Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Температурные и генотипические особенности содержания стрессового белка 310 кД в клетках озимых злаков

ВАК РФ 03.00.12, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "Температурные и генотипические особенности содержания стрессового белка 310 кД в клетках озимых злаков"

2 Ц ФЕВ А997

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК СИБИРСКОЕ ОТДЕЛЕНИЕ

СИБИРСКИЙ ИНСТИТУТ ФИЗИОЛОГИИ И БИОХИМИИ РАСТЕНИЙ

На правах рукописи УДК 581.19:577.42

Колесниченко Алексей Викторович

ТЕМПЕРАТУРНЫЕ И ГЕНОТИПИЧЕСКНЕ ОСОБЕННОСТИ СОДЕРЖАНИЯ СТРЕССОВОГО БЕЛКА 310 кД В КЛЕТКАХ ОЗИМЫХ ЗЛАКОВ

03.00.12 - физиология растений

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Иркутск. 1997

Работа выполнена в лаборатории физиологической генетики Сибирского института физиологии и биохимии растений Сибирского отделения РАН. Иркутск

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор В.К. Войников

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

О.П. Родченко

доктор биологических наук. Н.И. Рекославская

Ведущая организация: Иркутский государственный

университет

Защита диссертации состоится "19" марта 1997 г. в час. на заседании диссертационного совета К.003.25.01. по защитам кандидатских диссертаций при Сибирском институте физиологии и биохимии растений СО РАН по адресу: 664033. Иркутск, ул. Лермонтова. 132. а/я 1243

С диссертацией мохно ознакомиться в библиотеке Сибирского института физиологии и биохимии растений СО РАН

Автореферат разослан " 3 " февраля 1997 г.

Ученый секретарь диссертационного совета л

кандидат биологических наук О/г/сим д-ц. Акимова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Изучение фнзиолого-бнохимических механизмов зимостойкости, морозо- и холодоустойчивости культурных растений имеет чрезвычайно больное значение в связи с необходимостью преодолеть низкотемпературные ограничения для возделывания ряда ценных в хозяйственной отношении видов и сортов растений. Даже небольшие генетические и физиологические изменения устойчивости имеют огромное хозяйственное значение.

Среди механизмов адаптации растений к неблагоприятной температуре особое место занимает так называемый "ответ на температурный стресс", обеспечивающий синтез ряда стрессовых белков в ответ на изменение температуры (Lindquist. 1986). Достаточна хоропза изучены изменения экспрессии генов в ответ на повышение температуры, приводящие к индукции синтеза белков теплового шока.

За более чем столетний период изучения действия низких температур на метаболизм растительных клеток было накоплено много данных о действии низких теиператур на содержание и состав лнпидов и Сахаров (Левитт. 1983). Однако только в последние годы получены данные, свидетельствуйте о том, что воздействие низкотемпературного стресса вызывает в растениях синтез специфических, стрессовых, белков (Войннков и др.. 1987). часто называемых белками холодового пока - БХВ (Сиу. 1990). Предполагается, что синтез этих белков играет вадаун роль в приобретении растением устойчивости к действия неблагоприятного температурного фактора. В то же время мало что известно о структуре н функциях этих стрессовых белкл?. -стл и ьмилтся предполагать, что они играют защитнув и ферментативную роль и влияют на структуру и свойства мембран.

Цельи задачи^ исследования., Цельи данной работы было изучение при помогли иммунохнкических методов влияния гипотермии на содержание стрессовых белков в растениях озимых злаков, выделение одного из этих белков, изучение его характеристик и некоторых функций. Для достижения этой цели было необходимо реиить следующие задачи:

1. Используя мкмунохмкнческнй методы исследования, изучить качественные ¡и количественные изменения в спектре стрес-

совых белков в клетках контрастных по морозоустойчивости озимых злаков при гипотермии. Выявить белки, содержание которых в клетках злаков значительно увеличивается при гипотермии:

2. Выделить, очистить и охарактеризовать один из этих белков. Получить на него специфическую антисыворотку;

3. С поморю специфической сыворотки изучить изменения в содержании этого белка в клетках озимых злаков под действием гипотермии различной длительности и интенсивности;

4. С помощь» специфической сыворотоки изучить генотипи-ческне особенности содержания этого белка в тканях различающихся по холодоустойчивости озимых злаков.

Научная новизна. Установлено, что гипотермия вызывает в клетках озимых злаков количественные изменения в содержании стрессовых белков, выявляемые с помощь» иммунохимических методов. Впервые один из стрессовых белков озимой ржи и пшеницы, имеющий при иммуноэлектрофорезе в агарозе ЯГ 0.35 и 0.30 соответственно. выделен в нммунохимически чистом виде. Этот белок имеет молекулярную массу 310 кД. состоит из двух типов субъединиц (56 и 66 кД). и обозначен как БХШ 310 (белок холадового пока с молекулярной массой 310 кД). Установлено, что при гипотермии содержание ЬХШ 310 в проростках морозоустойчивых сортов озимой пшеницы резко увеличивается за счет индукции синтеза белка, а в 1-ой и 6-ой хромосомах й-генома морозоустойчивой озимой пшеницы локализованы гены, контролирующие синтез БХШ 310. БХШ 310 обнаружен в митохондриях морозоустойчивой озимой пшеницы. - где он выполняет функцию "разобщающего" белка, вызывая переход органелл в низкоэнергетическое состояние, являясь посредником в ядерном контроле за энергетическими функциями митохондрий при кратковременной гипотермии.

Научная и практическая ценность работы. Настоящая работа направлена На изучение роли м места стрессовых белков в устойчивости озимых злаков при гипотермии. Охарактеризован один из стрессовых белков, синтезирующийся под действием гипотермии, определена его молекулярная масса, субъединичный состав, локализация контролирующих его синтез генов и некоторые его функции.

Разработан и защищен авторским свидетельством способ определения морозоустойчивости сортов озимой пшеницы, основанный

ил определении уровня конститутивного синтеза стрессового белка на ранних стадиях онтогенеза.

Публикации и апробация работы. По материалам диссертации опубликовано 5 работ. 1 работа находится в печати, результаты исследований по теме диссертации были доложены и обсуждены на 3 Всесоюзной конференции молодых ученых по физиологии растительной клетки (Петрозаводск. 1988). научной сессии Сибирского института физиологии и биохимии растений С 1996 г.). на 2 съезде Всероссийского общества физиологов растений (Минск, 1990), на ежегодном симпозиуме ВОФР (Пенза. 1996).

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, методической части, изложения экспериментального материала и его обсуждения, заключения, выводов н библиографии, вклмчаящей 138 наименований, из них VI на русском языке: работа излодена на 144 страницах машинописного текста, содержит 6 таблиц и 22 рисунка.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В работе использовали трехсуточные этиолированные проростки озимой ржи (5еса1е сегеа1е Ь.. сорт Чулпан). озимой пшеницы (ТгШсша аезНуига Ь.. сорта: Безостая 1. Альбидун 114. Альбидун 24. Ульяновка. Заларинка. генотипы 11, В, Д I, 460Г и линии сорта Безостая 1 с замещениями хромосом Ш. 60. 1А и 6А из генома пшеницы сорта Альбидун 114). Кроме того, в работе использовали одномесячные растения озимой пшеницы (Тг1-11 сит аезНуш* Ь.. сорт Ульяновка). выраженные в сосудах с почвой в условиях естественного освещения в ниле (условия длинного дня).

Трехсуточные этиолированные проростки озимой пшеницы и озимой ржи подвергали низкотемпературному стрессу: 1) в течение одного часа при +3. О, -3. -7. -10°С: 2) в течение 7 суток при »4°С. В опытах использовали радиоактивнуи метку (,4С-лей-цин).

Подсушивание трехсуточных этиолированных проростков проводили в термостате при 26°С в течении 4 часов или одних суток. Определение содержания ..оды в проростках проводили, высушивая их в термостате при 105°С до постоянного веса.

Для выделения белка использовали срезанные побеги трехсуточных проростков и узлы кущения одномесячных растений. Белок определяли по методу Гринберга и Крэддока (1982).

Для разделения белковых фракций, осажденных различными концентрациями сульфата аммония, был применен метод колоночной гель - фильтрации (Остерман, 1985). Для препаративной наработки белковых фракций был использован сефадекс С 100 фирмы "Pharmacia", Швеция.

Для определения антигенов в белковом препарате использовали реакцию двойной иммунодиффузии в геле по Ухтерлони (Остерман. 1983). Для сравнения нескольких белковых систем применялся метод "квадратов" по Абелеву (Абелев, 1969). Иммуноэ-лектрофорез белков проводили по Грабар и Уильяме (Остерман. 1983). Перекрестный иммуноэлектрофорез проводили по Лореллу в модификации Кларка и Фримена с незначительными изменениями (Остерман, 1983). Рокет- иммуноэлектрофорез проводили в агаро-зе по Лореллу (Остерман. 1983).

Электрофорез в ПААГ нативного белка проводили в блоках полиакриламидного геля по Андерсон. Борг и Микаэльсон (1972). Электрофорез в ПААГ с ДДС-Na проводили в блоках полиакриламидного геля в модифицированной системе Лэммли (Laemli, 1970). используя прибор для электрофореза Mini-PROTEAN II Electropho-retic Cell фирмы BIO-RAD (США).

Митохондрии выделяли из срезанных побегов озимой пшеницы с помощью дифференциального центрифугирования по ранее описанному методу (Войников и др.. 1991). Очистку проводили с помощью перколла (21%) (Войников и др.. 1991). Определение активности митохондрий проводили при помощи платинового электрода закрытого типа на полярографе LP-60 (ЧССР).

Повторность экспериментов не менее чем трехкратная. Полученные результаты обработаны статистически: рассчитаны средние арифметические величины и ошибки средних (Лакин. 1973), в необходимых случаях использовали метод Фишера (Плохинский. 1961).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Иммунохкмическое сравнение белков неохлажденных растений озимых злаков и растений, подвергнутых действии гипотермии.

На первом этапе исследований была предпринята попытка выявить качественные изменения в наборе белков после часовой гипотермии озимой ржи (сорт Чулпан) и холодостойкой пшеницы (сорт Альбидум 24). Двойная диффузия по системе "квадратов" Абелева показала, что весь набор антигенов охлажденных растений преципитируется в перекрестной реакции с антителами на белки "контрольных" растений, как у ржи. так и у пшеницы. В то же время использование перекрестного иммуноэлектрофореза в агарозе позволило выявить существенные различия в содержании антигенов с ИГ 0.35 (0.30) у охлажденных и неохлажденных растений озимой ржи и пшеницы. В частности, охлаждение растений привело к значительному увеличения площадей пиков преципитации антигенов ИГ 0.35 у озимой ржи и 0.30 у пяеницы.

2. Возрастные изменения в содержании антигена с 1?Г 0.30 у незакаленных растений озимой пшеницы.

При исследовании возрастных изменений в содержании интересующих нас антигенов ржи с РГ 0.35 и пшеницы с 1(Г 0.30 было установлено, что содержание этих антигенов, относительно ясское у трехсуточных п"орсст;:с5 озимой ржи и озимой пшеницы, снижается с возрастом и у одномесячных незакаленных растений падает до очень низкого уровня. Это позволило разработать тест для определения наличия антигена с ЯГ 0.35 (у пшеницы - 0.30) при фракционировании белков пшеницы и ржи.

3. Выделение, очистка и определение характеристик антигена с НГ 0.35 из проростков озимой ржи.

Для определения характеристик антигена с 0.35 необходимо было выделить этот белок в иммунохимически чистом виде.

На первой стадии очистки белки трехсуточных проростков

озимой ржи фракционировали сульфатом аммония. Было установлено. что антиген выпадает в осадок при насыщении раствора сульфатом аммония от 30 до 50 X. При этом также выпадают в осадок ряд других белков. На второй стадии очистки фракция белков, выпадающих в осадок при насыщении раствора сульфатом аммония 30-50Х, разделяли на колонке с сефадексом С100 на ряд пиков. При помощи теста на наличие во фракции антигена с 1?Г 0.35 было установлено, что интересующий нас антиген выходит в первом пике в иммунохимическн чистом виде.

После препаративной наработки часть белка была использована для установления его молекулярной массы. Электрофорез в ПААГе нативного белка позволил определить молекулярную массу белка с ЯГ 0.35 из проростков озимой ржи (рис.1). Она оказалась равна 310 кД. При электрофорезе в присутствии ДДС-На в ПААГ этого белка было выявлено два типа субъединиц с молекулярными массами 66 и 56 кД (рис.2).

Большая часть очищенного белка проростков ржи с молекулярной массой 310 кД была использована для получения узкой сыворотки на этот антиген.

4. Влияние белка с молекулярной массой 310 кД на функционирование митохондрий в условиях гипотермии.

Митохондрии выделяли из срезанных побегов озимой пшеницы и использовали для двух це-

А Б

Рис.1 Электрофореграмма антигена из проростков озимой ржи С Я. 0.35. А- анализируемый белок, Б- белки- маркеры.

94

67

43

20

Рис.2 Электрофорез о ПААГ с ДДС-Na полипептидов БХШ 310. А- анализируемый белок; Б- белки- маркеры.

О) (7)

Рис.3 Двойная иммунодиффу-зия о агарозном геле анти-сьшоротки на БХШ 310 и ми-тохондрнальных белкоо.

1 - белки, выделенные из митохондрий озимой пшеницы:

2 - иммунная сыворотка на белок 310 кД.

лей: для экстракции из них белков и для анализа энергетической активности.

Очистку митохондрий проводили с помощь» перколла (21Х). Из очищенных митохондрий экстрагировали белки, как описано ранее (Боровский. Войников. 1993). Выделенный митохондри-альный белок использовали для анализа методом двойной иммуно-диффузии в геле по Ухтерлони (Остерман. 1983). При реакции сыворотки на БХШ 310 с мито-хондриальными белками образовывалась четкая линия преципитации. говорящая о наличии этого антигена в белках митохондрий (рис.3).

Результаты, полученные в эксперименте по двойной икмуно-диффузии. послужили основанием для изучения влияния белка с молекулярной массой 310 кД на энергетическую активность изолированных митохондрий при гипотермии. Оказалось, что инку-ir< vitro хорошо сопряженных митохондрий пшеницы со стрессовым белком в условиях гипотермии (0е С) в течение 90 минут индуцирует в органеллах переход в низкоэнергетическое состояние. В присутствии этого белка в митохондриях увеличивалось нефосфорилирувщее (состояние 4) дыхание (рис.О и снижался дыхательный контроль по

«J 5С че: о о

CUD О

с; и и г

S4 X г

X

о г

54

X ...

о о в

О Л

с; (— о О 2

t= х

60 -л

40 -

20

0

-пЧансу-Вильяису. что I свидетельствовало о !снижении сопряженности I окисления и фосфорили-1рования. Бычий сыворо-I точный альбумин, ис-

пользованный в эксперименте в качестве дополнительного контроля, в 1этих же условиях не вы-

Рис. 4 нмюсфорилирувцсс дыхание'зывал "ePex°* «итохонд-(состояние 4) митохондрий озимой пшс-1 ркй в низкоэнергетичес-ницы после их инкубации in vitro С|КОР гпгтпянир Ппгкплк-БХШ 310 в условиях гипотермии (ОС) в, состояние- "осколь течение 90 минут. 1ку этот переход приво-

1 - Без добавления БХШ 310 или БСА; im,T * тргшлгрнр-iv и гр-

2 - в присутствии БХШ 310 (1 мг на 3 к термогенезу и ге мг митохондриального белка); 1нетически контролирует-

3 - в присутствии БСА (1 мг на 3 мг|гя /ппйникпй 1ЧА7) тп митохондриального белка). 1ся <воиников- 1уап- то

-'обосновано заключение.

что белок с молекулярной массой 310 кД является посредником, с помощь» которого осуществляется генетический контроль за тер-могенезом митохондрий морозоустойчивых озимых злаков в условиях кратковременной гипотермии.

5. Сравнение содержания стрессового белка 310 кД в неохлажденных проростках контрастных по холодоустойчивости генотипов озимой пшеницы.

Полученная "узкая" сыворотка была использована для изучения содержания этого антигена в "контрольных" (выращенных при 26° С) трехсуточных проростках ряда генотипов озимой пшеницы, контрастных по холодоустойчивости. Для сравнения использовали особо высокоморозоустойчивые генотипы озимой пшеницы (линии 11. Д1. 8). успешно перезимовывающие в крайне суровых для этой культуры условиях Иркутской области, и генотип 460 Г. обладающий более низким уровнем морозоустойчивости. Сравнение проводили методом рокет-иммуиоэлектрофореза. Было установлено, что относительное содержание белка 310 кД у высокоморозоустойчивых генотипов в 1.25 - 1.6 раза превосходит его содержание у мало-

морозоустойчивого генотипа.

Картина экспрессии белка с молекулярной массой 310 кД имеет аналогии с картинами экспрессии многих белков теплового вюка (БТВ). Известно, что многие 6ТШ синтезируится в клетке конститутивно. Такие данные имемтся для белков семейств БТШ70 и 6ТИ90 (Laszlo. Li. 1985: Vierling. 1991): Имеются мутанты дрожжей S. cerevisíae. конститутивно синтезирующие белки теплового шока при "нормальной" температуре и характеризующиеся повышенной устойчивость» к тепловому шоку (I Ida. Yahara, 1984).

Таким образом, по аналогии с картиной конститутивного синтеза белхов теплового иока и учитывая то. что при кратковременной гипотермии содержание белха 310 кД резко возрастает, можно утверждать, что степень экспрессии этого антигена в "контрольных" проростках влияет на холодоустойчивость данного генотипа озимой пиеницы.

6. Локализация генов, кодирующих белок с молекулярной массой 310 кД.

Ранее было показано (Войников и др.. 1987). что первая и иестая хромосомы D-генома озимой пшеницы несут гены, контролирующие морозоустойчивость. Учитывая этот факт, а также полученные нами результаты было предположено, что эти же хромосомы иогут контролировать синтез БХЙ 310.

Для проверки этого предположения было проведено сравнение этносительного содержания этого белка r трехсутсчкых пророст-<яу Альбидум 114 и четырех линий пшеницы Безостая 1. в

(оторых пары хромосом ID, 6D. 1А и 6А были замещены на соответствующие пары хромосом из генома пшенш(ы Альбидум 114. Было установлено, что замещение хромосом пшеницы сорта Безостая 1 <а хромосомы A-генома пшеницы сорта Альбидум 114 не вызывает 1зменения уровня экспрессии генов, кодирующих данный белок. В -о же время введение в геном пшеницы сорта Безостая 1 6-ой фомосомы из D-генома пшеницы сорта Альбидум 114 вызвало уве-(ичение уровня содержания интересующего нас белка до 130Х к ровню его содержания у Безостой 1. а введение в геном Безос-•ой 1 ID-хромосомы пшеницы Альбидум 114 вызвало увеличение со-

- Iii -

держания белка 310 кД до 138Х к уровню его содержания у Безостой 1 (табл.1).

Таблица 1. Содержание белка 310 кД в растениях и морозоустойчивость линий озимой пшеницы сорта Безостая 1 с межсортовым замещением хромосом от пшеницы Альбидум 114.

I 1 Замещенные Относительное содержание ! Выживаемость: 1

1 хромосомы I белка 310 кД.Х (-17° С) 1

1 11D 138 + 2.0 80.72 + 2.08 1

I6D 130 ♦ 2.0 78.17 ♦ 1.42 1

tu 93 ♦ 1.5 66.97 + 1.42 1

I6A 100 ♦ 1.5 69.38 + 1.49 1

1 Безостая 1 100 ♦ 1.0 71.00 + 2.58 1

¡Альбидум 114 | 154 ♦ 2.0 82.29 + 1.90 1 |

Таким образом, можно с достаточной степенью уверенности сделать вывод, что в 1-ой и 6-ой хромосомах Э-гснома озимой пшеницы локализованы гены, контролирующие синтез белка с молекулярной массой 310 кД.

7. Изучение влияния интенсивности кратковременной гипотермии на содержание стрессового белка 310 кД.

Хотя ранее и было установлено, что кратковременная гипотермия вызывает увеличение содержания белка 310 кД у озимой пшеницы, не было изучено влияние интенсивности кратковременного низкотемпературного стресса на изменение содержания этого антигена. Для выяснения этого вопроса было проведено сравнение его содержания в трехсуточных проростках озимой ржи. подвергнутых действию температур +3, 0. -3 и -10 °С в течение одного часа и в "контрольных" проростках, выращенных при 26°С и не подвергнутых воздействию гипотермии . Сравнение относительного содержания белка с молекулярной массой 310 кД проводили методом рокет-иммуноэлектрофореза. Было установлено, что низкотемпературный стресс вызывает увеличение содержания этого

:лка во всех вариантах опыта (рис.5). Наибольшее увеличение держания БХШ 310 наблюдалось при температуре ♦3°С. что. возможно. связано с тем. что этот белок принимает участие в процессах. связанных с закаливанием растения. Известно.что при резком понижении температуры синтез белка de novo замедляется (Hahn. Walbot. 1989), поэтому можно было предположить, что изменение содержания этого белка связано либо с изменением его конформацин, либо с ассоциацией (диссоциацией) его субъединиц. В то же время нельзя было исключить и новообразование этого белка, поскольку показано. что yse 1 час гипотермии приводит к индукции синтеза de novo ряда стрессовых белков (Войнихов. Корытов. 1993).

8. Изучение влияния гипотермии на индукцию синтеза БХЭ 310.

Для выяснения вопроса о том. является ли увеличение со-¡ржания БХШ 310 после часовой гипотермии результатом пост-шсляционных изменении белковой макромолекул z~z йзме-'"V™ лзг.-стсл результатом синтеза белка de novo, было прозе->но определение уровня синтеза этого белка во время гипотер-1и путем измерения уровня включения радиоактивной метки в ;лки трехсуточных проростков озимой паеницы сорта Заларинка.

Было установлено что. если за 100Х принять вклячение ра-шактивной метки в БХШ 310 в "контрольных" проростках, то ^пячение в него радиоактивной метки во время холодового вока !°С. 1.5 часа) возрастало на 64.5%. в то время как вклячение ;тки в "об1ций" растительный белок (включая белок с молекуляр->й массой 310 кД) в случае холодового вока возрастало лишь на >. IX.

Рис.5 Рокет-иммуноэлектро-Форез белков проростков озимой ржи. подвергнутых низкотемпературному стрес-

1-- контрольные проростки. 26 С;. 2- 3VC: . 3- О С: 4- -З'С; 5- -Ю С.

Полученные результаты позволяют сделать следующие выводы. Во-первых, несмотря на снижение под действием гипотермии уровня синтеза большинства белков, увеличение относительного содержания белка с молекулярной массой 310 кД под действием кратковременного низкотемпературного стресса ("холодового шока") происходит за счет индукции его синтеза, а не посттрансляционных изменений белковой макромолекулы, диссоциации либо ассоциации ее субъединнц. Во-вторых, можно сделать вывод, что данный белок является стрессовым, принадлежит к группе белков с высоким уровнем индукции синтеза (Войнкков. Корытов. 1993) и его можно назвать "белок холодового шока с молекулярной массой 310 кД" (БХШ 310).

9. Изменение содержания БХШ 310 во время холодового закаливания проростков озимой пшеницы.

Особый интерес представляло изучение изменения содержания данного белка в проростках озимой пшеницы во время холодового закаливания. При помощи рокет-иммуноэлектрофореза было проведено сравнение его содержания в трехсуточных проростках высокоморозоустойчивой озимой пшеницы генотипа Д 1. подвергнутых действию температуры +4"С в течение одного, трех. пяти, семи часов и одних, трех. пяти, семи суток и в "контрольных" проростках. выращенных при 26°С и не подвергнутых воздействию гипотермии. Было установлено, что закаливание трехсуточных проростков морозоустойчивого генотипа Д 1 озимой пшеницы вызывает увеличение содержания этого белка через один час закалки, затем падение его содергания в течении первых суток закалки и, начиная с третьих суток закаливания, значительный рост его содержания (табл. 2).

Данные об индукции синтеза этого стрессового белка при низкотемпературном воздействии хорошо согласуется с имеющимися в литературе (Багйап. С1шуг1ег. 1985: Войников, Корытов. 1991. 1993). Ранее было показано, что гипотермия вызывает в клетках озимой пшеницы образование двух типов стрессовых белков: с высокой и низкой индукцией синтеза . Белки с высокой индукцией синтеза можно обнаружить в самые первые моменты действия неблагоприятной температуры. Стрессовые белки с низкой индукцией

интеза появляются в клетках озимой пшеницы при достаточно олгпй гипотермии . причем с образованием последних хорошо оррелирует степень морозоустойчивости пшеницы (Войников, Ко-ытов. 1993). По-видимому, исследуемый белок у озимой пшеницы тносится к белкам, имеющим два максимума индукции синтеза, и ля повторной индукции его синтеза и накопления в клетках ози-ой пшеницы требуется действие низкой температуры в течение

Таблица 2. Влияние закаливания на относительное содержание БХШ 310 в проростках озимой пшеницы.

¡Время закаливания

Содержание БХШ 310.%

0 часов (контроль) 1 100 + 1.0

1 час 1 ПО + 2.0

3 часа 1 97 + 2.0

5 часов 1 87 + 1.5

7 часов 1 85 + 1.5

1 сутки 1 92 + 1.0

3 суток 1 135 + 1.0

5 суток 1 142 + 1.5

7 суток 1 148 + 1.5

ескольких суток. Наличие двух пиков индукции синтеза белка с олекулярной массой 310 кД позволяет предположить, что данный елок при кратковременной гипотермии ("холодовом шоке") и ппм лительной гипотермии /;; процессе закаливания) выполняет раздающиеся функции.

10. Сравнение влияния гипотермии и водного дефицита на содержание стрессового белка 310 кД в проростках озимой пшеницы.

Поскольку действие гипотермии на растения тесно связано с 5езвоживанием клетки, было весьма интересно выяснить, изменятся ли относительное содержание данного стрессового белка в :лопиях водного дефицита и если изменяется, то в какой степе-

ни. Для этого было проведено сравнение относительного содержания БХШ 310 кД в белках трехсуточных проростков озимой пшеницы сорта Заларинка - "контрольных" растений, растений, подвергнутых действию гипотермии (-1С. 1 час), и водного дефицита (подсушиванию в термостате при 26 С в течении четырех часов и в течении одних суток).

Было установлено, что под действием подсушивания в течение 4 часов происходит некоторое снижение содержания воды в проростках озимой пшеницы с 89.9+0.4% до 87.2+0.2% и до 83.09+0.6% за одни сутки подсушивания. Под действием гипотермии также происходит некоторое уменьшение содержания воды в проростках - с 89.9+0.4% до 88.2+1%. При сравнении относительного содержания БХШ 310 было установлено, что под действием обоих типов стресса (и низкотемпературного, и подсушивания) происходит увеличение относительного содержания данного белка: до 106% под действием гипотермии, до 113% при действии водного дефицита в течение четырех часов и до 180% при действии водного дефицита в течение одних суток. Это увеличение относительного содержания БХШ 310 хорошо коррелирует с падением содержания воды в растениях.

Тесная связь низкотемпературного стресса и водного дефицита отмечалась многими исследователями (Левитт, 1983; Олайен, 1983; Чен, Густа. 1983). Известно, что подсушивание может привести к закалке растений, повышая их устойчивость как к засухе. так и к морозу. Для проявления способности к закалке необходимо очень небольшое уменьшение содержания воды, при этом отмечается очень высокая скорость выхода воды из клетки (Левитт. 1983). Все это позволяет предположить, что первичным индуктором запуска синтеза стрессового белка с молекулярной массой 310 кД при низкотемпературном стрессе является обезвоживание растительной клетки, происходящее под действием гипотермии в первые моменты действия гипотермии.

6. ВЫВОДЫ

1. Гипотермия вызывает в клетках озимых злаков количественные изменения в содержании стрессовых белков, выявляемые с помощь» иммунохимических методов.

2. Один из стрессовых белков озимой ржи. имеющий при им-муноэлектрофорезе в агарозе ЯГ 0.35. выделен в икмунохимическн чистом виде. Белок имеет молекулярную массу 310 кД. состоит из двух субъедениц <56 и 66 кД), н обозначен как БХВ 310 (белок холодового шока с молекулярной массой 310 кД).

3. При гипотермии происходит индукция синтеза БХШ 310. БХШ 310 имеет два пика индукции синтеза: в течение первого часа гипотермии и на пятые - седьмые сутки закаливания проростков. Максимальная индукция наблюдается при температуре ♦3°С.

4. В 1-ой и 6-ой хромосомах О-генома морозоустойчивой озимой пшеницы локализованы гены, контролирующие синтез БХШ 310.

5. БХИ 310 обнаружен в митохондриях морозоустойчивой озимой пшеницы. Этот белок индуцирует переход органелл в низкоэнергетическое состояние и является посредником а ядерном контроле за энергетическими функциями митохондрий при кратковременной гипотермии.

6. Изучены возрастные изменения содержания БХИ 310 в незакаленных проростках озимой тпеницы: его содержание, относительно высокое у трехсуточных проростков, снижается с возрастом и у одномесячных растений падает до очень низкого уровня.

7. Незакаленныз проростки контпяс?:::^; по «ирозоустойчи-воети сертез озпмых злаков значительно различаются по содержанию БХШ 310. В проростках морозоустойчивых сортов его содержание выше, чем в проростках неустойчивых к" морозу сортов. На этой основе был разработан кетод предварительной диагностики морозоустойчивости различных генотипов озимой пяеницы.

ч £

'О

Гт;

Основные публикации по теме диссертации

Колесниченко А.В. Иммунохимическое сравнение белков ] личашцихся по холодоустойчивости генотипов озимой пшеницы.. Всесоюзная конференция молодых ученых по физиологии растит! ной клетки. Петрозаводск. 18 - 22 апреля 1988 г. Тезисы до1 ДОВ.-М.. 1988.- С. 123.

Способ определения морозоустойчивости сортов озимой i ницы: А.С. 1607087 СССР. MK^.AOl С7/00 / Колесниченко А. Мишарин С.И.. Антипина А.И., Войников В.К.: Сиб. институт зиол. и биохим. растений.- N4668791/30-13; Заявл. 28.03. зарегнстрир. 15.07.90.

Мишарин С.И.. Колесниченко А.В.. Антипина А.И.. Войн)

B.К. Влияние низких температур на синтез белков озимой ри пшеницы // 2 Съезд Всерос. о-ва физиологов раст.. Минск. 2< септ.. 1990: Тез. докл.. Ч.2.- М.. 1992,- С 139.

Kolesnichenko A.. Borovsky С,. Voinikov V.. Misharin Antipina A. Isolation and purification of the antigene, ai inulated in the winter rye seedlings under hypothermia // At al symposium of RSPP: Physical-chemical basis of plant phy; logy. 5-8 February. 1996. Penza. Abstracts.- 1996,- Puschir 1996.- P. 98-99.

Колесниченко А.В.. Боровский Г.Б., Войников В.К.. Мишг

C.И.. Антипина А.Н. Характеристика белка из озимой ржи, на» ливащегося при гипотермии.// Физиология растений,- 19i Т.43. N6.- С. 894-899.

Побевнмова Т.П.. Колесниченко А.В., Войников В.К.. Вг кина Н.Н.. Боровский Г.Б. Стрессовый белок 310 кД при гншл мии влияет на энергетическую активность растительных митохс рий// ДАН. - в печати