Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Тепловая денатурация актиновых филаментов и влияние на нее актин-связывающего белка кофилина
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия
Автореферат диссертации по теме "Тепловая денатурация актиновых филаментов и влияние на нее актин-связывающего белка кофилина"
На правах рукописи
□□3454133
МИХАЙЛОВА Валерия Вадимовна
Тепловая денатурация актиновых филаментов и влияние на нее актин-связывающего белка кофилина
03.00 04-биохимия
Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
2 ' СО:
Москва 2008
003454133
Работа выполнена в лаборатории молекулярной организации биологических структур Института биохимии им. А.Н. Баха РАН
Научный руководитель:
доктор биологических наук, профессор Д.И. Левицкий
Официальные оппоненты:
доктор биологических наук С.Ю. Хайтлииа
кандидат биологических наук A.B. Воротников
Ведущая организация:
Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН
Защита состоится « /У » декабря 2008 года в часов на заседании диссертационного совета Д 002.247.01 по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора и кандидата наук в Институте биохимии им. А Н Баха РАН по адресу 119071, Москва, Ленинский проспект, д. 33, корп. 2.
С диссертацией можно ознакомиться в Библиотеке биологической литературы по адресу: 119071, Москва, Ленинский проспект, д 33, корп. 1.
Автореферат разослан « » ноября 2008
года
Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук
А.Ф. Орловский
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность темы. Актин является одним из самых распространенных белков в природе. Он присутствует во всех эукариотических клетках, а в последнее время актино-подобные белки были обнаружены и у прокариот. Актин - глобулярный белок с молекулярной массой 42 кДа, который может существовать как в виде мономера (С-актин), так и в виде длинных полярных филаментов (Р-актин), образующихся в результате полимеризации в-актина Актиновые филаменты являются одним из главных компонентов цитоскелета эукариотических клеток, а их взаимодействие с миозином лежит в основе мышечного сокращения и множества иных процессов биологической подвижности Полимеризация актина (образование филаментов Р-актина из мономерного в-актина) представляет собой обратимый динамический процесс, который сопровождается гидролизом АТФ и контролируется множеством актин-связывающих белков Особое место среди них занимает белок кофилин, способный взаимодействовать как с мономерным С-актином, так и с филаментами Р-актина, вызывая фрагментацию филаментов и значительно повышая скорость их деполимеризации. В последнее время множество работ было посвящено свойствам этого белка - главным образом, его влиянию на структуру актиновых филаментов и на динамику их сборки-разборки.
Изучение тепловой денатурации белков позволяет получать новую ценную информацию об их структуре и о тех конформационных перестройках, которые происходят в белках при моделировании процессов их функционирования. Для этого применяется метод дифференциальной сканирующей калориметрии (ДСК), позволяющий подробно изучать процесс тепловой денатурации белка. Этот метод давно уже успешно применяется в нашей лаборатории для структурно-функциональных исследований мышечных белков [Левицкий и др, 1998; Левицкий, 2004]. При этом, однако, до сих пор практически не проводились систематические исследования тепловой денатурации Р-актина. Очевидно было лишь то, что этот процесс очень сложен и не поддается описанию с использованием имеющихся моделей тепловой денатурации белка. Несмотря на значительное количество опубликованных к настоящему времени данных, механизм тепловой денатурации актиновых филаментов до сих пор оставался неизвестным, и требовалось множество дополнительных экспериментов для его детального изучения. Еще меньше было известно о том, как взаимодействие с различными актин-связывающими белками отражается на тепловой денатурации актиновых филаментов. Выяснение этих вопросов и составило главную цель предпринятого нами исследования.
Цель и задачи работы. Итак, целью данной работы стало изучение тепловой денатурации Р-актина и влияния актин-связывающих белков на этот процесс. В соответствии с этой целью были поставлены следующие конкретные задачи.
1). Методом ДСК провести исследования тепловой денатурации актиновых филаментов в широком диапазоне условий, варьируя различными факторами (такими, как концентрация белка и добавленных нуклеотидов, а также скорость прогрева), и попытаться описать механизм этого процесса.
2). Исследовать влияние актин-связывающего белка кофилина на процесс тепловой денатурации мономерного в-актина и филаментов Р-актина.
Основные положения, выносимые на защиту.
1. На основании результатов проведенных исследований предложен новый «диссоциативный» механизм тепловой денатурации Р-актина, главной особенностью которого является то, что необратимой тепловой денатурации Р-актина предшествуют, по крайней мере, две обратимые стадии - высвобождение прочно связанной АДФ из субъединиц актина и отщепление субъединиц с концов актиновых филаментов
2. Применение метода ДСК впервые позволило выявить два совершенно противоположных эффекта актин-связывающего белка кофилина на тепловую денатурацию Р-актина, а именно стабилизацию актиновых филаментов при стехиометрических концентрациях кофилина и сильную дестабилизацию филаментов при суб-стехиометрических концентрациях кофилина.
Научная новизна. Впервые предложен механизм тепловой денатурации Р-актина, главной особенностью которого является то, что актиновый филамент не денатурирует весь целиком, как зачастую считалось ранее. Напротив, необратимой тепловой денатурации актиновых субъединиц в филаменте предшествуют, по крайней мере, две обратимые стадии - диссоциация субъединиц с концов актиновых филаментов и высвобождение из них прочно связанной АДФ. Результаты экспериментов, проведенных методом ДСК, впервые позволили выявить два совершенно противоположных эффекта актин-связывающего белка кофилина на тепловую денатурацию Р-актина. Показано, что при стехиометрическом связывании (т.е при полном насыщении актина кофилином) кофилин заметно увеличивает термостабильность как мономерного О-актина, так и филаментов Р-актина Оказалось, однако, что при низких концентрациях кофилин дестабилизирует актиновые филаменты, заметно смещая максимум теплового перехода Р-актина в сторону более низких температур. Дестабилизация Р-актина кофилином происходила с высокой кооперативпостыо и наблюдалась даже при очень низких концентрациях кофилина (при молярном отношении кофилин/актин, равном 1:100 - 1:200). На основании этих данных был сделан вывод о том, что кофилин, взаимодействуя с Р-актином, стабилизирует только те субъединицы актина, с которыми он непосредственно связывается, но дестабилизирует множество свободных от кофилина соседних субъединиц в актиновом филаменте.
Научно-практическая ценность. Полученные данные расширяют и углубляют представления о механизмах тепловой денатурации сложных олигомерных белков и их комплектов и могут быть использованы при чтении курсов лекций по биохимии и биофизике. Дестабилизация F-актииа кофилипом, обнаруженная нами впервые методом ДСК, может играть важную роль в динамике актнновых филаментов в живой клетке, способствуя выполнению кофилпном его главных, уже описанных в литературе функций -ускорению деполимеризации актиповых филаментов и их фрагментации. Калориметрические подходы, разработанные при исследованиях комплексов актина с кофилипом, могут в дальнейшем успешно использоваться для изучения взаимодействия мономерного G-актина и филаментов F-актина с другими актин-связывающими белками.
Апробация работы. Основные результаты работы были представлены па III Съезде биохимического общества (г. Санкт-Петербург, 2002), на 31-й, 32-й, 33-й, 34-й и 35-й Европейских мышечных конференциях (г. Люнтерен, Нидерланды, 2002; г. Монпелье, Франция, 2003; о. Эльба, Италия, 2004; г. Дебрецен, Венгрия, 2005; г. Гейдельберг, Германия, 2006), па Международных симпозиумах «Биологическая подвижность» (г. Пущино-па-Оке Московской области, 2004; 2006) и на 30-м Международном конгрессе FEBS (г Будапешт, Венгрия, 2005).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 14 печатных работ (4 статьи в рецензируемых журналах и 10 тезисов).
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения результатов и их обсуждения (2 главы), заключения, выводов и списка цитируемой литературы (120 источников) Диссертация изложена на 98 страницах, содержит 24 рисунка и 1 таблицу.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Обзор литературы
В обзоре литературы рассматриваются известные к настоящему моменту сведения о структуре и свойствах мономерного С-актина, филаментов Р-актина и актин-связывающего белка кофилина, а также анализируются имеющиеся в литературе данные о взаимодействии между этими белками. Особое внимание уделяется анализу имеющихся в литературе данных о тепловой денатурации й-актина и Р-актина, исследованной методом ДСК.
Материалы и методы исследования
Актин выделяли из ацетонового порошка скелетных мышц и очищали двумя циклами полимеризации-деполимеризации. За час до использования мономерный G-актин в G-буфере (2 мМ трис-HCl, рН 8,0, 0,2 мМ АТФ, 0,2 мМ СаС12, 0,5 мМ р-меркаптоэтанол) полимеризовали, добавляя MgCI2 до конечной концентрации 2 мМ, и использовали в F-форме Рекомбинантные малые белки теплового шока человека - Hsp27-wt (малый белок теплового шока дикого типа с кажущейся молекулярной массой 27 кДа) и Hsp27-3D (мутант Hsp27 с имитацией фосфорилирования путем замены остатков серина в положениях 15, 78 и 82 на остатки аспарагиновой кислоты) были любезно предоставлены профессором Н.Б. Гусевым (кафедра биохимии Биологического факультета МГУ им. M.D. Ломоносова). Рекомбинантный дрожжевой кофилин был любезно предоставлен И.В Дедовой (Department of Anatomy and Histology, University of Sydney, Сидней, Австралия)
Калориметрические исследования проводили на дифференциальном адиабатическом сканирующем микрокалориметре ДАСМ-4М (Институт биологического приборостроения РАН, г. Пущино-на-Оке) с капиллярными платиновыми ячейками объемом 0,47 мл. Для получения кривых теплопоглощения препарат белка с концентрацией 0,5-2 мг/мл в буфере 30 мМ Hepes-KOH (рН 7,3), содержащем 2 мМ MgCl2, или в G-буфере (рН 8,0), содержащем Hepes-KOH вместо трис-HCl, помещали в ячейку прибора и прогревали с постоянной скоростью, равной 0,5, 1,0 или 1,8 град/мин, от 5 до 100°С при постоянном давлении 2,2 атм. Базовую линию записывали, помещая в рабочую и контрольную ячейки используемый в опыте буфер. Для проверки обратимости тепловой денатурации исследуемых белков, после первого сканирования и последующего охлаждения ячеек до 5°С пробу подвергали повторному прогреву в тех же условиях. Тепловая денатурация актина была полностью необратимой. Из каждой полученной кривой теплопоглощения белка вычитали или инструментальную базовую линию, или кривую, полученную при повторном прогреве образца.
Для обработки и анализа кривых теплопоглощения актина использовали пакеты программного обеспечения "Origin 1,16" и "Origin 7,0" фирмы "MicroCal" (США). Калориметрическую энтальпию (ДНса|) определяли как площадь под пиком на кривой теплопоглощепия, а кооперативность теплового перехода - как ширину пика на его полувысоте.
Процесс тепловой агрегации F-актина контролировали, регистрируя температурные зависимости светорассеяния F-актина. Светорассеяние измеряли на флуоресцентном спектрофотометре Сагу Eclipse (Varían), нагревая образец с постоянной скоростью 1°С в минуту от 25°С до 90°С при скрещенных монохроматорах и длине волны 350 им. Температуру измеряли датчиком, погруженным непосредственно в раствор белка. Измерения температурных зависимостей светорассеяния проводили в тех же условиях, при
том же концентрации белка и при той же скорости нагрева, что и в соответствующих экспериментах, проведенных методом ДСК.
При центрифугировании на больших скоростях филаменты актина осаждаются. Если в растворе есть небольшие молекулы, способные связываться с актиновыми филаментами, то они также будут обнаруживаться в осадках вместе с ними. Следовательно, анализируя осадки и супернатанты после ультрацеитрифугнрования, можно делать выводы о способности небольших белков взаимодействовать с F-актипом. Для проведения таких экспериментов по соосаждению использовали ультрацентрифугу Airfuge фирмы «Beckman» с ротором 18°. Подготовленные растворы белков объемом 100— 200 мкл центрифугировали в течение 20 минут при 140000 g. Затем отбирали супернатанты, а осадки суспендировали в буфере того же объема, что и исходный объем образца. Содержание белков в супернатантах и осадках анализировали при помощи SDS-электрофореза в полиакриламидном геле.
Белковый состав проб анализировали методом вертикального SDS-электрофореза по методу Лэммлн. В работе использовали 13% и 15% разделяющие гели. Электрофорез проводили в камере Mini-Protean 3 Cell (Bio-Rad) при постоянном напряжении 200 В. Гель окрашивали раствором Кумасси R-250. Полученные гели сканировали, используя планшетный сканер Umax Astra 6700. Электрофореграммы обрабатывали с помощью программы ImageQuant 5.2.
Для изучения свойств гидрофобных поверхностей нативного и денатурированного актина исследовали спектры флуоресценции зонда ANS В работе использовали флуоресцентный спектрофотометр Сагу Eclipse (Varían). Длины волн возбуждения флуоресценции составляли 292 нм - для триптофана и 400 нм-для ANS.
Основные результаты и их обсуждение
Влияние нуклеотидов на характер тетовой денатурации Р-актина.
В ходе исследования тепловой денатурации актиновых филаментов было замечено, что термостабилыюсть Р-актина сильно зависит от концентрации добавленного нуклеотида (АДФ или АТФ) Из рисунка 1А видно, что увеличение концентрации АДФ в растворе приводит к заметному смещению кривой теплопоглощения Р-актина в сторону более высоких температур. Аналогичный эффект наблюдается и в случае АТФ (данные не представлены) Температура максимума теплового перехода Р-актина (Гшкс) возрастает на 5-6 градусов с увеличением концентрации АДФ вплоть до 1 мМ и выходит на плато при более высоких концентрациях АДФ (рис 1Б). Данный эффект не зависит от скорости
нагрева образца и наблюдается при трех использованных скоростях - от 0,5 до 1,8 град/мин.
Рис. 1. Влияние концентрации добавленной АДФ на тепловую денатурацию F-актина (Л) Слева направо представлены кривые теплопоглощення F-актина, полученные в отсутствие добавленной АДФ и в присутствии 0,11, 0,2, 0,5 и 1,0 мМ АДФ (Б) Зависимость температуры максимума теплового перехода F-актина (Гчакс) от концентрации добавленной АДФ Концентрация белка 1,5 мг/мл. Скорость нагрева 1 град/мин Условия 30 мМ буфер Hepes-KOH, рН 7,3, 2 мМ MgCl2
Стабилизирующий эффект АДФ является высокоспецифичным,
поскольку наблюдается он лишь в присутствии АДФ, но не других нуклеозид-дифосфатов (1DP, UDP, GDP, CDP). Более того, некоторые из них (UDP, GDP и CDP) даже несколько снижают термостабильность F-актина (рис. 2). Напротив, сильный эффект стабилизации F-актина в присутствии АТФ значительно менее специфичен, т. к. он наблюдается, хотя и в меньшей степени, для других исследованных нуклеозид-трифосфатов (ITP, UTP, GTP) (рис. 2). Это наводит на мысль о том, что стабилизирующий эффект АТФ существенно отличается по своему механизму от эффекта, вызываемого АДФ. Не исключено, что АТФ и другие нуклеозид-трифосфаты могут взаимодействовать не только с высокоспецифическим участком связывания нуклеотидов, расположенным в нуклеотид-связывающей щели между двумя доменами в молекуле актина, но и с дополнительным нуклеотид-связывающим участком в F-актине. Наличие в актине такого «второго» участка связывания нуклеотидов с низкой специфичностью и низким сродством было ранее отмечено в литературе. Связывание нуклеотидов в этом участке происходит при их миллимолярных концентрациях, причем ИТФ и ЦТФ связываются даже эффективнее, чем АТФ.
По-видимому, стабилизирующий эффект АТФ в значительной степени обусловлен именно ее взаимодействием со «вторым» нуклеотид-связывающим участком в F-актине. В пользу этого предположения говорит тот факт, что повышение концентрации АТФ от 1 до
8
5 мМ приводит к дальнейшему увеличению термостабильности Р-актина, тогда как подобное повышение концентрации АДФ уже не оказывает никакого влияния на термостабильность (рис. 3). Самые значительные изменения в термостабильности Р-актина происходят при низких концентрациях добавленного нуклеотида (0,1-0,2 мМ) и в этих условиях эффекты АДФ и АТФ очень сходны между собой. Подобные эффекты трудно объяснить каким-либо взаимодействием АДФ или АТФ с дополнительным нуклеотид-евязывающим участком в Р-актине, для которого требуются значительно более высокие концентрации нуклеотида.
У 68
F-a
-UDP ^пр +CDP +CDP
F-a
Дифосфаты
Трифосфаты
Рис. 2. Сравнение эффектов различных нуклеозид-дифосфатов (ADP, [DP, UDP, GDP и CDP) и нуклеозид-трифосфатов (ATP, ITP, UTP, GTP), а также неорганического пирофосфата (PPi) на температуру максимума теплового перехода F-актина (Г„ЯКс). F-a - F-актин в отсутствие добавленных нуклеотидов. Концентрация актина - 1 мг/мл, концентрация всех нуклеотидов - 2 мМ, пирофосфата - 5 мМ. Скорость нагрева 1,8 град/мин.
1 2 3 4 5
Концентрация нуклеотида, мМ
Рис. 3. Зависимость температуры максимума теплового перехода F-актина (Тшкс) от концентрации добавленного нуклеотида - АДФ или АТФ. Концентрация белка 1,5 мг/мл. Прочие условия: 30 мМ буфер Hepes-КОН, pH 7,3, 2 мМ MgCl2, 100 мМ KCl. Скорость нагрева 1,8 град/мин.
Однако стабилизирующее влияние нуклеотидов на тепловую денатурацию Р-актина может быть объяснено иным образом, нежели взаимодействием нуклеотидов с дополнительными сайтами связывания. Мы предполагаем, что необратимой тепловой денатурации Р-актина предшествует обратимая стадия диссоциации нуклеотида (АДФ) из специфических нуклеотид-связывающих центров в актиновых субъединицах. Хорошо известно, что актин, лишенный нуклеотидов, крайне нестабилен и легко денатурирует. Он сохраняет стабильность и способность к образованию филаментов Р-актина лишь в присутствии высоких концентраций сахарозы. В обычных условиях АДФ, прочно связанная с субъединицами Р-актина, неспособна обмениваться со свободными нуклеотидами. Обратимая диссоциация АДФ из нуклеотид-связывающего центра протомера актина происходит, по-видимому, лишь в процессе нагрева, непосредственно перед необратимой денатурацией белка. Присутствие в растворе свободного нуклеотида (АДФ или АТФ) препятствует такой диссоциации, и именно этим можно объяснить вызываемое нуклеотидами увеличение термостабильности Р-актина.
Зависимость тепловой денатурации Р-актина от концентрации белка.
Известно, что при тепловой денатурации многих олигомерных белков и ферментов температура максимума теплового перехода (Гшкс) заметно повышается с увеличением концентрации белка. Исследование тепловой денатурации Р-актина при разных концентрациях белка показало, что в случае актиновых филаментов зависимость положения максимума кривой теплопоглощения от концентрации белка выражена достаточно сильно (рис. 4). Согласно современным представлениям, наличие подобной зависимости температуры максимума теплового перехода от концентрации белка свиде!ельствует о том, что необратимой тепловой денатурации белковых субъединиц предшествует обратимая стадия их диссоциации из состава олигомера Следовательно, можно предположить, что перед необратимой денатурацией Р-актина происходит обратимая фрагментация актиновых филаментов (или диссоциация коротких олигомеров с одного из концов филамента).
Для проверки этого предположения были исследованы подобные зависимости для
актина в разных состояниях: для мономерного О-актина, для филаментов Р-актина, а также
для Р-актина, стабилизированного фаллоидином или фторидом алюминия (А1Р4"). На рис. 4
показаны зависимости температуры максимума теплового перехода (Гм аьс) от
концентрации белка для всех описанных выше состояний актина. Видно, что для Р-актина
величина Тытс увеличивается почти на 3 градуса при повышении концентрации белка с 0,5
до 2,0 мг/мл. Сходная зависимость величины Ттк от концентрации белка обнаружена
также для Р-актина, стабилизированного фаллоидином, в то время как в присутствии АШ4"
такая зависимость выражена значительно слабее. Что касается мономерного О-актина, то в
этом случае, как и ожидалось, величина Гмакс вообще не зависела от концентрации белка
10
(рис. 4). Эти данные подтверждают наше предположение о наличии обратимой стадии фрагментации Р-актина непосредственно перед необратимой денатурацией белка.
Концентрация актнна, мг/мл
Рис.4. Зависимости температуры максимума теплового перехода актина (Г,шкс) от концентрации белка для G-актима (/), F-актина (2) и F-актина, стабилизированного фаллоидипом (J) или фторидом алюминия AIF4' (4) Условия буфер G, содержащий Hepes-KOH вместо трис-НС1 (/), или 30 мМ буфер Hepes-KOH, pH 7,3, содержащий 2 мМ MgCl2, 2 мМ АДФ (2), а также либо 45 мкМ фаллоидин (J), либо 0,5 мМ AIF4" (5 мМ NaF и 0,5 мМ А1С1з) (4) Скорость нагрева 1 град/мин
Предполагаемый механизм тепловой денатурации актииового филамеита.
На основании полученных данных был предложен новый «диссоциативмый» механизм тепловой денатурации Р-актина. В основу этой модели легли приведенные выше предположения о том, что необратимой тепловой денатурации Р-актина предшествуют, по крайней мере, две обратимые стадии - высвобождение нуклеотида (АДФ) из нуклеотид-связывающих центров субъединиц актина и фрагментация актиновых филамеитов. Завершается процесс денатурации агрегацией денатурированных молекул белка.
На рис. 5 схематически представлен «диссоциативный» механизм тепловой денатурации филамеитов Р-актина. Предполагается, что в процессе нагрева актиновые филаменты подвергаются дестабилизации, подвижность их увеличивается, а связи между отдельными актиновыми субъединицами ослабляются. Вследствие этого происходит фрагментация Р-актина: короткие олигомеры отрываются с одного из концов полярного актинового филамента (скорее всего, с «минус»-конца, на котором скорость отщепления субъединиц актина значительны выше, чем на растущем «плюс»-конце). В том случае, если отщепившиеся олигомеры утрачивают связанную АДФ из нуклеотид-связывающих центров актиновых субъединиц, то, становясь крайне нестабильными, они достаточно быстро подвергаются денатурации и последующей агрегации. Однако содержащие АДФ
11
олигомеры способны вновь связаться с актиновым филаментом, причем вероятнее всего подобное связывание будет происходить с «плюс»-концом ближайшего соседнего филамента.
Рис. 5. Схема, иллюстрирующая «диссоциативный» механизм тепловой денатурации
филаментов F-актина. Молекулы АДФ как в свободном состоянии, так и связанные с актиновыми мономерами, обозначены буквой «D». Актиновые мономеры или короткие олигомеры,
отрывающиеся при нагревании с «-»-конца актинового филамента, либо утрачивают связанную АДФ, после чего быстро денатурируют и агрегируют, либо содержащие АДФ олигомеры вновь
присоединяются к «+»-концу того же или другого филамента.
т Ш' iiiL-^
• -Jfl
Предложенная модель (рис. 5) позволяет объяснить полученные нами данные о том, что тепловая денатурация F-актина зависит как от концентрации АДФ, так и от концентрации белка. В силу того, что в процессе нагрева нуклеотид (АДФ) в нуклеотид-связывающем центре молекулы актина может, по-видимому, обмениваться с нуклеотидами в растворе, избыток свободной АДФ затрудняет вызываемое нагревом обратимое высвобождение прочно связанной АДФ из актиновых субъединиц. Увеличение же концентрации белка приводит к увеличению количества актиновых филаментов, а, соответственно, и их растущих «+»-концов, к которым могут присоединяться олигомеры актина.
Следует отметить существенные различия во влиянии фаллоидина и A1F4" на зависимость 7"шкс от концентрации белка (рис. 4). Несмотря на то, что оба стабилизирующих агента резко увеличивают термостабильность F-актина, они делают это
12
(+) F-ЭКТИН
D D; 0 DAD " D* Я^У -.0Yq D D^D;
Д D .(D/D;; DWDXDYD^W, ' Dxp; D> ' ;D; b;D" D 'D; D,D'D'
P ö.
p tos
Денатурация
Агрегация
независимо друг от друга, и механизм стабилизации актинового филамента данными агентами имеет совершенно разную природу. Фаллоидин повышает термостабильность F-актииа, усиливая связи между соседними субъединицами в актиповом филамепте, тогда как AIF4" оказывает сходный эффект путем прочного удерживания АДФ в пуклеотид-связывающем центре актина Таким образом, комплекс АДФ-А1Р4'-актин, имитирующий промежуточное состояние АДФ-Ф„-актин в цикле полимеризации актина, должен препятствовать высвобождению АДФ из субъединиц актина и, с другой стороны, стимулировать присоединение актиновых мономеров или коротких олигомеров к растущему «+»-концу филамента. В свете предложенной выше модели это означает, что AIF4' может оказывать влияние па обе обратимые стадии, предшествующие необратимой тепловой денатурации F-актина, делая таким образом зависимость 7"ыакс от концентрации F-актина менее выраженной и приближая ее к зависимости, характерной для мономерных белков. Это хорошо согласуется с полученными нами данными (рис. 4).
Данные литературы, свидетельствующие в пользу «диссоциативного» механизма тепловой денатурации F-актина.
Для того, чтобы предложенную нами модель тепловой денатурации актиновых филамептов можно было считать достаточно обоснованной, мы в первую очередь обратились к опубликованным к настоящему времени данным литературы в поисках необходимых подтверждений наших предположений.
Одним из важнейших положений предлагаемого механизма тепловой денатурации актиновых филаментов (рис. 5) является утверждение о том, что содержащие АДФ короткие олигомеры актина, отщепившиеся с «-»-конца филамента, могут вновь связываться с растущими «+»-концами соседних филаментов. В настоящее время хорошо известно, что содержащий связанную АДФ мономерный G-актин способен полимеризоваться с образованием филамептов F-актина, причем филаменты, полученные из АДФ-О-актина и АТФ-С-актина, достаточно близки по своим свойствам. Кроме того, возможно присоединение АДФ-О-актина к растущим концам уже сформированных актиновых филаментов [Pollard, 1984; 1986]. Помимо этого, опубликован целый ряд работ, свидетельствующих о способности F-актина образовывать длинные нити из коротких филаментов актина Такое явление обусловлено взаимодействием между «+»- и «-»-концами двух филаментов, с сохранением их полярности, и получило название «отжига» [Murphy et al, 1988; Sept et al, 1999; Andrianantoandro et al, 2001]. Данный процесс происходит спонтанно, не требует наличия содержащих АТФ мономеров G-актина или гидролиза АТФ, не зависит от природы нуклеотида, связанного с протомерами актина на концах нити, а наличие стабилизатора (фаллоидин) не оказывает на этот процесс заметного влияния. Таким образом, приведенные выше данные свидетельствуют о том, что
постулируемое в нашей модели присоединение содержащих АДФ коротких олигомеров актина к растущим концам актиновых филаментов (рис. 5) является вполне вероятным.
Кроме того, нами был проведен целый ряд дополнительных экспериментов для проверки основных постулатов предложенной модели тепловой денатурации F-актина Здесь стоит отметить тот факт, что при исследовании тепловой денатурации актина нельзя не принимать во внимание сопровождающий ее процесс агрегации белка. Именно стадия агрегации является последней в описанном выше «диссоциативном» механизме денатурации актиновых филаментов (рис. 5). Поэтому для получения полного представления о процессе тепловой денатурации F-актина, необходимо подробно исследовать его тепловую агрегацию.
Тепловая агрегация актина.
Для детального исследования агрегации актина нами был использован метод светорассеяния, позволяющий регистрировать изменения интенсивности светорассеяния раствора белка в процессе его нагрева. Было показано, что в процессе агрегации мономерного G-актина интенсивность светорассеяния увеличивается очень незначительно, в то время как агрегация F-актина сопровождается заметным ростом светорассеяния. Важно отметить, что исследования температурных зависимостей светорассеяния проводились в тех же условиях и при той же скорости нагрева, что и эксперименты по изучению тепловой денатурации актина методом ДСК. Это позволяло нам сопоставлять температурные зависимости тепловой денатурации актина с температурными зависимостями его агрегации. В результате была обнаружена очень хорошая корреляция между тепловой денатурацией актина (рис. 6, DSQ и увеличением светорассеяния, обусловленного агрегацией белка (рис. 6, LS) Полученный результат указывает на то, что в процессе нагрева денатурированные молекулы актина сразу подвергаются агрегации, и именно эта стадия является заключительной в процессе тепловой денатурации актинового филамента.
Исследование процесса тепловой денатурации актина при помощи гидрофобного
флуоресцентного зонда ANS.
Одним из подтверждений высказанного нами предположения о том, что денатурации подвергаются не целые актиновые филаменты, а отдельные короткие олигомеры, отрывающиеся от филамента в процессе нагрева, стали результаты исследований тепловой денатурации актина с использованием гидрофобного флуоресцентного зонда 1-анилинопафталин-8-сульфоната (ANS). Этот зонд интересен тем, что при его взаимодействии с гидрофобными кластерами, появляющимися на поверхности белка при его денатурации, наблюдается резкий прирост флуоресценции ANS.
| DSC|
. [ГЦ
40 SO 60 70
Te.\inepai>pa, °C
Piic. 6. Температурные зависимости тепловой денатурации, регистрируемой методом ДСК (DSC), и вызываемой ею агрегации, регистрируемой по приросту светорассеяния прп 350 нм (LS), для F-актина при низкой ионной силе (30 мМ Hepes-KOH, рН 7,3, 2 мМ MgCh) Пунктирной линией показана корреляция между максимумом на кривой теплопоглощения и полупереходом на кривой температурной зависимости светорассеяния Концентрация актина составляла 1 мг/мл, скорость прогрева - 1 град/мин
300 350 400 450 500 550 600 Длина волны, им
Рис. 7. Спектры флуоресценции ANS для G- и F-актина, полученные для нативных белков при комнатной температуре (спектры 1 и 2) и после прогрева белков до температуры 70°С, т е до их полной необратимой денатурации (спектры 3 и 4, соответственно) Спектры
записывали при 20°С Длина волны возбуждения 292 нм Концентрация белков 0,1 мг/мл Эксперименты проводили при низкой ионной силе (в G-буфере)
На рис. 7 представлены спектры флуоресценции, полученные в присутствии ANS для G- и F-актина при комнатной температуре (нативные белки) и после их прогрева до 70°С (полностью денатурированные белки). Хорошо видно, что флуоресценция ANS (пик с максимумом при ~470 нм) наблюдается лишь в случае денатурированных белков (спектры
3 и 4 на рис. 7), тогда как для нативных белков подобного эффекта не выявлено. G- и F-актин мало отличаются друг от друга по величине прироста флуоресценции ANS, и спектры флуоресценции зонда, связанного с денатурированным актином, для них очень похожи (рис. 7). Необходимо отметить, что данный эффект наблюдается вне зависимости от длины волны возбуждения (292 нм или 400 нм). Сходство полученных в результате тепловой денатурации G- и F-актина спектров флуоресценции ANS позволяет предположить, что гидрофобные свойства поверхностей обоих денатурированных белков отличаются незначительно.
Исследования температурных зависимостей интенсивности флуоресценции ANS для G-актина и F-актина показали, что прирост флуоресценции ANS непосредственно связан с процессом тепловой денатурации актина, а не с его последующей агрегацией. В силу того, что спектры флуоресценции связанного с денатурированным актином гидрофобного зонда ANS для G- и F-актина демонстрируют столь заметное сходство (рис. 7), представляется вероятным, что и тепловая денатурация этих белков в данных условиях происходит сходным образом. Из литературы известно, что денатурация мономерного G-актина приводит к образованию небольших комплексов, состоящих из ограниченного количества развернутых молекул белка. Следовательно, на основании того, что гидрофобные поверхности денатурированного G- и F-актина имеют схожие свойства, можно предположить, что актиновый филамент денатурирует не целиком, а сначала распадается на отдельные небольшие олигомеры, которые в процессе денатурации образуют комплексы, аналогичные растворимым комплексам денатурированного мономерного G-актина. Это является еще одним свидетельством в пользу предложенного «диссоциативного» механизма тепловой денатурации F-актина (рис. 5)
Влияние малых белков теплового шока на агрегацию F-актина в процессе его
тепловой денатурации.
Еще одно подтверждение предложенного механизма тепловой денатурации актиновых филаментов (рис. 5) было получено при исследованиях взаимодействия F-актина с малыми белками теплового шока (sHSP). Считается, что в клетке эти белки предотвращают агрегацию различных денатурированных белков, не обладая при этом узкой специфичностью.
Методом ДСК было показано, что sHSP не оказывают никакого влияния на процесс тепловой денатурации F-актина. Однако при измерениях температурных зависимостей светорассеяния, проводимых в тех же условиях, что и эксперименты методом ДСК, было установлено, что sHSP эффективно предотвращают агрегацию денатурированного актина, смещая кривую светорассеяния более чем на 20°С в сторону более высоких температур (рис. 8) Для того, чтобы понять механизм такого защитного действия sHSP на агрегацию
Р-актина при его тепловой денатурации, были проведены эксперименты по соосаждению Р-актина с Н5р27-ЗЭ (псевдофосфорилированный мутант малого белка теплового шока Нзр27, существующий в виде небольших димеров или тетрамеров). Смесь белков прогревали с постоянной скоростью (1°С/мин) от 25 до 90°С, контролируя процесс агрегации по приросту светорассеяния (рис. 8, ¿5). По достижению определенных значений температуры (25, 70 или 90°С) отбирали аликвоты белка, которые затем охлаждали, подвергали ультрацентрифугированию и с помощью БОЗ-гель электрофореза определяли содержание белков в осадках (р) и супернатантах (5) (рис. 8, электрофореграмма).
А Р асНп
1 - Р-актин ¡Щ
2 - Р-актин + Нэр 1
*
1 1 2 /
В
асПп Нэр
25°С
70"С
90°С
Температура. "С
Рис. 8. Влияние малого белка теплового шока Нзр27-ЗВ на агрегацию Р-актина в процессе его тепловой денатурации. Р-актин (1 мг/мл) в отсутствие (кривая I) или в присутствии Нзр27-ЗВ (0,33 мг/мл) (кривая 2) прогревали с постоянной скоростью I град/мин и регистрировали агрегацию по приросту светорассеяния (7.5). При определенных температурах, отмеченных стрелками (25, 75 и 90°С), отбирали аликвоты, охлаждали их и центрифугировали в течение 1 5 мин при 140000g, после чего методом БОЗ-ПААГ-электрофореза определяли содержание актина и Нзр27-30 в осадках и супернатантах. Справа представлены электрофореграммы, показывающие распределение белков (актин и Нзр27-30) в супернатантах (4-) и осадках (р) после прогрева актина до указанной температуры в отсутствие (А) или в присутствии Нзр27-30 (В). Слева на электрофореграмме отмечены положения полос актина (аейп) и Нзр27-30 (Нэр).
В качестве самого важного результата данного эксперимента следует отметить то, что после прогрева до 70°С (т.е. после полной необратимой денатурации Р-актина) в отсутствие Н.чр27-30 весь актин обнаруживался в осадке, тогда как в присутствии НБр27-30 более 70% актина и почти весь Н5р27-ЗЭ одновременно обнаруживались в супернатанте (рис. 8). Эти данные свидетельствуют о том, что в процессе нагрева бНБР образуют с денатурированным актином стабильные хорошо растворимые комплексы, которые не осаждаются в процессе ультрацентрифугирования. Подобные результаты могут быть интерпретированы следующим образом: малые белки теплового шока связываются с денатурированными короткими олигомерами актина, получаемыми в процессе нагревания
17
Р-актнна, и защищают их от агрегации путем образования небольших и хорошо растворимых комплексов, размеры которых намного меньше, чем у нативных актиновых филаментов, которые полностью осаждаются при ультрацентрифугировании. Очевидно, что эти результаты являются еще одним свидетельством в пользу предложенного «диссоциативного» механизма тепловой денатурации актиновых филаментов (рис. 5).
Влияние кофилииа в насыщающей концентрации на процесс тепловой
денатурации актина.
Актин-связывающий белок кофилин может взаимодействовать как с Р-актином, так и с мономерным в-актином. Из литературы известно, что с одной молекулой актина связывается только одна молекула кофилина. Следовательно, для получения полностью насыщенного кофилином актина необходимо, чтобы молярная концентрация кофилина была равна или превышала молярную концентрацию актина. В данном разделе приведены результаты экспериментов, в которых молярное соотношение кофилина к актину составляло 1,2 Тепловую денатурацию белков исследовали с помощью метода ДСК.
В первую очередь мы исследовали влияние кофилина на тепловую денатурацию О-актина. На рис.9А представлены кривые теплопоглощения для мономерного в-актина, кофилина и комплекса этих белков. Для изолированных белков температуры максимумов тепловых переходов соответствуют 60,3°С в случае й-актина и 56,5°С в случае кофилина. В составе комплекса наблюдается заметная стабилизация обоих белков, и их денатурация происходит при более высокой температуре с максимумом теплового перехода при 66,4°С (рис.9А, кривая 3), при этом полностью исчезают пики свободных белков. Это свидетельствует о том, что новый высококооперативный тепловой переход не является результатом суперпозиции переходов изолированных в-актина и кофилина, а происходит образование достаточно прочного комплекса этих двух белков, которые затем денатурируют вместе как единое целое. Следует отметить, что подобное изменение характера тепловой денатурации мономерного в-актина при взаимодействии с кофилином не является результатом полимеризации актина. Об этом свидетельствуют данные о полном отсутствии полимеризованного Р-актина в осадках, полученных при ультрацентрифугировании комплексов в-актина с кофилином. Тем не менее, при связывании мономерного й-актина с кофилином происходит значительное увеличение термостабильности обоих белков (рис.9А).
Аналогичная ситуация наблюдается и для Р-актина в присутствии насыщающих концентраций кофилина (рис.9Б). В результате полимеризации актина происходит незначительная стабилизация белка (Тшк для Р-актина соответствует 61,5°С, что всего на 1,2°С выше температуры денатурации мономерного О-актина), но заметно увеличивается кооперативность теплового перехода. При добавлении кофилина в насыщающей концентрации наблюдается заметная стабилизация обоих белков: максимум кривой
18
теплопоглощения комплекса достигается при температуре 68,5°С, а кооперативность теплового перехода значительно возрастает (рис.9Б). Как и в случае мономерного 0-актина, образование комплекса Р-актина с кофилином сопровождается почти полным исчезновением тепловых переходов свободных белков.
50 - С-акшии А
40 _ 1 - Кофилин з
2 - С-актин д
30 - 3 - О-актнн + Кофнлин /
20 ^ /
2 /
10
0 4 4 1.1.1.1. 1 , 1
50 - Р-актип 3 . Б
40 I - Кофнлин
2 - Р-актпн /
30 . 3 - Р-актнн + Кофилин 1
2 /
20 Л /
1 ! У
10 ' /
0 у \ V..
1.1.1.1.1.1
_I_1_ I_,_I_I_I_,_1_
30 40 50 60 70 80
Температура, °С
Рис. 9. Влияние кофилнна на тепловую денатурацию О-актина (Л) и Р-актина (Б) при насыщающей концентрации кофилнна
Представлены кривые ДСК для О-актина (А) и Р-актина (Б) в отсутствие кофилнна (кривые 2) и в присутствии кофилнна (кривые 3) Кривая I отражает тепловую денатурацию свободного кофнлина Условия 25 мкМ актин, 30 мкМ кофилин, О-буфер, в случае Р-актина (Б) образец содержал также 2 мМ Скорость нагрева 1 град/мпн
Таким образом, связывание как в-актина, так Р-актина с кофилином в его насыщающих концентрациях приводит к значительному увеличению термостабильности обоих белков в составе образующихся комплексов. Исходя из того, что эффект стабилизации актинового филамента кофилином аналогичен стабилизирующему эффекту, наблюдаемому для комплекса кофилина с мономерным в-актином, можно предположить, что кофилин индуцирует сходные структурные перестройки как в актиновом мономере, так и в субъединицах Р-актина, с которыми он связывается непосредственно. Из литературы известно, что связывание актина с кофилином приводит к серьезным структурным перестройкам в молекуле актина (например, оно способствует переходу нуклеотид-связывающей щели между двумя доменами молекулы актина в более «закрытое» состояние). Не исключено, что именно это и является одной из главных причин вызываемого кофилином значительного повышения термостабилыюсти как мономерного О-актина, так и филамента Р-актина (рис. 9).
Влияние кофилииа в малых концентрациях на процесс тепловой денатурации Р-актипа. Кооперативная дестабилизация актинового филамента.
В противоположность стабилизирующему эффекту насыщающих концентраций кофилина на тепловую денатурацию Р-актина (рис. 9Б), в концентрациях ниже ненасыщающих (т.е. в более низких молярных концентрациях, чем у Р-актина) кофилин дестабилизирует актиновый филамент В этих условиях мы наблюдали заметное снижение термостабильности Р-актина, которое выражалось в смещении его теплового перехода в сторону более низких температур на 1-6°С, в зависимости от молярного отношения кофилина к актину. Наиболее ярко выраженный эффект наблюдался при концентрациях кофилина от 4 до 16 мкМ (те. при молярных соотношениях актин/кофилин от 6,25 до 1,56). В этих условиях на термограмме наблюдалось одновременно два пика: пик стабилизированного кофилином Р-актина при 65-67°С и пик при 56-58°С, отражающий тепловую денатурацию Р-актина, дестабилизированного кофилином (рис. 10). С уменьшением молярного отношения кофилина к актину происходило уменьшение пика Р-актина, стабилизированного кофилином, и увеличение пика Р-актина, дестабилизированного кофилином. При низких концентрациях кофилина (0,125-1,0 мкМ) наблюдался только пик дестабилизированного Р-актина (рис. 10), причем его максимум сдвигался в сторону более низких температур при увеличении концентрации кофилина. Напротив, максимум пика
стабилизированного Р-актина при 1
повышении концентрации кофилина
смещался в сторону более высоких температур (рис. 10).
Рис. 10. Кривые теплопоглощения комплексов Р-актина с кофилином, полученные при различных молярных соотношениях кофилин/актин Концентрация Р-актина оставалась неизменной (25 мкМ), концентрации кофилина указаны для каждой кривой Вертикальная пунктирная линия отмечает максимум теплового перехода Р-актина в отсутствие кофилина (Г»,акс ~ 61,5°С) Прочие условия' 30 мМ Нереэ-КОН, рН 7,3, 2 мМ М§С1г, 0,2 мМ АДФ Скорость нагрева 1 град/мин Кривые ДСК сдвинуты друг относительно друга вдоль вертикальной оси исключительно для удобства восприятия, вертикальная метка соответствует 25 мкВ
оа
I-
Концентрация кофилина мкМ
32
0____^
_. 1-._и_._I-
40 50 60 70
Температура, °С
1_. 1-._I.
Следует особо отметить, что дестабилизирующий эффект кофилииа является высококооперативным: он наблюдается даже при очень низких молярных отношениях кофилин/актин, когда на 100-200 субъединиц F-актина приходится всего одна молекула кофилииа.
В экспериментах по ультрацентрифугированию было показано, что во всех случаях актин обнаруживается только в осадках. Таким образом, дестабилизация F-актина при низких концентрациях кофилииа не является следствием деполимеризации актина и этот эффект обусловлен, скорее всего, структурной реорганизацией актинового филамента
Влияние стабилизаторов F-актипа па тепловую денатурацию его комплексов с
кофилипом.
Последующая серия экспериментов была проведена для выяснения влияния двух стабилизаторов F-актина, фаллоидина и фторида алюминия (A1F4~), на индуцируемую кофилином стабилизацию или дестабилизацию актинового филамента. Как уже указывалось ранее (рис 4), при связывании F-актина с фаплоидином термостабильность актина значительно увеличивается: максимум кривой теплопоглощения F-актипа смещается с 61,5 до 78 "С (рис. 11, кривые 1,3). При добавлении к стабилизированному фаллоидином F-актину кофилина в насыщающей концентрации форма кривой ДСК (рис. 11 А, кривая 4) становится практически такой же, как и для комплекса F-актина с кофилином в отсутствие фаллоидина (рис. 11 А, кривая 2) Из литературы известно, что сродство фаллоидина к F-актину намного выше, чем у кофилииа, и именно этим объясняется тот факт, что фаллоидин обычно препятствует связыванию кофилина с актином в условиях in vitro. Однако представляется вполне возможным, что в процессе нагрева белков сродство кофилина к F-актину значительно возрастает. В результате кофилин получает возможность связываться с F-актином даже в присутствии фаллоидина, полностью предотвращая при этом его стабилизирующий эффект (рис. 11А).
Напротив, при низких концентрациях, недостаточных для насыщения, кофилин почти не оказывает влияния на тепловую денатурацию F-актина, стабилизированного фаллоидином (рис. 11 Б) В этом случае добавление фаллоидина полностью предотвращает дестабилизирующий эффект кофилина.
Аналогичные эффекты наблюдались нами и в случае добавления кофилина к F-актину в присутствии A1F4" (данные не представлены). Известно, что данный анион (аналог неорганического фосфата) связывается с АДФ-Р-актином с очень высоким сродством и в значительной степени увеличивает термостабилыюсть F-актина; однако добавление кофилина в насыщающих концентрациях полностью нейтрализует эффект этого стабилизатора. Этот факт позволяет предположить, что структурные перестройки, индуцируемые кофилином в субъединицах F-актина, могут препятствовать структурным
21
перестройкам, индуцируемым А1Р4". При этом дестабилизирующий эффект, оказываемый на Р-актин кофилином в низких, ненасыщающих концентрациях полностью предотвращается добавлением фторида алюминия
Рис. 11 Влияние кофилина в насыщающей (А) и ненасыщающей (Б) концентрации на тепловую денатурацию Б-актина в отсутствие (кривые 1 и 2) и в присутствии фаллоидина (кривые 3 и 4) Концентрация кофилина составляла 32 ыкМ (А) или 1,6 мкМ (Б), концентрация И-актина - 25 мкМ, концентрация фаллоидина - 38 мкМ Прочие условия 30 мМ Нерев-КОН, рН 7,3, 2 мМ МвСЬ, 0,2 мМ АДФ Скорость нагрева 1 град/мин
Таким образом, эффекты стабилизации Р-актина как фаллоидином, так и А1Р4, нейтрализуются при добавлении насыщающих концентраций
кофилина, но, с другой стороны, они оказываются намного сильнее дестабилизирующего эффекта кофилина в случае его ненасыщающих концентраций и полностью предотвращают этот эффект.
Дестабилизирующий эффект кофилина в свете «диссоциативного» механизма тепловой денатурации актиновых фалиментов.
Представленные выше данные свидетельствуют о том, что связывание с кофилином оказывает двойственный эффект на термостабильность Р-актина, в зависимости от концентрации кофилина. При стехиометрических (насыщающих) концентрациях кофилин стабилизирует структуру актинового филамента, что выражается в повышении температуры теплового перехода. Однако наиболее интригующим результатом является дестабилизация актинового филамента при суб-стехиометрических (ненасыщающих) концентрациях кофилина (рис. 10). Этот эффект трудно объяснить деполимеризацией Р-актина: против этого свидетельствуют как данные экспериментов по
22
50 Насыщающая концентрация - кофилина (32 мкМ) 4 \ А
40 30 20 1 ■ р-актин /1 2 - Р-актин + кофилин / 1 3 - р-акшн + фаллоидин 1 1 4 - р-актин + кофилин + 1 I + фаллоидин / I 1__^/у 1 I 1 |
10 / н 1 1
0 \ 1
50 Ненасыщающая концентрация - ьофилина (1,6мкМ) Л л Б
40 30 _ 1 - Р-актин 2 - Р-актин + кофилин 3 - Р-актин + фаллоидин 4 • Р-актин + кофилин +фаллоидин г4
20 10 / /1 1 1 1
0 ' ' / ......... | 1
30 40 50 60 70 80 90
Температура, "С
ультрацентрифугированию, так и данные ДСК о том, что добавление фаллондипа к И-актину, дестабилизированному кофилином, полностью устраняет эффект дестабилизации (рис. 11Б). Важно отметить, что пики стабилизированного и дестабилизированного Г-актина могут сосуществовать на одной и той же термограмме (рис. 10). Эти данные позволяют предположить, что кофилип стабилизирует только те субъединицы в актиновом филаменте, с которыми он связывается непосредственно, по при этом он с высокой степенью кооперативное™ дестабилизирует соседние субъединицы, свободные от кофилина. Это объяснение подразумевает сосуществование как минимум двух различных конформациопных состояний частично декорированного кофилином актинового филамента: термостабильного Р-актина, декорированного кофилином, и свободных от кофилина участков того же самого филамента, являющихся менее термостабильными Вероятно также, что индуцируемые кофилином структурные изменения в Р-актине могут распространяться вдоль филамента от субъединиц, непосредственно связанных с кофилином, к свободным от кофилина протомерам актинового филамента, причем такой дестабилизирующий эффект кофилина отличается очень высокой кооперативностыо
В настоящее время ни одна из существующих моделей, применяемых для описания процесса тепловой денатурации взаимодействующих друг с другом белков, не может объяснить кооперативный эффект дестабилизации актинового филамента кофилином в его ненасыщающей концентрации. Мы считаем, что этот эффект кофилина трудно объяснить иначе, чем фрагментацией актинового филамента, предшествующей его необратимой денатурации. Попробуем представить дестабилизирующее влияние кофилина на актиновый филамент в свете предложенного нами «диссоциативного» механизма тепловой денатурации Р-актина
При концентрациях кофилина, недостаточных для полного насыщения актинового филамента, он связывается лишь с некоторыми субъединицами, что приводит к структурной дестабилизации свободных от кофилина областей частично декорированного актинового филамента. Следствием этого является повышение ((хрупкости» в местах контактов декорированных и недекорированных участков филамента, в результате чего Р-актин обретает склонность ломаться и рваться в подобных «слабых» точках (что подтверждается и некоторыми литературными данными). Однако снижение термостабильности Р-актина не может являться только следствием разрывов, происходящих в филаменте. Это позволяет предположить, что индуцируемая кофилином дестабилизация актинового филамента включает в себя как серьезные изменения в ориентации актиновых субъединиц, находящихся в дестабилизированных областях филамента, так и значительные структурные перестройки в самих субъединицах. Так как в соответствии с предложенной нами моделью тепловой денатурации Р-актина (рис. 5) температурно-зависимая диссоциация олигомеров от филамента происходит при меньших температурах, чем температура денатурации, то дестабилизированные кофилином
субъединицы актина будут диссоциировать от филамента Мы предполагаем, что такие субъединицы в течение некоторого времени могут «помнить» свое измененное конформационное состояние. Вследствие подобной «конформационной памяти» свободные от кофилина субъединицы могут, по-видимому, некоторое время сохранять приобретенную конформацию, которая отличается пониженной термостабильностью, что на термограмме Р-актина отражается в виде появления низкотемпературного теплового перехода (рис. 10). Таким образом, предложенный ранее «диссоциативный» механизм тепловой денатурации актиновых филаментов может, с некоторыми допущениями, объяснить два столь противоположных эффекта, оказываемых кофилином на процесс тепловой денатурации Р-актина.
Дестабилизация Р-актина кофилином может играть важную роль в динамике цитоскелета, способствуя выполнению кофилином его главных, уже описанных в литературе функций - ускорению деполимеризации актиновых филаментов и их фрагментации. Имеются данные о том, что кофилин локализован главным образом вблизи клеточной мембраны и его гораздо меньше в центре клетки. При этом концентрация кофилина в клетке существенно меньше концентрации актина. Следовательно, вблизи мембраны актиновые филаменты будут практически полностью декорированы кофилином и стабилизированы им, тогда как по мере удаления от мембраны к центру клетки все меньше и меньше молекул кофилина будет связано с Р-актином. Исходя из наших данных, можно предположить, что актиновые филаменты в центре клетки будут нестабильны, что приведет к их фрагментации и образованию большого количества небольших олигомеров или даже мономеров, которые вновь смогут полимеризоваться в насыщенных кофилином областях клетки вблизи мембраны. Таким образом, как стабилизирующий, так и дестабилизирующий эффекты кофилина, обнаруженные нами впервые методом ДСК, могут играть важную роль в динамике актинового цитоскелета в живых клетках.
ВЫВОДЫ
1. При исследованиях тепловой денатурации филаментов актина (Р-актина) методом дифференциальной сканирующей калориметрии (ДСК) показано, что термостабильность Р-актина существенно возрастает с увеличением концентрации белка, а также при увеличении концентрации добавленного нуклеотида (АДФ). Эффект АДФ является высокоспецифичным, поскольку он не проявляется в присутствии других нуклеозиддифосфатов.
2. На основании полученных данных предложен новый «диссоциативный» механизм тепловой денатурации И-актина, согласно которому необратимой стадии денатурации (и последующей агрегации) белка предшествуют как минимум две обратимые стадии -диссоциация коротких олигомеров с концов актиповых филаментов и высвобождение нуклеотида (АДФ) из нуклеотид-связывающих центров субъедипиц актина.
3 С помощью метода ДСК впервые выявлены два противоположных эффекта актин-связывающего белка кофилииа на тепловую денатурацию Р-актина: стабилизация (увеличение термостабилыюсти) актиповых филаментов при насыщающих концентрациях кофилииа и дестабилизация (значительное снижение термостабилыюсти) филаментов при низких концентрациях кофилииа, недостаточных для полного насыщения всех актиповых субъединиц в филамепте.
4. Показано, что дестабилизация актиновых филаментов имеет место даже при очень низких концентрациях кофилииа, когда на 100-200 актиновых субъединиц приходится одна молекула кофилииа. Предполагается, что при взаимодействии с Р-актином кофилин стабилизирует только те субъединицы актина, с которыми он непосредственно связывается, но дестабилизирует множество свободных от кофилина соседних субъедипиц в актиновом филамепте.
Работа выполнена при поддержке Российского фонда фундаментальных исследований и Программы «Молекулярная и клеточная биология» Президиума РАН.
Список работ, опубликованных по теме диссертации
Статьи в рецензируемых журналах:
1. Dedova I.V., Nikolaeva О.Р., Mikhailova V.V . dos Remedios C.G. and Levitsky D.I. (2004) Two opposite effects of cofilin on the thermal unfolding of F-actin: a differential scanning calorimetric study. Biophys. Chem , 110, 119-128.
2. Pivovarova A.V , Mikhailova V.V , Chernik I.S , Chebotareva N.A , Levitsky D I. and Gusev N В (2005) Effects of small heat shock proteins on the thermal denaturation and aggregation of F-actin. Biochem Biophys Res. Commun ,331, 1548-1553.
3. Михайлова В В . Курганов Б.И., Пивоварова А.В., Левицкий Д.И. (2006) Диссоциативный механизм тепловой денатурации F-актина. Биохимия, 71, № 11, 1550-1560.
4. Levitsky D I., Pivovarova А V, Mikhailova V V and Nikolaeva O.P (2008) Thermal unfolding and aggregation of actin. Stabilization and destabilization of actin filaments. FEBSJ, 275, № 17, 4280-4295.
Тезисы докладов:
1. Николаева О П , Михайлова В.В.. Дедова И В , Левицкий Д И. (2002) Влияние кофилина на тепловую денатурацию актина. Тезисы научных докладов III Съезда Биохимического Общества (Санкт-Петербург, 26 июня - I июля 2002 г.), стр. 97-98.
2. Nikolaeva О.Р., Dedova I.V., Mikhailova V.V . and Levitsky D.I. (2002) Effects of cotllin on the thermal unfolding of actin. J Muscle Res. and Cell Motil, v. 23, № 1, p. 24-25. (Abstracts of the ЗГ' European Muscle Conference, Lunteren, Netherlands, 14-17 September 2002).
3. Mikhailova V.V . Kurganov B.I., Levitsky D.I. (2003) Thermal denaturation of F-actin: a proposed mechanism. J. Muscle Res and Cell Motil, v. 24, № 4-6, p. 329. (Abstracts of the 32'"1 European Muscle Conference, Montpellier, France, 6-10 September 2003).
4 Mikhailova V.V . Kurganov В I., and Levitsky D.I. (2004) A proposed mechanism for the thermal denaturation of actin filaments. Abstracts of International Symposium "Biological Motility" (Pushchino, Moscow region, May 23-June 1, 2004), p. 93-94.
5 Chernik I.S., Mikhailova V V.. Pivovarova A.V., Levitsky D.I., and Gusev N.B (2004) Protective effects of small heat shock proteins (sHSP) on the thermally induced aggregation of actin filaments. Abstracts of International Symposium "Biological Motility" (Pushchino, Moscow region, 23 May-1 June 2004), p 78.
6. Mikhailova V.. Pivovarova A., Chernik I., Gusev N.. and Levitsky D (2004) Small heat shock proteins prevent thermally induced aggregation, but not thermal denaturation of actin filaments. J. Muscle Res. and Cell Motil, 2004, v. 25, № 3, p. 251. (Abstracts of the 33"1 European Muscle Conference, Isola d'Elba, Italy, 19-23 September 2004).
7. Pivovarova A.V., Mikhailova V V . Chernik I.S., Gusev N В., and Levitsky D.I. (2005) Small heat-shock proteins prevent thermally induced aggregation of actin filaments by formation of soluble complexes with denatured actin. FEBSJ, v. 272, Suppl. 1, p. 356. (Abstracts of the 30FEBS Congress and 9'h IUBMB Conference, Budapest, Hungary, 2-7 July 2005).
8. Mikhailova V.. Pivovarova A., Chernik I., Chebotareva N., Gusev N., and Levitsky D.
(2005) A new insight into "dissociative" mechanism of the thermal unfolding of F-actin by using small heat shock proteins. J. Muscle Res. and Cell Motil, v. 26, № 1, p. 79.
(Abstracts of the 34'h European Muscle Conference, Hortobagy, Hungary, 17-21 September, 2005).
9. Levitsky D.I., Pivovarova A.V., Mikhailova V.V.. Chebotareva N.A., and Kurganov B.I.
(2006) Thermal denaturation and aggregation of actin filaments Abstracts of International Symposium "Biological Motility Basic Research and Practice " (Pushchino, Moscow Region, May 11-15, 2006), p. 29-30
10 Pivovarova A , Mikhailova V.. and_Levitsky D.I. (2006) Comparative studies on the thermal unfolding of G-actin and F-actin by using ANS fluorescence J Muscle Res. Cell Motil,. v. 27, № 5-7, p. 512. (Abstracts of 35'h European Muscle Conference, Heidelberg, Germany, 9-12 September 2006).
Заказ № 49/11/08 Подписано в печать Об 11 2008 Тираж 100 экз Уел пл 1.5
, ООО "Цифровичок", тел (495) 797-75-76, (495) 778-22-20 ивде с/г т ; е-тса1. т/о@с/г. га
Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Михайлова, Валерия Вадимовна
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
ВВЕДЕНИЕ
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1. G-актин
2. Полимеризация G-актина
3. F-актин
4. Взаимодействие актина с другими белками
4.1 Кофилин
5. Тепловая денатурация актина
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
1. Препаративные методы
1.1. Получение ацетонового порошка для выделения актина из скелетных мышц кролика
1.2. Выделение актина из ацетонового порошка
1.3. Определение концентрации белка
1.4. Получение F-актина и его стабилизация
2. Используемые методы исследования
2.1. Исследования термодинамических характеристик тепловой денатурации белков методом дифференциальной сканирующей калориметрии (ДСК)
2.2. Исследование агрегации F-актина методом светорассеяния
2.3. Аналитическое соосаждение
2.4. Электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии SDS
2.5. Метод флуоресцентной спектроскопии
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Глава 1. Исследование тепловой денатурации актиновых филаментов. 41 1.1. Влияние состава буфера на процесс тепловой денатурации
F-актина.
1.2. Влияние нуклеотидов на характер тепловой денатурации актиновых филаментов.
1.3. Зависимость тепловой денатурации F-актина от концентрации белка.
1.4. Предполагаемый механизм тепловой денатурации актинового филамеита.
1.5. Данные литературы, свидетельствующие в пользу «диссоциативного» механизма тепловой денатурации F-актина.
1.6. Тепловая агрегация актина.
1.7. Исследование процесса тепловой денатурации актина при помощи гидрофобного флуоресцентного зонда ANS.
1.8. Влияние малых белков теплового шока на агрегацию F-актина в процессе его тепловой денатурации.
Глава 2. Влияние кофилина на тепловую денатурацию актина.
2.1. Эффекты кофилина в насыщающих концентрациях.
2.2. Эффекты кофилина в концентрациях ниже насыщающих. Кооперативная дестабилизация F-актина.
2.3. Влияние стабилизаторов F-актина на тепловую денатурацию его комплексов с кофилином.
2.4. Два противоположных эффекта кофилина на тепловую денатурацию F-актина: обсуждение результатов.
Введение Диссертация по биологии, на тему "Тепловая денатурация актиновых филаментов и влияние на нее актин-связывающего белка кофилина"
Актин является одним из самых распространенных белков в природе. Он присутствует во всех эукариотических клетках, а в последнее время актино-подобные белки были обнаружены и у прокариот. Актин — глобулярный белок с молекулярной массой 42 кДа, который может существовать как в виде мономера (G-актин), так и в виде длинных полярных филаментов (F-актин), образующихся в результате полимеризации G-актина. Актиновые филаменты являются одним из главных компонентов цитоскелета эукариотических клеток, а их взаимодействие с миозином лежит в основе мышечного сокращения и множества иных процессов биологической подвижности. Полимеризация актина (образование филаментов F-актина из мономерного G-актина) представляет собой обратимый динамический процесс, который сопровождается гидролизом АТФ и контролируется множеством актин-связывающих белков. Особое место среди них занимает белок кофилин, способный взаимодействовать как с мономерным G-актином, так и с филаментами F-акгина, вызывая фрагментацию филаментов и значительно повышая скорость их деполимеризации. В последнее время множество работ было посвящено свойствам этого белка - главным образом, его влиянию на структуру актиновых филаментов и на динамику их полимеризации-деполимеризации.
Изучение тепловой денатурации белков позволяет получать новую ценную информацию об их структуре и о тех конформационных перестройках, которые происходят в белках при моделировании процессов их функционирования. Для этого применяется метод дифференциальной сканирующей калориметрии (ДСК), позволяющий подробно изучать процесс тепловой денатурации белка. Этот метод уже давно успешно применяется в нашей лаборатории для структурно-функциональных исследований мышечных белков [Левицкий и др., 1998; Левицкий, 2004]. При этом, однако, до сих пор практически не проводились систематические исследования тепловой денатурации F-актина. Очевидно было лишь то, что это очень сложный процесс, не поддающийся описанию с использованием имеющихся моделей тепловой денатурации белка. Несмотря на значительное количество опубликованных к настоящему времени данных, механизм тепловой денатурации актиновых филаментов до сих пор оставался неизвестным, и требовалось множество дополнительных экспериментов для его изучения. Еще меньше было известно о том, как взаимодействие с различными актин-связывающими белками отражается на тепловой денатурации актиновых филаментов. Именно поэтому главной целью предпринятого нами исследования стало изучение тепловой денатурации F-актина и влияния актин-связывающих белков на этот процесс.
Научная новизна и практическая значимость. Впервые предложен механизм тепловой денатурации F-актина, главной особенностью которого является то, что актиновый филамент не денатурирует целиком как единое целое, как зачастую считалось ранее. Напротив, необратимой тепловой денатурации актиновых субъединиц в филаменте предшествуют, по крайней мере, две обратимые стадии - диссоциация субъединиц с концов актиновых филаментов и высвобождение из них прочно связанной АДФ. Результаты экспериментов, проведенных методом ДСК, впервые позволили выявить два совершенно противоположных эффекта актин-связывающего белка кофилина на тепловую денатурацию F-актина. Показано, что при стехиометрическом связывании (т.е. при полном насыщении актина кофилином) кофилин заметно увеличивает термостабильность как мономерного G-актина, так и филаментов F-актина. Оказалось, однако, что при низких концентрациях кофилин дестабилизирует актиновые филаменты, заметно смещая максимум теплового перехода F-актина в сторону более низких температур. Дестабилизация F-актина кофилином происходит с очень высокой кооперативностью и наблюдается даже при очень низких концентрациях кофилина (при молярном отношении кофилин/актин, равном 1:100 - 1:200). На основании этих данных был сделан вывод о том, что при взаимодействии с актином кофилин стабилизирует те его субъединицы, с которыми он связывается непосредственно, но при этом он с высокой кооперативностью дестабилизирует множество свободных от кофилина соседних субъединиц в актиновом филаменте.
Полученные данные расширяют и углубляют представления о механизмах тепловой денатурации сложных олигомерных белков и их комплексов и могут быть использованы при чтении курсов лекций по биохимии и биофизике. Дестабилизация F-актина кофилином, обнаруженная нами впервые методом ДСК, может играть важную роль в динамике актиновых филаментов в живой клетке, способствуя выполнению кофилином его главных, уже описанных в литературе функций - ускорению деполимеризации актиновых филаментов и их фрагментации. Калориметрические подходы, разработанные при исследованиях комплексов актина с кофилином, могут в дальнейшем успешно использоваться для изучения взаимодействия мономерного G-актина и филаментов F-актина с другими актин-связывающими белками.
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
Актин, один из основных структурных белков клетки, был открыт в 1942 г. как белок мышц, активирующий АТФазную активность миозина, что и определило его название. Актины — это целое семейство высококонсервативных цитоплазматических белков. Они являются структурными белками любых клеток эукариот, в том числе дрожжей и клеток растений. Также были найдены бактериальные гомологи актина: РагМ и МгеВ. Актины принимают участие во множестве клеточных процессов: подвижности одноклеточных и многоклеточных организмов, цитокинезе, секреции, сортировке белков, экспорте матричной РНК, передаче сигнала, дифференцировке и делении клеток [Cossart, 1995; Tirion & ben-Avraham, 1993; Lasa et al., 1998; Lippincott-Schwartz, 1998].-Актиновые филаменты играют ключевую роль в биологической подвижности как существенные партнеры миозиновых "моторных" систем и как главная составная часть цитоскелета.
В клетках актин встречается в виде глобул и фибрилл. Фибриллярный актин (F-актин) представляет собой спиральный полимер, состоящий из мономеров актина (G-актин). В условиях in vitro G-актин спонтанно образует длинные полярные филаменты при добавлении нейтральных солей. Полимеризация G-актина сопровождается гидролизом АТФ с последующим отщеплением неорганического фосфата. В условиях in vivo процесс полимеризации актина обусловлен не только связыванием с нуклеотидом и последующим его гидролизом, но и взаимодействием с огромным количеством актин-связывающих белков, регулирующих динамику актинового ■ филамента. Уникальная физиологическая роль актина во многом обусловлена тем, что между мономерным и полимерным актином существует динамическое равновесие.
1. G-актин
Мономерный актин (G-актин) - глобулярный белок, состоящий из одной полипептидной цепи с молекулярной массой 42 кДа. Большинство актинов содержит 375 аминокислотных остатков, причем на N-конце цепи наблюдается большое количество отрицательно заряженных групп. Эта часть белка является наиболее вариабельной, хотя существуют и другие участки вариабельности. В основном эти участки представляют собой области взаимодействия молекулы с нуклеотидами, с актин-связывающими белками и другими молекулами актина. Клетки высших эукариот содержат шесть изоформ актина (а-скелетномышечный, а-сердечный и а-гладкомышечный, р- и у-цитоплазматические и у-гладкомышечный), отличающихся друг от друга по аминокислотному составу не более чем на 10%. В клетке поддерживается определенное соотношение между разными изоформами актина, которые специфически локализованы в компартментах клетки, выполняют различные задачи и не могут замещать друг друга, не изменяя морфологию и функции клетки [Хайтлина, 2007]. Однако в целом первичная структура молекулы актина имеет высокую степень консервативности, что говорит о многофункциональности данного белка.
Кристаллизация G-актина связана с определенными трудностями в силу того, что повышение концентрации соли в растворе обычно приводит к образованию актиновых филаментов, которое полностью исключает получение кристаллов. Поэтому для кристаллизации необходимо создать условия, в которых бы полимеризация мономерного актина не происходила. Для этого использовались комплексы G-актина с различными актин-связывающими белками (такими как ДНКаза I, гельзолин, профилин) [Kabsch et al., 1990; Mannherz, 1992; Mannherz et al., 1992; Schutt et al., 1993] или с органическими токсинами [Klenchin et al., 2003]. Кроме того, для этой цели использовались препараты G-актина, которые вследствие химических модификаций [Otterbein et al, 2001; Graceffa & Dominguez, 2003; Kudryashov et al., 2005], мутаций [Rould et al., 2006] или специфического ограниченного протеолиза [Klenchin et al., 2006] утрачивали способность к спонтанной полимеризации. Были получены доказательства того, что такие модификации, как и образование комплексов G-актина с актин-связывающими белками, не оказывают существенного влияния на третичную структуру белка [Klenchin et al., 2006].
Рис. 1. Трехмерная структура молекулы актина [Kabsch et al., 1990]. Отмечены первые и последние аминокислотные остатки в а-спиралях и fJ-складках. В вертикальной щели между "большим" (слева) и "малым" (справа) доменами показано положение нуклеотида (АТФ) и двухвалентного катиона (в виде шарика).
Первая кристаллическая структура глобулярного актина, полученная в комплексе G-актина с ДНКазой I, была опубликована в 1990 году [Kabsch et al 1990]. Было показано, что молекула G-актина состоит из двух хорошо различимых доменов (рис. 1). Их принято называть "малым" и "большим" доменами G-актина, хотя различие их по размерам незначительно. Малый домен содержит как N-конед, так и С-конец полипептидной цепи и состоит из участков, ограниченных аминокислотными остатками 1-144 и 338-375, а большой домен образуют аминокислотные остатки с 145 по 337. Это означает, что полипептидная цепь дважды пересекает область между большим и малым доменами [Mannherz, 1992], Тот факт, что домены соединяются только двумя нитями полипептидной цепи, обеспечивает их высокую подвижность друг относительно друга. Именно поэтому данную область называют шарнирным участком молекулы [Tirion & ben-Avraham, 1993]. Домены разделены глубокой щелью, в которой располагаются катион-связывающий и нуклеотид-связывающий центры. Как правило, молекула актина содержит прочно связанную АТФ (или АДФ), которая может свободно обмениваться с нуклеотидом в растворе или замещаться другими нуклеотидами, и двухвалентный катион (Са2+ или Mg2+).
Каждый из доменов G-актина в свою очередь подразделяют на два субдомена: "малый" домен состоит из субдоменов 1 и 2, а "большой" - из субдоменов 3 и 4. В субдомене 2 расположена так называемая «ДНКаза I-связывающая петля» (в литературе часто можно встретить и другие ее названия: «ДНКазная петля» или «D-петля»), играющая важную роль в образовании актипового филамента. В частности, в результате расщепления G-актина бактериальной протеазой ЕСР32 в единственном месте - между аминокислотными остатками Gly42 и Val43, расположенными на этой петле, содержащий ион Са2+ G -актин утрачивает в обычных условиях способность к полимеризации, индуцируемой добавлением нейтральных солей [Khaitlina et al, 1993; Klenchin et al, 2006].
Следует отметить, что существует целое суперсемейство актино-подобпых белков, называемых еще белками-АТФазами, так как все они содержат АТФ-связывающий участок. Кроме актинов, в него входят белок теплового шока Hsp70, гексокиназа, Агр и прокариотические актино-подобные белки МгеВ и РагМ. Все белки данного семейства состоят из двух больших доменов, соединенных между собой шарнирным участком, а в щели между доменами располагается нуклеотид-связывающий сайт. Несмотря на значительные различия первичных структур, третичные структуры таких белков-АТФаз обладают заметным сходством, особенно в области нуклеотид-связывающего сайта. Предполагается, что подобное сходство обусловлено тем, что эти белки используют один и тот же механизм гидролиза АТФ и освобождения продуктов реакции, хотя и для осуществления совершенно различных процессов, происходящих в клетках [Flaherty et al., 1991]. Структуры белков этого семейства, содержащих связанный нуклеотид (АТФ или АДФ), характеризуются закрытым состоянием междоменной щели, в то время как для белков без нуклеотида щель остается открытой. Подробные исследования гексокиназы показали, что наиболее заметные конформационные изменения в структуре молекулы белка вызывает переход между открытым и закрытым состоянием нуклеотид-связывающей щели. Поэтому, на основании сходства третичных структур, можно предположить, что подобное утверждение будет справедливым и для других представителей данного суперсемейства, в частности и для G-актина [Reisler & Egelman, 2007].
К настоящему времени опубликовано около 25 кристаллических структур G-актина, но лишь для одной из них (комплекс G-актина с профилином [Chik et al1996]) нуклеотид-связывающая щель показана в открытом состоянии. Актин, закристаллизованный в комплексе с профилином, заметно отличается от остальных кристаллических структур, имеющих сходные конформации. Переход между открытым и закрытым состоянием щели сопровождается вращением большого домена относительно малого на -9,6°, а также поворотом субдомена 2. При этом субдомены 1 и 2 ведут себя как две независимые единицы. Помимо этого, происходят локальные конформационные изменения в гидрофобном кармане, окружающем цистеин 374, на N-конце и в области ДНКаза1-связывающей петли [Chik et al., 1996]. Существует предположение, что нуклеотид-связывающая щель в молекуле G-актина должна быть в действительности закрыта намного сильнее, чем это наблюдается в большинстве известных к настоящему времени кристаллических структур. Это, по-видимому, связано с тем, что необходимые для кристаллизации актип-связывающие белки, токсины или химические вещества препятствуют не только полимеризации G-актина, но и вращению большого домена и/или субдомена 2, связываясь непосредственно в области между доменами, в нуклеотид-связывающей щели или с субдоменами 2 и 4. В результате не происходит достаточного сближения субдомена 2 и субдомена 4, и нуклеотид-связывающая щель закрывается не полностью [Takamoto et al., 2007].
Ведется множество споров о том, может ли открытие щели быть связано с заменой связанного нуклеотида с АТФ на АДФ, и происходят ли при этом другие конформационные изменения в субъединицах актина. Анализируя огромное количество данных по регуляции динамики актинового филамента посредством гидролиза АТФ и отщепления фосфата, а также данных по взаимодействию с актии-связывающими белками, можно прийти к выводу, что определенные изменения в структуре молекулы актина происходить должны [Reisler & Egelman, 2007]. Несмотря на это, при сравнении кристаллических структур АТФ-G-aKTHHa и АДФ-в-актина не было обнаружено значительных конформационных перестроек или смещения доменов друг относительно друга. Некоторые изменения структуры наблюдались в области связывания у-фосфата АТФ, а также петли, содержащей His-73, и субдомена 2. Существуют ли различия в области ДНКаза I-связывающей петли, в настоящее время достоверно неизвестно. Возможно, структура этой петли не является строго организованной [Rould et al., 2006]; имеются, однако, данные о том, что ДНКазная петля дезорганизована только в АТФ-содержащем актине, а в случае АДФ-актина она представляет собой достаточно стабильную а-спираль [Graceffa & Dominguez, 2003].
Все эти изменения носят, однако, локальный характер, и кристаллические структуры АТФ-G-aKTHHa и АДФ-G-aKTHiia практически не отличаются. В то же время данные, полученные при исследованиях поведения белка в растворе, свидетельствуют о заметной разнице между актинами, содержащими АТФ или АДФ. Это может объясняться тем, что в процессе кристаллизации белка происходит закрытие междоменной щели в G-актине, тогда как для актина, находящегося в растворе, щель открыта из-за наличия связанного в ней нуклеотида. Таким образом, исследования кристаллической структуры G-актина демонстрируют явные противоречия между наблюдаемыми структурами и реальной структурой незакристаллизованного белка [Reisler & Egelman, 2007].
Что касается двухвалентных катионов, связывающихся с G-актином в области щели, то исследования показали, что ион Mg2+ (в природном актине) или Са2+ (на который замещается Mg2+ в процессе выделения) сначала связывается с молекулой АТФ и лишь затем - с актином, образуя тройной комплекс. Нуклеотид-связывающая щель между субдоменами 2 и 4 в случае Mg-АТФ-актина находится в более закрытом состоянии, чем в случае Са-АТФ-актина [Takamoto et al., 2007]. Комплекс Са-АТФ связывается с актином в 3-5 раз сильнее, чем комплекс Mg-АТФ. Так же, как и нуклеотид, связанный катион может обмениваться со средой, хотя диссоциация происходит достаточно медленно. Кроме того, молекула актина имеет еще 5-9 центров связывания ионов Са2+, Mg2+, К+ и др., однако сродство этих центров к ионам металла на несколько порядков ниже, чем в комплексе с нуклеотидами, имеющих сродство 109М"'. Связывание ионов с низкоафинными сайтами приводит к активации одного из самых важных процессов - полимеризации мономерного глобулярного актина с образованием нитей полимерного F-актина [Carlier, 1991]. К такой полимеризации способен как АТФ-О-актин, так и АДФ-О-актин, а в определенных условиях - даже G-актин, вообще не содержащий нуклеотида и являющийся крайне нестабильным в этом состоянии. Однако полимеризация таких актинов происходит с разными скоростями и при различных критических концентрациях белка, необходимых для начала полимеризации.
Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Михайлова, Валерия Вадимовна
выводы
1. При исследованиях тепловой денатурации филаментов актина (F-актина) методом дифференциальной сканирующей калориметрии (ДСК) показано, что термостабильность F-актина существенно возрастает с увеличением концентрации белка, а также при увеличении концентрации добавленного нуклеотида (АДФ). Эффект АДФ является высокоспецифичным, поскольку он не проявляется в присутствии других нуклеозиддифосфатов.
2. На основании полученных данных предложен новый «диссоциативный» механизм тепловой денатурации F-актина, согласно которому необратимой стадии денатурации (и последующей агрегации) белка предшествуют как минимум две обратимые стадии — диссоциация коротких олигомеров с концов актиновых филаментов и высвобождение нуклеотида (АДФ) из нуклеотид-связывающих центров субъединиц актина.
3. С помощью метода ДСК впервые выявлены два противоположных эффекта актин-связывающего белка кофилина на тепловую денатурацию F-актина: стабилизация (увеличение термостабилыюсти) актиновых филаментов при насыщающих концентрациях кофилина и дестабилизация (значительное снижение термостабильности) филаментов при низких концентрациях кофилина, недостаточных для полного насыщения всех актиновых субъединиц в филаменте.
4. Показано, что дестабилизация актиновых филаментов имеет место даже при очень низких концентрациях кофилина, когда на 100-200 актиновых субъединиц приходится одна молекула кофилина. Предполагается, что при взаимодействии с F-актином кофилин стабилизирует только те субъединицы актина, с которыми он непосредственно связывается, но дестабилизирует множество свободных от кофилина соседних субъединиц в актиновом филаменте.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
В заключение, подведем главные итоги проведенных исследований. Во-первых, предложен новый «диссоциативный» механизм тепловой денатурации F-актина, главной особенностью которого является то, что необратимой тепловой денатурации F-актина предшествуют, по крайней мере, две обратимые стадии - высвобождение прочно связанной АДФ из субъединиц актина и отщепление коротких олигомеров актина с концов актиновых филаментов. Во-вторых, применение метода ДСК впервые позволило выявить два совершенно противоположных эффекта актин-связывающего белка кофилина на тепловую денатурацию F-актина, а именно стабилизацию актиновых филаментов при насыщающих концентрациях кофилина и сильную дестабилизацию филаментов при низких концентрациях кофилина, недостаточных для полного насыщения кофилином всех актиновых субъединиц в филаменте. Завершая анализ полученных результатов, попробуем объединить их воедино и объяснить эффекты кофилина в свете «диссоциативного» механизма тепловой денатурации F-актина.
Стабилизация и дестабилизация F-актина кофилином в свете «диссоциативного» механизма тепловой денатурации актиновых филаментов.
Тепловая денатурация F-актина представляет собой достаточно сложный процесс, поэтому обнаруженные нами эффекты кофилина не могут быть объяснены существующими в настоящее время моделями, применяемыми для описания процесса тепловой денатурации взаимодействующих друг с другом белков. Что касается стабилизирующего эффекта кофилина, то здесь хотя бы приблизительно можно опираться на модели прочных белок-белковых взаимодействий [Brands & Lin, 1990] или прочного связывания лигандов, стабилизирующих нативное состояние белка [Cooper et al., 2000]. Однако не существует модели, которая могла бы объяснить кооперативный эффект дестабилизации актинового филамента кофилином в ненасыщающей концентрации. Действительно, если предположить, что актиновый филамент денатурирует как единое целое, очень трудно представить, каким образом дестабилизированные кофилином субъединицы, денатурирующие при низкой температуре, могут оказывать влияние на тепловую денатурацию других субъединиц в филаменте, свободных от кофилина и денатурирующих при более высокой температуре. Нам удалось объяснить эти эффекты кофилина на тепловую денатурацию F-актина, исходя из предложенного «диссоциативного» механизма тепловой денатурации актинового филамента. Напомним, что одним из важнейших постулатов этого механизма является существование как минимум двух обратимых стадий, предшествующих необратимой денатурации F-актина, причем одной их этих стадий является обратимое отщепление коротких олигомеров актина от «минус»-конца актинового филамента. В свете этого «диссоциативного» механизма эффекты стабилизации и дестабилизации F-актина при связывании его с кофилином можно объяснить следующим образом.
В ходе тепловой денатурации полностью декорированного кофилином актинового филамента насыщенные кофилином короткие олигомеры актина диссоциируют от филамента и, как и в случае стабилизированного кофилином мономерного G-актина, подвергаются необратимой денатурации, демонстрируя высокотемпературный тепловой переход на термограмме F-актина. При концентрациях кофилина, недостаточных для полного насыщения актинового филамента, кофилин связывается лишь с некоторыми субъединицами, что приводит к определенным конформационным изменениям в свободных от кофилина субъединицах актина. Мы предполагаем, что, отрываясь от филамента, такие субъединицы будут в течение некоторого времени «помнить» свое измененное конформационное состояние. Вследствие подобной «конформационной памяти», не связанные с кофилином субъединицы сохраняют приобретенную конформацию, которая характеризуется пониженной термостабильностью, что на термограмме F-актина отражается в виде появления низкотемпературного теплового перехода (рис. 21). Таким образом, мы предполагаем, что не связанные с кофилином дестабилизированные субъединицы актина после их диссоциации от филамента не успевают принять нормальную конформацию и быстро денатурируют, находясь в измененном конформациоином состоянии.
Предложенный механизм предполагает, что температурно-зависимое отщепление коротких олигомеров от актинового филамента происходит при температурах меньших, чем температура денатурации. Также представляется вполне вероятным, что связывание с кофилином (в особенности при его ненасыщающих концентрациях) снижает температуру, при которой происходит диссоциация олигомеров. С последним утверждением хорошо коррелируют данные литературы, подтверждающие способность кофилина ускорять диссоциацию актиновых субъединиц с «минус»-концов актиновых филаментов [Carlier et al., 1997; Carlier & Pantaloni, 1997; Carlier et al., 1999]. Следовательно, если короткие олигомеры актина отщепляются от частично декорированного кофилином актинового филамента при относительно низкой температуре (например, при ~55°С), то субъединицы актина, находящиеся в измененном конформациоином состоянии, подвергаются быстрой денатурации, в то время как стабилизированные кофилином субъединицы денатурируют при температурах 63-65°С. Важно отметить тот факт, что температура максимума теплового перехода (Тмакс) стабилизированных актиновых субъединиц смещается в сторону более высоких температур при увеличении молярного соотношения кофилин/актин (таблица 1). Данный эффект может быть частично объяснен с помощью модели, описывающей стабилизацию белка, происходящую при связывании лиганда (в данном случае кофилина) с нативной формой данного белка [Cooper et al., 2000]. Несмотря на то, что эта модель была предложена для обратимо денатурирующих белков, она также может быть применена и для белков, разворачивающихся необратимо. Данная модель предполагает, что индуцируемое лигандом уменьшение скорости денатурации может происходить в том случае, когда связывание лиганда с нативным белком сильнее, нежели его связывание с белком в переходном конформациоином состоянии. По-видимому, данное утверждение справедливо и для отщепляющихся от филамента актиновых субъединиц, связанных с кофилином. Именно таким образом мы можем объяснить, почему Тмакс пика стабилизированного актина возрастает при увеличении концентрации кофилина.
Конформационные изменения распространяются вдоль филамента иа значительные расстояния от стабилизированных кофилином субъединиц к субъединицам, свободным от кофилина. Очевидно, что при малых концентрациях кофилина данные изменения ослабевают при увеличении расстояния между стабилизированными субъединицами, непосредственно связанными с кофилином. Именно этим можно объяснить то, что индуцируемая кофилином дестабилизация наиболее заметна при концентрациях кофилина от 2 до 16 мкМ (рис. 21, таблица 1). В том случае, когда стабилизированных кофилином субъединиц актина достаточно много, а, следовательно, и расположены они относительно недалеко друг от друга, тогда и свободные от кофилина субъединицы располагаются достаточно близко к стабилизированным субъединицам, а происходящие в них конформационные изменения наиболее заметны. При диссоциации от филамента короткие олигомеры актина содержат субъединицы, которые «запомнили» значительные конформационные изменения, что приводит к снижению термостабильности белка и его необратимой денатурации при существенно меньшей температуре по сравнению с нативным актином.
При обсуждении модели, объясняющей стабилизирующий и дестабилизирующий эффекты кофилина на тепловую денатурацию актинового филамента с помощью предложенного нами «диссоциативного» механизма, нельзя не отметить недавно опубликованную статью Бобкова с соавторами [Bobkov et al., 2006]. В своей работе они повторили наши эксперименты по изучению термостабильности актинового филамента в присутствии насыщающих и ненасыщающих концентраций кофилина и получили практически такие же результаты. Сходные результаты были получены этими авторами и при использовании F-актина, в котором остатки Gln-41 и Cys-374 соседних в продольном направлении протомеров (вдоль оси филамента) были ковалентно сшиты друг с другом бифункциональным реагентом 7У-(4-азидо-2-нитрофенил) путресцином (ANP). По мнению авторов, такая сшивка исключала отщепление мономеров или коротких олигомеров от актинового филамента в процессе его тепловой денатурации. Было показано, что сшитый ANP F-актин демонстрирует большую термостабильность по сравнению с нативным белком (кривая теплопоглощения смещалась на 3,2°С в сторону более высоких температур). При добавлении кофилина в насыщающих концентрациях термостабильность такого сшитого ANP F-актина увеличивалась на ~6°С, а в присутствии кофилина в ненасыщающих концентрациях на термограмме F-актина одновременно обнаруживались, как и в нашем случае, два тепловых перехода с температурами максимумов на 5°С ниже и на б°С выше температуры максимума сшитого F-актина в отсутствие кофилина [Bobkov et al., 2006]. Таким образом, представленные в этой статье результаты калориметрических экспериментов хорошо коррелируют с нашими данными, за исключением того, что получены они были на F-актине, протомеры которого были продольно сшиты между собой. Опираясь на то, что в сшитом ANP F-актине ингибирована, по-видимому, диссоциация субъединиц от актинового филамента, А.А. Бобков с соавторами утверждают несостоятельность предложенной нами модели. Мы, однако, считаем, что двойственный эффект, оказываемый малыми концентрациями кофилина на термостабильность F-актина, невозможно объяснить иначе, как фрагментацией актинового филамента, предшествующей его необратимой денатурации. По указанным выше причинам нам представляется крайне маловероятной возможность плавления дестабилизированных кофилином субъединиц актина в составе длинного филамента. Поэтому мы предполагаем, что фрагментация актинового филамента имеет место, и олигомеры, содержащие стабилизированные или дестабилизированные субъединицы актина, отщепляются от филамента и плавятся раздельно. Что касается ковалентной сшивки актиновых протомеров, то вряд ли ANP обеспечивает 100-процентное связывание всех субъединиц в филаменте, и разрыв нити F-актина происходит, по-видимому, в местах отсутствия ковалентной сшивки. Возможно, влияние сшивки ANP на процесс тепловой денатурации актиновых филаментов в присутствии кофилина было бы более заметным при меньших молярных отношениях кофилина к актину, чем те, которые представлены в этой статье (1:2). Кроме того, подобная сшивка филамента должна отразиться на зависимости температуры максимума теплового перехода от концентрации актина. К сожалению, авторы не приводят соответствующих данных.
Таким образом, предложенный «диссоциативный» механизм тепловой денатурации актиновых филаментов может, с некоторыми допущениями, объяснить два столь противоположных эффекта, оказываемых кофилином на процесс тепловой денатурации F-актина.
Так или иначе, стабилизирующий и дестабилизирующий эффекты кофилина являются, по-видимому, очень важными для жизнедеятельности клетки. Дестабилизация F-актина кофилином может играть важную роль в динамике цитоскелета, способствуя выполнению кофилином его главных, уже описанных в литературе функций — ускорению деполимеризации актиновых филаментов и их фрагментации. Имеются данные о том, что кофилин локализован главным образом вблизи клеточной мембраны и его гораздо меньше в центре клетки [dos Remedios et al., 2003]. При этом концентрация кофилина в клетке (~20 мкМ) [Koffer et al., 1988] существенно ниже концентрации актина (-65 мкМ) [dos Remedios et al., 2003]. Следовательно, вблизи мембраны актиновые филаменты будут практически полностью декорированы кофилином и стабилизированы им, тогда как по мере удаления от мембраны к центру клетки все меньше и меньше молекул кофилина будет связано с F-актином. Исходя из наших данных, можно предположить, что актиновые филаменты в центре клетки будут нестабильны, что приведет к их фрагментации и образованию большого количества небольших олигомеров или даже мономеров, которые вновь смогут полимеризоваться в насыщенных кофилином областях клетки вблизи мембраны. Таким образом, как стабилизирующий, так и дестабилизирующий эффекты кофилина, обнаруженные нами впервые методом ДСК, могут играть важную роль в динамике актинового цитоскелета в живых клетках.
Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Михайлова, Валерия Вадимовна, Москва
1. Кремнева Е.В., Николаева О.П., Гусев Н.Б., Левицкий Д.И. (2003) Влияниетропонина на тепловую денатурацию связанного с актином тропомиозина. Биохимия, 68, 976-984.
2. Левицкий Д.И., Хайтлина С.Ю., Гусев Н.Б. (1995) Белки актомиозиновой системыподвижности. В кн.: «Белки и пептиды» (ред. Иванов В.Т., Липкин В.М.), М., «Наука», 1995, с. 249-293.
3. Левицкий Д.И., Николаева О.П., Орлов В.Н., Павлов Д.А., Пономарев М.А.,
4. Росткова Е.В. (1998) Дифференциальная сканирующая калориметрия миозина и актина. Биохимия, 63, 381—394.
5. Левицкий Д.И. (2004) Применение метода дифференциальной сканирующейкалориметрии для структурно-функциональных исследований мышечных белков. Успехи биол. химии, 44, 133—170.
6. Остерман Л.А. (1981) Методы исследования белков и нуклеиновых кислот.
7. Электрофорез и ультрацентрифугирование. М. Наука.
8. Панасенко О.О., Ким М.В., Гусев Н.Б. (2003) Структура и свойства малых белковтеплового шока. Успехи биол. химии, 43, 59—98.
9. Татунашвили Л.В., Привалов П.Л (1984) Калориметрическое исследованиеденатурации G-актина. Биофизика, 29, 583-585.
10. Хайтлина С.Ю. (2007) Механизмы сегрегации изоформ актина в клетке.1. Цитология, 49, 345-354.
11. Andrianantoandro Е., Blanchain L., Sept D., McCammon J.A. and Pollard T.D. (2001)
12. Kinetic mechanism of end-to-end annealing of actin filaments. J. Mol. Biol., 312, 721-730.
13. Andrianantoandro E. and Pollard T.D. (2006) Mechanism of actin filament turnover bysevering and nucleation at different concentrations of ADF/cofilin. Mol. Cell, 24, 13-23.12.
-
Михайлова, Валерия Вадимовна
-
кандидата биологических наук
-
Москва, 2008
-
ВАК 03.00.04
- Тепловая денатурация различных изоформ тропомиозина в отсутствие и в присутствии F-актина
- Изучение роли щелочных легких цепей миозина в быстрых скелетных мышцах кролика
- Участие альфа-актинина 4 в регуляции экспрессии генов и контроле сплайсинга мРНК
- Влияние малых белков теплового шока на тепловую агрегацию F-актина
- Взаимодействие малого белка теплового шока HSPB6 с универсальным адаптерным белком 14-3-3
