Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Типо- и группоспецифические антигенные детерминанты аренавирусов, выявляемые с помощью моноклональных антител

ВАК РФ 03.00.06, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Типо- и группоспецифические антигенные детерминанты аренавирусов, выявляемые с помощью моноклональных антител"

АКАДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХ НАУК ИНСТИТУТ ПОЛИОЫИЕЛШ И ВИРУСНЫХ ЭНЦЕФАЛИТОВ

На правах рукописи

КУШПКАЯ Лвдшла Яковлевна

ТИПО- И тШОСШЩЮЕСШ АНТИГЕННЫЕ ДЕТЕРМЬШНТи АРЕНАВИРУСОВ, ВЫЯВЛЯЕМЫЕ С ПОМОЩЬЮ МОНОКЛОНАЛЪНЫХ АНТИТЕЛ

03.00.06 - вирусология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Ыосква - 1991

АКАДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХ НАУК ИНСТИТУТ ПОЛИОМИЕЛИТА И ЕИРУСКЫХ ЭНЦЕФАЛИТОВ

На гфавах рукописи

КУНИЦКАЯ Людмила Яковлевна

ТИЛО- И ГРУППОСПЕЦИФИЧЕСКИЕ АНТИГЕННЫЕ ДЕТЕРМИНАНТЫ АРЕНАВИРУСОВ, ВЦЯВЛЯЕЖЕ С ПОМОЩЬЮ МОНОКЛОНАЛЫШ АНТИТЕЛ

03.00.06 - вирусология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 1991

Работа выполнена в Белорусском ордена Трудового Красного Знамени научно-исследовательском институте эпидемиологии н микробиологии МЗ БССР.

A.C. Владыко

Официальные оппоненты - плен-корреспондент АШ СССР,

профессор В'.А.Лашевич

доктор биологических наук Н.ТЛихонова

Ведущее учреждение - Инс^у, ШссГ* ^^

Зашита диссертации состоится ^ 19Э1 г.

в " часов на заседании Специализированного совета (Д 001.27.01) при Институте полиомиелита и вирусных энцефалитов АМН СССР по адресу: 142782, Московская область. Ленинский район, и/о Институт шлиомиолита.

С диссертацией мои/о ознакомиться и библиотеке Института полиомиелита и вирусных энцефалитов АМК СССР.

Научный руководитель

кандидат медицинских наук

Автореферат разослан ." CSlfci c/zJ^ yaj г.

Г/

■ Ученый секретарь Спещшшзирозааиого совета, кандидат биологических наук

Лу р О.А.Мадаэдкина

Актуадьность работы. Семейство аренавирусов насчитывает 15 оболочечных РНК-содеркагоп вируcue, объединены* общностью уникальной морфологии частиц и грушоспецифи^есгааш антигенами [Rowe W.P, et al.,19701. Прототипним представителем всего семейства является вирус лкмфсцитарного гориомениншта (ЛХМ). Серологячеаатй анализ и географическое распространение вирусов позволяют разделить их на две большие группы - вирусы Старого Света и вирусы Нового Света. Первая группа - ЛХМ/Ласса - включает вирусы: Ласса, ЛХМ, Молейя, Мобвла, Скухуза, Иппи; вторая i"pyma - ТзкариЗе: вирусы Мачупо, Хунин, Такарибе, Латийо, Пичиуде, Амап&ри, Тамиамк, Парана, Флексал. С помощью поли- и мсноклональкых антител (ЫКЛ) iCarals J., 1975; Buchmeir M.J.et al, 1931; Sanchez et al., 1989] в группе Такарибе выделяют две антигенные подгруппы. Между вирусами первой подгруппы (Мачупо, Хунин, Такарибе, Амапари, Латино) выявляются более близкие антигенные связи, чем меаду ними и вирусами второй полгруппы (Пичинде, Парана, Тамиами).

Из патогенны* аренавирусов наибольшую опасность для человека представляет вирус Ласса, вызывающий одноименную лихорадку. Описаны случаи завоза этого заболевания в страны Европы и Северной Америки [Дроздов С.Г., Сергиев В.П., 1984].

йромв этог*, в последние года продолжается изоляция Ласса-подобных вирусов на Африканском континенте [Gonzales «J.P., 1982; 1984; Kiley Ы.Р. et al.,19361 .

Поиск групповых и типоспецифических эпитопов и выявление антигенных взаимоотношений у аренавирусов с помощью МКА по-прежнему привлекает повышенное внимание [Sanchez А. et al.,19891. Для . идентификации вновь выделенных изолятов необходимо получеиио МКА ко всему спектру антигенных детерминант. Необходимость получения МКА к аренавирусзм обусловлена еще и тем, что

они могут оказаться удобным инструментом для анализа •функциональных и биологических свойств аренавируссв.

В качестве экспериментальных вирусных моделей для получения гибридом, продуцирующих МКА, нами были выбраны основные представители семейства: непатогенный для человека вирус Ничкпце и патогенные вирусы Мачупо и Ласса.

Настоящая работа выполнена в плане научно-исследовательских работ, предусмотренных заданием МЗ СССР "Изучить субвирионные компоненты и факторы патогенности для разработки средств и методов диагностики, специфической профилактики и химиотерапии геморрагических лихооадок, вызываемых патогенными аренавирусами", * гос. регистрации 01.85.0062071.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы бы."э получение гибридом, продуцирующих МКА к патогенному и непатогенному для человека аренавирусам Мачупо и Пичинде комплекса Такарибе и патогенному вирусу Ласса, комплекса ЛХМ/Ласса, для выявления на их основе типо- и группоспецифяческих антигенных детерминант в структурных белках этих вирусов.

Поставленная цель обусловила необходимость решения следующих задач:

-отработка методики инактивации инфекционной активности патогенных для человека аренавирусов;

-отработка оптимальной схемы иммунизации мышей ВАЬВ/с инактивированным' вирусом с целью получения гипериммунных животных;

-отработка метода приготовления суспензионных препаратов, пригодных для массового скрининга образцов специфических антител в гибридомной технологии;

-получение и отбор стабильных штаммов гибридных клеток-продуцентов МКА к непатогенному для человека вирусу Пичинде и патоген-

ным вирусам Мачупо и Лассз;

-исследование антителпродуцирующей способности полученных гибридом при культивировании их in vitro и in vivo;

-изучение свойств МКА и специфичности к антигенам аренавиру-

сов;

-выявление взаимородственных антигенных связей у • представителей комплексов Такарибе и ЛХМ/Ласса;

-выявление группо- и типоспещфгееских антигенных детерминант в структурных белках аренавирусов.

Научная новизна и теоретическая значимость работы. В результате проведенных исследований и разработок впервые получены гибридомы, продуцирующие МКА к антигенным детерминантам патогенного вируса Мачупо. Штамм гибридных клеток AFMA-M, продуцирующий МКА к вирусу Ыачупо, защищен авторским свидетельством (реш. на выдачу Авт. свид. *4843403 /13 от 27.02.91 г.)

Впервые в стране получены гибридомы, продуцирующие МКА к непатогенному для человека вирусу Пичинде (комплекс Такарибе), направленные к поверхностному гликопротеиду. Штамм - продуцент МКА к вирусу Пичинде защищен авторским свидетельством * 1426086 (дата приоритета 27.07.1986).

Впервые в стране получены гибридомы, продуцирующие моноклональные антитела к антигенным детерминантам патогенного для человека вируса Лассэ (комплекс ЛХМ/Ласса). Штаммы гибридных клеток АРМА-Л, AFMA-L-1 защищены авторскими свидетельствами (# 1628525, дата приоритета 19.06.1989; реш. на выдачу авт.скид. » 4906435/13 от 22.05.91 г.).

Проведен анализ секреторной способности полученных гибридом. Изучены свойства МКА в различных серологических реакциях: реакция связывания комплемента (РСК), реакция нейтрализация (РН), непрямая

иммунофлюоресценция (ИФ), твердофьзкый иммуноферментный анализ •(ИФА), радиоиммунопрецигштадая (РИЛ).

С помощью полученной коллекции МКА обнаружены и подтверждены общие антигенные детерминанты у вирусов Мачупо, Лаоса, Мапейя, •Такарибе и Тамиами.

Впервые были получены тиаоспецифические МКА к вирусу Мачупо н Пичинде, позволяющие проводить серодиффоренциацшо вирусов.

Впервые получены МКА, специфичные к белку СР-2 вируса Ласса, обладающие нейтрализующей активностью, что показывает наличие нейтрализующего сайта в беже, являющимся высококонсервативным.

Практическая ценность работа. Разработана методика, позволя-якщая в'условиях максимальной безопасности получать стабильные и технологичные штаммы гибридных клеток, продуцирующие МКА к патогенным и кензтогенным для человека аренавирусам.

Серии стабильных и технологичных гибридом применены в качестве базы для наработки МКА с целью получения усовершенствованных иммунодиагностических препаратов.

Препараты МКА к групповой антигенной детерминанте вирусов комплекса Такарибе в ЛХМ/Ласса, а также препараты МКА, обладающие нейтрализующей активностью, продуцируемые гибрвдомами серии АРМА-Л, используются в научно-практических целях в БвлНШЗМ МЗ БССР, а также переданы в вирусологическую лабораторию Республики Гвинея. Получена и испытана в Новосибирском ВНЩ молекулярной биологии Микмедпрома в декабре 1990 г. экспериментальная серия диагностического препарата на основе МКА к вирусу Ласса, конъюгированных с пероксидазой хрена.

Препараты МКА к вирусам Мачупо и Пичинде, продуцируемые гибридомами АРМА-М к АГМА-П, используются в научно-исследовательских разработках в отделе ООВИ БелНИЮМ МЗ БССР.

- 7 -

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Отработаны условия инактивации патогенных для человека аренавирусов с целью использования в" дальнейшем при получении МКА. Показано преимущество длительной схемы иммунизации мышей линии ВаХЗ/с, что позволяет получить активированные спленоциты животных, используамке в гибрадошой технологии.

2. Впервые получены 37 линии гибридом, продуцирующих МКА к антигенным детерминантам вируса Мачупо. Кроме этого, получено 40 линий гибридных клеток, продуцирующих МКА к вирусу Ласса, и 3 линии - к вирусу Пичинде. Полученные гибридные линии клеток могут служить перспективным источником гомогенных специфических антител, пригодных для изучения антигенной структуры вирусных белков, их взаимородственных отношений.

3. Наличие общих антигенных детерминант у вирусов Мачупо, Такарибе и Тамиами и отсутствие таковых у вирусов Пичинде и Амапари подтверждает наличие в серокомплексе Такарибе двух антигенных подгрупп.

4. Поверхностный белок гликопротеида СР-2 вируса Пичинде и нуклеопротеид вируса Мачупо содержат типоспецифические антигенные детерминанты, выявляемые с помощью МКА.

5. С помовд з МКА, специфичных к вирусу Ласса, выявлены общие антигенные детерминанты для вирусов Ласса, Мачупо, Такарибе, Тамиами и Мопейя, локализование в белках ИР и бР-г.

Апробация работы. Результаты исследований доложены на пленумах проблемной комиссии союзного значения "Химиотерапия и химиопрсфшактика вирусных инфекций, особо опасные и медленные инфекции", Минск, 1984, 1986 гг; на II Всесоюзном совещании "Культивирование клеток животных и человека" в г. Пушино в ноябре 1985; на XII Мечниковской конференции молодых

ученых-медиков "Современные вопросы вирусологии, микробиологии и иммунологии" в г.Одессе в сентябре 1989 г.; на 2-ом рабочем Совещании Координационного сосета по комплексной программе. Моноклональные антитела*в изучении и диагностике природно-очагових инфекций, в Ростове-на-Дону в июне 1991 г.

В завершенном виде диссертационная работа была доложена на конференции отдела ООВИ, протокол * 7 от 29.05.91 г., на заседании Ученого совета БелНИИЭМ, протокол * 5 от 13.06.91 г.

Публикация результатов исследования. По материалам диссертации опубликовано 18 печатных работ.

Объем и структура работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, методической части, результатов исследований, обсуждения, выводов и спис "а литературы. Последний включает I-1G источников отечественной и зарубежной литературы.

Работа изложена на 122 листах машинописи, включает 7' рисунков и 19 таблиц.

Обзор литературы. В соответствии с ~ основными задачами диссертациионной работы обзор литературы состоит из главы, состоящей из 3 частей. В главе отражены: основная характеристика аренавирусов, анализ антигенной структуры аренавирусов с помощью поли- и моноклональных антител, а также рассмотрены вопросы взаимородственных антигенных связей у представителей семейства аренавирусов.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования. В работе использовали вирус Ласса (штамм Josiah), полученный от д-ра G.van der Groen (Институт

тропической медицины, Антверпен, Бельгия); штамм An 3739 вируса

Пичинде, штамм Corvalio Еируса Мачупо; вирусы Такарибе, Тамиами,

Ачапари, Мспейя.

Вирусы размножали в культура* клеток 4647, BHK-2I. Vero и титровали методом негативных колоний под агаровым покрытием в однослойных культурах клеток Yero. Вирусную суспензию с титром

с 7

10 -10 БОЕ/мл использовали для получения иммуногена. С этой целью зируссодэржещую жидкость концентрировали на "Amicoii" DC-2 с полыми волокнами Н1Р-Ю0. Очищенный препарат вируса готовили методом центрифугирования в линейном градиенте плотности сахарозы 20-60% при 30000 g в течение IQ ч при 4°С.

Для иммунизации мышей линии £¡¿LB/o. использовали антигены вирусов Лаоса и Мдчудо инактивированные гамма-облучением в дозе 20 кГр.

Гибридизацию иммунных спленоцитов с миеломдами клетками ж-1, NS-o, хбз, fg, X53-AG8.653 проводили по общепринятому методу [Kohler tí, Milstein С, 1975].

Скрининг положительных гибридом осуществляли с помощью метода непрямой ИФ. Специфическую активность полученных МКА определяли в реакциях непрямой ИФ, ИФА, РСК, FH.

Клонирование и реклонирсвание положительных гибридом проводили с помощью метода предельных разведений Шовохатский А.С. и др., 1985]. К^чоконсервацию и восстановление гибридом проводили по ранее описанному мэтоду [Малахова И.В. и др., 1965].

Специфичность МКА к структурным белкам аренавирусов определя-ме-годом ралиокммунопреципитации с последупцим электрофоретическим анализом (Lukashevich I.S., Lemeshko N.N.,1985)

Относительную авидность МКА определяли методом ИФА [Владыко А.С. и др., 1387; Bruck С. et al., 1982J.

Класс продуцируемых гибрвдомами иммуноглобулинов проводили методом ЙФА с использованием набора для изогипирования мышиных

МКА фирмы "Caibiochanr (Швейцария, кат.# 38G445).

Исследование специфичности получениях моноклинальных антител с помощью техники иммунопреципиташш и последующего электрофоретического ' анализа выполнены совместно со ст.науч.сотр., канд.биол.наук Н.Н.Лемешко (лзб.ГЛ отдела ООВИ -руководитель докт.мед.наук И.С.Лукашевич.

РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

I. Особенности получения гибридом, продуцирующих ыонокло-налъяне антитела к аренавирусам. Поскольку аренавируск Ласса и Мачупо, с.одной стотхзкы, относятся к высоко патогенным, а с другой -'обладают лилфотропвостыо, то необходимым условием при получении гибридом служила ¡активация их инфекционной активности . Для этой цели использовали подобранную нами дозу гамм?.-облучения в 20 кГр, позволяющую проводить полную инактивацию вирусов при максимальном сохранении ьативности ьирусикх белков,

С*

обусловливающих антигэнные и иммуногенные свойства.

■ При отработке оптимальной схемы иммунизации мышей лишга BALB/o было выявлено, что наиболее высокие титры антител в крови животных получены при использовании продолжительной схемы иммунизации мышей, .охватываицей период не менее 2 месяцев с введением бустерной дозы антигенного препарата непосредственно в селезенку.

Гибридизацию"клеток шеломы мышей с иммунными сплоноцитами в соотношении 1:2-1:5 проводили на 4-й день после бустзрно?. дозы антигена в присутствия 50Х ПЭГ - 4000 фирмы loba.

После слияния иммунных к вирусу Ласса сллеясцитов с киеломей X-G3 гибридные клоны обнаруживались в 80,7? лунок. После серийных

пересевов и позтсркых тестирований выделено 4 активно размножающихся и продуцирующих, специфические к вирусу Лассз антитела, гибридных клонов, что составило 0,322 от общего числа культур.

Совсем иная картина наблюдалась при использовании родительской миеломной лиши N3-1. В результате слияния гибридные культуры были обнаружены только в 6,9% лунок. Однако, первичный скргошнг супернатантов из II растущих гибридных культур показал, что Гфодукцич сшцкфических антител через 2-3 недели после слияния обнарукгвалась у всех клоков (100%). Такой ке высокий выход положительных гибридом был получен на модели патогенного вируса Мачуш.

После клонирования и реклонирования положительных гибридом нами были приготовлены 40 линий гибридных клеток серии АРМА-Л, активно продуцирующие специфические МКА к В1фусу Ласса, 37 линий гибридных культур серии АРМА-М, продуцирующих МКА к вирусу Мачуш, и 3 стабильные линии АЖА--П, продуцирующих МКА к вирусу Шгшнде.

Для изучения свойств МКА в различных серологических реакциях мы использовали аецитическпе кидкости, которые получали путем введения гибридных клеток в брюшную полость сингенным типам, предварительно г^нсибилизированный различными агентами. Получен-¡ше данные подтверздяют целесообразность применения в. качестве сенсибилизирующих агентоЕ пристана, полного и неполного адъввактов Фрейнда. Однако, наш, также как я другими авторами (Матвеев й др., 19891, было выявлено некоторое преимущество предварительной обработки мышей неполным адъютантом Фрейнда. В этом случае сенсибилизация проводилась не за 2-4 недели, а за 1-4 суток до введения гибридных клеток, при этом, доза инокулируемых клеток, необходимая для формирования асцита, сокращалась.

-122. Серологическая характеристика ионоклональных антител к .аренавирусаы Ласса, Мачупо и Пичинде. Известно, что МКА избирательно вступают в определенные серологические реакции, поэтому Для характеристики их биологической активности требуется применение комплекса серологических методов (непрямая ИФ, ИФА, РСК, ГО, РИП).

. Все полученные МКА серий АРМА-Л, АРМА-М и АРМА-П обладали

высокой специфической активностью ь непрямой Ш и ИФА, титры

антител достигали'до 1:32000 в ИФ и 1:1000000 в ИФА (табл.1, 2, 3)

> Таблица I

Характеристика МКА к антигенам вируса Ласса

Класс проду- Специфическая активность Специфичность

Гибри- цируемых им- ------------------------ к белкам ви-

дома муноглобул. ИФ ИФА РН РСК руса Ласса

1101 С". 8000 1000000 0 0 ггр

1102 С1 16000 64000 О О ИР

1103 01 16000 1000000 0 0 ЯР 1107 16000 64000 0 0 М? . 1122 01 16000 256000 1,4° 0 ар-2 1127 01 8000 4000 С) О СР-1

1131 01 16000 256000 0 0 Ю>

1132 01 16000 4000 О О ОР-1

1138 С1 32000 64000 0 0 НР

1141 01 16000 64000 0 0 КР

Позитивный контроль

АХЯвМ, С1, вга, 1024 64000 2,1 128 НР, ОР-1,

сгь вр-г

Поскольку полученные нами гибридомы продуцироЕали, в основном, иммуноглобулины 01, не способные активировать комплемент, то все они не обладали' комплементсвязквавдиыи свойствами. В наших исследованиях почти все полученные МКА не были способны нейтрализовать вирусную активность. Исключение составили МКА 1122, специфичные к вирусу Ласса, индекс нейтрализации которых оказался

рэвен 1,4 БОЕ/мл

Идентификацию вирусных белков, с которыми взаимодействовали

МКА, проводили с помощью метода радиоиммунопреципитации и

последующего электрофоретического анализа. По специфичности МКА.

полученные к вирусу -Пасса, были распределены нз 3 группы: МКА,

преципитирующие белок нуклеопротеида вируса Ласса с М.м. 60 кД;

МКА, преципитирующие поверхностный белок гликопрэтеида бР-1 с М.м.

Таблица 2

Серологическая характеристика и специфичность МКА к вирусу Мачупо

МКА Класс про- Специфи- Активность МКА в тестах

серии дуципуемых чность к -------------------------

АРИА-М иммуногло- белкам ИФ ИФА РН

булинов в. Мачупо

3101 61 КР 16000 4000 0

3103 61 ЯР 16000 1000 0

3106 ЯР 4000 1000 а

3107 01 ИР 16000 64000 0

3108 01 ЯР 16000 256000 0

3140 ЯР 64000 1000000 0

3122 . ЯР 4000 256 0

48 кД и МКА, преципитирующие гликопротеид бР-г с М.м 34 кД. МКА 1122, специфичные к бР-2, обладали способностью нейтрализовать вирусную актив* четь. Известно, что нейтрализующие зпитопы определяются, в основном, в составе поверхностных белков бР-1 некоторых аренавирусов. Имеются лишь единичные публикации, подтверждающие способность МКА, специфичных к ар-г. чзстично нейтрализовать инфекционную активность вируса ЛХМ (ВисЬте1ег М^ et а1, 1981]. Наши данные показывают существование нейтрализующего эпитопа в высококонсервативном белке (¡Р-2 вируса Ласса.

Исследование на специфичность МКА, полученных к вирусу Мачупо показало, что все они преимитировали белок с М.м.64 кД, что

ссответтствует белку нуклеопротеида вируса.

Анализ специфичности ШСА к структурным белкам вируса Шгашде

показал,что исследуемые, МКА преципитировали гликопротеид gp-2 с

М.м. 38 кД и вирусные белки с М.м. 68, и 30 кД. ,Из литературы

известно, что МКА, специфичные к гликопротеидам некоторых

аренавирусов, кроме основного белка, дополнительно преципитируют

другие белки. Это объяснется наличием сходных конформашюнных

Таблица 3

Свойства моноклональшх антител к аренавирусу Пичинде

«jj. Иммукофгаоорес- Титр антител спецкФич-

'г.„ центное свечение в реакциях

af& """ "Цитоплаз ""мембран-~ ~ЙФ ЙФА' n^w/ш

лгаАП _____магическое___ное_______________________________

A-I + í 256 64000

А-2 + + 512 256000

А-3 + + 1024 1000000

структур в. эпитопэх белков и частичной деградацией' одного из вирусных белков ÍHoward. C.R. et al.,1585].

3. Антигенные взаимоотношения между аренавирусами, выявляемые с помощью иококлояальных антител. Изучение антигенных Езаимоотас-шений между аренавирусами проводили с помощью непрямой ИФ и радиоиммуногфсципктйции. Как видно из табл.4, МКА, специфичные к вирусу Ласса, обнаруживали в непрямой ИФ гетерологкчше вирусы Старого Света (Мопейя) и Нового света (Мачупо, Такарибе, Тамаами). Антигенные детерминанты, общие для вышеназванных вирусов, локализованы во внутреннем бзлке N? и поверхностном гликопротеиде GP-2. Ни один вид МКА не обнаруживал антигенного родства между вирусами Пичявде и Амепари. Вышеизложенные данные по перекрестной реактивности, были подтверждены и дополнены с помощью метода

gp-2 gp-2 gp-2

Таблйца 4

Перекрестная реактивность MICA, специфичных к вирусу Ласса, с гетерологичнпмк вирусами

МКА Специфичность Ретерологичные вирусы

серии к структурным ------------------------------------------------

AFIiA-Л белкам вируса Мопейя Мачупо Такприбе Тамиами Ам^нари Пичикд^ Ласса

1103 NP + т Ч

по? NP + + + +

1108 NP + + +

1109 NP + +

1110 NP + + 4

1122 GP-2 + + +

1141 JIP + ■f

норм. АЖ б.мышей ИАК б. мышей NP, GP-I, GP-2 + ' 4 + +

В опыт взяты асцитические жидкости белых мышей, иммунизированных соответственно вирусами Мопейя, Мачупо, Такари.бе, Тамиами, Амапари, Пичинде.

радиоиммунопреципитации. Как видно из табл. 4, МКА, специфичные к вирусу Ласса, преципитируют белки NP гомологичное вируса (дороаки 2,3,) и белки NP вирусов Мачупо, Такарибо и Мопейя. Таким образом, полученные результаты позволяют предполскить, что пси исследованные МКА к вирусу Ласса направлены против групповой антигенной детерминанты, являющейся общей для вирусов Ласса, Мопейя, Такарибе, Тамиами и Мачупо.

При исследовании перекрестной реактивности МКА. полученных к вирусу Мачупо, оказалось, что МКА 3106, 3107 и 3122 способны реагировать в непрямой № с инфицированными вирусами Ласса, Такарибе и Тамиами клетками vero (табл.5). В то ке время, МКА 3103 и 3140 обладали более широким спектром гетерологичной реактивности и способны реагировать как с антигенами вышеуказанных вирусов, так и с вирусом Мопейя, который представляет другой серологический

-¿шг 3 4 6 6 7

200-

—№

■-ГТ

Рис. Имвдтгопрсципигация вирусспецифических белков МКА 1108

1-ая дорожка - молокулярше массы (в кД) стандартных белков фирмы "АтегеЬат"

2, 3 дорожки -- МКА -г клетки, инфицирс.ванные вирусом Ласса

4-ая дорожка - МКА + неинфицированные клетки

5-ая дорожка - МКА ч клетки, инфицированные вирусом Мачупо 5-ая дорожка - МКА + клетки, инфицированные вирусом Такариба 7-ая дэрокка - МКА + клетки, инфицированные вирусом Мопейя

Габлица 5

Антигенные взаимосвязи между аренавирусами, выявляемые с помощью МКА серии АРМА-М в непрямой ИФ

МКА Гетерологичные вирусы

серии -----------------------------------------:-------------------

АРМА-М Ласса Мопейя Такарибе Тагами Пичиндо Амапари

3101 - - - -

3103 + + + +

3106 + - + •+

3107 + - + + - -3122 + - + +

3140 + . + + + - -

норм. АЯ.

0. мышей - -

ИАЖ

0. мышей + -* + + + + +

В опыт взята асцитические жидкости белых мышей, иммунизированных, соответственно, вирусами Ласса, Мопейя, Такарибе, Тамиами, Пичинде и Амапари.

комплекс семейства. До настоящего времени в литературе не содержалось сведений о наличии общих антигенных детерминант у вирусов Мачупо и Мопейя.

Данные по перекрестной реактивности МКА к вирусу Мзчупо с вирусом Ласса были подтверждены и дополнены исследованиями, выполненными с помощью реакций ИФА и иммунопрвципиташш. Было показано, что перекрестно реагируемые в ИФА МКА к вирусу Мачупо преципитировали белок нуклеокапсида вируса Ласса.

Особый интерес представляет факт отсутствия перекрестной реактивности МКА к вирусу Мачупо с вирусами, входящими в этот же серокомплекс - Пичинде и Амапари.

МКА 3101, распознающие антигенные детерминанты в белке вируса Мачупо, не обнаруживали гетерологичных перекрестов ни с одним из исследованных вирусов, а, следовательно, обладали

типоспецифгееской активностью. Ранее с помощью ' поликлональных антител было определено наличие б белке ш> аренавирусов только группоспецифических эпитопов, а с типоспацифичностыз были связаны поверхностные гликопрорейда. Позже с помощью МКА НиГегЪ 1989 на модели, вируса Ласса показали, что белок МР содержит антигенные сайты, с которыми связаны как ^уппоспецифические, так и типоспецифические . антигенные свойства. Наши данные доползши вышеизложенное. На модели патогенного вируса Мачупо было показано, что типе- и группоспецифичеекие антигенные детерминанты вируса локализованы в белке нуклеокапсида.

МКА серия АРМА-П, специфичные к гликопротеиду вР-й, взаимодействовали в реакции ИФА только с гомологичным вирусом Пичинде и не проявляли активности ни с одним из гетерологичных вирусов группы Такарибе и ЛХМ/Ласса. Способность этих МКА избирательно реагировать только с гомологичным вирусом'' позволяет считать, что эти антитела направлены против типоспецифической антигенной детерминанты', расположенной на гликопротеидз ор-2 вируса Пичинде.

Выводы.

1. Получено 37 линий гибридных клеток, продуцирующих МКА к вирусу Мачупо. Подтверхдено наличие общих антигенных детерминант у вирусов Мачупо,. Ласса, Такарибе и Тамиами, выявляемых моноклональными антителами в структурных белках да.

2. Получено 40 линий гибридных клеток, продуцирующих МКА к вирусу Ласса. Подтверждено антигенное родство между вирусами Лзсса и Мопейя, а также вирусами Мачупо, Такарибе, Тамиами, относящимися

к разным серологическта комплексам.

3. Выявлена в белко KP 060510 антигенные детерминанты у вирусов Мачуго и Мспейя. относящихся к разным серологическим группам.

4. С помощью МКА к вирусу Мачуго показано тесноэ антигенное родство вирусов Тамиами, Мзчупо и Такарибе, что предполагает зозмоуйость пахокдения вируса Тамиами в подгруппе Та-карибе.

5. Функциональный анализ МКА, специфичных к вирусу Ласса позволил выявить наличие зируснейтрализувдего эпктопа в высококонсервативном белке GP-2 вируса Лэсса.

G. Показано, что поверхностный белок fiP-2 вируса Пичинде содеркит типоспещщичсские антигенные детерминанты, выявляемые с помощью МКА к Еирусу Пичинде.

Список научных трудов, опубликованных по теме диссертации:

I. Ковохатский A.C., Малахова И.В., Гайдямович С. Я., Мельникова Е.Э., Свешникова H.A., Михеева Т.Г., Литвинович Н.У., Куницкая Л.Н., Шуткона Т.М. Получение аецктных препаратов монокленалькых алтател // Вопр. вирусол. - 1985. - Je6 - С.749-753.

' 2. Литбиноейч Н.Е.,- Малахова И.В., Куницкая Л.Н., Новохатский A.C. Выявление моноклональных антител методом иммунофлворесценции // В сб.:"Культивирование клеток животных и человека".- Пуиино,

I9S5. - С. Э2-ЭЗ.

3. Нивсхатсхий A.C., Малахова И.З., Гайдамович С.Я., Мельникова Е.Э., Свепппжовз H.A., Михеева Т.Г., Литвинович Н.Е.,

Куницкая Л.Я., Шуткова Т.М. Сравнительная характеристика асцитных препаратов моноклональшх антител, продуцируемых различные Гибридомами // Там же. - С. 93-94.

4. Куницкая Л.Я., Владыко A.C., Новохатский A.C. В1фус Пичинде. Оптимизация ^экспрессии в клетках Vero антигенов, выявляемых непрямым методом флюоресцирующих антиуел // В сб.: "Химиотерапия и химиопрсфилактика вирусных инфекций . Особо опасные и медленные инфекции". - Минск, 1985. - С. 100-104.

5. Новохатский A.C., Малахова И.В., Гайдамович С.Я., Мельникова Е.Э., Свешникова H.A., Михеева Т.Г., Литвинович Н.Е., Куницкая Л.Я., Шуткова Т.М. Изучение условий образования асцитов при культивировании гибридов in vivo // КМЗИ. - 1986. - W?. - С. 13-17.

6. Куницкая Л.Я., Зайцева В.Н., Владыко A.C., Новохатский A.C. Продукция инфекцгэнного вируса и накопление в клетках Vero антигеноб вируса Пичинде, выявляемых непрямым методом флюоресцирующих антител /'" Вопр. вирусол. - I9S6. - #4. -С. 493-498.

7. Куницкая Л.Я., Малахова И.В., Владыко A.C., Новохатский. A.C. Моноклоналыше антитела к гликопротеиду вируса Пичинде // В сб.: "Актуальные вопросы микробиологии, эпидемиологии и иммунологии инфекционных болезней". - Харьков, 198!-'. - С. 85-86.

8. Куницкая Л.Я., Малахова И.В., Быстрова С.И., Лемешко H.H., Владыко A.C., Новохатский A.C. Получение и характеристика моноклональшх антител к арвнавирусу Пичинде // Вопр. вирусол. -1988. - JJ3. - С. 3G5-369.

9. Владыко A.C., Куницкая Л.Я., Малахова И.В., Лукашевич И.О., Новохатский A.C. "Штамм гибридных культивируемых клеток животных Mas musculuß, используемый для получения моноклональшх антител je 'аренавирусу Пичинде" // Авт. свид. * 1426086 от 22.05. 1988 г.

10. Владыко A.C., Куницкая Л.Я., Быстрова С.И., Чередниченко И. А., Зайцева В.Н. "Штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus musculuß, используемый для получения моноклокальных антител к аренавирусу Ласса". Автор, свид. * 1628525 от 15.08.1990.

И.Владыко A.C., Куницкая Л.Я., Быстрова С.И., Хзатова Л.А. Реакция коагглютинации для выявления вируса Ласса // В сб. мат.. 1-го Иммунологического съезда Белоруссии. "Экологические

проблемы иммунологии и аллергологии". Минск.-1990. - С. 26.

12.Куницкая Л.Я., Малахова И.З., Сурикоза Л.Е., Владыко A.C. Моноклональные антитела, специфичные к вирусу Мачупо: особенности использования в серологических реакциях // Там же. - С.34-35.

13.Владыко A.C., Куницкая Л.Я., Выстрова С.И., Крзсько А.Г., Лемешко H.H., Лукашевич И.С. Получение и .характеристика моноклональчых антител к ьирусу Ласса // Вопр. вирусол. - 1990. -*5. - С. 396-398.

14.Владыко A.C., Куницкая Л.Я., Красько А.Г., Быстровз С.И., Пыжова Н.С., Лукашевич К.С. Рекомбинантные моноклональные антитела к вирусу Ласса: формирование реактивных паратопов // Там же, -1Э90.- Хв. - С. 488-492.

15. Vladyko А., Kunitskya L., Bystrova S., KrasKO А., Lemeshko II., Lukashevich I. Recombinant monoclonal antibodies (RHAbs) specific to nucleocapsid protein (IIP) of Larsa virus //

' VHI-th international Congress of virology. Berlin, 1990. - F.151.

16.Малахова И.В., Куницкая Л.Я., Владыко A.C., Лукашевич И.С. Штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus murculus. АРМАМ - продуцент моноклональных антител к аренавирусу Мэчупо // Реш. яа выдачу Авт. свид. * 4843403 /13 от 27.02.91 г.

17.Куницкая Л.Я., Быстрова С.И., Чередпичеснко И.А., Зайцева В.Н., Владыко A.C. Получение антителпродуцируиаих гибридом к вирусу Ласса // МЭИ. - 1991. - 183. - С. 67-70.

18.Владыко A.C., Куницкая Л.Я., Малахова И.В., Лукашевич И.О. Штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus musculus •АРМА-ь-1 - продуцент моноклональных антител к поверхностному гликопротеиду вируса Ласса // Реш.на выдачу Авт.свид. £ 49054&5/I3 от 22.05.91 г.

Подписано к печати 10.10. 91г. Заказ » 142. Тирад 100 экз. Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов АМН СССР