Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Термочувствительные покрытия и материалы для клеточных технологий и доставки лекарств

ВАК РФ 03.01.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Термочувствительные покрытия и материалы для клеточных технологий и доставки лекарств"

На правах рукописи

Рочев Юрий Алексеевич

ТЕРМОЧУВСТВИТЕЛЬНЫЕ ПОКРЫТИЯ И МАТЕРИАЛЫ ДЛЯ КЛЕТОЧНЫХ ТЕХНОЛОГИЙ И ДОСТАВКИ ЛЕКАРСТВ

Специальность 03.01.02 - «Биофизика», 03.01.08 - «Биоинженерия»

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора физико-математических наук

1 я НАР 2015

005560625

Пущино 2015

005560625

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институт Теоретической и Экспериментальной Биофизики Российской академии наук (ИТЭБ РАН).

Официальные оппоненты:

Баграташвили Виктор Николаевич, доктор физико-математических наук, профессор, заведующий отделом лазерной атомно-молекулярной технологии, Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт проблем лазерных и информационных технологий Российской академии наук

Нечипуренко Юрий Дмитриевич, доктор физико-математических наук, старший научный сотрудник, Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт молекулярной биологии им. В. А. Энгельгардта Российской академии наук

Стовбун Сергей Витальевич, доктор физико-математических наук, заведующий лабораторией химической физики биосистем, Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт химической физики им. H.H. Семенова Российской академии наук

Ведущая Федеральное государственное бюджетное учреждение

организация: науки Институт биохимической физики им. Н.М. Эмануэля Российской академии наук

Защита состоится 23 апреля 2015 г. в 15.30 часов на заседании диссертационного совета Д501.002.11 при Московском государственном университете имени М.В. Ломоносова по адресу: 119991, ГСП-1, Москва, Ленинские горы, д. 1, стр. 2, физический факультет МГУ, центральная физическая аудитория.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова.

Автореферат разослан » А 2015 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат технических наук

Сидорова А.Э.

Актуальность работы

В последние годы традиционная парадигма науки о биоматериалах, как о материалах с необходимыми механическими характеристиками и не вызывающих негативного ответа организма, претерпела серьезные изменения. Наиболее перспективными являются материалы, способные адекватно менять свои характеристики при изменении окружающей среды (в англоязычной литературе их называют "smart" или "intelligent"). Для создания такого рода биоматериалов необходимо привлекать новые физические модели, использовать нетрадиционные для биологии и медицины концепции переработки информации и трансформации энергии. Среди адаптивных биоматериалов, по-видимому, наиболее перспективными являются полимеры, резко меняющие конформацию при незначительном изменении внешних параметров, таких как рН, температура, концентрация лиганда и т.д. Физико-химические характеристики таких полимеров изучены достаточно подробно, в частности исследовано поведение полимеров с нижней критической температурой растворимости (НКТР). При понижении температуры на несколько градусов ниже критической такие полимеры в водном растворе переходят из состояния компактной глобулы в состояние клубка. В случае полимерных сеток (гелей) переход характеризуется гидратацией, набуханием и увеличением физических размеров гидрогеля. Биологические объекты, например, клетки млекопитающих, иммобилизованные на термочувствительном покрытии при

физиологической температуре 37 °С могут успешно функционировать на поверхности термочувствительного материала, однако при понижении температуры ниже НКТР и последующем набухании гидрогеля, происходит открепление биообъектов с поверхности геля (рис.1). Необходимое условие: НКТР должна быть строго меньше 37° С.

Полимер (Т) Клетка

Физический процесс отделения клеток с поверхности набухшего гидрогеля лег в основу новой методологии при работе с клеточными культурами человека и млекопитающих.

Метод культуры клеток является фундаментом современной биологии и медицины. Успехи молекулярной биологии, промышленной

биотехнологии, молекулярной фармакологии и тканевой инженерии непосредственно связаны с методом культуры клеток. Подавляющее большинство клеточных культур являются субстрат зависимыми. Такие клетки нормально функционируют лишь в случае их прикрепления (адгезии) к субстрату-подложке. Как правило, для завершения технологического цикла или лабораторного эксперимента клетки должны быть отделены от поверхности. Задача отделения клеток с поверхностей, на которых иммобилизованы клетки млекопитающих, с неизбежностью возникает, как при масштабном культивировании клеток для

производства биологически активных соединений, так и на микро и нано-уровнях, при решении проблем, связанных с микрофлюидикой, молекулярной диагностикой и т.д. Современные методы открепления клеток с поверхности, основанные на применении специальных

ферментов, были разработаны почти столетие назад (Rous and Jones, 1916; Scherer et al., 1953) и с тех пор остаются практически неизменными. Механизм открепления основан на активности ферментов-гидролаз, которые катализируют гидролиз белков, отвечающих за взаимодействие клетки с субстратом. Гидролизованные белки не могут поддерживать адгезию клеток и клетки отделяются от субстрата. На сегодняшний день приведено немало данных, свидетельствующих о принципиальных проблемах связанных с применением ферментов при снятии клеточных культур, поэтому появление новых материалов, изделий из этих материалов, позволяющих как поддерживать рост клеток, так и снимать клетки при понижении температуры на несколько градусов вызвало огромный интерес как среди биологов, так и среди специалистов в области биоматериалов.

Наряду с использованием термочувствительных покрытий в регенеративной медицине, материалы с НКТР являются перспективными при разработке новых систем для локальной и контролируемой доставки лекарств (рис. 2).

При температуре выше НКТР лекарство, иммобилизованное в термочувствительном геле, практически не диффундирует в водную фазу. При понижении температуры ниже температуры перехода, полимерная сетка набухает, превращаясь в гидрогель. Скорость переноса резко увеличивается, лекарство выходит из матрицы в водную фазу. Через заданный промежуток времени (t2-ti) температура повышается до 37°С, полимерная сетка (гидрогель) коллапсирует и переходит в начальное состояние. Рабочий цикл может повторяться при следующем понижении температуры. Таким образом, кинетика выхода лекарства может локально контролироваться изменением температуры окружающей среды.

Системы для локальной и контролируемой доставки лекарств - одно из важнейших направлений современной фармакологии, поэтому

-полимер о -лекарство

Т. 37 °С Т,37°С

■ " ТНктр

(~33°С)

( t2 Время, мин

Рис. 2. Схема локальной доставки лекарств из материалов на основе термочувствительных полимеров.

материалы на основе полимеров с НКТР вызывают пристальный интерес со стороны биоинженеров и фармакологов.

Цель и задачи работы

Цель настоящей работы состояла в разработке нового класса биосовместимых термочувствительных полимерных покрытий на основе полимеров с нижней критической температурой растворимости для использования в клеточных технологиях, а именно, для получения изолированных клеток и клеточных пластов без применения протеолитических ферментов и других (био)химических агентов. Также эти покрытия могут использоваться для локальной управляемой термоконтролируемой доставки лекарств. Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи:

1. Получение термочувствительных покрытий в диапазоне толщин 10нм-104нм с температурами структурного перехода 5 - 36 °С.

2. Определение физико-химических характеристик термочувствительных покрытий.

3. Выяснение взаимосвязи между адгезией и ростом клеток и физико-химическими характеристиками термочувствительных покрытий.

4. Выявление закономерностей открепления клеток и клеточных пластов от термочувствительных материалов.

5. Оценка воздействия бесферментного снятия клеток на рост и дифференцировку мезенхимальных стволовых клеток человека.

6. Получение кинетических кривых циклического выхода лекарств из термочувствительных покрытий.

7. Построение математической модели кинетики циклического выхода лекарств.

8. Разработка устройства для доставки лекарств из термочувствительных покрытий.

Научная новизна диссертационной работы определяется основными

результатами, приведенными ниже:

1. Получен ряд новых термочувствительных покрытий для роста клеточных культур и бесферментного открепления клеток и клеточных слоев. Среди них: покрытие на основе гомополимера № изопропилакриламида, полученное методом центрифугирования; покрытия на основе сополимеров А'-изопропилакриламида и Ы-трет-бутилакриламида с различным молярным соотношением мономеров ИПААм и Л^-трет-БААм; гидрогель на основе сополимера № изопропилакриламида и акриламидобензофенона.

2. Впервые синтезированы и исследованы сополимеры на основе Ы-изопропилакриламида и этилпирролидон метакрилата с температурами перехода близким к 37 °С.

3. Впервые установлена зависимость кинетики открепления клеток от смачиваемости термочувствительных покрытий и факторов клеточной адгезии.

4. Показано, что мезенхимальные стволовые клетки, культивируемые на гомополимере N-изопропилакриламида, сохраняют плюропотентность и способность к дифференцировке.

5. Предложена математическая модель доставки лекарств из термочувствительных гидрогелей. Показано, что модель адекватно описывает основные экспериментальные результаты.

6. Разработано устройство для доставки лекарств из полимеров с НКТР на основе элементов Пельтье.

Апробация работы

Основные результаты диссертации были представлены автором лично на следующих международных конференциях и семинарах: Семинар в Институте полимеров (Institute of Polymer Science and Technology, CSIC, Мадрид, Испания, июнь, 2012); 24-я Европейская конференция по биоматериалам "24th European Conference on Biomaterials ESB2011» (Дублин, Ирландия, сентябрь 2011 ); Научная школа «Porous Hydrogels for Biomedical Applications: from Cytapheresis to Tissue Engineering» (Анталия, сентябрь 2009); Семинар в центре "Nanotechnology and Advanced Materials Research Institute (NAMRI), University of Ulster" (Белфаст, Англия, март 2009); Европейское совещание по прикладной математике в промышленности «75th European Study Group with Industry (ESGI)» (Консорциум по применению математики в науке и индустрии, the Mathematics Applications Consortium for Science and Industry (MACSI), Лимерик, Ирландия, 2010); 21-я Европейская конференция по биоматериалам «21st European Conference on Biomaterials, ESB2007» (Брайтон, Англия, сентябрь 2007 ); VII Всемирный конгресс по

биоматериалам «VII World Congress of Biomaterial» (Сидней, Австралия, май 2004); Ежегодная британская конференция по биоматериалам «UK Society for Biomaterials (UKSB)» (Белфаст, Англия, июнь 2003); 17-я Европейская конференция по биоматериалам "17th European Conference on Biomaterials ESB2003» (Штутгарт, Германия, сентябрь 2003 ); 14 Европейская конференция «14th Conference of the European Colloid and Interface Society», (Патрас, Греция, 2000); а также на российских конференциях и семинарах: IV Всероссийский съезд биофизиков, Нижний Новгород, август, 2012; Семинар в Федеральном Институте супертвердых и новых углеродных материалов, Троицк, октябрь, 2011; Физический факультет МГУ им.Ломоносова «Фундаментальные проблемы биофизики», Москва, ноябрь, 2009; Семинар в Институте трансплантологии и искусственных органов, Москва, декабрь, 2005.

Практическая ценность работы

Предложенные термочувствительные материалы и протоколы бесферментного открепления клеток используются для снятия линий трансформированных клеток в Dublin Institute of Technology, Centre for Radiation and Environmental Science, Dublin; для работы с первичными моноцитами человека в Отделе Биохимии Института экспериментальной кардиологии Российского кардиологического научно-производственного комплекса МЗ Российской Федерации (группа в.н.с. Н.В. Проказовой); для работы с клеточными пластами в Network of Excellence for Functional Biomaterials, National University of Ireland, Galway. Полученные материалы, методы и модели могут эффективно использоваться при разработке новых медицинских изделий и систем доставки лекарств. Материалы диссертационной работы используются при чтении курсов "Биоматериалы" в Национальном Университете Ирландии, Г. Галвей.

Публикации

Автором по теме диссертации опубликовано в рецензируемых журналах 36 статей.

Личный вклад автора

Вклад автора в формулировку проблемы, в постановку задач исследований и интерпретации результатов является определяющим. Автором лично разработаны методики получения биосовместимых термочувствительных покрытий. Разработаны методы культивирования клеток на термочувствительных покрытиях, а также методы бесферментного открепления клеток. Автором разработано устройство для доставки лекарств на основе термочувствительных полимеров. Сформулирована математическая модель доставки лекарств из термочувствительных полимеров.

Структура и объём диссертации

Диссертация содержит Введение, 4 главы, Выводы и Список цитируемой литературы ( 158 ссылок). Материал изложен на 207 страницах и сопровождается 98 рисунками и 14 таблицами. В каждой главе предложена независимая нумерация рисунков, формул и таблиц. Краткое содержание диссертации

Во Введении дана общая характеристика работы, сформулированы цели и задачи работы, обоснована актуальность исследований, описана новизна полученных результатов и приводится информация об апробации основных результатов работы. По теме диссертационной работы опубликовано 36 статей в отечественных и зарубежных реферируемых научных журналах.

В Главе 1 (Экспериментальные методы) приведены методики формирования термочувствительных покрытий, экспериментальные методы исследования покрытий, а также методы анализа клеточных популяций. В заключительной части приводится описание установки по

изучению кинетики доставки лекарств из термочувствительных полимеров.

В работе использовались три группы полимеров с НКТР.

1. Сополимеры N-изопропилакриламида и Ы-/ире/и-бутилакриламида (поли-^-ИПААм-со-Ы-трет-БААм)), а также сополимеры N-изопропилакриламида и акриламидобензофенона (поли-(Ы-ИПААм-со-ААБФ)) были синтезированы в группе А.В. Горелова в университете Дублина (School of Chemistry & Chemical Biology, UCD, Dublin, Ireland) и ИТЭБ РАН, Пущино. Детали синтеза линейных сополимеров и ковалентно сшитых полимеров представлены в наших работах (Gilchrest et al., 2004; Nash et al., 2012). Метод получения ковалентно сшитых гидрогелей на основе поли-(М-ИПААм-со-ААБФ), используемых для бесферментного снятия клеток приведен в работе (Nash et al, 2012). Формирование гидрогелей для доставки лекарств описано в работе (Yang et al.,2013).

2. Поли-(М-изопропилакриламид) (поли-М-ИПААм) со среднечисловой молекулярной массой Мп в диапазоне 20-25КД согласно информации от производителя (Sigma Aldrich).

3. Сополимеры N-изопропилакриламида и этилпирролидон метакрилата (поли-^-ИПААм-со-ЕПМ)) синтезированы под руководством Dr. Carlos Elvira (Department of Applied Macromolecular Chemistry, Institute of Polymer Science and Technology CSIC, Madrid, Spain).

В Главе 2 приведены результаты исследования физико-химических характеристик покрытий. В настоящее время определены основные физико-химические характеристики поверхностей биоматериалов, определяющие поведение клеток in vitro (Zeiger at al., 2013). Среди них, свободная энергия поверхности у, топография поверхности механические характеристики поверхности - модуль Юнга (Е) и

твердость (//), а также химическая структура поверхности. Именно эти характеристики являются определяющими при разработке материалов для культивирования клеток. Для тонких и ультратонких покрытий толщина (Л) также может стать фактором, определяющим биосовместимость поверхностей. Для некоторых физических характеристик поверхностей известны численные значения, характерные для цитосовместимых покрытий. В экспериментах по определению корреляции между смачиваемостью субстрата и клеточной адгезией было показано, что оптимальное значение краевых углов смачивания в должно находиться в диапазоне 20-65 град, а свободная энергия поверхности должна быть выше 45 мДж/м2. Шероховатость (RMS) стандартных покрытий для культур клеток не превышает 30 нм. В случае термочувствительных покрытий дополнительно должны быть определены термодинамические параметры перехода полимера из гидрофобного в гидрофильное состояние. В таб.1

Таб. 1. Характеристики покрытий и основные методы физико-химических исследований, применяемых в настоящей работе.

Характеристики покрытий Методы исследования

Толщина (h) Атомно-силовая микроскопия

Абляция поверхности и профилометрия

Сканирующая электронная микроскопия

Шероховатость (RMS) Атомно-силовая микроскопия

Модуль Юнга (£), твердость (Я) Нанотвердомер

Краевые углы натекания (0„) Оптическое определение краевого угла, (метод лежащей капли)

Анализ белковых структур на поверхности покрытий Атомно-силовая микроскопия

Сканирующая электронная микроскопия

Химическая структура и элементный состав Инфракрасная Фурье-спектроскопия

Рентгеновская фотоэлектронная спектроскопия

Образование молекулярной сетки УФ спектроскопия

Энтальпия перехода (Н), НКТР и полуширина перехода (Т|д) Дифференциальная микрокалориметрия, Турбидиметрия

приведены характеристики поверхностей, а также основные физические методы, используемые в настоящей работе. По-видимому, наиболее подходящим полимером для получения термочувствительных покрытий является поли-Л'-ИПААм, НКТР которого близка к 32 °С, а переход характеризуется малой полушириной и высокой кооперативностью. Важным свойством данного полимера является слабая зависимость температуры перехода от молекулярной веса полимера. /V-ИПААм относительно легко сополимеризовать как с более гидрофобными, так и с более гидрофильными мономерами, что позволяет варьировать НКТР в максимально широком диапазоне температур.

Нами были исследованы сополимеры на основе N-ИПААм и N-трет-БААм с молярным соотношением N-ИПААм и N-трет-БААм: 100/0, 85/15, 65/35 и 50/50, а также сополимер N-ИПААма и ААБф (поли-(Ы-ИПААм-со-ААБФ)) с молярным соотношением 99/1. Кроме того, нами впервые были синтезированы сополимеры поли-(М-ИПААм- ЕПМ) с молярным отношением N-ИПААма и ЕПМ 90/10, 80/20, 70/30 и 60/40 соответственно. На рис. 3 приведены структуры поли-М-ИПААм и его сополимеров. На основании этих полимеров было получено более 20-ти различных термочувствительных покрытий. Исследование растворов термочувствительных полимеров

Важнейшими характеристиками термочувствительных полимеров, используемых при работе с клеточными культурами являются НКТР и полуширина температуры перехода. Данные термодинамические характеристики сополимеров наряду с энтальпией перехода оценивали при помощи дифференциальной сканирующей микрокалориметрии (таб. 2). Сополимеризация /V-ИПААм с более гидрофобным JV-трет-БААм приводит к понижению НКТР, что позволяет использовать сополимеры с молярным отношением 65/35 и 50/50 для работы клеточными культурами

в

1^= и 1 N4 1 сн [сн,-сн-]- ■чн _-С---

Н1с"'/* "^сн, с=о СМ, Iе"- ¿4

1 нн нс'кн 1 ч Г' г- (У

Рис. 3. Структуры термочувствительных сополимеров. А) Поли-(Ы-изопропилакриламид) (поли-Ы-ИПААм); Б) Сополимер Ы-ИПААм и Ы-трет-бутилакриламида (поли-(Ы-ИПААм-со-Ы-трет-БААм)). Химические структуры мономеров Ы-ИПААм и Ы-трет-БААм отличаются дополнительной метильной группой у Ы-трет-БААм.; В) Сополимер Ы-ИПААм и акриламидобензофенона (поли-(Ы-ИПААм-со-ААБФ)); Г) Сополимер Ы-ИПААм и этилпирролидонметакрилата {поли-(Ы-ИПААм-со-ЕЛМ)).

при комнатной температуре без дополнительного температурного контроля.

Рассматривая вторую группу полимеров на основе поли-(М-ИПААм-со-ЕПМ), необходимо отметить, что материалы на основе пирролидона гидрофильны и обладают хорошей биосовместимостью.

Сополимеризация М-ИПААм с гидрофильным мономером ЕПМ приводит к увеличению температуры перехода. Материалы с НКТР близкой к 37 °С являются перспективными для использованиях их в медицинских изделиях. Зависимость НКТР от температуры не является линейной, тем не менее, на практике можно достаточно точно получать необходимую температуру перехода при соответствующих молярных соотношениях мономеров.

Наряду с температурой перехода, важной характер и сткой термочувствительных полимеров является полуширина перехода Тт.

Таб. 2. Параметры структурного перехода растворов поли-(Ы-ИПААм-со-Ы-трет-БААм), поли-(Ы-ИПААм-со-ЕПМ) и поли-(Ы-ИПААи-со-ААБФ). Данные дифференциальной сканирующей микрокалориметрии.

Содержание N-ИПААм, (%) НКТР, °С Tl/2, °с ДН, Дж/г

поли-(М-ИПААм-со-N-трет-БААм) 100 32.9 1.2 50.6

85 25.1 2.3 58.2

65 16.1 3.5 66.6

50 9.8 3.8 69.3

поли-(М-ИПААм-со-ЕПМ)) 90 33.8 2.3 42.7

80 35.0 3.4 28.1

70 35.6 4.0 21.4

60 36.2 4.8 10.9

Поли-(М-ИПААм-со-ААБФ) 99 30.8* 1.5*

*- Данные получены методом турбидиметрии.

Сополимеры ЛГ-ИПААма в как с ЕПМ, так и с N-трет-БААм обладают большей Tj/2, что связано с уменьшением кооперативности перехода. Наряду с НКТР полуширина перехода должна учитываться при проведении работ с клеточными культурами. Термочувствительные покрытия

Нами были разработаны покрытия на основе линейных сополимеров поли-(М-ИПААм-со-М-трет-БААм) и поли-(Ы-ИПААм-со-ЕПМ), а также гидрогель на основе поли-(Ы-ИПААм-со-ААБФ). Гидрогель получали при помощи УФ-инициированной фотореакции, которая обеспечивала образование полимерной термочувствительной сетки, а также ковалентное связывание с подлежащим полимерным субстратом, в нашем случае с ПСКК. В качестве сшивающего агента использовали бензофенон. Схема фотореакции приведена в нашей работе (Nash et al., 2011).

В работе использовались два метода нанесения покрытий: метод центрифугирования и метод высушивания из растворов. Метод центрифугирования ("spin coating" или "spin cast" в англоязычной литературе) - один из наиболее эффективных способов получения гомогенных и «гладких» полимерных покрытий с толщинами в диапазоне 10 нм - 10 мкм на плоских подложках. Метод высушивания из раствора позволяет получать покрытия как на плоских подложках, так и в чашках Петри и многолуночных плашках для культивирования клеток. Толщина покрытий таких составляла 1-10 мкм. В сводной таб. 3 представлены покрытия, которые использовались для бесферментного снятия клеток.

Анализ элементного состава покрытий разных толщин, проведенный методом рентгеновской фотоэлектронной спектроскопии показал, что соотношение элементов С, N и О остается близким к стехиометрическому (75%, 12.5% и 12.5% соответственно) независимо от метода приготовления покрытия. Значения модуля Юнга для сухих покрытий, полученных методом наноиндентирования, находились в диапазоне 3-6 ГПа, что соответствует значениям пластиков, применяемых для культивирования клеток.

Методом центрифугирования были получены покрытия на основе поли-ЛЧШААм, поли-(1Ч-ИПААм-со-М-трет-БААм), поли-(Ы-ИПААм-со-ЕПМ) и поли-(К-ИПААм-со-ААБФ). Нами были получены

экспериментальные зависимости толщины покрытия от угловой скорости вращения h(co), от концентрации полимера h(c) и от времени центрифугирования для различных сополимеров, что позволило оптимизировать процесс формирования покрытий и получать покрытия с заданной толщиной в диапазоне 10 нм - 2000 нм. RMS покрытий не превышало 15 нм.

На рис. 4 приведены значения краевых углов смачивания для покрытий

Таб. 3. Термочувствительные покрытия, используемые для бесферментного открепления клеток.

Полимеры Метод получения Толщина Дополнительные характеристики

иоли-/У-ИПААм Центрифугирование 30-2000 нм

Высушивание из раствора 1-10 мкм

поли-fN- ИПААм-co-N- трет-БААм) Центрифугирование 100-1000 нм

Высушивание из раствора 1-10 мкм Модификация ФА*

Поли-(1Ч- ИПААм-со- ААБФ) Центрифугирование 10-100 нм Полимерная сетка (гель)

поли-0/V-ИПААм-ЕПМ) Центрифугирование ЮОнм

*Факторы адгезии: коллаген I, ламинин I, фибронектин, поли-Ь-лизин.

на основе сополимеров поли-(К-ИПААм-со-]М-трет-БААм) и поли-(1Ч-ИПААм-со-ЕПМ) ( толщина покрытий - 100 нм). Неожиданно низким оказалось значение краевого угла для гомополимера поли-УУ-ИПААм (-50 град.). Это, безусловно, новый и важный результат, поскольку значение краевой угла для поли-М-ИПААм оказывается в диапазоне значений, которые соответствуют цитосовместимым поверхностям. Существенно, что этот результат был подтвержден в более поздней работе (Cooperstein and Canavan, 2013).

Краевые углы натекания гелей на основе поли-(Ы-ИПААм-со-ААБФ) были определены для ультратонких покрытий (13 нм) и для покрытий толщиной 188 нм (рис. 4 (б)). Краевые углы покрытий с толщинами 188 нм характеризуются поведением "Stick and slip", т.е. залипанием (На рис. 4 (б) выделен стрелкой) и отрывом фронта водной капли. Немонотонная динамика значений краевого угла, по-видимому, объясняется сорбцией воды сополимерами, что приводит к резкому уменьшению механических

100 90-

Поли-ЛЛИПААм (%)

600 1000 1500 2000 2500 Время (сек)

Рис. 4. Краевые углы смачивания для покрытий полученных методом центрифугирования а) Зависимость краевых углов от содержания поли-Ы-ИПААма. 1) поли-{К-ИПААм-со-ЕПМ) и 2) nonu-(N-liTlAAM-co-N-mpem-EAAM). Толщина покрытий -100 нм. 6) Краевые углы натекания покрытий из поли-(Ы-ИПААм-со-ААБФ). 1) Контроль - ПСКК; 2) поли-(И-ИПААм-со-ААБФ), толщина 13 нм, после УФ-облучения ; 3) попи-{Ы-ИПААм-со-ААБФ), толщина 188 нм; после УФ-облучения. Стрелкой обозначен угол «налипания».

характеристик покрытия. В результате под действием вертикальной составляющей поверхностного натяжения на поверхности покрытия формируется микровыступ, который изменяет динамику движения фронта капли на поверхности полимера. Сорбция воды в «гидрофобном» сколлапсированном состоянии поли-А'-ИПААма составляет по нашим данным приблизительно 12% от сухого веса покрытия, а для сополимера с молярным соотношением 50/50 - 4%. Эти результаты косвенно подтвердились в работах (Klymchenko et al., 2010, Chhabra et al, 2013), где исследовалось связывание воды при различной влажности газовой фазы над поверхностью покрытия из поли-УУ-ИПААма.

Методом высушивания из раствора формировали покрытия на основе поли-А'-ИПААм и поли-(1^-ИПААм-со-М-трет-БААм). Толщина покрытий составляла 1-10 мкм. Методы формирования пленок приведены в работах (Gilcreest et al, 2004; Moran et al., 2007). Значения RMS для всех исследованных полимеров не превышали 30 нм, а в большинстве случаев

не превышали 10 нм. Значения краевых углов в для сополимеров находились в диапазоне 74.5 град, для поли-N- ИПААм и 87.0 для поли-N-трет-БААм. Значения поверхностной энергии сополимеров у лежали в дипазоне 38.9 мДж/м2и 31.0 мДж/м2для поли-Л'-ИПААм и для поли-Л'-трет-БААм соответственно (Gilcreest et al, 2004). (Расчет проведен в группе А.В. Горелова.) Краевые углы сополимеров поли-(К-ИПААм-со-N-трет-БААм) также характеризовались поведением "Stick and slip". Краевые углы покрытий с толщинами порядка нескольких микрон для гомополимеров и всех сополимеров лежали выше оптимальных значений углов, характерных для материалов, используемых при работе с клеточными культурами. Последнее обстоятельство осложняет применение данного типа покрытий на основе поли-М-ИПААм при работе с клетками in vitro.

Покрытия модифицированные факторами адгезии клеток

Одним из основных методов улучшения цитосовместимости поверхностей является модификация поверхности факторами клеточной адгезии, как правило, белками. Белки должны равномерно покрывать подложку и сохранять нативную структуру, позволяющую поддерживать адгезию клеток. В экспериментах с ФА были использованы сополимеры на основе поли-(М-ИПААм-со-М-трет-БААм), полученные методом высушивания. Толщина термочувствительных покрытий составляла 4-5 мкм. Методы нанесения ФА на полимерные покрытия изложены в (Moran et al., 2007). Коллаген типа I на сополимере образовывал гетерогенные структуры на основе неупорядоченных фибрил (рис.5). Нативность тройной спирали коллагена сохранялась, что подтверждает наличие повторяющейся структуры, характерной для коллагена, с периодом 67 нм. В отличие от коллагена, ламинин I и фибронектин однородно покрывали полимерную подложку, сохраняя субъединичную структуру белков.

El Г-

0

* /

Рис. 5. Факторы адгезии на покрытии из поли-(И-ИПААм-со-Ы-трет-БААм) (молярное отношение 85/15). Атомно-силовая микроскопия, (а) Коллаген / (RMS ~51нм); (б) Ламинин I (RMS ~9 нм); (в) Фибронектин (RMS - 2.3 нм).

Глава 3 посвящена взаимодействию клеточных культур с термочувствительными покрытиями. Анализ такого взаимодействия включает в себя два этапа. Прежде всего, необходимо было установить основные закономерности роста клеток на термочувствительных поверхностях, после чего исследовать процессы бесферментного открепления клеток. Этим проблемам посвящены первые два параграфа данной главы. В отдельном параграфе рассматривается поведение МСК человека на термочувствительных покрытиях. В экспериментах по росту и бесферментному откреплению клеток нами было исследовано поведение более 15-ти типов первичных клеток и перевиваемых клеточных линий, но анализ поведения стволовых клеток человека мы выделили в отдельный параграф, поскольку именно этот тип клеток является наиболее перспективным для использования в регенеративной медицине, тканевой инженерии и клеточной терапии.

3.1 Рост клеток на термочувствительных покрытиях

Закономерности роста клеток на термочувствительных субстратах наиболее подробно были исследованы нами на примере линии эпителиальных клеток HeLa. На рис. 6 приведена численность клеточной популяции на 1-й (TV/) и 3-й (N3) день культивирования на сополимерах поли-(М-ИПААм-со-М-трет-БААм) и в контроле на ПСКК. Число клеток в контроле значительно превышает количество клеток на

любом из сополимеров. Вместе с тем, относительный прирост клеток в контроле и на сополимерах приблизительно совпадает (Ni/Ni). Интерпретируя эти данные в рамках логистической модели роста клеточной популяции, можно заключить, что в случае полимерных покрытий наблюдается задержка адгезии клеток, но уже

прикрепившиеся клетки входят в клеточный цикл. Из рис.6 также следует, что с ростом содержания iV-трет-БЛАм, количество клеток на сополимерах увеличивается. Этот парадоксальный результат не может быть объяснен в рамках концепции «оптимальной смачиваемости» субстрата, т.к. увеличение содержания jV-трет-БААм, делает систему более гидрофобной и «отдаляет» от зоны оптимальных краевых углов, характерных для клеточной адгезии.

Для объяснения механизмов адгезии и роста клеток нами была исследована экспрессия генов клеток HeLa на гомологичных термочувствительных покрытиях в сравнении с ПСКК. Используя технику ДНК-чипов, были определены гены, экспрессия которых в клетках отлична на всех покрытиях поли-(М-ИПААм-со-М-трет-БААм) по сравнению с контролем (рис.7 (в)). В списке детектированных генов можно выделить гены, непосредственно связанные с внеклеточным матриксом (фибронектин и тромбоспондин-1), с организацией цитоскелета (САР-1, а-актин), с митогенами (Smad6), с генами, контролирующими цитокины (ADAM17) и др. Экспрессия фибронектина в клетках, растущих на сополимерах, ниже, чем в контроле (уменьшение в -2.3-, 2.0-, и 2.6- раза для сополимеров 50:50, 65:35, 85:15 соответственно). Для тромбоспондина, гликопротеина внеклеточного матрикса, уровень экспрессии снижен в 3.7, 5.4, 6.5 раза соответственно. Резкое увеличение экспрессии гена DUSP2 (3.9, 14.6 и 17.0) связано в данном случае с организацией цитоскелета как показано в более поздних работах (Allen et al., 2006; SEFCIK et al, 2013). Для клеток, растущих на полимерах,

' 200,000-

с

"а

5 100,000-

□ 24 Ч

□ 72 ч

Рис. 6. Рост клеток линии НеЬа на сополимерах поли-(Ы-1ШААм-со-№-трет-БААм). 1) поли-Ы-ППААм; 2) Сополимер:85/15;3) Сополимер: 65/35;4) Сополимер:50/50;5) ПСКК. Толщина покрытий - 5 мкм. (Планки погрешностей соответствует стандартному отклонению, п=3).

наблюдается уменьшение экспрессии генов, связанных с организацией микрофиламентов СШВВ4, ТиВВ, ТиВА1 и а-актин), а также снижение экспрессии гена САР-1, связанного с внутриклеточной концентрацией цАМФ и организацией микрофиламентов (в 1.8, в 1.8 и в 2.0 раза соответственно) . Анализ экспрессии генов указывает как минимум на две системы, которые вовлечены в процесс прикрепления и распластывания клеток, на внеклеточный матрикс и клеточный цитоскелет. Общая схема регуляции клеточной адгезии, включающая вклады отдельных белков, сложна и недостаточно изучена, поэтому целесообразно было оценить интегральный параметр, характеризующий взаимодействие клеток с термочувствительными покрытиями. Площадь клеток,

взаимодействующих с подложками, была определена с использованием системы анализа изображений (рис.7 (а, б)). Средняя площадь клеток в контроле значительно превышала площадь клеток на сополимерах, при этом с увеличением содержания поли-А'-ИПААм площадь клеток уменьшалась. Причина подобного поведения клеток была отчасти

объяснена в работе (Allen et al, 2006), где авторами на этой же группе полимеров поли-(М-ИПААм-со->4-трет-БААм) было показано, что сорбция фибронектина - важнейшего фактора клеточной адгезии на поверхности сополимеров была меньше, чем в ПСКК, и уменьшалась с ростом содержания поли-А'-ИПААм. Таким образом, можно предположить следующую схему взаимодействия клеток и термочувствительных полимеров. Фибронектин, присутствующий в среде культивирования, недостаточно адсорбируется на термочувствительные поверхности, что не позволяет клеткам распластаться, реорганизовать цитоскелет и войти в клеточный цикл. Поскольку в таких клетках снижен уровень синтеза элементов внеклеточного матрикса, то процесс рапластывания клеток еще более замедляется.

Четкая зависимость роста клеток от содержания А-трет-БААм наблюдалась также для линии клеток Нер2. Для линий клеток L929, BNHK-21, ЗТЗ и Vero рост клеток не зависел от композиции полимера, но был медленнее чем в контроле. Кроме того, для всех клеточных линий наблюдалось достоверное ингибирование клеточного роста на гомополимере из поли-А'-ИПААм.

Гидрофобные полимеры на основе поли-(Н-ИПААм-со-Ы-трет-БААм) не обеспечивают устойчивый рост клеток, следовательно необходимо модифицировать поверхность таких термочувствительных покрытий факторами адгезии. Данные по росту клеток на полимерах покрытых коллагеном, ламинином и поли-Ь-лизином для клеток линии ЗТЗ представлены на рис. 8. Очевидно, что нанесение ФА значительно ускоряет рост клеток, но для каждого типа клеток и типа полимера необходимо подбирать оптимальный ФА. Так, для первичных клеток эндотелия HUVEC, культивируемых на сополимере 85/15, оптимальным оказываются такие ФА как ламинин и коллаген. А для клеток ЗТЗ -

n»72) <n <>3) <n~7$) (n----89)

КОНТРОЛЬ 50:50

r 0ч1 T f 1

65:35

85:15

DUSP2

e-fos (probeset I)

c-fos (probe set 2)

IFN indue ibEc proicin 9-27

ADAMI7

Sniwi6

MAO-3

KOLR1 (probe sei I) FOLR! (probe see 2) UBE1

Cathepsir С

1EX-1

TRK Ree. Axl CAP-1 TUBßä TUBB TUBal Alpha Actm 3 CaNI9 Fibronectia Thrrunbospondin-I

■ 50 50 О 65.35 О 85 15

-10 -5

10 15

20

Рис. 7. Клетки HeLa на термочувствительных покрытиях на основе поли-(М-ИПААм-со-Ы-трет-БААм).24 ч культивирования. Толщина покрытий — 5 мкм. а) Относительная площадь клеток на сополимерах по отношению к площади клеток на ПСКК. Величина ошибки соответствует стандартной ошибке измерения. В скобках приведено количество измеренных клеток. Использованы следующие значения для доверительных интервалов: *, Р<0.05; **, Р<0.01; ***, Р<0.005 при сравнении площадей клеток на ПСКК и сополимерах по критерию Стьюдента .Обозначения (•) и (•••) соответствуют значениям Р<0.05 и Р<0.005 при сравнении площадей клеток на различных сополимерах, б) Распластывание клеток на различных сополимерах. Клетки на сополимере 85/15 при дальнейшем культивировании приобретают морфологию сходную с клетками на других сополимерах. Шкала - 50 мкм. в) Экспрессия генов клеток HeLa, растущих на различных сополимерах.

лучшие результаты были получены на сополимере 65/35 для этих же ФА, в тоже время, поли-Ь-лизин недостаточно ускорял рост клеток. Поскольку краевой угол для пленок из поли-УУ-ИПААм, полученных методом центрифугирования, составляет приблизительно 50 град., то

Рис. 8. Рост клеток ЗТЗ на термочувствительных покрытиях из поли-(Ы-ИПААм-со-N-mpem-БААм), модифицированных факторами адгезии. Группа колонок С, слева направо: ПСКК, ПСКК покрытый коллагеном, ламинином и поли-Ь-лизином соответственно. Группа колонок 85/15. Сополимер 85/15 без факторов адгезии, сополимер 85/15 покрытый коллагеном, ламинином и поли-Г-лизином соответственно. Для колонок 65/35 и 50/50 аналогично. Контроль - материалы без факторов адгезии. Толщина покрытия - 4 мкм. Общее количество ДНК определялось по методу PicoGreen. (Планки погрешностей соответствует стандартному отклонению, п=3).

можно предположить, что такое покрытие будет поддерживать рост клеток. Действительно, покрытие толщиной 100 нм из поли-Л'-ИПААм, полученное методом центрифугирования, значительно лучше обеспечивает рост клеток, чем покрытия, полученные методом высушивания из раствора (рис.9). Рост клеток на покрытиях из поли-ZV-ИПААм, полученных методом центрифугирования, не зависел от толщины покрытия во всем диапазоне толщин (10нм-103 нм), что свидетельствует о том, что метод нанесения покрытия является ключевым фактором при получении термочувствительных покрытий на основе поли-jV-ИПААм. Сходный результат получен и для сополимеров на основе поли-(М-ИПААм-со-ЕПМ). При этом изменение соотношения

мономеров сополимера не влияло на скорость роста клеток. По-видимому, отсутствие концентрационной зависимости связано с тем, что

120 -I

40-

2 3

ДНК

1 1 Метаб.

активность

Рис. 9. Сравнение роста клеток ЗТЗ на покрытиях, полученных методами центрифугирования и высушивания из раствора. 1. ПСКК. 2. Покрытия на основе noлu-N-ИПAAм, полученные методом центрифугирования. Толщина -100 нм. 3. Покрытия на основе попи^-ИПААм, полученные методом центрифугирования. Толщина - 812 нм. 4. Покрытия на основе поли-(Ы-ИПААм-со-ЕПМ), полученные методом центрифугирования. Толщина -100 нм. Соотношение мономеров 60/40. 5. Покрытия на основе поли-Ы-ИПААм, полученные методом высушивания из раствора. Толщина -5 мкм. (Планки погрешностей соответствует стандартному отклонению, п=3).

краевые углы всех сополимеров на основе поли-(К[-ИПААм-со-ЕПМ) находятся в диапазоне углов, характерных для адгезии клеток в культуре (20-50 град.).

Следующим классом термочувствительных покрытий, полученных методом центрифугирования, были фотосшитые полимеры на основе поли-(К-ИПААм-со-ААБФ) с относительно высоким уровнем гидрофобности (краевой угол 80 град.). Было показано, что клеточный рост наблюдается лишь в случае сверхтонких пленок толщиной 13 нм. Увеличение толщины покрытия до 30 нм приводило к полному ингибированию клеточного роста. Такое явление известно для термочувствительных графт-полимеров на основе поли-А'-ИПААм (А1ауата е! а1, 2004; Бикитоп е1 а1, 2010). Авторы не приводят объяснения данного феномена, но связывают зависимость роста клеток от толщины

покрытия различной гидратируемостью ультратонких пленок, а также эффектом подлежащего субстрата.

3.2 Бесферментное открепление клеток

Процессы открепления клеток в культуре от субстратов в отличие от процессов клеточной адгезии до последнего времени не привлекали к себе внимания. Недавно появились первые публикации, в которых исследуются структурные и клеточные аспекты открепления клеток от термочувствительных подложек (Halperin and Kröger, 2012) при понижении температуры ниже НКТР. Целью данной части работы являлось выявление закономерностей открепления клеток и клеточных пластов от термочувствительных субстратов. Для открепления клеток температуру среды культивирования во всех экспериментах снижали до 4 °С.

Открепление клеток от термочувствительного покрытия происходит в результате набухания полимера. При этом в случае линейных несшитых полимеров происходит растворение и выход полимера в водную фазу. Отрыв клетки от субстрата неизменно сопровождается разрушением цитоскелета и осфериванием клетки.

Сравнительный анализ открепления клеток от покрытий на основе поли-(М-ИПААм-со-Ы-трет-БААм) с толщиной 5 мкм продемострировал зависимость скорости открепления от гидрофобности субстрата. Характерное время открепления клеток линии L929 составляло 0.5, 2.0, 30 и 180 мин для полимеров с молярным отношением /V-ИПААм и N-трет-БААм 100/0, 85/15, 65/35 и 50/50 соответственно. Скорость открепления зависела не только от гидрофобности субстрата, но и от метода получения покрытия. Для покрытий на основе поли-Л'-ИПААм, полученных методом центрифугирования, характерное время открепления клеток, как правило, составляло 10 мин. Как и в случае традиционной трипсинизации

клеток, скорость открепления в сильной степени зависела от типа

клеточной культуры. В таб. 4 приведены сравнительные характеристики

открепления 7-ми трансформированных клеточных линий.

Таб. 4. Время открепления трансформированных линий клеток от покрытия на основе поли-Ы-ИПААм.

сззо CaSki SiHa А549 HeLa SW480 HaCat

Время открепления, % открепившихся клеток 5 мин 100% 60 мин 30% 5 мин 100% 5 мин 100% 10 мин 100% 5 мин 100% 5 мин 100%

При анализе процессов открепления клеток от термочувствительных субстратов целесообразно разделять открепление единичных клеток и клеточных пластов. Механизм открепления клеточных пластов связан с внутренними механическими напряжениями, которые приводят к локальному отделению пласта клеток, после чего пласт волнообразно открепляется от подложки. Отделившаяся часть пласта начинает «заворачиваться», как это показано на рис. 10 (а). Клетки в пластах фибробластов (рис. 10 (а)) сохраняют механическую связность за счет элементов внеклеточного мактрикса, но не за счет межклеточных контактов. В случае эндотелиальных клеток (рис. 10 (б)) клеточные контакты сохраняются и при откреплении клеточного пласта (Moran et al., 2007).

Серия фотографии на рис.11 характеризует динамику открепления клеточных пластов с ультратонкого гидрогеля на основе поли-(1Ч-ИПААм-со-ААБФ).

Нами было исследовано влияние факторов адгезии на скорость открепления клеток. Динамика открепления клеток линии ЗТЗ от покрытия на основе поли-(М-ИПААм-со-Ы-трет-БААм) (мол. отношение

Рис. 10. Открепление клеточных пластов при понижении температуры до 4°С. Сканирующая электронная микроскопия, а) Открепления пласта клеток линии ЗТЗ, культивируемых на сополимере поли-(М-ИПАЛм-со-Ы-трет-БААм) (85/15) покрытом коллагеном. Открепление, как правило, начинается на границе. б) Полностью открепившийся пласт первичных эндотелиальных клеток Н1!УЕС с сохранившимися клеточными контактами.

приведена в таб. 5. Скорость открепления клеток от наиболее

Рис. 11. Открепления пласта клеток линии ЗТЗ, культивируемых на ультратонких гидрогелях на основе поли-(Ы-ИПААм-со-ААБФ). Клеточный пласт открепляясь заворачивается на себя. Открепление пласта начинается через 5 мин после понижения температуры до 4° С и полностью заканчивается через 10 мин. Толщина покрытия - 13 нм. Шкала - 50 мкм.

(85:15)), модифицированного ламинином (А) и коллагеном типа I (Б),

гидрофильного сополимера (85/15) не зависела от белка, которым модифицированы термочувствительные покрытия. Для сополимеров (65/35) и (50/50) скорость открепления клеток резко уменьшалась, при этом динамика открепления зависела от типа ФА.

Таб. 5. Процент открепившихся клеток от покрытий на основе поли-(Ы-ППААм-со-Ы-трет-БААм), модифицированных коллагеном и ламинином.

Поли-СМ-ИПААм-со-Г^-трет-БААм), 85/15 Поли-(М-ИПААм-со-ГЧ-трет- БААм), 65/35 Поли-(Ы-ИПААм-со-Ы-трет-БААм), 50/50

Ламинин Коллаген Ламинин Коллаген Ламинин Коллаген

20 мин, 100% 20 мин, 100% 60 мин, 95% 60 мин, 60% 60 мин, 75% 60 мин, 60%

3.3 Мультипотентные мезенхимальные стволовые клетки человека на термочувствительных подложках

Применение стволовых клеток - одно из основных направлений современной регенеративной медицины. Мультипотентные

мезенхимальные стромальные клетки (МСК) способные к дифференцировке в остеобласты (клетки костной ткани), хондроциты (хрящевые клетки) и в адипоциты (жировые клетки) активно применяются в клеточной терапии и тканевой инженерии. Культивирование МСК, применяемых в медицине, должно соответствовать технологическим и медицинским стандартам.

Одно из ограничений, налагаемых стандартами, связано с минимальным применением или отказом от продуктов животного происхождения, в том числе протеолитических ферментов. Таким образом, необходимо развитие новых технологий культивирования стволовых клеток. Целью данной части работы являлась разработка методов культивирования МСК человека на покрытиях на основе поли-М-ИПААм. В соответствии с целью исследования были определены следующие задачи:

- Определение фенотипа стволовых клеток в процессе культивирования, открепления и многократного пассирования клеток;

- Определение режимов дифференцировки МСК.

При анализе фенотипа МСК и определении маркеров дифференцировки мы придерживались рекомендаций комитета по мезенхимальным и тканевым стволовым клеткам международного общества клеточной терапии ( Mesenchymal and Tissue Stem Cell Committee of the International Society for Cellular Therapy (ISCT)) (Dominici, et al, 2006). Возможное влияние полимеров и процедуры холодового открепления на МСК исследовалось в экспериментах, в которых процедура бесферментного открепления повторялась трижды. Покрытия получали методом высушивания из раствора (толщина 1 мкм). Позитивные маркеры, как в случае трипсинизации, так и в случае бесферментного снятия наблюдались у более 95% клеток, что соответствовало установленным критериям для МСК (таб. 6). Для «негативных» маркеров установленным критерием является порог в 2%. Этому критерию удовлетворяли клетки как после бесферментного открепления, так и после трипсинизации. Данные по экспрессии маркеров дифференцировки МСК свидетельствуют, что фенотип МСК не меняется при пролонгированном культивировании на термочувствительных материалах. В следующей группе экспериментов мы исследовали процесс дифференцировки клеток в остеоциты, хондроциты и адипоциты.

Оценку степени дифференцировки адипоцитов оценивали по общему кальцию, адипоцитов - по окраске липидов, хондроцитов - по количеству гликозоамингликанов (ГАГ) нормированных на общее количество ДНК в клеточной популяции. Степень дифференцировки всех указанных типов клеток на термочувствительных покрытиях не отличалась от контрольной. Фотографии монослоев МСК, остеоцитов и адипоцитов приведены на

Таб. 6. Экспрессия маркеров после трипсинизации и трехкратного бесферментного снятия клеток на покрытиях из поли-Ы-ИПААм (I мкм).

Маркер Трипсинизация(%) поли-УУ-ИПААм (%)

СО 19 (-) 0.9+0.1 0.7+0.2

СБ34 (-) 1.1+0.4 1.5+0.4

СЭ45 (-) 0.8+0.1 1.0+0.2

СБ73 (+) 96.0+1.5 95.5±1.2

СЭ90 (+) 95.6+0.9 95.2+1.1

СОЮ5 (+) 98.0+1.2 98.8+1.0

рис. 12. Таким образом, впервые было показано, что покрытия на основе поли-УУ-ИПААм могут успешно использоваться для культивирования МСК, а также для получения остеобластов, хондроцитов и адипоцитов.

а б

Рис. 12. Дифференцировка МСК в остеоциты (а) и адипоциты (б) на термочувствительном покрытии. Перед запуском дифференцировки клетки трижды пассировали на термочувствительном покрытии, (а) Дифференцировка МСК в остеоциты. Окраска ализарином красным. 1) Недифференцированные клетки. Снятие трипсином. 2) Недифференцированные клетки. Поли-Ы-ИПААм. 3) Дифференцировка на поли-Ы-ИПААм. 4) Дифференцировка. Снятие трипсином, (б) Дифференцировка МСК в адипоциты. 1) Недифференцированные клетки. Поли-/V-ИПААм. 2) Недифференцированные клетки. Снятие трипсином. 3) Дифференцировка на поли-Ы-ИПААм. 4) Дифференцировка. Снятие трипсином. (Шкала - 200 мкм).

Глава 4 посвящена проблеме доставки лекарств из термочувствительных покрытий на основе гидрогелей из поли-(М-ИПААм-со-ААБФ). 4.1 Математическая модель

Для описания процессов доставки лекарств из термочувствительных покрытий нами была предложена математическая модель, которая описывает диффузию лекарства из пленок при изменяющихся температурных режимах. Концентрация родамина В в пленке мала, что дает возможность использовать приближение слабых растворов и воспользоваться законом Фика и уравнениями диффузии для переноса вещества.

Одномерная модель описывает динамику концентрации низкомолекулярных диффундирующих молекул в полимерной пленке c(x,t). Мы предположили, что пленка может находится в двух состояниях. Коллапсированном, которое характеризуется толщиной Нс и коэффициентом диффузии Dc , ив набухшем, которое характеризуется другим набором параметров, толщиной Hs и коэффициентом диффузии Ds. Коллапсированное состояние соответствует системе с температурой выше НКТР, а набухшее состояние - системе с температурой ниже НКТР.

В момент t=0 пленка находится в коллапсированном состоянии. В момент /=// температура пленки мгновенно становится выше НКТР и пленка переходит в набухшее состояние. В момент t=t2 происходит обратный процесс перехода в коллапсированное состояние. Далее цикл переходов повторяется несколько раз. Обозначим, что H(t) и D(t) толщина пленки и коэффициент диффузии соответственно. Уравнение диффузии для данной модельной системы можно записать в следующем виде:

Эс Э2с

lt=D(t) Э? 'для 0<JC<//(i) (!)

33

где

0(0 =

Д,0 <;<г,,

0с,/2</</ з.

и Я(0 =

Я(,0</ <г,, Я,,г, </<г2, Я,,г2<г<г3,

(2)

Уравнения (1) и (2) должны быть дополнены следующими начальными и граничными условиями: (¡) Лекарство равномерно распределено в пленке. Следовательно, С-Со в момент 1—0 при 0<х< Мс. Со — постоянная. (11) Нижняя граница пленки, х=0 непроницаема для лекарства, т.е.

Эс

выполняется условие: -0—= 0 при д:=0.

6х

(ш) Нулевая концентрация лекарства на поверхности пленки, т.е. с=0 при х=Н(г), что соответствует идеальному перемешиванию водного раствора над поверхностью покрытия.

Решение системы (1, 2) с условиями (1)-(Ш) может быть получено методом разделения переменных. Если общее количество лекарства, вышедшее из

н

пленки за время г, М(0 = Яс0-|с(х,0Л, то выражение для М(0 принимает

о

вид:

М, М

(3)

- — /I

Где лп =---. Для случая постоянной температуры, а соответственно

нециклического выхода лекарств имеем Г>с/Я^2 = 0г/Н) = Э1 Н1, подставляя в (3) получаем:

М, , 8^1 f (2п-\)г7rDt\

--№

Для всех t>0.

Уравнение (4) -решение задачи диффузии с плоской поверхности.

В эксперименте относительно легко варьируемыми параметрами являются толщина покрытий и начальная концентрация родамина В. Измеряемым параметром является количество вещества, вышедшего из пленки. Зная кинетику выхода M(t), аппроксимируя кривую выхода, можно из уравнения (4) методом наименьших квадратов определять размерный параметр D/H2. Далее, зная D/H2 для разных температур и подставляя эти значения в уравнение (3), можно получить теоретическую кривую выхода лекарства и сравнить ее с данными эксперимента.

4.2 Экспериментальное исследование доставки лекарств из термочувствительных покрытий

На первом этапе мы исследовали выход родамина из полимерных покрытий при различных температурах. На Рис. 13 приведены кривые выхода родамина В для температуры 4°С и 37°С, т.е. из набухшего и сколлапсированного состояния полимерного покрытия. В течение первого часа более 90% родамина В диффундирует в водную среду из набухшего покрытия. Кинетика выхода при 37°С, как и ожидалось, - гораздо более замедленная. За 42 ч выходит приблизительно 90% красителя. Нами были получены кривые выхода красителя для температур в диапазоне от 24°С -40°С. По кривым выхода красителя оценивали параметр D/H2 и получали теоретические кривые выхода для режима циклического изменения температур.

На рис. 14 представлены экспериментальная и теоретическая кривые циклического выхода лекарств. Температура принимала два значения:

40°С (выше НКТР, «медленный выход») и 4°С (ниже НКТР , «быстрый выход»). Во всех шести циклах температура выше НКТР поддерживалась 3 мин, далее система переключалась на температуру ниже НКТР. В это время происходил наиболее интенсивный выход красителя. Продолжительность этого состояния не была постоянной, а увеличивалась,

Рис. 13. Выход родамина В при температурах ниже НКТР 4°С (а) и выше НКТР 37°С (б).

для того чтобы общий выход красителя за каждый цикл оставался

практически постоянным. Модельная кривая соответствует

экспериментальным данным за исключением первого цикла, где

эксперимент показывает существенно более медленный выход красителя.

5.3 Система доставки лекарств из термочувствительных полимеров на основе устройства Пельтье

Концепция доставки лекарств из термочувствительных полимеров была предложена в работах A. Hoffman (Huffman et al., 1986; Afrassiabi et al., 1987). В дальнейшем было предложено немало полимерных систем и различных типов лекарств, которые обеспечивали циклический выход

лекарств хотя бы за два цикла. До сегодняшнего дня не было предолжено ни одной практической реализации термочувствительной системы, которая могла бы автономно функционировать в организме. Мы предложили использовать элемент Пельтье в качестве термоэлектрического преобразователя энергии, необходимого для локального понижения температуры. Схема экспериментальной ячейки Представлена на рис. 15. Покрытие с родамином В располагалось на

т—|-1-'-1—■-1-1-1-1-1-'-гО 5 10 15 20 25 30

Время, МИН

■ эксперимент

— температура

— модель

Рис. 14. Циклический выход родамина В при изменении температуры между 4°С и 40°С. Покрытие 5 мкм, концентрация родамина В - 20 (нмоль/пленка).

пластине из материала ТЬегтапох®. Пластина, в свою очередь, прилегала

к холодной части элемента Пельтье. Элемент Пельтье был соединен с

источником постоянного тока.

Был проведен ряд калибровочных измерений, в частности, исследовалась зависимость изменения температуры воды в ячейке от силы подаваемого тока и зависимость изменения температуры воды в ячейке от объема

ячейки при заданном токе. Оценивалась задержка изменения температуры в ячейке при мгновенной подаче электрического сигнала. Циклический режим удалось продемонстрировать на 3-х циклах изменения напряжения (рис.16) при токе 2.00 А.

Рис. 15. а). Ячейка для измерения выхода родамина В. Покрытие с родамином находится на холодной стороне элемента Пельтье. б). Общий вид элемента Пельтье с термочувствительным покрытием.

100

80-

g 60 х 2 ш

ж 40 8 20 0-

-■-2.00 А 1.75 А -ж-1.50 А .....- Cu rent

Jgt

jit

¿Л

i'

i1'

■И"

.Л*

10 15 20 Время, мин

25

30

Рис. 16. Циклический выход родамина В в водную фазу при изменении электрического сигнала. Родамин В иммобилизован в термочувствительном гидрогеле на основе поли-(Ы-ИПААм-со-ААБФ). Толщина покрытия - 5 мкм. Концентрация родамина В- 20 нмол /мг.

В Заключении сформулированы основные результаты и выводы диссертационной работы.

В работе предложена и реализована методология получения термочувствительных покрытий на базе полимеров с нижней критической температурой растворимости для культивирования клеток и их бесферментного открепления. Создание термочувствительных биоматериалов включает в себя методы химической модификации полимеров на основе 1Ч-изопропилакриламида, функционализацию поверхностей различными факторами адгезии клеток, получение гидрогелей, а также изменения свойств поверхностей за счет методов формирования покрытий.

По результатам диссертационной работы можно сформулировать следующие выводы:

1. Разработаны методы получения термочувствительных поверхностей с малой шероховатостью (ЯМ5<30 нм), заданной толщиной в диапазоне 10 нм -104 нм и обладающие модулем Юнга 3-5 ГПа.

2. Впервые получен и охарактеризован новый класс гидрофильных сополимеров на основе М-изопропилакриламида и этилпирролидон метакрилата с нижней критической температурой растворимости в диапазоне 33°С - 36°С. Полимеры этого класса поддерживают рост клеток и обеспечивают бесферментное снятие клеток.

3. Впервые охарактеризованы покрытия на основе И-изопропилакриламида и М-даре/и-бутил акр илам ида с различными молярными соотношениями мономеров и с нижней критической температурой растворимости в диапазоне 9°С - 32°С. Предложены методы улучшения цитосовместимости данных покрытий путем увеличения содержания Ы-шрет-бутилакриламида, а также применения факторов адгезии таких как коллаген, ламинин, фибронектин и поли-Ь-лизин.

4. Впервые установлено, что применение метода центрифугирования для нанесения покрытий позволяет получать термочувствительные поверхности на основе /У-изопропилакриламида с краевым углом натекания близким к 50 град. Такие покрытия поддерживают клеточную пролиферацию и обеспечивают бесферментное открепление клеток. Впервые экспериментально показано, что наиболее значимый полимер с нижней критической температурой растворимости (поли- Л'-изопропилакриламид) может быть успешно использован при работах с культурами клеток без какой-либо химической модификации.

5. Впервые установлено, что рост клеток на термочувствительных гидрогелях на основе И-изопропилакриламида и акриламидобензофенона ковалентно связанных с подлежащим субстратом, зависит от толщины покрытий. Показано, что исключительно ультратонкие покрытия толщиной порядка 10 нм обеспечивают рост клеток и бесферментное открепление клеток.

6. Предложенные методы бесферментного открепления клеток апробированы на 12-ти типах клеточных культур. Установлено, что скорость бесферментного открепления клеток уменьшается с ростом гидрофобности покрытий, факторы адгезии клеток специфично уменьшают скорость открепления клеток.

7. При пролонгированном культивировании на подложке из 14-изопропилакриламида мезенхимальные стволовые клетки человека не меняют свой фенотип и сохраняют плюропотентность. Мезенхимальные стволовые клетки, культивируемые на термочувствительном покрытии, дифференцируются в адипоциты, хондроциты и остеоциты при соответствующей индукции дифференцировки.

8. Впервые представлена математическая модель доставки лекарств из термочувствительных гидрогелей. Модель описывает выход лекарства при циклическом изменении температуры. В эксперименте исследована кинетика выхода родамина В из термочувствительных гидрогелей на основе N-изопропилакриламида и акриламидобензофенона при различных температурах. Показано соответствие экспериментальных данных предложенной математической модели.

9. Впервые предложено и разработано устройство для доставки лекарств из полимеров с нижней критической температурой растворимости на базе элемента Пельтье. Устройство позволяет управлять кинетикой выхода лекарств.

Публикации по теме диссертации

Статьи в рецензируемых журналах

1. Satyam A., Kumar R., Fan X., Gorelov A., Rochev Y., Joshi L., Selgas H. P., Lyden D„ Thomas В., Rodriguez В., Raghunath M., Pandit A. and Zeugolis D., Macromolecular crowding meets tissue engineering by self-assembly: A paradigm shift in regenerative medicine // Adv.Mater.- 2014, -V.26(19),-P.3024-3034.

2. Meere M.G., Tuoi Vo, Yang R., Aldabbagh F., Carroll W„ Rochev Y., A Thermally Activated Drug Delivery System Based on a Thermoresponsive Polymer and a Cooling Device: a Theoretical Assessment // J. Thermal Sci. Eng.-2014,-V.6(2),-N 021012.

3. Fan X., Nosov M., Carroll W„ Gorelov A., Elvira C„ Rochev Y., Macrophages behaviour on different NIPAm based thermoresponsive substrates //J. Biomed. Mater. Res.(A)-2013,V.102(8), - P.2901-2910.

4. Yang R„ Gorelov A.V., Aldabbagh F„ Carroll W.M., Rochev Y., An implantable thermoresponsive drug delivery system based on Peltier device // Int. J. Pharm.-2013, V.447(l-2), -P.109-114.

5. Hopkins C., McHugh P.E., O'Dowd N.P., Rochev Y., McGarry J.P., A combined computational and experimental methodology to determine the adhesion properties of stent polymer coatings // Computational Mater. Sci.-2013,-V.80, P.104-112.

6. Nash M.E., Fan X., Carroll W.M., Gorelov A.V., Barry F.P., Shaw G„ Rochev Y.A., Thermoresponsive Substrates used for the Expansion of Human Mesenchymal Stem Cells and the Preservation of Immunophenotype // Stem.Cell. Reviews and Reports.- 2013,- V.9 (2), -P.148-157.

7. Nash M. E„ Healy D„ Carroll W. M„ Elvira C. and Rochev Yury A., Cell and cell sheet recovery from pNIPAm coatings; motivation and history to present day approaches //J. Mater. Chem.-2012,-V.22,-P. 19376-19389.

8. O'Connor P., Yang R„ Carroll W.M., Rochev Y., Aldabbagh F„ Facile synthesis of thermoresponsive block copolymers of N-isopropylaciylamide using heterogeneous controlled/living nitroxide-mediated polymerizations in supercritical carbon dioxide // European Polymer Joumal.-2012,-V.48(7),-P. 1279-1288.

9. Nash M.E., Carroll W.M., Velasco D., Gomez, J., Gorelov A.V., Elezov D., Gallardo A., Rochev Y.A., Elvira C., Synthesis and Characterization of a Novel Thermoresponsive Copolymer Series and their Application in Cell and Cell Sheet Regeneration // J. Biomat. Sci.: Polymer Edition.-2013,-V.24(3),-P.253-268.

1 O.Nash M.E., Carroll W.M., Foley P.J., Maguire G„ Connell C.O., Gorelov A.V., Beloshapkin S., Rochev Y.A, Ultra-thin Spin Coated Crosslinkable Hydrogels for use in Cell Sheet Recovery // Synthesis, Characterization to Application, Soft Matter.-2012,-V.8,-P.3889-3899.

11.Yang R. , Vo T. N., Gorelov A.V., Aldabbagh F., Carroll W.M., Meere, M.G., Rochev Y. A mathematical model for pulsatile release: controlled release of rhodamine B from UVcrosslinked thermoresponsive thin films // Int. J. Pharm.-2012,- V(10),-P.427(2):320-327.

12.Tardajos M.G., Nash M., Rochev Y., Reinecke H., Elvira C., Gallardo A., Homologous Copolymerization Route to Functional and Biocompatible Polyvinylpyrrolidone // Macromolecular Chem. Phys.-2012,-V.213(5),-P.529-538.

13.McMahon S.S, Nikolskaya N., Ni Choileain S., Hennessy N., O'Brien T., Strappe P., Gorelov A., Rochev Y., Thermosensitive Hydrogel for Prolonged Delivery of Lentiviral Vector Expressing Neurotrophin-3 in vitro // J. Gene Med.-2011,- Nov. 13(11),-P.591-601.

14.Nash M.E., Carroll W.M., Nikoloskya N„ Yang R„ O'Connell C„ Gorelov A.V., Dockery P., Liptrot C., Lyng F.M., Garcia A., Rochev Y.A., Straightforward, one-step fabrication of ultrathin thermoresponsive films from commercially available pNIPAm for cell culture and recovery // ACS Appl. Mater. Interfaces.-2011,-Jun.3(6),-1980-90.

15.Szczupak B., Ryder A.G., Togashi D.M., Klymchenko A.S., Rochev Y.A., Gorelov A., Glynn T.J., Polarity Assessment of Thermoresponsive Poly(NIPAM-co-NtBA) Copolymer Films Using Fluorescence Methods // J.Fluoresc.-2010,-V.20(3),-P.719-731.

16.Szczupak B., Ryder A.G. , Togashi, D.M., Rochev Y.A., Gorelov A.V., Glynn T.J., Measuring the Micro-Polarity and Hydrogen-Bond Donor/Acceptor Ability of Thermoresponsive N-isopropylacrylamide/Ntert-butylacrylamide Copolymer Films Using Solvatochromic Indicators // Appl. Spectrosc.-2009,-Apr.63(4),-P .442-9.

17.Burke M., Clarke B., Rochev Y., Gorelov A., Carroll W., Estimation of the strength of adhesion between a thermoresponsive polymer coating and nitinol wire//J. Mater. Sci. Mater. Med.-2008,-V.19(5),-P.1971-1979.

18.Moran M.T., Carroll W.M., Gorelov A., Rochev Y. Intact Endothelial Cell Sheet Harvesting from Thermoresponsive Surfaces Coated with Cell Adhesion Promoters//J. R. Soc. Interface.-2007,-4(17),-P.l 151-1157.

19.Moran M.T., Carroll W.M., Selezneva I., Gorelov A., Rochev Y., Cell growth and detachment from protein coated PNIPAAm based co-polymers // J. Biomed. Mater. Res. A.,- 2007.-V.81 A(4), 870-876.

20.Селезнёва И.И., Горелов A.B., Рочев Ю.А., Использование термочувствительных полимерных материалов на основе N-изопропилакриламида и N-трет-бутилакриламида в клеточных технологиях // Клеточные технологии в биологии и медицине.-2006,-V.2.-P.231-234.

21.Николаева Т.Н., Тиктопуло Е.И., Полозов Р.В., Рочев Ю.А., Термодинамические характеристики коллагеновых фибрилл, реконструированных in vitro при разных температурах и концентрациях // Биофизика,- 2007,- Т.52,- N2. - С. 261-267.

22.McGillicuddy F.C., Lynch I., Rochev Y.A., Burke M., Dawson K.A., Gallagher W.M., Keenan A.K., Novel "plum pudding" gels as potential drug-eluting stent coatings: Controlled release of fluvastatin // J. Biomed. Mater. Res.-A. 2006,-V.79(4),-P.923-933.

23.McLucas E„ Gallagher H„ Rochev Y., Carroll W.M., Gorelov A., Smith T.J., Global gene expression analysis of the effects of vinblastine on endothelial cells, when eluted from a thermo-responsive polymer // J. Biomed. Mater. Res.,- A. 2006,-V.79(2),-P.246-253.

24.Kavanagh C.A., Gorelova T.A., Selezneva I.I., Rochev Y.A., Dawson K.A., Gallagher W.M., Gorelov A.V., Keenan A.K., Poly(N-isopropylacrylamide) copolymer films as vehicles for the sustained delivery of proteins to vascular

- endothelial cells // J. Biomed. Mater. Res.,-A. 2005,-V72(l),-P.25-35.

25.Gilchrest V.P., Carroll W.M., Rochev Y.A., Blute I., Dawson K.A., Gorelov A.V., Thermoresponsive poly(N-isopropylacrylamide) copolymers: contact

angles and surface energies of polymer films // Langmuir.-2004,- 20(23), -P.10138-45.

26.Kavanagh C.A., Rochev Y.A., Gallagher W.M., Dawson K.A., Keenan A.K., Local drug delivery in restenosis injury: thermoresponsive copolymers as potential drug delivery systems // Pharmacol.Ther.-2004,-V.102 (1),-P.1-15.

27.Rochev Yu. , O'Halloran D., Gorelova Т., Gilcreest V., Selezneva I., Gavrilyuk В., Gorelov A., Rationalizing the Design of Polymeric Thermoresponsive Biomaterials // J.Mater. Sci.: Materials in Medicine.-2004,-V.15 (4),-P.513-517.

28.Doorty K.B., Golubeva T.A., Gorelov A.V., Rochev Y.A., Allen L.T., Dawson K.A., Gallagher W.M., Keenan A.K., Poly(N-isopropylacrylamide) co-polymer films as potential vehicles for delivery of an antimitotic agent to vascular smooth muscle cells, Cardiovasc. Pathol. 2003,-V.12(2),-P.105-10.

29. Wilson S.J., Gorelov A.V., Rochev Y.A., McGillicuddy F„ Dawson K.A., Gallagher W.M., Keenan A.K., Extended delivery of the antimitotic agent cochicine from thermoresponsive N -isopropylacrylamide-based copolymer films to human vascular smooth muscle cells // J. Biomed. Mater. Res.-2003,-V.67A(2),-P.667-73, 2003.

30.АНеп L.T., Fox E.J., Blute I., Kelly Z.D., Rochev Y., Keenan A.K., Dawson K.A., Gallagher W.M., Interaction of soft condensed materials with living cells: phenotype/transcriptome correlations for hydrophobic effect // PNAS.-2003,-V(100),-P.6331 -6336.

31.Николаева Т.И., Писаченко А.И., Полозов P.В., Рочев Ю.А., Гаврилкж Б.К., Исследование образования фибрилл коллагена типа I in vitro // Биофизика.-2001, -Т.46, № 4,- С.612-618.

32.Rochev Yu., Golubeva Т., Gorelov A., L.Allen L., Gallagher W., Selezneva I., Gavrilyuk В., Dawson K., Surface modification for controlled cell growth

on copolymers of N-isopropylacrylamide // Progress in Colloid and Polymer Sci.-2001,-V.l 18,-P.153-156.

33.Николаева Т.Н., Писаченко А.И., Селезнева И.И., Рочев Ю.А., Гаврилюк Б.К., Изучение самосборки молекул коллагена типа I с удаленными телопептидами // Биофизика.-2000,- Т.45, № 6,- С.1146-1149.

34.Пискарёва О.А., Рочев Ю.А., Гаврилюк Б.К., Горелов А.В., Голубева Т.А., Даусон К.А., Влияние матрикса на основе термореверсивных полимеров на рост фибробластов человека П Биофизика.-1999,-Т .44,-Р.281-283.

35.Селезнева И.И., Кузьмин С.В., Николаева Т.И., Рочев Ю.А., Применение поляризационной термомикроскопии для регистрации процессов формирования и деградации коллагеновых фибрилл // Биофизика,-1996,- Т.41 ,-С.541 -542.

36.Николаева Т.И., Рочев Ю.А., Гаврилюк Б.К., Термодинамические характеристики коллагеновых фибрилл в процессе их образования // Биофизика.-1995,- Т.40,-С.478-479.

Главы из коллективных монографий

1. Vo Thi Ngoc Tuoi, Rongbing Yang, Yury Rochev and Martin Meere, A Mathematical Model for Drug Delivery, Progress in Industrial Mathematics at ECMI2010, Mathematics in Industry, 2012, Volume 17, Part 6,-P.521-528.

Автор выражает благодарность А.В.Горелову (иСБ ОиЬЬп/ИТЭБ РАН) за всестороннюю помощь и поддержку. Также автор считает своим приятным долгом поблагодарить заведующую лабораторией роста клеток и тканей ИТЭБ РАН И.И.Селезневу. Автор благодарен проф.

Б.К.Гаврилюку за многолетнее плодотворное сотрудничество.

Работа была поддержана фантами: Разработка методики контроля топографических и механических характеристик функциональных покрытий медицинских и биологических изделий с помощью сканирующих зондовых, ФЦП 2009-2013; Роль ганглиозида GM3 в макрофагальной дифференцировке при атеросклерозе, РФФИ; Создание измерительного оборудование и методики контроля рабочих параметров тонких функциональных покрытий, ФЦП 2009-2013; Smart thermoresponsive biomaterial for cell culture, Enterprise Ireland Research Innovation Fund (2005); Smart biomaterials for cell sheet engineering, Enterprise Ireland Research Innovation Fund (2007); Modelling Diffusion In Polymeric Stent Coatings, Postgraduate Fellowship, Mathematics Consortium for Applications with Science and Industry, Science Foundation of Ireland (SFI), (2008); IRCSET Scholarship Grants: Development of Novel Drug Delivery System of Ultra-Thin Block Copolymer Films with Dual Sensitivities, (2010); Clean Controlled Synthesis of Stimuli-Sensitive Materials, SFI, 2008.

Формат 60x90/16. Заказ 1790. Тираж 150 экз.

Печать офсетная. Бумага для множительных аппаратов.

Отпечатано в ООО "ФЭД+", Москва, Ленинский пр. 42, тел. (495)774-26-96