Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Тиопзависимая гемолитическая активность KLEBSIELLA PNEUMONIAE и ее рольв патогенности

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Тиопзависимая гемолитическая активность KLEBSIELLA PNEUMONIAE и ее рольв патогенности"

- - „л п

I

1 и

На правах рукописи

РУДНЕВ Игорь Александрович

ТИОПЗАВИСИМАЯ ГЕМОЛИТИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ KLEBSIELLA PNEUMONIAE И ЕЕ РОЛЬ В ПАТОГЕННОСТИ

(03.00.07— микробиология)

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва^ 1995

Работа выполнена в Научно-исследовательском институте эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н. Ф. Гамалеи РАМН.

Научный руководитель: доктор медицинских наук, профессор В. М. Бондаренко

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор А. Ф. Мороз доктор медицинских наук А. С. Анкирская

Ведущее учреждение: Московская Медицинская Академия имени И. М. Сеченова

Защита диссертации состоится «¿С 199/Г г.

в $часов на заседании Диссертационного совета К 001.07.01 в Научно-исследовательском институте эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н. Ф. Гамалеи РАМН по адресу— 123098, Москва, ул. Гамалеи, 18.

С диссертационной работой можно ознакомиться в библиотеке НИИЗМ им. Н. Ф. Гамалеи РАМН.

Автореферат разослан 199ч^~года

Ученый секретарь специализированного совета доктор медицинских наук

Е. И. Коптелова

Актуальность проблемы. Особенностью современных гнойно-воспалительных инфекций является возрастание числа заболеваний, вызываемых грамотрицательными условно-патогенными бактериями, среди которых доминируют клебсиеллы. В настоящее время бактерий вида К. pneumoniae и К. oxytoca регистрируют в качестве возбудителей воспалительных процессов урогениталь-ного грйкта, мозговых оболочек, поражении глаз, суставов и позвоночника, а также при острых желудочнокишечных заболеваниях (Wenffen VV. et al., 1984; Бондаремко В.M. и др.> 1994).

Отмечено, что клебсиеллы, вызывая воспалительные процессы различной локализации, в основном поражают больных со сниженной иммунореактивностью, новорожденных и детей первого года жизни (поражая от 15 до 20% госпитализированных детей (Maki О. et al., 1384; Masta A. et al., 1985, ¿ерезина Л.A. И др., 1993, Фролов В.М, и др., 1Э94.).

Выша сказанное свидетельствует об актуальности изучения факторов и свойств патогенности у клинических изолятов клеб-сиелл и их этиологической значимости.

Одним из таких недавно обнаруженных свойств является гемолитическая активность клебсиелл (Albeza I.L. et al. 1985), опосредуемая тнолзавиеимым, термо-стабильным димерным белком {1 в KDa). Роль гемолитической активности клебсиелл.в развитии патологического процесса и ее генетический контроль требует изучения.

Целью настоящей работы являлось изучение тиолзависимой гемолитической активности К. pneumoniae, выявление природы ее генетического контроля и роли в развитии инфекционного процесса на иоиелпх m vitro и fn vivo).

Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи ; -

1. Создать коллекцию клинических штаммов клебсиелл, выделенных в роддомах и детских стационарах некоторых городов России, Украины и Литвы.

2. Охарактеризовать штаммы по наличии тиолэависимой гемолитической активности и определить частоту ее встречаемости среди клинических изолятоа клебсиелл.

3. Охарактеризовать тип гемолиза и биохимические особенности тиолзависимой гемолитической активности клебсиелл: определить активирующие и ингйбирукмцие субстраты, а также эритроциты каких животных являются наиболее чуствительныии к гемолитической активности клебсиелл.

4. Установить природу генетического контроля тиолзависимой гемолитической активности и получить изогенные пары штаммов К.pneumoniae, различающихся по гемолитической активности.

5. В экспериментах на различных биологических моделях при использовании изогенной пары штаммов К.pneumoniae.: интрана-зальное заражение беспородных белых мышей, инфицирование культуры клеток Н£р~2 и перитонеальных макрофагов морской свинки, выявить роль тиолзависимой гемолитической активности клебсиелл в развитии патологических процессов.

Научная новизна и практическая значимость работы:

1.Сконструирована оригинальная питательная среда, позволяющая выявлять у бактерий тиолзависимую гемолитическую активность, которая может быть использована а качестве маркера потециальной патогениости у грамотрицательных бактерий, изолируемых в клинике.

2. В процесса исследования установлена хромосомная природа генетического контроля тиолзависимой гемолитической активности К.pneumoniae и установлена ее роль в развитии пато-, морфологических изменений, определяемых в экспериментах, на различных биологических моделях в системах in vitro и In vivo.

3. Селектирован оригинальный бесплазмидный, стабильно проявляющий гемолитическую активность, штамм К.pneumoniae ВО/ЮТ. штамм характеризуется выраженным цитотоксическим действием в отношении клеток НЕр-2, культур« перитонеальных макрофагов морской свинки и вызывает гибель мышей при интра-назальном заражении.

Публикации. Основные материалы диссертации отражены в в работах, опубликованных в отечественной и зарубежной печати.

Апробация работы. Диссертация апробирована в июля 1994 года на научной конференции Отдела генетики и молекулярной биологии бактерий НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи РАМН.

Обьем и структура работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, методической части, результатов исследования, обсуждения, выводов и списка литературы. Материал изложен на 103 страницах машинописного текста, иключая 5 таблиц, в рисунков. Список литературы содержит 181 наименований отечественных и зарубежных авторов.

Методы исследования. Исследуемые клинические штаммы клебсиелл тестировали на устойчивость к антибиотикам методами серийных разведений и дисков, Коньюгационное скрещивание осуществляли общепринятым методой (Миллер Дж. , 1970).

Наличие в штаммах плазмидной ДНК регистрировалось использованием метода Kado C.I. and Liu S.Т.(1381). Препаративное выделение плазмидной ДНК бактерий проводило по методу, описанному Birnboim Н.С. and.Doli J.А. (1979).

Определение молекулярной массы плазмид осуществляли с учетом их электрофоретической подвижности в 0.7-1.ОХ агароз-ном геле (Meyers F.A. et al. 1970). Элиминацию плазмид иэ штаммов К.pneumoniae осуществляли при выращивании бактерий в жидкой среде, содержащей сублетальные дозы гигромицина, эти-диума бромида, акридинового оранжевого (Миллер Дж., 1970).

Получение гемолизин отрицательных (Т1у~.) мутантов К.pneumoniae проводили методом транспозонопосредованного мутагенеза. (Marayama S. et al. 1981).

Биологические методы исследования. Внутрибрюшинное и ин-транаэальное заражение бактериальными суспензиями каждым из изучаемых штаммов осуществляли no Karber G. (1931) и Войно-Ясенецкой М.К. (1957). Для оценки цитотоксичности исследуемых штаммов использовали модели клеточных культур НЕр-2 и перитонеальных макрофагов морской свинки (Бондаренко В.М. и др. 1973, Маслова Т.Н. и др. 1973). Окраску осуществляли по Романовскому-Гимэе. Определение гемолитической активности у

клебсиелл осуществляли по наличию зон гемолиза при выращивании на триптиказо-соеиои агаре, содержащем эритроциты кролика или человека (A)beza L.I et al. 1985).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИСЛЕДООАНИЙ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. Коллекция клинических штаммов К.pneumonias и их общая характеристика

Для проведения исследований была собрана коллекция из 421 клинического изолята К.pneumoniae, выделенных в роддомах и детских стационарах некоторых городов России, Украины и Литвы, которая может быть условно разделена на 2 группы:

1ая - состоящая на 306 культур, выделенных от детей разного возраста и 2ая - 115 культур, изолированных от недоношенных детей, с явлениями иммунодефицита. Изучение спектра резистентности культур 1ой группы показало, что у BSTC выявляется устойчивость к ампициллину, карбенициллину, тетрациклину, хлорамфенмколу, канамицмну, гентамицину и тобраницину. ¡1) гаммы характеризовались полиплазмидным,составом и имели молекулярную массу плазмид преимущественно от 38 до 120 Ме-V гадальтон iMDa). Во 2ой группе большинство штаммов являлись полиантибиотикорезистентными, отличаясь в основном по чуст-вительности к гентамицину и тобраницину и характеризовалась наличием гетерогенной по мол.массе плазмид: 8, 40 и 60 MDa и 40, 55 и 120 MDa.

Эти группы штаммов отличались и по частоте встречаемости признака гемолитической активностью. Так у бактерий 1ой группы, гемолитическая активность была обнаружена только у 9 штаммов К.pneumoniae (2,9Х). Среди штаммов, изолированных от недоношенных детей (2ая группа) - 44 (37,ЗХ) проявляли гемолитическую активность, что указывает на циркуляцию в стационаре однотипных клонов.

Следует подчеркнуть, что гемолитически активные клебси-еллы были выделены из крови и спиномозговой жидкости иа фоке быстро текущей токсикосептицемии, а 40% случаев заканчивающейся летальным исходом.

Таким образом, частота встречаемости гемолитической активности составила ЗОЯ среди культур выделенных из крови и спиномозговой жидкости при быстро текущей токсикосептицемии и 12,5% среди всей коллекции.

2 Лип гемолиза и биохимические особенности проявления гемолитической активности клинических штаммов Klebsiella

pneumon iae.

В дальнейших исследованиях мы использовали группу из 9 клинических штаммов К.pneumoniae, у которых стабильно проявлялась гемолитическая активность. В таблице 1 представлены данные спектра антибиотикорезистентностм и плазмидного профиля этих штаммов. /

Табл.1. Основные характеристики исследуемых гемолитически активных шгаммов К.pneumoniae.

N n/n N штамма Антибитикограмма штамма Плазмиды (Ша)

1 412 AmrTcrErrRi fr 120

2 413 AmrTcrRifr 94

3 416 AmrRi frStr 94

4 423 AmrRifrStrr 120

5 80/107 Rifr нет

6 214/217 Апг Km'Тс CitrEr'Ri f rStr rNalr 1.9,38,74

7 263/72 AmrKmrTcrGmrStrrNa1r 2. 4, ,3B,74,65,120

8 276/281 AmrKmrTcrCinrGmrSt rrPol rNa1r 38,38,74,100

9 281/55 AmrKmrTcrCmrErrRi frStr rNa1r 38,60,100

Условные обозначения: Аш-ампициллин, Km-канамицин, Gm-гента-мицин, Тс-тетрациклин, Ст-хлорамфеникол, Ег-эритромицин, Rlf -рифампицин, Str-стрептомицин, РоТ-полимиксин, Nal-налидик-сооая кислота, MDa-мегадальтоны.

Результаты исследования особенностей гемолитической активности изучаемых 9 клинических штаммов К. pneumoniae показаны в таблице 2 в сравнении с L.monocytogenes и E.coli.

Табл.2. Сравнительные особенности проявления гемолитической активности изучаемых клебсиелл.

1.ЪХ агао тоиптиказосоевый Хоттингеоа

без холес- с холе- Сез дитио- с дитио-

терина стерином триэтола триэтолом

(5 (0.02Х)

эритроциты К Б Ч К Б ч К Б ч К Б Ч

К.pneumonia 3 1 0 0 0 0 0 0 0 3 2 0

L.monocyt. 3 1 0 0 0 0 0 0 0 3 1 0

e.wii ., 3 3 3 г г 2 3 3 3 ? 3 3

Условные обозначения: эритроци-ты - К-кролика, Б-барана, Ч-человека; зоны гемолиза - О - отсутствие, 1 - до 1 мм, 2 -до 2 ми, 3 - от 3 им и более.

Из таблицы 2 видно, что все гемалитически активные штаммы клебсиелл проявляли гемолитическую активность при выращивании на триптиказосоевом агаре, а на агаре Хотингера лизис наблюдали только при добавлении в среду дитиотриэтола (0,0254). Лизис эритроцитов протекал по бетатипу. Наибольшую чуствительность показали эритроциты кролика (зона гемолиза -от 3 до 6 мм). Менее чуствитеяьиыми были эритроциты барана (зоны гемолиза - около 2 мм). Лизис эритроцитов человека не наблюдали, однако по данным Albeza таким действием обладал очищенный гемолизин. Гемолитическая активность подавлялась при добавлении в агар холестерина (5 мкг/мл). В качестве положительного контроля гемолитической активности использовали гемолитически активные штаммы - Е. соЛ с продукцией альфа гемолизина и L.monocytogenes с тиолзависимым гемолизином. У Е.соЛ гемолитическая активность наблюдалась во всех слу- 5 чаях, даже в присутствии холестерина, а у L.monocytogenes ■ проявлялась так же. как у клебсиелл.

На основании проведенных экспериментов была предложена питательная среда для выявления тиолэависииой гемолитической активности у энтеробактерий, не которую было получено авторское свидетельство N 1893082 (заявка N 4757979, приоретет 25.10.89. от 22.7.91). Основная особенность среды это присутствие а ней эритроцитов кролика и L-цистеина (0.001 -0.01

г/л). Такая комбинация позволяет выявлять о течение 24-48 часов, почти в 100% случаев тиолзависимую гемолитическую актив-ность. Гиоловые соединения входящие в состав среды, теряют свою активность (окисляются) при хранении и манипуляции с ней, поэтому такие среды должны быть использованы в течении 3 суток.

3. Данные о природе генетического контроля гемолитической активности в штаммах К.pneumoniae.

У 0 из 9 изучаемых культур К. pneumoniae были выявлены плазмиды массой - 38, СО,74 и120 MDa (Табл.1), .было сочтено целесообразным выявить роль плазмид а генетическом контроле гемолитической активности. В процессе элиминации плазмид из этих штаммов были получены клоны, частично потерявшие маркеры антибиотикорезистентности. Анализ этих клонов покаазал сохранность гемолитической активности и выявил элиминацию плазмид. Данные по изменению антибиотикорезистентности и плазмидного профиля представлены в таблице 3.

Табл.3. Основные характеристики клонов геиолитически активных штаммов К.pneumoniae-с измененным плаэмидным

профилем.

N N штамма Антибиограмма ■ Плазмиды

n/n (MDa)

1412е-AmrR1frнет

2 413е Rifr нет

3 41 бе R1fr нет

4 423е R1fr нет

5 214/217e1 KmrTcrErrR1frStrrNalr 1.9,74 в 214/217е2 AmrKfflrCmrR1frNalr 38,54

7 263/72е1 TcrGmrStrrNa1r 2.4,74.85,120

8 263/72е2 TcrNa1r 2.4,74

9 2ВЗ/72еЗ AmrKmrTorMa1r . 74,85 ю 278/281 el AmrKmrPo1rNalr 38,3В

11 27б/281е2 AmrTorCmrQmr3trrPo1rNa1r3e,74,100

12 278/28183 AmrKmrPo1rNalr 38

13 281/55e1 AmrKmrTcrErrStrrNa1r 38,B0

14 281/55e2 AmrKmrCmrft1frMa1r 38,54.100

15 281 /55еЗ ТсгБггИ1 f rStl-rNa1r 80

Условные обозначения и исходные характеристики плазмидного профиля преведены в таблице 1.

Таким образом, сохранение тиолэависимой гемолитической' активности у элиминантов, 4 из которых были бесплазмидными. указывало на хромосомный характер контроля данного признака.

4. Получение изогенной лары штаммов Klebsiella pneumoniae отличающихся' по гемолигческой активности.

Чтобы выявить роль тиолзависимой гемолитической активности клебсиелл в развитии патоморфологических изменений на биологических моделях мы получили методом транспозонопосре-дованого мутагенеза изогенную пару штаммов клебсиелл, отличающихся по гемолитической активности Для этой цели был выбран бесплазмидный гемолитически активный штамм К. pneumoniae '80/107 ( Т1у+) (см. таблица 1). Передача транспозона в штамм осуществлялась коньюгативным переносом от донорного штаима Е. coli с Б00 плазмиды рТНЮ несущей транслозон Тп1, содержащей температуро-заансимый репликон (32°С) и маркеры устойчивости к ампициллину, канамицину и тетрациклину. Селекцию и контрселекцие осуществляли на селективной среде с антибиотиками. Клоны, в хроиосому которых интегрировался транслозон были получены при выращивании трансконыогантов при 42°С в среде с ак.ибиотиками, Частота интеграции транспозона составила 7*10"4. При анализе на гемолитическую активность 1537 клонов с интегрированным транспоэоном, было выявлено 3 Арг клона потерявших гемолитическую активность (Т1у~). Эти Т1у~ клоны были обозначены NN 80/107/1, 80/107/2. 80/107/3. Процент потери гемолитической активности составил 0,002%.

Для изучения роли гемолитической активности клебсиелл в экспериментальной патологии мы использовали изогенную пару штаммов т- К.pneumoniae 80/107 (Т1у+) и ВО/Ю7/1 (Т1у~).. .

5. Исследование роли тиолзависимого гемолизина клебсиелл в процессе развития экспериментальной

клебсиелезной инфекции на различных моделях

5.1. Определение LD5q гемолитически активных штаммов Klebsiella pneumoniae при внутрибрюшинном заражении мышей.

Внутрибрюшинное заажение белых беспородных мышей гемолитически активными штаммами К.pneumoniae вызывало гибель животных в позе, превышающей 10э КОЕ. LD-50 составила 9.2-

9,4 _+ 0,5 1g. При инфицировании сублетальными дозами (10е) во внутренних органах заболевших животных клебсиеллы сохранялись в течение 7-10 дней. Гибель части животных по истечении 24 часов указывала на токсический характер поражения животных. В связи с этим, для изучения роли гемолитической активности в развитии патоморфологических изменений нами были выбраны другие модели.

5.2. Заражение культуры клеток НЕр-2 В опытах на перевиваемой клеточной линии НЕр-2 при заражении бактериями Т1у* штамма ВО/107, через 2 часа инкубации наблюдали адгезию бактерий к плазмолеме клеток НЕр-2 (55 бактерий на 100 клеток НЕр-2). "Пораженные" клетки НЕр-2 составляли 20% монослоя. Несмотря на наличие прикрепленных к поверхности бактерий в морфологии клеток НЕр-2 «в наблюдалось видимых изменений.

Через 4 часа культивирования наряду с адгезией наблюдалось размножение бактерий. Их относительное количество возросло до 72 на 100 клеток НЕр-2, а число пораженных до 40Х. На этом сроке культивирования были заметны цитоплазмотичес-кие изменения: сморщивание цитоплазмы, округление ядер и уплотнение их структур, что свидетельствует о цитопатическон эффекте. В единичных клетках монослоя (приблизительно в 5Х) обнаруживались отдельные прозрачные цитоппазматические вакуоли, содержащие делящиеся или уже разделившиеся клебсиеллы.

Через в часов культивирования наблюдалось разрушение 304 клеток НЕр-2. На месте разрушенных клеток были видны остатки цитоплазмы с группами активно размножающихся клебсиелл (до BOX бактерий имели интенсивную окраску).

При взаимодействии бактерий Т1у~ штаима К.pneumoniae 80/107/1, утратившего гемолитическую активность, видимых ци-толатических изменений клеток НЕр-2 не наблюдали.

Таким образом, исходный геиолитйчески активный штамм К. -pneumoniae ВО/ЮТ характеризуется выраженным цитотоксичесхии аффектом по отношению к клеткам линии НЕр-2. В сраиении с ним его изогенный гемолитически неактивный вариант к.ргюшю-

niae ВО/107/1 не вызывал видимых цитотоксических изменений в структуре клеток НЕр-2.

5.3. Заражение культуры клеток перитонеальных макрофагов морской свинки

В опытах на культуре клеток перитонеальных макрофагов морской свинки, зараженных исходным штаммом К.pneumoniae 80/107 (доза заражения - 200 бактерий на 1 макрофаг).через 2 часа после заражения отмечалась адгезия бактерий на клеточной плаэмолемме и их фагоцитоз. Количество макрофагов, фагоцитировавших от 2 до 11 бактерий, составляло 35% от всех клеток пласта, а процент "пораженных" макрофагов - 14%. В ' первые 2 часа после взаимодействия клебсиелл с культурой перитонеальных макрофагов, последние сохраняли свою морфологию.

Через 4 часа культивирования наблюдалось внутриклеточное размножение бактерий. В 45% "пораженных" перитонеальных макрофагов хорошо были видны прозрачные цитоллазматические вакуоли и фаголизосомы, содержащие делящиеся или уже разделившиеся клебсиеллы. В этих клетках наблюдались выраженные ци-топатичоские изменения: вакуолизация цитоплазмы, округление ядер и уплотнение их структур ("вакуольная дистрофия").При детальном рассмотрении было видно, что бактерии сохраняли форму палочек и хорошо окрашивались азур-эозином, что свидетельствовало о сохранении их жизнеспособности.

Через 8 часов культивирования наблюдалась деструкция более 50% клеток. На месте разрушенных клеток выделялись группы делящихся бактерий, значительная часть которых (до 60%) сохраняла палочковидную форму и хорошо окрашивались.

Изогенный Т1у~ штамм К.pneumoniae 80/107/1 видимых цито-патических изменений макрофагов не вызывал. Через 2 часа после заражения отмечался выраженный фагоцитоз бактерий. Количество фагоцитированных Т1у~ бактерий, штамма К.pneumoniae 80/107/1, значительно превышало показатели регистрируемые для гемолитически активного исходного варианта (4054 и 14%. соответственно). Через 4 часа культивирования отмечали единичные случаи размножения бактерий в фаголизосомах (12%). В.

65Х случаев фагоцитированные бактерии сохраняли форму палочек, но имели слабую окраску клеточных структур, что свидетельствовало о изменении их жизнеспособности в фаголизосо-мах.

Через 6 часов культивирования было отмечено интенсивное переваривание бактерий внутри фаголизосом. Клебсиеллы утрачивали свою палочковидную форму, остатки микробных тел окра-.шивались в розовый цвет, то есть макрофаги освобождались от бактерий путем завершения их фагоцитоза.

. Таким образом, исходный геиолитически активный штамм К. pneumoniae 80/107, характеризуется выраженной цитотоксич-ностыо, сопровождающейся вакуольной дистрофией перитониаль-ных макрофагах (4 часа) с последующей (6 часов) деструкцией клеток. В сранзнии с ним изогенный гемолитически неактивный вариант К.pneumoniae 80/107/1 после захвата макрофагами переваривался о фаголизосомах, утрачивая способность вызывать в них цитопатические изменения.

5.4- "Легочная" модель - интранпзальное' заражение болых мышей

При интраназальнсм заражении 10 белых мышей исходным гемолитически активным штаммом К.pneumoniae 80/107 ( 107 КОЕ) через 24 часа наблюдалась гибель 50-60% животных с явлениями пневмонии, к концу 43 часов как правило.погибали все животные. Изучение срезов легких и пазков отпечатков погибших мышей методом светооптической микроскопии выявило ряд деструктивных изменений в легких. В мазках отпечатках отмечался спущенный бронхиолярный и альвеолярный эпителий, фагоциты с вакуольной дистрофией и-деструктивными изменениями ядер.

При гистологическом исследовании было отмечено, что ткань легкого имела неравномерную воздушность. Наблюдались мелкие очаги ателектаза, которые чередовались с фокусами пг-рифокальной в основном субплевральиой локализацией с явлениями эмфиземы. Просвет алвеол и бронхиол был заполнен эксудатом, содержащим слученные клетки: сегментоядерные лейкоциты.

макрофаги и одиночные эритроциты. Капилляры межальвеолярных перегородок были расширены, в них отмечался стаз С отдельнми гиалиновыми тромбами. При гистобактериологическом исследовании на стенках альвеол и на поверхности бронхиол отмечали отдельные делящиеся бактерии, а в цитоплазме фагоцитов -незавершенный фагоцитоз.

При интраназальном заражении мышей изогенным гемолити-чески неактивным штаммом К.pneumoniae 80/107/1 гибели животных не наблюдали. Для регистрации возможных латологомор-фологических /изменений животных забивали через 24 и 4В часов после заражения. Изучение срезов легких и мазков отпечатков методом светооптической микроскопии позволило выявить некоторые изменения структуры тканей. В мазках отпечатках отмечали небольшое количество фагоцитов, а в эпителии бронхиол и альвеол одиночные клетки с вакуольной дистрофией. В просвете альвеол с трудом обнаруживались единичное бактерии, большой частью фагоцитированные полиморфноядерными лейкоцитами.

При гистологическом исследовании было отмечено, что ткань легкого сохраняла неравномерную воздушность во всех отделах. Были выявлены единичные расширения алвеол. Отмечались утолщения межальвеолярных перегородок за счет набухания альвеолоцитов. В просвете алвеол и бронхиол были видны небольшое количество макрофагов, сегментоядерных лейкоцитов и одиночный клетки спущенного эпителия. При гистобактериологическом исследовании на стенках альвеол и на поверхности бронхиол отмечали лишь единичные бактерии, находящиеся на разных стадиях внутриклеточного переваривания.

Таким образом, интранааальноэ заражение мышей исходным гемолитическн активным штаммом К.pneumoniae 80/107 вызывало развитие у них пневмонии с эксудативно-гемморагическими явлениями, приводя к гибели животных. В сравнении с ним изо-генный гемолитическн неактивный вариант к.pneumoniae 80/107/1 вызывал воспаление с эксудагивныии элементами.

ОБСУЖДЕНИЕ

Представителей вида К.pneumoniae принято относить к группе так называемых условнооатогенных микроорганизмов,

бактерии которых способны при снижении естественной резистентности макроорганиэма вызывать заболевания, для которых характерно отсутствие нозологической специфичности. Факторы патогенности услоанопатогенных бактерий и генетический контроль этих факторов, изучены недостаточно.

В нашей работе по изучению гнолзависимой гемолитической активности К.pneumoniae было проанализировано 421 клиничес-; кий штамм среди которых было найдено 53 гемолитически активных. Эти штаммы характеризовались множественной антибиоти-кореэистентностью и несли R-плаэмиды разными молекулярными массами. Гемолитическая активность у этих штаммов имела сходное проявление; имгибировалась холестерином, активировалась днтиотриэтолом, наибольшая активность проявлялась р отноше- • нии эритроцитов кролика, что совладает с даннь/и.ч, приведенными Albeza I.L. et al., 1ЭВ5. Это позволило характеризовать, описываемый нами гемолиз как тиолзависимый.

Частота встречаемости гемолитической активности составила 30% среди культур выделенных из крови и спиномозговой жидкости больных детей, инфекционной процесс у которых заканчивался летально и 12.5% среди всей группы штаммов (421). Это может быть объяснено хромосомным характером контроля гемолитической активности, что было подтверждено нами в опытах по элиминации плазмид а гемолитически активных штаммах. Такие расхождения могут быть объяснены так же региональными различиями штаммов, циркулирующих среди больных. Большая часть изученных нами штаммов была выделена от детей первого года жизни с различными формами клебсиеллезов (диареи,' пневмонии, менингиты и др.), но гемолитически активные клебсиел-лы были выделены только в тех случаях, когда процесс сопровождался летальным исходом, это позволило нам сделать предположение' о том, что тиолзависнмая гемолитическая активность клебснелл играет важную роль при развитии септических форм клебсиеллезов.

При изучении роли тиолзаеисимой гемолитической активности клебсиелл в развитии патологических процесов на биологи-

ческих моделях были получены следующие результаты, свидетельствующие о ее вкладе в вирулентность бактерий.

При использовании изогенной лары штаммов К.pneumoniae 80/107 и 60/107/1, отличающейся по гемолитической активности, в опытах на клетках линии НЕр-2 и перитонеальных макрофагах морской свинки была зафиксирована цитотоксическая активность для гемолитически активного варианта. Эти данные сходны с результатами, полученными на культурах клеток, зараженных гемолитически активными грамположительными бактериями, роль которых в развитии инфекционной патологии уже установлена (стрептолизина - S.pneumoniae (Мс Carty М. et а!., 1980) и листериолизина - L.monocitogenes (Kuhn М. et al., 1994). Возникновение в ходе эволюции аналогии функций этих факторов' патогенности у столь отдаленных таксономических групп бактерий может быть объяснено адаптацией к длительному существованию в условиях макроорганизиа.

Сравнительное изучение изменеий легких мышей, зараженных интраназально Т1у+ и Т1у~ изогенными штаммами К.pneumoniae показало, что под действием Т1у+ бактерии развивается двухсторонняя оливная бронхопневмония геморрагического или лейко-цитарно-геморрагического характера с выраженными аяьтератив-ными изменениями бронхиолярного и альвеолярного эпителия.

После заражения мышей бактериями Т1у~ штамма К.pneumoniae 80/107/1 развивается мелкоочаговая пневмония с умеренно выраженными расстройствами микроциркуляции, дистрофическими изменениями бронхиолярного и альвеолярного эпителия. Именно при использовании генетически связанных пар штаммов К.pneumoniae отличающихся по гемолитической активностив опытах с интраназальным заражением белых мышей впервые продемонстрирована корреляция между развитием у животных гемморагическо-го отека легких и продукцией бактериями тиолзависимого гемолизина.

Опыты с инфицированием перевиваемой клеточной линии НЕр-2 показали,, что гемолитический признак связан и с инва--зивной активностью Т1у+ штаммов клебсиелл, что лодтверждает зарубежные исследования, показавших роль бета гемолизина

P.mirabilis, так же учатвукицего в инвазии бактерий в эпителиальные клетки. О способности гемолитически активных клеб-сиелл проникать в цитоплазму клеток НЕр-2 указывают так' же данные об отсутствии лизиса внутриклеточных форм К.pneumoniae при добавлении в среду поливалентного клебсиеллезного бактериофага, лиэирующего только внеклеточно распложенные бактерии.

Внутрибрюшинное заражение мышей сублетальныии дозами бактериальных суспензий гемолитически активных штаммов К. pneumoniae показало только токсическое действия ЛПС клеб-сиелл и их персистенцию во внутренних органах животных.

Как известно, ионы железа в свободном состоянии в организме отсутствуют и бактерии, попадая в организм хозяина при . низком содержании Fe+2 вынуждены использовать разные механизмы для его добычи, что необходимо для дальнейшего развития инфекционного процессаа. Большая часть внутриклеточного железа содержится а теме гемоглобина и трансферинд. Некоторые бактерии имеют на поверхности специфические рецепторы, способные извлекать Fe+2 из трансферина. Способность некоторых штаммов К.pneumoniae разрушать эритроциты, как это показано а нашем исследованиях, связано с обогащением среды ионами нелеза. Таким образом, тиолзависимая гемолитческая активность К. pneumoniae детерминируется хромосмой, что продемонстрировано в опытах элиминации криптических пла'зиид и сохранением гемолитической активности у элиминантов, кроме того, нами были обнаружены и дикие штаммы К.pneumoniae не содержащие плазмид, но обладающие гемолитической активностью.• Проведенное исследование указызает на то, что тиолзависимая гемолитическая активность К.pneumoniae играет существенную роль в развитии патоморфологических изменений в эксперименте. '

ВЫВОДЫ

1. Создана и охарактеризхована по ллазмидному профилю, антибиотикорезистентностн и гемолитической активности коллекция из 421 клинического штамма клебсиелл, выделенных а роддомах и детских стационарах городов России, Украины, Литвы.

2. При изучении 421 клинического штамма К.pneumoniae показано наличие тиолэависимой гемолитической активности у 53 (12,550; при этом частота встречаемости культур с тиолэависимой гемолитической активностью составила 30% среди культур изолированных от септицемических больных с летальным исходом инфекционног процесса.

3. Биохимические особенности тиолэависимой гемолитической активности у изучаемых гемолитически активных клебсиелл были однотипны: гемолиз ингибировался холестерином и активи-ровлся дитиотриэтолом. Пиэис эритроцитов протекал по бета типу, при этом наибольшей чуствителыюстыю к тиолэависимой гемолитической активности обладали эритроциты кролика.

4. Установлена хромосомная природа генетического контроля тиолэависимой гемолитической активности К.pneumoniae.

5. На генетически связанных парах штаммов К.pneumoniae 80/107 и К.pneumoniae 80/107/1, отличающихся по гемолитической активности, показана роль последней в развитии патоиор-фологических изменений, выявленных на различных биологических моделях в системе in vitro и in vivo.

в. Селектирован оригинальный бесплазмидный штамм И.pneumoniae S0/107 обладающий тиолэависимой гемолитической активностью, характеризующийся выраженным цитотоксическим эффектом по отношению к культуре клеток НЕр-2, культуре пери-тондальных макрофагов морской свинки, вызывающий гибель мышей при интраназальном заражении, рекомендуепый в качестве эталонного штамма этого вида бактерий. .

7. Сконструирована оригинальная питательная среда (авторское свидетельство N 1693062, зарегистрировано 22.07.91, приоритет 25.10.89), позволяющая выявлять у грамотрицатель-ных бактерий тиолзависимую гемолитическую активность, которая может быть использована как маркер потенциальной пато-генности культур клебсиелл изолируемых в_ клинике.

Список основных работ, опубликованных по теме

1. Биологические и генетические характеристики клебси- ' елл, выделенных при внутрибольничных инфекциях / Бондаренко В.М. , Марченко В.Г., Руднев И.А. и др.// В сборнике : Акту-

альные проблемы ноэокомиальных инфекций и лекараственной устойчивости микроорганизмов.Минск» 1966, С. 31-32.

2. Плазмиды вирулентности и колонизирующая способность клебсиелл, выделенных из крост сепгицемическнх- больных /Бон-даренко В.М., Марченко В.Г..Лопушансхая О.В.. Руднев и.А. и др. //В сборнике : Эпидемиология и микробиология раневых инфекций. Москва, 1986, С. 31-33.

3. Питательная среда для вывления тиояэависимых гемолизинов/ Якушемко О.С., Габрилоаич U.M., Бондараико в.м. , Руднев И.А. // Авторское свидетельство N 1693082. Зарегистрировано 22.07.91. Приоритет от 25.10.89,

4. Хромосомный контроль синтеза тиолзавясмого гемолизина у клебсиелл и цитрбактер/ Якуленко O.e., Бондаренко В.И., Руднев И.А. и др.// В сборнике ; Бактериальные токсины. Юрмала, Латвия, 1969, С. 155.

5. Цитотоксическое действие тиолзависиого гемолизина клебсиелл и цитрбактер/ Якушенко О.С., Бондаренко В.И., Руднев И.А. и др.// О сборнике : Бактериальные токочны. Юрмала, Латвия, 1ЭВ9, С. 153.

6. Разработка критериев этиологической значимости штатное так называемых условнопатогенмых бактерий / БОндаренко В.М., Аладьева О.С., Руднев И.А. и др.// В сборнике : Вопросы физиологии, метаболизма и идентификации микроорганизмов■ Москва,19ев, С. 14-17.

7. Роль клебсиелл в развитии анутрибольничкай -инфекции новорожденных/ Сельникова О.II., Полищук E.H., Бондарекко В.М. , Беркасовская E.H., Чернышева Л.И. , Руднев '-И.'А.// ;В сборнике : Эпидемиологический анализ и опыт профилактики внутрибольничиых заболеваний новорожденных и родильниц. Москва. 1991, С. 44-49.

8. Руднео И.А., Бомдаренко В.М. Тиолзависивые 'гемолизины как фактор fюгогенности клебсИелл/АШЭИ, 1ЯЭЗ., 'N.'S, С. 31-32.