabis sativa L.). Справа - локализация Р-галактозидазы (N1) в клеточной стенке ксилемных волокон древесины натяжения тополя (Populas trémula L х P. tremuloides Michx.). ВКС - вторичная клеточная стенка, S, Gn, G - ксилановый и желатинозные слои ВКС. Масштабная линия 5 мкм. Фото Сальникова В.В.

2.4. Характеристика формирования клеточной стенки желатинозного типа у трансгенных растений льна с антисмысловой конструкцией к гену р-галактозидазы. В совместных исследованиях с коллегами из Университета Алберты

(Канада), М. Roach и М. Deyholos были получены трансгенные линии льна с пониженной экспрессией гена анализируемой р-галактозидазы, а нами -проведен их анализ. Подавление экспрессии достигалось путем введения антисмыловой последовательности (340 п.о.) к участку гена, содержащему вариабельный и консервативный домены. Анализ изменений проводился на Т2 трех гомозиготных линий (4-1,6-1, 6-2).

юо>.

° „ 75 ■■ о»

2 50>

О тс

а. а

уровня

Рис. 9. Снижение содержания мРНК (3-галшстозидазы в трансгенных линиях растений льна по сравнению с контрольными растениями (контроль принят за 100%).

Оценка экспрессии гена [3-галактозидазы в участках стебля ниже «точки слома» с помощью метода ПЦР в реальном времени показала снижение содержания мРНК в трансгенных линиях растений в среднем в 2 раза но сравнению с контрольными растениями (рис. 9). Существенных фенотипических

различий или особенностей в развитии у растений трансгенных линий по сравнению с контрольными растениями не наблюдали.

2.4.1. Анализ р-галактозидазной активности в трансгенных растениях льна. При оценке р-галакгозидазной активности в осветленных гомогенатах волокнистой части стебля ниже «точки слома» с помощью хромогенного субстрата было выявлено снижение активности в трансгенных линиях по

£ Т 0.8 j

о г

Я 5 0.6

0.4

0.2

.. . I i I

4-1

6-1

6-2

Рис. 10. р-Галактозидазная активность в волокнистой части стебля трансгенных (4-2, 6-1, 6-2) и контрольных растений льна (\УТ), хромогенный субстрат о-нитрофенил-р-галактопиранозид.

Табл. 1. Содержание свободной галактозы во флоэмной части стебля ниже «точки слома» в контрольных (\УТ) и трансгенных линиях растений (4-2, 6-1,6-2)

Вариант Свободная галактоза (мкг/г ткани)

WT 137±32

4-2 5Ы4

6-1 30±5

6-2 35±9

сравнению с контрольными растениями в среднем на 35 % (рис. 10).

Анализ содержания свободной галактозы в осветленном гомогенате волокнистой части стебля льна показал, что в контрольных растениях содержание свободной галактозы бьшо в 2-4 раза выше, чем в трансгенных растениях (табл. 1). Таким образом, в анализируемых трансгенных линиях растений наблюдается подавление активности тканеспецифичной р-галактозидазы.

2.4.2. Особенности структуры клеточной стенки волокон трансгенных растений льна В ходе анализа вторичной клеточной стенки волокон с помощью методов микроскопии были выявлены явные отличия трансгенных линий от контрольных растений.

Известно, что для вторичной клеточной стенки волокон желатинозного типа генетически не модифицированных растений льна характерна неоднородность и постсинтетическая модификация слоев (Сальников и др., 1993; СогэЫсоуа й а!., 2004, 2005), Внутренняя часть клеточной стенки имеет характерный вид, создающий впечатление рыхлой структуры. Этот слой желатинозной клеточной стенки получил название Оп (вновь отложенный). Наружная часть (слой О) имеет значительно более однородную структуру. Во всех анализируемых трансгенных линиях растений с пониженным уровнем экспрессии Р-галактозидазы толщина Оп слоя оказалась больше по сравнению с контрольными растениями (рис. 11). Если доля слоя Оп от общей толщины вторичной клеточной стенки волокон в контрольных растениях составила порядка 40%, то в трансформантах - 60-70%. Следовательно, снижение уровня экспрессии тканеснецифичной р-галактозидазы в волокнах льна приводит к тому, что процесс трансформации рыхлого слоя Оп в более плотный в становится менее эффективным.

Рис. И. Поперечный срез стебля льна ниже «точки слома», а - контрольные растения; б - трансгенная линия растений 4-2. G, Gn - слои вторичной клеточной стенки. Масштабная линия 20 мкм. Фото Снегиревой A.B.

2.4.3. Иммуноцитохимическая локализация галактана в клеточной стенке волокон трансгенных растений льна. Анализ распределения эпитопов антитела ЬМ5 с помощью электронной микроскопии также наглядно продемонстрировал отличие в ультраструктуре слоев вторичной клеточной стенки в растениях с нормальной и пониженной Р-галактозидазной активностью. Плотность распределения эпитопов для ЬМ5 в клеточной стенке волокон трансгенных линий была выше по сравнению с контрольными растениями, как и толщина слоя клеточной стенки, в котором сосредоточено основное количество связавшихся с эпитопом антител (рис. 12).

Рис. 12. Анализ распределения (1—>4)-галактана (LM 5) с помощью электронной микроскопии на срезах стебля льна ниже «точки слома», а -контрольные растения, б - трансгенная линия растений 6-1. Масштабная линия 5 мкм. Фото Снегиревой A.B.

2.4.4. Содержание тканеспецифичного галактана, слабо связанного с микрофибриллами целлюлозы, в клеточной стенке трансгенных растений льна. а 251 Проанализировано содержание

галактана, как доминирующего полисахарида матрикса, во фракции слабо связанных с микрофибриллами целюллозы полимеров клеточной стенки 6_2 контрольных и трансгенных

растениях льна. Содержание галактана оценивали по количеству галактозы в высокомолекулярном (700-2000 кДа) пике полимеров (экстракция оксалатом аммония), полученном

Ч ^ л

о о

о у/у

Рис. 13. Доля галактозы от общего содержания углеводов в высокомолекулярном пике после хроматографирования на колонке с сефарозой СЬ-4В полимеров, экстрагируемых оксалатом аммония из клеточной стенки контрольных растений ^Т) и трансгенных линий льна (4-2,6-1, 6-2).

после их хроматографирования на колонке с сефарозой CL-4B. В клеточной стенке трансгенных растений содержание галактана, слабо связанного с целлюлозой, в 2 раза выше по сравнению с контрольными (рис. 13), что может быть напрямую связано с утолщением Gn-слоя.

Таким образом, анализ трансгенных растений льна не только подтвердил активное участие выявленной ß-галактозидазы в метаболизме клеточной стенки желатинозного типа, но и представил убедительные аргументы, что для трансформации Gn-слоя в G-слой необходимо укорочение боковых цепочек тканеспецефичногогалактана.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Полученные в представленной работе результаты позволяют ответить на ряд вопросов, касающихся процессов формирования вторичной клеточной стенки желатинозного типа, обозначить возможные механизмы создания ее особой структуры и выявить ключевых участников этого процесса. Клеточную стенку желатинозного типа формируют только волокна - клетки с наиболее выраженной механической функцией. Создаваемое в клеточных стенках желатинозного типа натяжение необходимо для формирования ответа на различные механические стимулы. Оно способствует, например, развитию отрицательного гравитропизма при образовании реакционной древесины, или формированию устойчивости к сгибанию стебля у травянистых растений с тонким длинным стеблем.

использован термин «мускулы» на основании обнаружения у них кошрактильных свойств (Clair et al., 2006). В качестве «запечатанного» полисахарида у волокон разных видов растений выступают, возможно, различные полисахариды. Присутствие в клеточной стенке желатинозного типа волокон ряда растений ткане- и стадия-специфичного галакгана, обладающего особыми свойствами, метаболизм которого напрямую связан с формированием желатинозных слоев (Gorshkova, Morvan, 2006; Salnikov et al., 2008), позволяет предположить наличие активной метаболической составляющей в создании натяжения в клеточной стенке желатинозного типа ряда растений.

На основании полученных в нашей лаборатории данных по исследованию метаболизма и структуры тканеспецифичного галакгана сформирована следующая гипотеза участия этого полисахарида в формировании надмолекулярной структуры клеточной стенки желатинозного типа (Биогенез растительных волокон, 2009). Тканеспецифичный галактан волокон (2000 кДа), имеющий длинные галактозные цепочки, секретируется с помощью особых производных аппарата Гольджи за пределы плазмалеммы, где встраивается между микрофибриллами целлюлозы и предотвращает их латеральное взаимодействие сразу после формирования (рис. 14). Именно эта часть галакгана извлекается при экстракции оксалатом аммония и обеспечивает видимость «рыхлой» структуры недавно отложенных слоев клеточной стенки Gn. По мере развития волокна «рыхлая» структура постепенно трансформируется в более плотную (G-слой), при этом «новые» порции Gn-слоя продолжают откладываться со стороны плазмалеммы. Постепенно толщина внешнего слоя увеличивается, и в зрелом волокне Gn-слой исчезает, целиком трансформируясь в G-слой. Эта процессы сопряжены с изменением кристалличности целлюлозы и с постсинтетической модификацией тканеспецифичного галакгана (Andeme-Onzighi et al., 2000; Gorshkova, Morvan, 2006). При этом модификации галакгана должны проходить таким образом, чтобы появилась возможность латерального взаимодействия микрофибрилл целлюлозы. Латеральное взаимодействие микрофибрилл целлюлозы обуславливает повышение ее кристалличности и создание более плотного G-слоя.

Постсинтетическая модификация полисахарида предполагает наличие в клеточной стенке соответствующих ферментов, поиск и характеристика которых являлись задачами представленной работы. Нами было установлено присутствие в волокнах льна тканеспецифичной Р-галактозидазы, секретируемой во вторичную клеточную стенку желатинозного типа Продемонстрирована активация экспрессии гена этого фермента на соответствующей стадии развития волокон. Показано, что нативным субстратом для выявленной р-галактозидазы может служить ткане- и стадияспецифичный галактан сложной структуры.

Дополняя высказанную выше гипотезу, мы предполагаем, что после

встраивания в клеточную стенку (З-галактозидаза гидролизует длинные боковые цепочки галактана, что позволяет микрофибриллам целлюлозы латерально взаимодействовать. Оставшийся между микрофибриллами «запечатанный» полисахарид приводит к их изгибу, что создает в клеточной стенке некоторое натяжение (рис. 14).

Рис. 14. Схема участия р-галактозидазы в трансформации слоев клеточной стенки желатинозного типа.

Окончательно убедиться в том, что идентифицированная р-галактозидаза участвует в модификации тканеспецифичного галактана, которая обуславливает трансформацию Сп-слоя в й-слой клеточной стенки, помог анализ изменений, происходящих в структуре клеточной стенки волокон, в которых понижена экспрессия гена этого фермента Подавление активности р-галактозидазы приводит к нарушению нормального хода трансформации слоев клеточной стенки. Увеличение содержания в клеточной стенке волокон галактана, слабо связанного с целлюлозой, сопровождается увеличением доли Оп-слоя от общей толщины клеточной стенки в трансгенных растениях. Это доказывает, что отличительные особенности структуры Оп-слоя связаны с наличием галактана именно этой фракции. Подавление активности Р-галактозидазы приводит к снижению эффективности гидролиза боковых цепочек галактана, слабо связанного с микрофибриллами целлюлозы, вследствие чего микрофибриллы целлюлозы не могут латерально взаимодействовать, а, следовательно, и формировать более плотный слой й.

Таким образом, для функционирования клеточной стенки желатинозного типа флоэмных волокон льна необходимы активные метаболические процессы, ключевым элементом которых является р-галактозидаза Обнаружение аналогичного фермента в волокнах желатинозного типа у растений различной таксономической принадлежности и в волокнах различного происхождения говорит о наличии у них сходных механизмов формирования клеточных стенок желатинозного типа и делает выявленные на примере волокон льна закономерности более общими.

ВЫВОДЫ

1. Показано резкое увеличение р-галактозидазной активности в волокнах льна (Linum usitatissimum L.) при их переходе от интрузивного роста к формированию вторичной клеточной стенки желатинозного типа.

2. Выделен и очищен белок, ассоциированный с тканеспецифичным галактаном волокон льна. Анализируемый белок идентифицирован как р-гапактозидаза на основании а) выявления с помощью масс-спектрометрии фрагмента белка, гомологичного Р-галакгозидазе, б) наличия в геноме льна соответствующего гена, экспрессия которого активируется при переходе волокон к формированию вторичной клеточной стенки желатинозного типа, в) демонстрации Р-галактозидазной активности с помощью искусственных субстратов, г) отщепления мономерной галактозы от Р-( 1 —>4)-галактана.

3. С помощью полученных специфичных антител установлена тканевая и субклеточная локализация идентифицированной Р-галактозидазы. Показана солокализация анализируемого фермента с тканеспецифичным галактаном в секретируемых пузырьках аппарата Гольджи и в клеточной стенке желатинозного типа волокон льна.

4. Установлено наличие аналогичной р-галактозидазы в волокнах растений различной таксономической принадлежности и образуемых различными меристемами: в первичных и вторичных флоэмных волокнах конопли (Cannabis sativa L.) и ксилемных волокнах древесины натяжения тополя (Populas trémula L х P. tremuloides Michx.). Это указывает на существование сходных механизмов формирования клеточных стенок желатинозного типа и на существенную роль в них Р-галактозидазы.

5. Продемонстрировано нарушение нормального хода трансформации структуры слоев желатинозной клеточной стенки при подавлении экспрессии гена тканеспецифичной р-галактозидазы в трансгенных растениях льна Это доказывает необходимость активных метаболических процессов для функционирования клеточной стенки желатинозного типа и ключевую роль в них идентифицированного фермента

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Мокшииа, Н.Е. Характеристика выделенного из флоэмы льна-долгуши комплекса высокомолекулярного галактана с неиденгафицированным белком / Н.Е. Мокшииа, JI.O. Ягодина, Т.А. Горшкова // Сб. тез. / Пущина, 2006. - С. 84.

2. Особенности функционирования аппарата Гольджи при формировании клеточной стенки желатинозного типа / Н.Е. Мокшииа, Т.А Горшкова, JI.O. Ягодина, М.В. Агеева, Н.Н. Ибрагимова, В.В. Сальников, Т.Е. Чернова // Сб. тез. / С.-Пб., 2006. - С. 174.

3. Biogenesis of gelatinous type cell wall in plant fibers // T. Gorshkova, V. Salnikov, M. Ageeva, N. Mokshina, S. Amenitsky, N. Ibragimova / Physiologia Plantarum. Abstr. of Xlth Cell Wall Meeting. / Copenhagen, 2007. - № 4. - V. 130.

4. Тканеспецифичный белок волокон с клеточной стенкой желатинозного типа / Н.Н. Ибрагимова, Н.Е. Мокшииа, JI.O. Ягодина, В.В. Сальников, Т.А. Горшкова // Материалы докладов / Коми НЦ УрО РАН. - Сыктывкар, 2007. - С. 85-87.

5. Pectins in secondary cell walls / Т.А. Gorshkova, P.V. Mikshina, N.N. Ibragimova, N.E. Mokshina, O.P. Guijanov, S.B. Chemikosova // Book of Abstract / Wageningen Academic Publishers. - Wageningen, - 2008. - P. 34.

6. Мокшииа, Н.Е. Р-Галактозидазная активность в волокнах льна, формирующих клеточную стенку желатинозного типа / Н.Е. Мокшина, Н.Н. Ибрагимова, Т.А. Горшкова II Сб. трудов / Изд-во Арта. - Новосибирск, 2008. - С. 490.

7. Galactosidase activity is important for the formation of secondary cell wall of gelatinous type U N.N. Ibragimova, N.E. Mokshina, P.V. Mikshina, S.B. Chemikosova, T.A. Gorshkova / Book of Absract. / Sigtuna, 2008. - P. 44.

8. Ибрагимова, Н.Н. Проблемы нротеомики при исследовании растительной клеточной стенки / Н.Н. Ибрагимова, II.E. Мокшина, Т.А. Горшкова // Сб. трудов / Апатиты, 2009. - С. 129-131.

9. Формирование вторичной клеточной стенки льняного волокна.особая роль Р-галактозидазы / Н.Е. Мокшииа, Н.Н. Ибрагимова, М.В. Агеева, В.В. Сальников, Т.А. Горшкова // Сб. трудов. / Апатиты, 2009. - С. 236-238.

10. Ибрагимова, Н.Н. Протеомика растительных клеточных стенок / Н.Н. Ибрагимова, Н.Е. Мокшина, Т.А. Горшкова// Сб. трудов / Казань, 2009. - С. 21.

11. Роль Р-галактозидазы в формировании вторичной клеточной стенки растительных волокон / Н.Е. Мокшина, Н.Н. Ибрагимова, М.В. Агеева, В.В. Сальников, С.И. Амешщкнй, Т.А. Горшкова II Сб. трудов / Казань, 2009. -С.117.

12. Pectins in secondary cell walls: modifications during cell wall assembly and maturation / T.A. Gorshkova, P.V. Mikshina, N.N. Ibragimova, N.E. Mokshina, Т.Е. Chernova, O.P. Gurjanov, S.B. Chemikosova II Pectins and Pectinases / Wageningen Academic Publishers. - 2009. - P. 149-165.

13. Свободная галактоза и галактозидазная активность в волокнах льна на разных стадиях формирования / П.В. Микшина, С.Б. Чемикосова, Н.Е. Мокшина, Н.Н. Ибрагимова, Т.А. Горшкова // Физиология растений. - 2009. -Т. 56, Х»1. - С.67-77.

14. Формирование вторичной клеточной стенки волокон // Биогенез растительных волокон / Т.А. Горшкова, О.П. Гурьянов, П.В. Микшина, Т.Е. Чернова, М.В. Агеева, В.В. Сальников, II.E. Мокшина, Н.Н. Ибрагимова, С.И. Аменицкий, С.Б. Чемикосова / под ред. Т.А. Горшковой / Наука. - 2009. - С. 91-176.

15. Ибрагимова, Н.Н. Протеомика растительных волокон // Биогенез растительных волокон / Н.Н. Ибрагимова, Н.Е. Мокшина, Т.А. Горшкова / под ред. Т.А. Горшковой. М.: Наука, 2009.

16. Особый тип вторичной клеточной стенки, формируемый растительными волокнами / Т.А. Горшкова, О.П. Гурьянов, П.В. Микшина, Н.Н. Ибрагимова, Н.Е. Мокшина, В.В. Сальников, М.В. Агеева, С.И. Аменицкий, Т.Е. Чернова, С.Б. Чемикосова // Физиология растений. - 2010. - Т. 57. - №3. - С. 328-341.

Подписано в печать 26.05.10 г. Форм. бум. 60x80 1/16. Печ. л. 1,5.

Гарнитура Times New Roman. Тираж 140. Заказ № 105. Отпечатано с готового оригинал - макета в ООО «Вестфалика» г. Казань, ул. Б. Красная, 67. Тел.: 236-62-72

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Мокшина, Наталья Евгеньевна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Два типа вторичной клеточной стенки растительных волокон.

1.1.1. Вторичная клеточная стенка классического, ксиланового, типа у растительных волокон.

1.1.2. Вторичная клеточная стенка особого, желатинозного, типа у растительных волокон.

1.1.2.1. Состав и структура клеточной стенки желатинозного типа.

1.1.2.2. Механизмы реализации функциональной нагрузки клеточной стенки желатинозного типа.

1.2. Постсинтетические модификации полимеров клеточной стенки.

1.2.1. Ферменты, локализованные в клеточной стенке и модифицирующие ее компоненты.

1.2.1.1. Гликаназы (гликозидгидролазы).

1.3. Подходы к анализу ферментов клеточной стенки растительных волокон.

1.4. Формирование желатинозной клеточной стенки флоэмных волокон льна.

ГЛАВА 2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

2.1. Объекты исследований.

2.2. Оценка галактаназной активности.

2.2.1. Анализ низкомолекулярных углеводов.

2.2.2. Измерение р-галактозидазной активности с помощью хромогенного субстрата.

2.2.3. Окрашивание срезов с помощью флуорогенного субстрата

2.3. Выделение и идентификация Р-галактозидазы.

2.3.1. Выделение тканеспецифичного галактана и ассоциированного с ним белка.

2.3.2. Постановка одномерного электрофореза по Лэммли.

2.3.3. Идентификация белка методом ВЭЖХ МС.

2.3.4. Анализ аминокислотной последовательности белка с помощью методов биоинформатики.

2.4. Получение поликлональных антител.

2.4.1. Получение антигена.

2.4.2. Иммунизация препаратом белка.

2.4.3. Подтверждение специфичности полученных антител.

2.5. Анализ срезов растений методами микроскопии и 61 имму ноцитохимии.

2.6. Определение содержания мРНК методом ПЦР в реальном времени.

2.7. Выделение полимеров, слабо связанных с микрофибриллами целлюлозы клеточной стенки.

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. Галактаназная активность в тканях стебля льна.

3.1.1. Определение содержания низкомолекулярных углеводов в тканях стебля льна на разных стадиях развития волокон.

3.1.2. Оценка Р-галактозидазной активности в тканях стебля льна с помощью искусственных субстратов.

3.2. Выявление и идентификация фермента, осуществляющего модификации тканеспецифичного галактана волокон льна.

3.2.1. Анализ Р-галактозидазной активности во фракции, содержащей тканеспецифичный галактан.

3.2.2. Белковый состав фракции, содержащей тканеспецифичный галактан.

3.2.3. Анализ выявленного во фракции высокомолекулярного галактана белка методами протеомики и биоинформатики.

3.3. Субклеточная локализация р-галактозидазы в тканях стебля льна и других растений, волокна которых формируют клеточную стенку желатинозного типа.

3.3.1. Получение поликлональных антител к исследуемому белку и оценка степени их специфичности.

3.3.2. Иммуноцитохимическая локализация Р-галактозидазы в тканях стебля льна и других растений.

3.4. Особенности формирования клеточной стенки желатинозного типа у трансгенных растений льна с антисмысловой конструкцией к гену тканеспецифичной р-галактозидазы волокон.

3.4.1. Общая характеристика трансгенных растений льна.

3.4.2. Анализ р-галактозидазной активности в трансгенных растениях льна.

3.4.3. Особенности структуры клеточной стенки волокон льна с пониженной экспрессией гена Р-галактозидазы.

3.4.4. Локализация галактана в клеточной стенке волокон льна с нормальной и пониженной экспрессией гена Р-галактозидазы.

3.4.5. Содержания тканеспецифичного галактана, слабо связанного с микрофибриллами целлюлозы, в клеточной стенке трансгенных растений льна.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Тканеспецифичная галактозидаза растительных волокон, формирующих клеточную стенку желатинозного типа"

Постановка проблемы и ее актуальность

Клеточная стенка растительных клеток выполняет многообразные функции, среди которых наиболее выраженной является механическая. При этом клеточные стенки могут не только служить статичной опорой, но и обладать свойствами, способствующими перемещению частей растения в пространстве. Такие свойства характерны для вторичных клеточных стенок желатинозного типа, которые формируются только в растительных волокнах и отличаются от классического, ксиланового, типа вторичных клеточных стенок высоким содержанием целлюлозы, продольной ориентацией ее микрофибрилл, особым составом полисахаридов матрикса и низким содержанием лигнина (Горшкова, 2007). Особый состав и структура клеточной стенки желатинозного типа обуславливают наличие I контрактильных свойств, которые основаны на создании в клеточной стенке натяжения (Clair et al., 2006).

Механизм создания натяжения в клеточных стенках желатинозного типа остро дискутируется. Основные предложенные гипотезы сводятся к пассивному набуханию клеточных стенок желатинозного типа при ограничении их объема окружающими слоями ксилановой клеточной стенки (Goswami et al., 2008), или к натяжению латерально взаимодействующих микрофибрилл целлюлозы при попадании между ними полисахаридов матрикса (Mellerowicz et al., 2008). Последний механизм подразумевает, что создание натяжения в клеточной стенке основано на активных метаболических процессах. Такие процессы предполагаются, в частности, для тканеспецифичного галактана, накопление которого сопряжено с формированием вторичной клеточной стенки флоэмных волокон льна и конопли (Gorshkova et al., 1996, 2004; Gorshkova, Morvan, 2006). Этот полисахарид построен как сложный рамногалактуронан I с боковыми цепочками, состоящими, в основном, из р-(1—>4)-связанной галактозы, составляющей основную массу полимера. После встраивания галактана в клеточную стенку происходит значительное уменьшение его молекулярной массы (Gurjanov et al., 2008), что может быть связано с укорочением боковых цепочек полимера.

Гидролиз боковых цепочек галактана in vivo теоретически возможен в результате действия эндогенной галактозидазы и/или эндогалактаназы. Выявление и характеристика фермента, осуществляющего постсинтетические модификации тканеспецифичного галактана, позволит существенно дополнить картину процессов, происходящих при формировании вторичной клеточной стенки желатинозного типа и выявить ключевые элементы в механизмах ее функционирования.

Цель и задачи исследования

Целью данной работы было выявление и характеристика фермента, обеспечивающего постсинтетические модификации галактана в ходе формирования клеточной стенки желатинозного типа.

Были поставлены следующие задачи:

2. Выделить и очистить фермент, идентифицировать и охарактеризовать его методами протеомики и биоинформатики.

4. Охарактеризовать особенности формирования клеточной стенки желатинозного типа у трансгенных растений льна с антисмысловой конструкцией к гену выявленного фермента.

Научная новизна работы

С помощью комплекса подходов впервые охарактеризован тканеспецифичный белок волокон желатинозного типа, который идентифицирован как р-галактозидаза. Выявлена активация экспрессии гена этого фермента при переходе волокон к формированию клеточной стенки желатинозного типа. С помощью наработанных антител продемонстрирована локализация фермента во флоэмных волокнах льна, где он обнаруживается совместно с тканеспецифичным галактаном в секретируемых пузырьках аппарата Гольджи и во вторичной клеточной стенке желатинозного типа. Установлено наличие аналогичной (3-галактозидазы в клеточной стенке желатинозного типа волокон растений различной таксономической принадлежности и образуемых различными меристемами, что указывает на наличие у них сходных механизмов формирования клеточных стенок желатинозного типа и существенную роль в них Р-галактозидазы. Снижение уровня экспрессии тканеспецифичной Р-галактозидазы путем введения антисмысловой конструкции к соответствующему гену приводит к нарушению нормального хода трансформации слоев клеточной стенки, что доказывает ключевую роль фермента в формировании ее надмолекулярной структуры и свидетельствует о необходимости активной метаболической составляющей в функционировании клеточной стенки желатинозного типа.

Научно-практическая значимость работы

Представленные в работе данные вносят вклад в понимание механизмов образования и функционирования вторичной клеточной стенки особого желатинозного типа, которая характерна для многих хозяйственно ценных культур. Полученные представления об участии тканеспецифичного фермента в формировании надмолекулярной структуры клеточной стенки позволяют развить биотехнологические подходы для целенаправленного изменения свойств клеточной стенки и, следовательно, качества волокна. Разработанная совокупность подходов для идентификации, характеристики и установления роли индивидуального фермента может быть использована при исследовании других белков растительной клетки.

Апробация работы

Материалы диссертации докладывались на итоговой научной конференции КГУ (Казань, 2005), VI съезде Общества физиологов растений России и Международной конференции «Современная физиология растений: от молекул до экосистем» (Сыктывкар, 2007), IX Международной конференции по клеточной стенке (Копенгаген, Дания, 2007), Международной конференции «Pectins and Pectinases» (Вагенинген, Нидерланды, 2008), IV съезде Российского общества биохимиков и молекулярных биологов (Новосибирск, 2008), Международной конференции по растительным полисахаридам «PPW 2008» (Сигтуна, Швеция, 2008), Международном симпозиуме по углеводам «ICS 2008» (Осло, Норвегия, 2008), итоговых конференциях КИББ КазНЦ РАН (2009, 2010), Международной конференции по растительным волокнам «Plant fibers: view of fundamental biology» (Казань, 2009), Гордоновской конференции по растительной клеточной стенке (Смитфилд, США, 2009), годичном собрании общества физиологов России (Апатиты, 2009), IV Российском симпозиуме «Белки и пептиды» (Казань, 2009).

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 16 работ, в том числе главы в зарубежной и отечественной монографиях.

Связь работы с научными программами и собственный вклад автора в исследования

Исследования проводились в соответствии с планами НИР КИББ КазНЦ РАН (номер госрегистрации 0120.0 408625); частично поддержаны грантами РФФИ № 06-04-48853, № 08-04-00845, № 09-04-97038. Научные положения и выводы диссертации базируются на результатах собственных исследований автора.

Структура и объем диссертации

Диссертация изложена на 136 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания объектов и методов исследования, изложения и обсуждения результатов, заключения, выводов и списка литературы. В работе представлено 5 таблиц и 42 рисунка. Список литературы включает 155 источников, в том числе 138 — иностранных.

Заключение Диссертация по теме "Физиология и биохимия растений", Мокшина, Наталья Евгеньевна

116 выводы

1. Показано резкое увеличение Р-галактозидазной активности в волокнах льна (Linum usitatissimum L.) при их переходе от интрузивного роста к формированию вторичной клеточной стенки желатинозного типа.

2. Выделен и очищен белок, ассоциированный с тканеспецифичным галактаном волокон льна. Анализируемый белок идентифицирован как Р~ галактозидаза на основании а) выявления с помощью масс-спектрометрии фрагмента белка, гомологичного (3-галактозидазе, б) наличия в геноме льна соответствующего гена, экспрессия которого активируется при переходе волокон к формированию вторичной клеточной стенки желатинозного типа, в) демонстрации галактозидазной активности с помощью искусственных субстратов, г) отщепления мономерной галактозы от Р-(1—>4)-галактана.

4. Установлено наличие аналогичной Р-галактозидазы в волокнах растений различной таксономической принадлежности и образуемых различными меристемами: в первичных и вторичных флоэмных волокнах конопли (Cannabis sativa L.) и ксилемных волокнах древесины натяжения тополя (Populus trémula L. х P. tremuloides Michx.). Это указывает на существование сходных механизмов формирования клеточных стенок желатинозного типа и на существенную роль в них Р-галактозидазы.

5. Продемонстрировано нарушение нормального хода трансформации структуры слоев желатинозной клеточной стенки при подавлении экспрессии гена тканеспецифичной (3-галактозидазы в трансгенных растениях льна. Это доказывает необходимость активных метаболических процессов для функционирования клеточной стенки желатинозного типа и ключевую роль в них идентифицированного фермента.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Полученные в представленной работе результаты позволяют ответить на ряд вопросов, касающихся процессов формирования вторичной клеточной стенки желатинозного типа, обозначить возможные механизмы создания ее особой структуры и выявить ключевых участников этого процесса. Клеточную стенку желатинозного типа формируют только волокна — клетки с наиболее выраженной механической функцией. Создаваемое в клеточных стенках желатинозного типа натяжение необходимо для формирования ответа на различные механические стимулы. Оно способствует, например, развитию отрицательного гравитропизма при образовании реакционной древесины, или формированию устойчивости к сгибанию стебля у травянистых растений с тонким длинным стеблем.

Считается, что реализация механических свойств клеточной стенки желатинозного типа может осуществляться за счет разницы пассивного набухания желатинозного и ксиланового слоев, что связывают либо с различиями в ориентации микрофибрилл целлюлозы (Burgert et al., 2007), либо с наличием гигроскопичных полимеров матрикса (рамногалактуронан I) (Clair et al., 2008). Однако ряд данных позволяет предположить, что натяжение в клеточной стенке желатинозного типа возникает в результате латерального взаимодействия микрофибрилл целлюлозы и захвата полисахаридов матрикса (Mellerowicz et al., 2008). Было показано, что микрофибриллы целлюлозы в волокнах, формирующих клеточную стенку желатинозного типа, характеризуются большими размерами кристаллических участков, по сравнению с большинством других растительных объектов (Viëtor et al., 2002, Sturcova et al., 2004). Это дало основание предполагать наличие в желатинозных слоях латерального взаимодействия микрофибрилл целлюлозы, чему способствует их одинаковая ориентация, а также отсутствие лигнина и значительных количеств полисахаридов матрикса, разделяющих микрофибриллы друг от друга. Е. Mellerowicz с соавторами (Mellerowicz et al., 2008) высказана идея, что микрофибриллы целлюлозы, взаимодействуя латерально, «захватывают» матриксные полисахариды. Этими же авторами, применительно к желатинозным волокнам древесины, использован термин «мускулы» на основании обнаружения у них контрактильных свойств (Clair et al., 2006). В качестве «запечатанного» полисахарида у волокон разных видов растений выступают, возможно, различные полисахариды. Присутствие в клеточной стенке желатинозного типа волокон ряда растений ткане- и стадия-специфичного галактана, обладающего особыми свойствами, метаболизм которого напрямую связан с формированием желатинозных слоев (Gorshkova, Morvan, 2006; Salnikov et al., 2008), позволяет предположить наличие активной метаболической составляющей в создании натяжения в клеточной стенке желатинозного типа ряда растений.

На основании полученных в нашей лаборатории данных по исследованию метаболизма и структуры тканеспецифичного галактана сформирована следующая гипотеза участия этого полисахарида в формировании надмолекулярной структуры клеточной стенки желатинозного типа (Биогенез растительных волокон,. 2009) (рис. 14). Тканеспецифичный галактан волокон (2000 кДа), имеющий длинные галактозные цепочки, секретируется с помощью особых производных аппарата Гольджи за пределы плазмалеммы, где встраивается между микрофибриллами целлюлозы и предотвращает их латеральное взаимодействие сразу после формирования. Именно эта часть галактана извлекается при экстракции оксалатом аммония и обеспечивает видимость «рыхлой» структуры недавно отложенных слоев клеточной стенки Gn. По мере развития волокна «рыхлая» структура постепенно трансформируется в более плотную (G-слой), при этом «новые» порции Gn слоя продолжают откладываться со стороны плазмалеммы. Постепенно толщина внешнего слоя увеличивается, и в зрелом волокне Gn-слой исчезает, целиком трансформируясь в G-слой. Эти процессы сопряжены с изменением кристалличности целлюлозы и с постсинтетической модификацией тканеспецифичного галактана (Andeme-Onzighi е1 а1., 2000; ОогсЬкоуа, Могуап, 2006). При этом модификации галактана должны проходить таким образом, чтобы появилась возможность латерального взаимодействия микрофибрилл целлюлозы. Латеральное взаимодействие микрофибрилл целлюлозы обуславливает повышение ее кристалличности и создание более плотного в-слоя, итоплазма

Рис. 42. Схема участия р-галактозидазы в трансформации слоев клеточной стенки желатинозного типа.

Постсинтетическая модификация полисахарида предполагает наличие в клеточной стенке соответствующих ферментов, поиск и характеристика которых являлись задачами представленной работы. Нами было установлено присутствие в волокнах льна тканеспецифичной (3-галактозидазы, секретируемой во вторичную клеточную стенку желатинозного типа. Продемонстрирована активация экспрессии гена этого фермента на соответствующей стадии развития волокон. Показано, что нативным субстратом для выявленной Р-галактозидазы может служить ткане- и стадия-специфичный галактан сложной структуры.

Дополняя высказанную выше гипотезу, мы предполагаем, что после встраивания в клеточную стенку Р-галактозидаза гидролизует длинные боковые цепочки галактана, что позволяет микрофибриллам целлюлозы латерально взаимодействовать. Оставшийся между микрофибриллами «запечатанный» полисахарид приводит к их изгибу, что создает в клеточной стенке некоторое натяжение (рис. 42).

Окончательно убедиться в том, что идентифицированная р-галактозидаза участвует в модификации тканеспецифичного галактана, которая обуславливает трансформацию Оп-слоя в О-слой клеточной стенки, помог анализ изменений, происходящих в структуре клеточной стенки волокон, в которых понижена экспрессия тканеспецифичной Р-галактозидазы. Подавление активности Р-галактозидазы приводит к нарушению нормального хода трансформации слоев клеточной стенки. Увеличение содержания в клеточной стенке волокон галактана, слабо связанного с целлюлозой, сопровождается увеличением доли Оп-слоя от общей толщины клеточной стенки в трансгенных растениях. Это доказывает, что отличительные особенности структуры Оп-слоя связаны с наличием галактана именно этой фракции. Подавление активности р-галактозидазы приводит к снижению эффективности гидролиза боковых цепочек галактана, слабо связанного с микрофибриллами целлюлозы, вследствие чего микрофибриллы целлюлозы не могут латерально взаимодействовать, а, следовательно, и формировать более плотный, кристалличный слой в.

Таким образом, для функционирования клеточной стенки желатинозного типа флоэмных волокон льна необходимы активные метаболические процессы, ключевым элементом которых является Р-галактозидаза. Обнаружение аналогичного фермента в волокнах желатинозного типа у растений различной таксономической принадлежности и в волокнах различного происхождения говорит о наличии у них сходных механизмов формирования клеточных стенок желатинозного типа и делает выявленные на примере волокон льна закономерности более общими.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Мокшина, Наталья Евгеньевна, Казань

1. Александров В.Г. Принципы строения стебля лубо-волокнистых текстильных растений и методы его изучения / В.Г. Александров, К.Ю. Абесадзе, В.А. Насонов, М.С. Яковлев // Тр. по прикл. ботанике, генетике и селекции. 1932. -Т. 3.-М> 2. - С. 49-74.

2. Биогенез растительных волокон / Т.А. Горшкова, О.П. Гурьянов, П.В. Микшина, Т.Е. Чернова, М.В. Агеева, В.В. Сальников, Н.Е. Мокшина, H.H. Ибрагимова, С.И. Аменицкий, С.Б. Чемикосова / под ред. Т.А. Горшковой /Наука. — 2009. — 264 с.

3. Горшкова Т.А. Стадии формирования лубяных волокон Ыпит usitatissimum L. / Т.А. Горшкова, M.B. Агеева, B.B. Сальников, Н.В. Павленчева, A.B. Снегирева, Т.Е. Чернова, С.Б. Чемикосова // Ботан. журн. -2003. Т. 88. -№ 12. - С. 1-11.

4. Горшкова Т.А. Растительная клеточная стенка как динамичная система/Т.А. Горшкова. М.Наука, 2007. — 429 с.

5. Формирование надмолекулярной структуры растительной клеточной стенки / Т.А. Горшкова, П.В. Микшина, О.П. Гурьянов, С.Б. Чемикосова //Биохимия. — 2010. — Т. 75. -№ 2. (в печати).

6. Характеристика структуры тканеспецифичного галактана волокон льна с использованием 1Н-ЯМР и MALDI-TOF-масс-спектрометрии / О.П. Гурьянов, Т.А. Горшкова, М. Кабел, Я. ван Дам // Биоорганическая химия. 2006. - Т. 32. - N2 6.-С. 1-11.

7. Жуковский П.М. Ботаника / П.М. Жуковский- М.: Колос, 1982. 623 с.

8. Лозовая В.В. Формирование клеточных стенок в тканях стебля льна-долгунца / Лозовая В.В., Сальников В.В., Юмашев Н.В. / Научн. ред. акад. АН СССР И.А.Тарчевский. — Казань: Казанский институт биологии, 1990.-171с.

9. Лотова Л.И. Морфология и анатомия высших растений /Л.И Лотова. -М.: Эдиториал УРСС, 2001. 526 с.

10. Свободная галактоза и галактозидазная активность в волокнах льна на разных стадиях формирования / П.В. Микшина, С.Б. Чемикосова, Н.Е. Мокшина, Н.Н. Ибрагимова, Т. А. Горшкова // Физиология растений. — 2009. Т. 56. -Ml.- С. 1-11.

11. Микшина, П.В. Роль тканеспецифичного галактана в формировании надмолекулярной структуры клеточной стенки желатинозного типа: Автореф. дис. . канд. биол. наук: 03.00.12 /П.В. Микшина; Казань, 2009. — 24 с.

12. Ультраструктурный анализ лубяных волокон / В.В. Сальников, М.В. Агеева, В.Н. Юмашев, В.В. Лозовая // Физиология растений. — 1993. — Т. 40. —№ 3. —С. 458-464.

13. Сальников, В.В. Структурно-функциональная характеристика клеточных стенок в растительных тканях, специализированных на интенсивном синтезе целлюлозы: Автореф. дис. . докт. биол. наук: 03.00.12/В.В Сальников; С.-Пб, 2005.- 47с.

14. Тутаюк В.Х. Анатомия и морфология растений / В.Х. Тутаюк, —М.: Высш. гик., 1980. —317 с.

15. Формирование первичных и вторичных волокон конопли / Т.Е. Чернова, М.В. Агеева, С.Б. Чемикосова, Т.А. Горшкова // Вестн. ВНИИ по переработке лубяных культур. — 2005. — № 2. — С. 6-13.

16. Чернова, Т.Е. Биогенез флоэмных волокон льна (Linum usitatissimum L.) и конопли (Cannabis sativa L.): сравнительный анализ: Автореф. дис. канд. биол. наук: 03.00.12 /Т.Е. Чернова; Казань, 2007.- 24 с.

17. Эсау К. Анатомия растений / Эсау К. — М.: Мир, 1969. — 564с.

18. Ali Z.M. Isolation, characterization and significance of papaya beta-galactanases to cell wall modification and fruit softening during ripening / Z.M. Ali, S.Y. Ng, R. Othman, L.Y. Goh, H. Lazan //Physiol. Plant. 1998. -V. 104. -P. 105-115.

19. Andème—Onzighi С. Immunocytochemical characterization of early-developing flax fibre cell walls / C. Andème-Onzighi, R. Girault, I. His, C. Morvan, A. Driouich //Protoplasma. 2000. - V. 213. — P. 235-245.

20. Arend M. Immunolocalization of (l,4)-fi-galactan in tension wood fibers of poplar /М. Arend// Tree Physiol. 2008. - V. 28.- P. 1263-1267.

21. Awano T. Deposition and localization of glucuronoxylans in the secondary cell wall of Japanese beech as observed using immuno FE-SEM / T. Awano, K. Takabe, M. Fujita, G. Daniel // Protoplasma. — 2000. — V. 212. — P. 72-79.

22. Barnett J.R. Cellulose microfibril angle in the cell wall of wood fibres / J.R. Barnett, V.A. Bonham // Biol. Rev. Camb. Philos. Soc. 2004. — V. 79. -P. 461-472.

23. Bayer E.M. Arabidopsis cell wall proteome defined using multidimensional protein identification technology / E.M. Bayer, A.R. Bottrill, J. Walshaw, M. Vigouroux, M.J. Naldrett, C.L. Thomas, A.J. Maule // Proteomics. -2006. v. 6. -p. 301-311.

24. Blake A.W. In situ analysis of cell wall polymers associated with phloem fibre cells in stems of hemp, Cannabis sativa L. / A. W. Blake, S.E. Marcus, J.E. Copeland, B. Richard, J. Knox // Planta. 2008. - V. 228. - P. 113.

25. Bonatti P.M. Histochemical and supramolecular studies in determining quality of hemp fibres for textile applications / P.M. Bonatti, Ch. Ferrari, B. Focher, C. Grippo, G. Torri, C. Cosentino // Euphytica. 2004. — V. 140. -P. 55-64.

26. Boudet A.M. Biochemistry and molecular biology of lignification / A.M. Boudet, C. Lapierre, J. Grima-Pettenati //New Phytol. 1995. - V. 129. -P. 203-236.

27. Bowling A. J., Vaughn K.C. Immunocytochemical characterization of tension wood: gelatinous fibers contain more than just cellulose 1 / A.J. Bowling, K.C. Vaughn //Am. J. of Botany. 2008. - V. 95. -№ 6.-P. 655-663.

28. Boyce C.K. Evolution of xylem lignification and hydrogel transport regulation / C.K. Boyce, M.A. Zwieniecki, G.D. Cody, C. Jacobsen, S. Wirick, A.H. Knoll, N.M. Holbrook /PNAS. 2004. - V. 101. -№> 50. - P. 17555-17558.

29. Bradford M.M. A rapid and sensitive method for quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye-binding /M. M. Bradford//An. Biochem. 1976. - V. 72. -P. 248-254.

30. Brett C. Physiology and biochemistry of plant cell walls / C. Brett, K. Waldron. — London.: Hyman, 1990. —194p.

31. Brummell D.A. Cell wall metabolism in fruit softening and quality and its manipulation in transgenic plants / D.A. Brummell, M.H. Harpster // PlantMol. Biol.-2001. V. 47. -P. 311-340.

32. Buckeridge M.S., Reid J.S.G. Purification and properties of a novel ß-galactosidase or exo-ß-(l-*4)-galactanase from the cotyledons of germinated Lupinus angustifolius L. seeds /M.S. Buckeridge, J.S.G. Reid //Planta. —1994. — V. 192. -P. 502-151.

33. Buckeridge D.L. An evaluation model for syndromic surveillance: assessing the performance of a temporal algorithm /D.L. Buckeridge, P. Switzer, D. Owens, D. Siegrist, J. Pavlin, M. Musett // MMWR Morb Mortal Wkly Rep. -2005. V. 54. - P. 109-115.

34. Burgert I. Tensile and compressive stresses in tracheids are induced by swelling based on geometrical constraints of the wood cell /1. Burgert, M. Eder, N. Gierlinger, P. Fratzl//Planta. 2007. - V. 226. -P. 981-987.

35. Burgert I., Fratzl P. Plants control the properties and actuation of their organs through the orientation of cellulose fibrils in their cell walls /1. Bürgert, P. Fratzl// Integr. Comp. Biol. -2009. V. 49. -P. 69-79.

36. Carey A.T. Down-regulation of a ripening-related $-galactosidase gene (TBG1) in transgenic tomato fruits / A.T. Carey, D.L. Smith, E. Harrison, C.R. Bird, K.C. Gross, G.B. Seymour, G.A. Tucker // J. Exp. Bot. 2001. - V. 52. -P. 663-669.

37. Carpita N.C. Structural models of primary cell walls in flowering plants: consistency of the walls during growth / N.C. Carpita, D.M. Gibeaut // Plant J. -1993. V. 3. -P. 1-30.

38. Carpita N., McCann M. The cell wall / N. Carpita, M. McCann //

39. Biochemistry and Molecular Biology of Plants /Eds. Buchanan B., Gruissem W., Jones R Rockville: Am. Soc. of Plant Physiologists, 2000. -P. 52-108.

40. Chaffey I. Microfibril orientation in wood cells: new angles on an old topic/1. Chaffey//Trends Plant Sei. 2000. - V. 5. -P. 360-362.

41. Chivasa S. Proteomic analysis of the Arabidopsis thaliana cell wall / S. Chivasa, B. Ndimba, W. Simon, D. Robertson, X.-L. Yu, J. Knox, P. Bolwell, A. Slabas//Electrophoresis. -2002. V. 23. -P. 1754-1765.

42. Clair B. On the detachment of gelatinous layer in tension wood fibre /B. Clair, B. Thibaut, J. Sugiyama// J. WoodSci. 2005. - V. 51. -P. 218-221.

43. Clair B. Tension wood and opposite wood in 21 tropical rain forest species 1. Occurrence and efficiency of the G-layer / B. Clair, J. Ruelle, J. Beauchêne, M.F. Prévost, M,. Fournier //IAWA J. 2006. - V. 27.- P. 329338.

44. Clair B. Characterization of a Gel in the Cell Wall To Elucidate the Paradoxical Shrinkage of Tension Wood / B. Clair, J. Gril, F. Di Renzo, H. Yamamoto, F. Quignard // Biomacromol. 2008. -V.9.-№2.-P. 494-498.

45. Cronier D. Structure and chemical composition of bast fibers isolated from developing hemp stem / D. Cronier, B. Monties, B. Chabbert // J. Agric. Food Chem. 2005. -V. 53.- P. 8279-8289.

46. Dammstrom S. On the interactions between cellulose and xylan, a biomimetic simulation of the hardwood cell wall / S. Dammstrom, L. Salmen, P. Gatenholm//BioResources. -2009. V. 4. -M> 1. - P. 3-14.

47. Doorsselaere J. D. A novel lignin in poplar trees with a reduced cajfeic acid/5-hydroxyferulic acid O-methyltransferase activity / J. D. Doorsselaere, M. Baucher, E. Chognot, B. Chabbert, M.-T. Tollier // Plant J. — 1995. V. 8. -P. 855-864.

48. Dopico B. Partial-purification of cell-wall beta-galactosidases from Cicer arietinum epicotyls — relationship with cell-wall autolytic processes / B. Dopico, G. Nicholas, E. Labrador //Physiologia Plantarum. — 1989. — V. 75. — P. 458-464.

49. Dopico B. Characterization of cell wall fi-galactosidase of Cicer aritinum epicotyls involved in cell wall autolysis / B. Dopico, G. Nicolas, E. Labrador//Physiol. Plantarum. 1990. - V. 80. -P. 629-635.

50. Ebringerova A., Heinze T. Xylan and xylan derivatives — biopolymers with valuable properties, naturally occurring xylans structures, isolation procedures and properties / A. Ebringerova, T. Heinze // Macromol. Rapid Commun. 2000. - V. 21. -P. 542-556.

51. Erdtman G. Pollen and spore morphology/Plant taxonomy. Gymnospermae, Pteridophyta, Bryophyta (illustrations) / G. Erdtman. -Stockholm.: Almquist and Wiksell, 1957.

52. Esau K. Vascular differentiation in the vegetative shoot of Linum. III. The origin of bast fibers/K. Esau//Am. J. Bot. 1943. - V. 30. -P. 579-586.

53. Esteban R. Cloning of a Cicer arietinum beta-galactosidase with pectindegrading function / R. Esteban, B. Dopico, F.J. Munoz, S. Romo, I. Martin, E. Labrador //Plant and Cell Physiol. 2003. - V. 44. -№ 7.-P. 718725.

54. Esteban R. A family of beta-galactosidase cDNAs related to development of vegetative tissue in Cicer arietinum / R. Esteban, E. Labrador, B. Dopico//Plant Sci. -2005. V. 168. -Nq 2. -P. 457-466.

55. Evtuguin D.V. Characterization of an acetylated heteroxylan from Eucalyptus globulus Labill. / D.V. Evtuguin, J.L. Tomds, A.M.S. Silva, C.P. Neto//Carbohydr. Res. -2003. V. 338. -P. 597-604.

56. Fahn A. Plant Anatomy / A. Fahn. Oxford: Pergamon Press, 1990.-587p.

57. Fang C.H. Growth stresses are highly controlled by the amount of G-layer in poplar tension wood/Fang C.H., Clair B., Gril J., Liu S.Q. // IAWA J. 2008. - V. 29. -P. 237-246.

58. Fisher J.B. Tension wood fibers are related to gravitropic movement of red mangrove (Rhizophora mangle) seedlings / J.B. Fisher, P.B. Tomlinson // J. Plant Res. -2002. V. 115. -P. 39-45.

59. Fisher J.B. Anatomy of axis contraction in seedlings from a fire prone habitat/J.B. Fisher//Am. J. Bot. 2008. - V.95. -P. 1337-1348.

60. Fry S.C. The growing plant cell wall: chemical and metabolic analysis/S.C. Fry. London: Longman Sci. and Technic., 1988. —333p.

61. Fry S.C. Xyloglucanendotransglucosiuase, anew wall-looseningenzyme activity from plants / S.C. Fry, R.C. Smith, K.F. Renwick // Biochem. J. 1992. V. 282. -P. 821-828.

62. Fry S.C. Polysaccharide-modifying enzymes in the plant cell wall / Fry S.C. // Annu Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 1995. -V. 46. - P. 497520.

63. Fry S.C. Primary cell wall metabolism: trackingthe careers of wall polymers inlivingplant cells / Fry S.C. //New Phytol. — 2004. V. 161. - P. 641675.

64. Fujita M. Electron microscopy of microtubules and cellulose microfibrils in secondary wall formation of poplar tension wood fibers / M. Fujita, H. Saiki, H. Harada//Mokuzai Gakkaishi. 1974. - V. 20. -P. 147-156.

65. Gierlinger N. Insights into the chemical composition of Equisetum hyemale by high resolution Raman imaging / N. Gierlinger, L. Sapei, O. Paris // Planta. -2008. V. 227. -№ 5. -P. 969-980.

66. Giesler-Lee J. Poplar carbohydrate-active enzymes. Gene identificationand expressionanalyses / J. Geisler-Lee, M. Geisler, P.M. Coutinho //Plant Physiol. 2006. - V. 140. -P. 946-962.

67. Girault R. Identification and partial characterization of proteins and proteoglycans encrusting the secondary cell walls of flax fibres / R. Girault, I. His, C. Andeme-Onzighi, A. Driouich, C. Morvan // Planta. — 2000. — V. 211. — P. 256-264.

68. Gorshkova T.A. Cell-wall polysaccharides of developing flax plants / T.A. Gorshkova, S.E. Wyatt, V. V. Salnikov, D.M. Gibeaut, M.R. Ibragimov, V.V. Lozovaya, N.C. Carpita //Plant. Physiol. 1996. -V. 110.-№ 2.-P. 721729.

69. Gorshkova T.A. Turnover of Galactans and Other Cell Wall Polysaccharides during Development of Flax Plants / T.A. Gorshkova, S.B. Chemikosova, V.V. Lozovaya, N.C. Carpita //Plant Physiol. — 1997. V. 114. -N22.-P. 723-729.

70. Gorshkova T.A. Composition and distribution of cell wall phenolic compounds in the flax (Linum usitatissimum L.) stem tissues / T.A. Gorshkova, V. V. Salnikov, N.M. Pogodina //Ann. Bot. 2000. - V. 85. P. - 477-486.

71. Gorshkova T.A. Snap point: a transient point in Linum usitatissimum bast fiber development / T.A. Gorshkova, V.V. Salnikov, S.B. Chemikosova, M.V. Ageeva, N. V. Pavlencheva, J.E.G. van Dam // Ind. Crops and Products. -2003. V. 18. -P. 213-221.

72. Gorshkova T.A. Tissue-specific processes during cell wall formation in flax fiber / T.A. Gorshkova, M. Ageeva, S. Chemikosova, V. Salnikov // Plant Biosystems. -2005. V. 139. -N2 1. -P. 88-92.

73. Gorshkova T. Secondary cell-wall assembly in flax phloem fibres: role of galactans / T. Gorshkova, C. Morvan //Planta. 2006. - V. 223. - P. 149158.

74. Gritsch C.S. Developmental changes in cell wall structure of phloem fibres of the bamboo Dendrocalamus asper / C.S. Gritsch, G. Kleist, R.J. Murphy //Ann. Bot. -2004. V. 94. -№ 4.-P. 497-505.

75. Gurjanov O.P. MALDI-TOF MS evidence for the linking of flax bast fibre galactan to rhamnogalacturonan backbone / O.P. Gurjanov, T.A. Gorshkova, M.A. Kabel, H.A. Schols, J.E.G. van Dam //Carbohydr. Polymers. -2007. V. 67. -P. 86-96.

76. Gurjanov O.P. Polysaccharides, tightly boung to cellulose in the cell wall of flax bast fibre: Isolation and identification / O.P. Gurjanov, N.N. Ibragimova, O.I. Gnezdilov, T.A. Gorshkova // Carbohydr. Research. 2008. — V. 72. -P. 719-729.

77. Halpin C. Manipulationof ligninquality by downregulationof cinnamyl alcohol dehydrogenase / C. Halpin, M.E. Knight, G.A. Foxon // Plant J. 1994. -V. 6.-P. 339-350.

78. Heath I.B. A unified hypothesis for the role of memrane bound enzyme complexes and microtubules in plant cell wall synthesis /I.B. Heath //J. Theor. Biol. 1974. - V. 48. -P. 445-449.

79. His I. Microscopical analysis of mature flax fibers embedded in LR White: immunogold localization of cell-wall matrix polysaccharides /I. His, C. Andeme-Onzighi, C. Morvan, A. Driouich //J. Histochem. Cytochem. — 2001. — V. 49. -P. 1525-1535.

80. Hock C.W. Microscopic structure of flax and related bast fibers / C.W. Hock//J. Res. Nat. Bur. Stand. -1942. V. 29. -P. 41-50.

81. Hotte N.S.C., Deyholos M.K. A flax fibre proteome: identification of proteins enriched in bast fibres / N.S.C. Hotte, M.K. Deyholos //Plant Biol — 2008. — V. 8. (online access).

82. Hsu Y-Sh. Anatomical characteristics of the secondary phloem in branches of Zelkova serrata Makino. / Y-Sh. Hsu, Sh-J. Chen, Ch-M. Lee, L-L. Kuo-Huang//Bot. Bull Acad. Sin.-2005. V. 46. -P. 143-149.

83. Jamet E. Recent advances in plant cell wall proteomics / E. Jamet, C. Albenne, G. Boudart, M. Irshad, H. Canut, R. Pont-Lezica // Proteomics. — 2008. V. 8.-P. 893-908.

84. Jones L. Localization of pectic galactan in tomato cell wall using a monoclonal antibody specific to (l—4)-fi-D-galactan / L. Jones, G. Seymour, J.P. Knox //Plant Physiol. 1997. - V. 113. -P. 1405-1412.

85. Joseleau J.P. Detection in situ and characterization of lignin in the G-layer of tension wood fibres of Populus deltoides / J.P. Joseleau, T. Imai, K. Kuroda, K. Ruel//Planta. 2004. - V. 219. -Ns 2.-P. 338-345.

86. Kabel M.A. Structural differences of xylans affect their interaction with cellulose /M.A. Kabel, H. V.D. Borne, J.-P. Vincken, A.G.J. Voragen, H.A. Schols//Carbohydr. Polym. -2007. V. 69. -P. 94-105.

87. Kaku 71 Proteomic analysis of the G-layer in poplar tension wood / T. Kaku, S. Serada, K. Baba, F. Tanaka, T. Hayashi //J. Wood Sci. 2009. -V. 55. -P. 250-257.

88. Kohnke 71 The effect of barley husk arabinoxylan adsorption on the properties of cellulose fibres / T. Kohnke, C. Pujolras, J. P. Roubroeks, P. Gatenholm //Cellulose. -2008. V. 15.-№4.-P. 537-546.

89. Konno H., Tsumuki H. Purification of a j3-galactosidase from rice shoots and its involvement in hydrolysis of the natural substrate in cell walls / H. Konno, H. Tsumuki//Physiol. Plant. 1993. - V. 89. -P.40-47.

90. Lam T.B.T. Structural characteristics of cell walls ofkenaf (Hibiscus cannabinus L.) and fixation of carbon dioxide / T.B. 71 Lam, H. Keko, K. Iiyama //J. Wood Sci. 2003. - V. 49. -P. 255-261.

91. Lehringer C. Topochemical investigation on tension wood fibres of Acer spp. Fagus sylvatica L. and Quercus robur L./ C. Lehringer, N. Gierlinger, G. Koch //Holzforschung. 2007. - V. 62. - P. 255-263.

92. Lindeboom J. Cellulose microfibril deposition: coordinated activity at the plant plasma membrane / J. Lindeboom, B.M. Mulder, J. W. Vos, 71 Ketelaar, A.M.C. Emons / J. of Microscopy. 2008. - V. 231. -№ 2. - P. 192200.

93. Love G.D. Determination ofphenolic structures in flax fibre by solid state 13 C NMR / G.D. Love, C.E. Snape, M.C. Jarvis, I.M. Morrison // Phytochemistry. 1994. -V. 35. -P. 489-492.

94. McDougall G.J. Isolation and partial characterization of the noncellulosic polysaccharides offlax fibre / G.J. McDougall // Carbohydr. Res. — 1993. V. 241. - P. 227-236.

95. McDougall G.J. Plant fibres: botany, chemistry and processingfor industrial use / G.J. McDougall, I.M. Morrison, D. Stewart // J. Sci. Food and Agric. -1993. V. 62. -P. 1-20.

96. Mellerowicz E.J. Unravelling cell wall formation in the woody dicot stem / E.J. Mellerowicz, M. Baucher, B. Sundberg, W. Boerjan / Plant Mol. Biol. -2001. V. 47. -P. 329-274.

97. Mellerowicz E., Sundberg B. Wood cell walls: Biosynthesis, developmental dynamics and their implication for wood properties / E. Mellerowicz, B. Sundberg // Curr. Opin. in Plant Biology. 2008. — V. 11. - P. 293-300.

98. Mellerowicz E.J. Xyloglucan: The Molecular Muscle of Trees / E.J. Mellerowicz, P. Immerzeel, T. Hayashi // Ann. of Bot. 2008. - V. 102. - № 5. -P. 659-665.

99. Meloche Ch.G. A cortical band of gelatinous fibers causes the coiling of redvine tendrils: a model based upon cytochemical and immunocytochemical studies / Ch.G. Meloche, J.P. Knox, K.C. Vaughn // Planta. -2007. V. 225. -P. 485-498.

100. Mijnsbrugge K.V. Wood formation in poplar: identification, characterization, and seasonal variation of xylem proteins / K.V. Mijnsbrugge, H. Meyermans, M. van Montagu, G. Bauw, W. Boerjan //Planta. 2000. - V. 210. -P. 589-598.

101. Moctezuma E. Antisense suppression of a betagalactosidase gene (TBG6) in tomato increases fruit cracking / E. Moctezuma, D.L. Smith, K.C. Gross//J. of Exp. Bot. — 2003. V. 54. -P. 2025-2033.

102. Muller M. Direct investigation of the structural properties of tension wood cellulose microfibrils using microbeam X-ray fibre diffraction / M. Muller, M. Burghammer, J. Sugiyama //Holzforshung. 2006. - V. 60. - P. 474-479.

103. Paux E. Transcript profiling of Eucalyptus xylem genes during tension wood formation / E. Paux, V. Carocha, C. Marques, A. Mendes de Sousa, N. Borralho, P. Sivadon, J. Grima-Pettenati // New Phytol. 2005. - V. 167. -P. 89-100.

104. Pilate G. Lignification and tension wood / G. Pilate, B. Chabbert, B. Cathala, A. Yoshinaga, J.C. Leple, F. Laurans, C. Lapierre, K. Ruel // C.R. Biologies. -2004a. V. 327.-P. 889-901.

105. Pilate G. Tension wood as a model for functional genomics of wood formation / G. Pilate, A. Dejardin, F. Laurans, J.-C. Leple // New Phytol. — 2004b. -V. 164.-P. 63-72.

106. Plomion Ch. Wood formation in trees / Ch. Plomion, G. Leprovost, A. Stokes//Plant Physiol.-2001. V. 127. -P. 1513-1523.

107. Prodhan A.K.M.A. Orientation of microfibrils and microtubules in developing tension-wood fibres of Japanese ash (Fraxinus mandshurica var. japonica) / A.K.M.A. Prodhan, R. Funada, J. Ohtani, K Fukazawa // Planta. 1995. V. 196. -P. 577-585.

108. Raghothama K G. Characterization of an ethylene-regulated flower senescence-related gene from carnation / K.G. Raghothama, K.A. Lawton, B. Goldsbrough, W.R. Woodson //Plant Mol. Biol. 1991. -V. 17.-P. 61-71.

109. Reis D., Vian B. Helicoidal pattern in secondary cell walls and possible role of xylans in their construction / D. Reis, B. Vian // Comptes Rendus Biologies. 2004. - V. 327. -P. 775-776.

110. Roach M.J., Deyholos M.K. Microarray analysis of flax (Linum usitatissimum L.) stems identifies transcripts enriched in fibre-bearing phloem tissues/M.J. Roach, M.K. Deyholos //Mol. Genet Genomics. — 2007. V. 278. -Nq 2. -P. 149-165.

111. Roach M.J., Deyholos M.K. Microarray analysis of developing flax hypocotyls identifies novel transcripts correlated with specific stages of phloem fibre differentiation / M.J. Roach, M.K. Deyholos // Ann. of Bot. 2008. - V. 102.-K9 3.-P. 317-330.

112. Roland J.C'. Dynamique du positionnement de la cellulose dans les parois des fibres textiles du lin (Linum usitatissimum) / J.C. Roland, M. Mosiniak, D. Roland//Acta Bot. Gallica. 1995. - V. 142.-P. 463-484.

113. Rose J.K.C. Tackling the plant proteome: practical approaches, hurdles and experimental tools / J.K. C. Rose, S. Bashir, J.J. Giovannoni, M.M. Jahn, R.S. Saravanan // The Plant J. 2004. - V. 39. - P. 715-733.

114. Ross G.S. Apple 3-galactosidase: activity against cell wall polysaccharides and characterisation of a related cDNA clone / G.S. Ross, T. Wegrzyn, E.A. McRae, R.J. Redgwell // Plant Physiol. 1994. - V. 106 - P. 521-528.

115. Ruel K. The wood cell wall at the ultrastructural scale — formation and topochemical organization /K. Ruel, V. Chevalier-Billosta, F. Guillemin, J. B. Sierra, J.-P. Joseleau //Madeiras. Ciencia y Technologia. 2006. -V. 8.-№ 2.-P. 107-116.

116. Salnikov V. The localisation of sucrose synthase and callóse in freeze substitution secondary-wall stage cotton fibers / V. Salnikov, M. Grimson, R. Seagull, C. Haigler 11 Protoplasma. 2003. - V. 221. - № 3-4. - P. 175-184.

117. Salnikov V. V. Homofusion of Golgi secretory vesicles in flax phloem fibers during formation of the gelatinous secondary cell wall / V.V. Salnikov, M.V. Ageeva, T.A. Gorshkova//Protoplasma. -2008. V. 233. - P. 269-273.

118. Singh M.B., Knox R.B. Gene controlling fi-galactosidase deficiency in pollen of oil seed rape / M.B. Singh, R.B. Knox // J. of Heredity. — 1985. — V. 76. -P. 199-201.

119. Smith R.C. Endotransglycosylation of xyloglucans in plant cell suspension cultures /R.C. Smith, S.C. Fry //Biochem. J. — 1991. — V. 279. — P. 529-535.

120. Smith D.L., Gross K.C. A family of at least seven beta-galactosidase genes is expressed during tomato fruit development / D.L. Smith, K. C. Gross // Plant Physiol. 2000. - V. 123.-P. 1173-1183.

121. Smith D.L. Down-regulation of tomato fi-galactosidase 4 results in decreased fruit softening / D.L. Smith, J. A. Abbott, K.C. Gross //Plant Physiol. — 2002. V. 129. -P. 1755-1762.

122. Sturcova A. Structural details of crystalline cellulose from higher plants / A. Sturcova, I. His, D.C. Apperley, J. Sugiyama, M.C. Jarvis // Biomacromol. -2004. -V. 5.-P. 1333-1339.

123. Talmage K.W. The structure of plant cell walls. I. The macromolecular components ofthe pectic polysaccharides II / K. W. Talmage, K. Keegstra, W.O. Bauer, P. Albersheim//Plant Physiol. 1973. - V. 51. - P. 158173.

124. Tomlinson P.B. Development of gelatinous (reaction) fibers in stems of Gnetum gnemon (Gnetales) / P.B. Tomlinson //Am. J. of Bot. — 2003. — V. 90. -№ 7.-P. 965-972.

125. Valero P., Labrador E. Inhibition of cell wall autolysis and auxin-induced elongation of Cicer arietinum epicotyls by P-galactosidase antibodies / Valero P., Labrador E. //Physiol. Plant. 1993. - V. 89. -P. 199-203.

126. Plant growth and development: Plant fiber formation // van Dam, J.E.G., Gorshkova, T. A. / Chapter MS 46 Encyclopedia of Applied plant sciences / Academic Press, Elsevier Ltd., 2003. — P. 87-96.

127. Van Hazendonk J. Structural analysis of acetylated hemicellulose polysaccharides from fibre flax (Linum usitatissimum L.) / J. Van Hazendonk, E.J.M. Reinerink, P. de Waard, J. van Dam // Carbohydr. Res. 1996. - V. 291. -P. 141-154.

128. Vian B. Distribution and possible morphogenetic role of the xylans within the secondary vessel wall of linden wood / B. Vian, J. C. Roland, D. Reis, M. Mosiniak//IAWA BullNS. 1992. - V. 13. -P. 269-282.

129. Vicré M. Immunolocalization of fi-(l-4) and fi-(l-6)-D-galactan epitopes in the cell wall and Golgi stacks of developing flax root tissues / M. Vicré, A. Jauneau, J.P. Knox, A. Driouich // Protoplasma. 1998. — V. 203 — P. 26-34.

130. Vietor R.J. Conformational features of crystal-surface cellulose from higher plants / R.J. Vietor, R.H. Newman, M.A. Ha, D.C. Apperley, M.C. Jarvis // Plant J.-2002. V. 30. -P. 721-731.

131. Wesley S. V. Posttranscriptional Gene Silencing in Plants / S. V. Wesley, Ch. Helliwell, M.-B. Wang, P. Waterliouse //Methods Mol. Biol. -2004. V. 265. -P. 117-129.

132. Willats W.G.T. Pectin: cell biology and prospects for functional analysis / W.G.T. Willats, L. McCartney, W. Mackie, J.P. Knox //Plant Mol. Biol.-2001. V. 47. -P. 9-27.

133. Wyatt S.E. Arabidopsis thaliana as a model for geleratious fiber formation / S.E. Wyatt, R. Sederoff, M.A. Flaishman, S. Lev-Yadun // Rus. Plant Physiol -2010. -№ 3. (in press).

134. Xu R. Determination of cell wall ferulic and p-coumaric acids in sugarcane bagasse /R. Xu, J. Sun, C. Sun, B. L. He, J. Fan //Anal. Chim. Acta. -2005. V. 552. -P. 207-217.

135. Xu F. Comparative study of anatomy and lignin distribution in normal and tension wood of Salix gordejecii / F. Xu, R.-C. Sun, Q. Lu, G.L. Jones // Wood Sci. Technol. 2006. - V. 40. - № 5. - P. 358-3 70.

136. Yamamoto H. Role of the gelatinous layer (G-layer) on the origin of the physical properties of the tension wood of Acer sieboldianum / H. Yamamoto, K. Abe, Y. Arakawa, T. Okuyama, J. Gril// J. Wood Sci. 2005. -V. 51.- P. 222-233.

137. Yamamoto H. Role of the gelatinous layer (G-layer) on the origin of the physical properties of the tension wood ofAcer sieboldianum / H. Yamamoto, K. Abe, Y. Arakawa, T. Okuyama, J. Gril // J. Wood Sci. 2005. -V. 51.- P. 222-233.

Информация о работе

Мокшина, Наталья Евгеньевна
кандидата биологических наук
Казань, 2010
ВАК 03.01.05

Диссертация

Тканеспецифичная галактозидаза растительных волокон, формирующих клеточную стенку желатинозного типа - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы