Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Световой порог регуляции нециклического электронного транспорта внутритилакоидным pH в хлоропластах растений

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Световой порог регуляции нециклического электронного транспорта внутритилакоидным pH в хлоропластах растений"

„ тГЦ

Г, Пг.л

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК

ИНСТИТУТ ПОЧВОВЕДЕНИЯ И ФОТОСИНТЕЗА

На правах рукописи

УДК [541.144.7+581.132]:577.15/. 17+58.04

Бородин Валерий Борисович

СВЕТОВОЙ ПОРОГ РЕГУЛЯЦИИ НЕЦИКЛИЧЕСКОГО ЭЛЕКТРОННОГО ТРАНСПОРТА ВНУТРИТИЛАКОИДНЫМ рН В ХЛОРОПЛАСТАХ РАСТЕНИЙ

03.00.04 - Биологическая химия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Пущино - 1996

Работа выполнена в лаборатории фотометаболизма углерода Института почвоведения и фотосинтеза Российской Академии Наук.

Научный руководитель - доктор биологических наук

Э.Д.Демидов

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Ф.Ф. Литвин

доктор биологических, наук А.Н.Мальян

Ведущая организация: Институт теоретической и экспериментальной биофизики Российской Академии Наук (г. Пущино)

Защита состоится ^ Л -¿¿-.у -с .1996 г. в /(С'! ° час. на заседании специализированного совета Д.200.29.01 в Институте почвоведения и фотосинтеза Российской Академии Наук, г. Пущино.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института почвоведения и фотосинтеза Российской Академии Наук.

Автореферат разослан " -¿Уз " ¡¿¿Ч с' х.-^ 1996 г.

Ученый секретарь Специализированного Совета доктор биологических наук

Б.Н.Иванов

-11. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

ВВЕДЕНИЕ. Особенностью процессов, обеспечивающих сопряжение электронного транспорта с синтезом АТФ на энергопреобразующих биомембранах' является то, что ЦЦС (протондвижущая сила) может оказывать ингибируицее влияние на электронный транспорт. Как в дыхательных, так и в фотосинтезирующих системах, взаимосвязь между электронным транспортом и ГЩС проявляется в виде подавления электронного транспорта недостатком АДФ и его активации при добавлении агентов (АДФ или разобщители), вызывающих диссипацию ПДС. В случае фотосинтезирующих систем, влияние ПДС на электронный транспорт именуется фотосинтетическим контролем.

Поскольку электрическая компонента ПДС на тилакоидах в стационарных условиях близка к нулю, регуляторное влияние ПДС на фотосинтетический электронный транспорт осуществляется через градиент рН на мембране, или, точнее, через рН внутренней фазы тилако-идов (рНвн). Физиологический смысл "фотосинтетического контроля" состоит в том, чтобы посредством снижения скорости электронного транспорта снизить скорость сопряженной с ним закачки протонов (Н*) внутрь тилакоидов и, тем самым, устранить чрезмерную энерги-зацию тилакоидных мембран.

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ. В ряду регуляторных механизмов, обеспечиващих нормальное протекание фотосинтетического процесса,, регуляция фотосинтетического транспорта электронов внутритилакоид-ным рН стоит на одном из первых мест. Большое значение "фотосинтетического контроля" в жизни растительных организмов обусловлено тем, что он обеспечивает сбалансированность световой, производящей АТФ и НАДФН, и темновой, потребляющей АТФ и НАДФН, стадий фотосинтеза. В виду важности вопроса, изучением механизма регуляции фотосинтетического электронного транспорта внутритилакоидным рН и непосредственно связанных с ним процессов в настоящее время занимаются во многих ведущих лабораториях мира. Уже прояснены некоторые аспекты данной проблемы. Например, установлено что влияние рН на электронный транспорт осуществляется на стадии окис-

Сокращения: ПДС - протондвижущая сила, СКП - световой компенсационный пункт, ЭТЦ - электрон-транспортная цепь, Н* - протон, АН* -величина светоиндуцированного поглощения протонов тилакоидами, рН - рН внутри тилакоидов, рНсн - рН снаружи тилакоидов, Реоу -феррицианид калия, ш - метилвиологен, Р1 - ортофосфат.

лений пластохинола в цитохром ъ^/г комплексе. Показано также, что торможение электронного транспорта под действием низкого рНвн сопряжено с закрытием реакционных центров в ФСП и, в итоге, с безизлучательной диссипацией избытка поступающей в фотосинтетический аппарат световой энергии. Вместе с тем, несмотря на то, что данная проблема гаходится в центре внимания исследователей в течение почти четырех десятков лет, до сих пор не было предпринято попытки детально и целенаправленно изучить каким образом меняется и меняется ли вообще регуляция фотосинтетического электронного транспорта внутритилакоидным рН при изменении уровня освещенности фотосинтетического аппарата.

ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ'. Основной целью настоящей работы было изучить действие света на регуляцию фотосинтетического электронного транспорта внутритилакоидным рН. В связи с этим были поставлены следующие задачи:

- выяснить каким образом изменяется световая кривая реакции Хилла у изолированных хлоропластов гороха под действием факторов, влияющих на протонную проводимость тилакоидных мембран.

- оценить изменение рНвн в разных точках световой кривой реакции Хилла под действием указанных выше факторов.

- изучить влияние С02 на световую кривую фотосинтеза протопластов гороха.

- проследить за поведением световой кривой фотосинтеза протопластов гороха при изменении рН внутренней фазы тилакоидов с помощью солей слабых кислот (включая КНС03) и ш^сг.

- изучить влияние 02 на световую кривую реакции Хилла у изолированных хлоропластов гороха в условиях, вызывающих чрезмерное закисление внутренней фазы тилакоидов.

- изучить влияние 02 на световую кривую фотосинтеза протопластов гороха, протопластов фасоли и интактного листа фасоли в С02-лимитирующих условиях.

- изучить влияние 02 на световую кривую фотосинтеза протопластов гороха в условиях, вызывающих чрезмерное закисление внутренней фазы тилакоидов.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА. Показано, что регуляторное влияние рНвн на фотосинтетический электронный транспорт в хлоропластах и протопластах гороха резко усиливается при интенсивностях света выше 5 Вт/м2. В связи с этим, интенсивность света около 5 Вт/м2 названа пороговой в данной регуляции. Величина пороговой интенсивности света не зависит от температуры в испытанном нами интервале знак

чений (15-25°С) и от степени зачисления содержимого тилакоидов.

Наличие светового порога в регуляции фотосинтетического электронного транспорта внутритилакоидным рН является причиной появления эффекта Кока у гороха и других растений в условиях, вызывающих чрезмерное закисление внутренней фазы тилакоидов. Указанный эффект имеет полное сходство с эффектом Кока, появляющимся при низком отношении С02/02 в окружающей среде, но в отличие от последнего его устранению способствует не снижение концентрации С>2 в среде, а подщелачивание содержимого тилакоидов. Именно это обстоятельство внесло путаницу в вопрос об эффекте Кока, поскольку подразумевая одно и то же явление, на самом деле, одни исследователи имели дело с эффектом Кока, обусловленным чрезмерным подкислением внутренней фазы тилакоидов, тогда как другие - с эффектом Кока, обусловленным активацией фотоокислительных процессов (предположительно фотодыхания по гликолатному пути и/или реакции Мейлера) из-за низкого отношения С02/02 в окружающей среде.

Опыты с протопластами гороха показали также, что при интен-сивностях света, соответствующих восходящему участку световой кривой фотосинтеза, для подавления активности фотосинтетического аппарата требуются много более высокие (> 2.5 мМ) концентрации С02> чем в условиях светового насыщения (>0.6 мМ).

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ. Полученные результаты углубляют знания о механизмах регуляции фотосинтетического процесса. Данные по влиянию С02, формиата и пропионата на фотосинтетическую активность протопластов могут быть использованы физиологами растений и экофизиологами при прогнозировании последствий "парникового" эффекта и загрязнения атмосферы соединениями, обладающими свойствами слабых кислот.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ. Результаты исследований по теме диссертации были доложены на республиканской конференции, посвященной 50-летию Института ботаники Академии Наук Азербайджанской ССР (Баку, 1986); на IV Конференции молодых ученых (Пущино, 1989); на 7 Конгрессе Федерации европейских обществ физиологов растений (итеа, Швеция, 1990); на международной конференции "Фотосинтез и фотобиотехнология" (Пущино, 1991); на ежегодном Симпозиуме ОФР "Физико-химические основы физиологии растений" (Пущино, 1995) и на международной конференции "Биоэнергетика фотосинтеза" (Пущино, 1996).

ПУБЛИКАЦИИ. По материалам диссертации опубликовано 11 работ.

СТРУКТУРА И ОБЪЕМ ДИССЕРТАЦИИ. Диссертация состоит из введения, литературной части, методической части, результатов и их об-

/

суждения, заключения, выводов и списка литературы (170 источников). Она изложена на 120 стр. машинописного текста и содержит 25 рисунков и 8 таблиц.

2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Горох (Pisum sativum Ь., сорт Превосходный) летом выращивали в теплице в почве на естественном свету. Зимой горох выращивали в оранжерее на вермикулите или торфе при температуре 23-27/17°С

(день/ночь), продолжительности фотопериода 12 ч и освещенности 10-12 клк. Для опытов брали растения 14-21-дневного возраста.

Фасоль (Phaseolus vulgaris ь., сорт Сакса) выращивали в климатической камере при температуре 25/20°С (день/ночь), продолжительности фотопериода 14 ч и освещенности 200 Вт/м2 (ФАР - 50$). Относительная влажность воздуха составляла 60-70% и влажность почвы - 60-70Ж от полной влагоемкости. Для опытов брали растения 25-60-дневно.го возраста.

Хлоропласта извлекали из листьев гороха способом, предложенным Вестом и Вискичем (West and Wiskioh, 1968). Полученные таким способом хлоропласта имели оболочку и могли осуществлять Feoy-зависимое, но не С02-зависимое выделение О^.В опытах использовали свежеизвлеченные хлоропласта, которые сохраняли в темноте при 2°С в сконцентрированном виде. Среда для хранения хлоропластов содержала 0.4 М сахарозу и 0.5% бычий альбумин.

Протопласты гороха и фасоли получали ферментативным способом с помощью целлюлазы и пектиназы (Игнатова, 1980; 1990). Препараты протопластов сохраняли в темноте при 2°С в сконцентрированном виде. Среда для хранения протопластов содержала 0,5 М сорбит, 1 мМ СаС12, 20 ММ MES-КОН (рН 6,0).

Газообмен кислорода в суспении хлоропластов и протопластов определяли амперометрическим методом с помощью электрода типа Кларк. Опыты с хлоропластами проводили при температуре 25°С в среде содержащей в качестве постоянных компонентов 0,4 М сахарозу, 50 MM NaCl, 2 мМ MgCl2, 6 мМ Na2HP04, 10 ММ трис-HCl (иногда трицин или hepes). Для создания фосфорилирующих условий к указанным компонентам добавляли 1-2 мМ АДФ. Опыты с протопластами проводили при температуре 20° С в среде содержащей 0,5 М сорбит, 1 мМ СаС12, 0,5 мм КН2Р04, 1 MM EDTA, 50 мМ HEPES-K0H. Среду перед использованием не менее часа продували воздухом без С02 или

аргоном. Концентрацию С02 (14С02) в суспензии протопластов регу-

лировали путем введения нужного количества кнсо^ или ИаН14'С03 с удельной радиоактивностью 0,42 мкК-мкмоль~1. Счет радиоактивности образцов вели на сцинтилляционном счетчике, вескмаи ъб юос.

Скорость фотофосфорилирования в изолированных хлоропластах определяли при помощи стеклянного рН-электрода по методу Заботина (Заботин, 1970). Измерения проводили при 20°С в среде содержащей 400 мМ сахарозу, 50 мМ ШС1, 2 мМ МёС12, 1 мМ АДФ, 3 мМ Иг^НРО^ (рН 7,8-7,9).

Количество протойов, поглощенных изолированными хлоропласта-ми, определяли при помощи стеклянного рН-электрода в присутствии МУ как акцептора электронов. Измерения проводили при 25°С в среде содержащей 400 мМ сахарозу, 50 мМ N801, 2 мМ %С12, ±0.5 мМ АДФ, 0.2 мМ Иа2НР0^ или На^НАбО^. Буферную емкость суспензии хлороп-ластов определяли с помощью титрования стандартным раствором НС1.

Содержание хлорофилла в суспензии хлоропластов и протопластов определяли по Арнону (Агпоп, 1949).

Скорости обмена СОо у интактных .листьев фасоли определяли с помощью двухканальной автоматизированной .газометрической установки (Егоров и др., 1985). Измерения проводили в открытой системе при 25°С с точностью ±18,2-Ю-2 мкмоль С02"М_2-с-1.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. Влияние факторов, изменяющих Непроводимость тилакоидных мембран, на световую кривую реакции Хилла у изолированных хлоропластов гороха

Подкисление внутренней фазы тилакоидов в присутствии АДФ и Р1 путем снижения рН,н в интервале значений 8.0-6.5 приводило к уменьшению скорости реакции Хилла с Ресу (рис. 1) или ш (данные не приведены), как акцепторами электронов, только при интенсив-ностях света выше 5 Вт/м2. Вследствие этого, при интенсивности света около 5 Вт/м восходящий участок световой кривой реакции Хилла подвергался излому, который усиливался или ослабевал соответственно при понижении или повышении рНсн- Аналогичный результат был получен в отсутствио АДФ с той лишь разницей, что изменение рНсн в этом случае оказывало незначительное влияние на транспорт электронов при интенсивностях света ниже 5 Вт/м2 ^рис. 26). Рис. 1б показывает также, что при значениях рНсн ниже оптимального уровня (т.е. ниже 8.0-8.2), насыщение реакции Хилла наступает соответственно при более низких интенсивностях света.

У

Рис. 1. Влияние рН среды на световую кривую Реоу-зависимого выделения 02 хлоропластами гороха в присутствии АДФ и Pi.

а - в скобках над световыми зависимостями указана степень их излома (отношение тангенса угла наклона нижнего к тангенсу ■ угла наклона верхнего отрезка); ошибка (бары) соответствует доверительной вероятности 0.95. б - выделение кислорода на плато световой кривой при рН 8.0 составляло 220 мкмолей/мг Хл*ч; Sd (стандартное отклонение от средней величины) не >5% (п=3).

Для получения доказательств в пользу того, что, показанные на рис. 1, изменения световой кривой реакции Хилла связаны с изменением концентрации Н4 внутри, а не снаружи тилакоидов, последующие измерения были проведены в условиях изменяющегося рНвн и постоянного рНсн. При постоянном рНсн добиться разного уровня рН можно с помощью соединений, изменяющих проницаемость тилако-

ВН I

идных мембран для IT. Проверка влияния АДФ и АТФ при рНсн 7,3 показала (рис. 2а), что подкисление внутренней фазы тилакоидов путем удаления из состава среды АДФ (кривая 2) и еще более сильное подкисление посредством добавки к хлоропластам АТФ (кривая з) приводило к снижению скорости электронного транспорта главным образом при интенсивностях света выше 5-6 Вт/м2. При этом торможение электронного транспорта было тем заметней, чем более сильное зачисление содержимого тилакоидов предполагали условия измерений. В результате, показатель степени излома восходящего участка световой кривой реакции Хилла увеличивался с 1,3 в контроле до 2,0 в

к

Рис. 2. Влияние АДФ и АТФ при рН среды 7.3 (а) и влияние рН среды и грамицидина Б в отсутствие АДФ (б) на световую кривую Ресу-зависимого выделения 02 хлоропластами гороха.

Опыт 8: 1 - в присутствии 2 мМ АДФ: 2 - без АДФ; 3 - без АДФ, но в присутствии 0.2 мМ АШ>. Опыт б: 1 - рН 8.0; 2 -рН 7.0; 3 - рН 7.0 + 2.5' 10~ М грамицидина. В скобках над кривыми указаны степени излома световых зависимостей (пояснение на рис. 1 ). Во вставке на рисунке указаны скорости выделения 0_ хлоропластами в мкмолях/мг Хл-ч на насыщающем

2

свету интенсивностью 230 Вт/м . Ошибка соответствует доверительному интервалу 0.95.

отсутствие АДФ и до 3,0 в присутствии АТФ.

С целью окончательно убедиться в том, что, отмеченные выше изменения световой кривой реакции Хилла обусловлены изменением рНвн, далее было изучено влияние каналоформера грамицидина Б на ход световой кривой реакции Хилла при рНсн 7,0 в отсутствие АДФ (рис. 26, вставка и кривые 2,3). Рис. 26 показывает, что увеличение рНвн до значений близких рНсн, благодаря выходу избытка Н1" из тилакоидов в окружающую среду по грамицидиновым каналам, оказывало такое же действие на световую кривую, как повышение рН до оптимального уровня (рис. 26, кривая 1) или добавление АДФ (рис. 2а). Интересно, что несмотря на довольно низкое значение рН и отсутствие АДФ, скорость реакции Хилла на плато световой кривой и степень излома восходящего участка после добавления грамицидина

)

достигали в опыте на рис. 26 примерно тех же значений, как в присутствии АДФ при оптимальном рНсн (рис. 1). Сходное действие на световую кривую грамицидин оказывал при рНсн 6,7-7,2 в присутствии АДФ и н. В отличие от низкого рНсн, добавление грамицидина при оптимальном рНгн в присутствии АДФ и Р1 не оказызывало существенного влияния на световую кривую реакции Хилла.

Таким образом, приведенные выше данные показывают, что независимо от способа воздействия на рНвн, электронный транспорт претерпевает изменения главным образом при интенсивностях света выше

5-6 Вт/м2 (в большинстве опытов выше 5 Вт/м2). Это означает, что

2

интенсивность света около 5 Вт/м является•пороговой в регуляции нециклического электронного транспорта внутритилакоидным рН.

3.2. Влияние АДФ и рН среды на световую кривую АНТ1"

Чтобы установить причину существования светового порога в регуляции нециклического электронного транспорта внутритилакоидным рН, было изучено влияние АДФ и рН на зависимость подщелачи-вания суспензии хлоропластов от интенсивности света. Светозависи-мое подщелачивание суспензии хлоропластов происходит вследствие сопряженного с электронным транспортом переноса протонов из наружной фазы тилакоидов во внутреннюю. Поэтому по количеству протонов изъятых из среды окружающей тилакоиды (АН4), можно судить не только о количестве протонов поступивших во внутритилакоидное пространство, но, если известна буферная емкость и объем внутренней фазы тилакоидов, то и о значении рН .

Расчеты, произведенные на основе полученных нами световых кривых АН4 и литературных данных о взаимосвязи между ДН+ и рНвн (Наггаих ап<1 КоисЫсоУБку, 1979; БсЬопХеЫ апй Коре1о711;с11, 1985), показали, что отсутствие АДФ при рН 7.8 приводило уже при интенсивностях света 3-6 Вт/м2 к снижению рНвн по сравнению с фос-форилирующими условиями на 0.3 единицы рН. Следующее за этим изменение рНсн с 7.8 до 7.2 в отсутствие АДФ дополнительно уменьшало величину рНвн на 0.3-0.4 или 0.4-0.5 единицы рН и в итоге она становилась на 0.6-0.7 или 0.7-0.8 единицы рН меньше, чем в присутствии АДФ и Р1 при рНсн 7.8-8.0. Различия, выявленные в значении рНвн при интенсивностях света 3-6 Вт/м2 в условиях разного рНсн оставались практически неизменными при увеличении интенсивности света вплоть до 130 Вт/м2.

Сопоставление результатов вычислений со световыми кривыми реакции Хилла при разной Непроводимости тилакоидных мембран поз-

воляет увидеть, что даже весьма значительное изменение величины рНвн в области излома восходящего участка световой кривой не сопровождается явно выраженным изменением положения точки излома на шкале интенсивностей света. Отсюда напрашивается вывод, что сигналом для перехода системы электронного транспорта из режима слабой в режим высокой чувствительности к значению рНвн является не количество протонов накопившихся во внутренней фазе тилакоидов, а количество квантов света, поглощенных пигментной системой фотосинтетического аппарата. Поскольку свое .влияние на электронный транспорт рНвн оказывает на стадии окисления пластохинола в цито-хром bg/f комплексе (Bendall, 1982; Rich, 1982), и поскольку пул пластохинона становиться полностью восстановленным при интенсив-ностях света близких (Amesz et al, 1972) интенсивности в точке излома световой кривой реакции Хилла в наших опытах, то причина существования светового порога вероятно заключается в том, что окисление пластохинола превращается в регуляторное место электронного транспорта только при интенсивностях света выше 5 Вт/м2.

3.3. Влияние температуры на световую кривую реакции Хилла

В дополнение к факторам, изменяющим Непроводимость тилако-идных мембран, было исследовано влияние температуры на индуцированный низким рНвн излом восходящего участка световой кривой реакции Хилла. Исследование показало, что, как и в случае изменения рНвн, наиболее сильные изменения скорости электронного транспорта в хлоропластах гороха под действием температуры происходили при интенсивностях света выше 5 Вт/м2. В результате, снижение температуры с 25 до 15°С приводило к увеличению показателя степени излома восходящего участка, в 1.2-1.4 раза.

Поскольку влияние температуры на электронный транспорт осуществляется главным образом через изменение скорости окисления пластохинола в цитохром b6/f комплексе (Cramer and Crofts, 1982; Tikhonov et al, 1984), и поскольку изменение температуры влияет на величину АрН (Kraayeiihof and Katan, 1972), можно полагать, что сходство в действии температуры и рНвн на световую кривую реакции Хилла обусловлено существованием зависимости рНвн от температуры.

3.4. Влияние солей слабых кислот и NH^Cl на световую кривую фотосинтеза протопластов гороха

В связи с обнаружением светового порога в регуляции электронного транспорта внутритилакоидным рН у изолированных хлороп-

ластов, следовало выяснить существует ж таковой у интактной фо-тосинтезируадей системы. С этой целью были проведены опыты на протопластах из мезофилла листьев гороха. Для подкисления и под-щелачивания содержимого тилакоидов у протопластов использовали соответственно соли слабых кислот (КНСОд, Ыа-формиат, Ыа-пропи-онат) и Ш4С1.

Опыты, проведенные на насыщающем свету показали, что для фотосинтеза протопластов концентрации С0£ в интервалах 0-0.06 мМ, 0.06-0.60 мМ и >0.6 мМ являются соответственно субоптимальными (лимитирующими), оптимальными и сверхоптимальными (ингибирующи-ми). Однако при интенсивностях света, соответствующих восходящему участку световой кривой, устойчивость протопластов к повышенным концентрациям С02 возрастала и требовалось более 2.5 мМ С02, чтобы вызвать подавление их фотосинтетической активности (рис. ЗВ).

Как будет показано ниже, изменения световой кривой фотосинтеза у протопластов гороха, индуцируемые лимитирующими концентрациями С02 в присутствии атмосферной концентрации 02 и индуцируемые солями слабых кислот, имеют очень большое сходство. Поэтому, во избежание наложения друг на друга двух разных эффектов, влияние формиата и пропионата натрия на фотосинтез было изучено в . присутствии оптимальных ' концентраций С02 (при изучении влияния сверхоптимальных концентраций КНС03(С02), эффект лимитирующих концентраций С02 исключался естественным образом).

Концентрации 002 превышающие 2.5 мМ, а также формиат и про-пионат натрия в присутствии оптимальной концентрации С02 изменяли ход световой кривой фотосинтеза протопластов. По сравнению с контролем, во всех трех перечисленных случаях выход световой кривой на плато происходил на более слабом свету, уменьшалась высота плато и уменьшался угол наклона восходящего участка световой кривой. Одновременно, у восходящего участка при интенсивности света около 5 Вт/м2 появлялся излом (рис. 3). Излом восходящего участка световой кривой фотосинтеза у протопластов (рис. 3) очень сильно напоминал излом восходящего участка световой кривой реакции Хилла у изолированных хлоропластов (рис. 1, 2), совпадал с ним по интенсивности света и также, как в случае с хлоропластами, был тем ярче, чем более сильное закисление внутренней фазы тилакоидов предполагали условия измерений (т.е. чем больше С02, пропионата или формиата содержалось в суспензии протопластов).

Чтобы убедиться в том, что появление излома у восходящего участка световой кривой фотосинтеза в присутствии солей слабых

А

Б

! 25

20

di R о

3

Я

с5

0

01

с

о

ч 3 m

15

10

-5

iVa—ФОРМИАТ 1

- QQQQO 0 -

Л АЛ Л Л 80

ппппп 120 6/

160 От

***** 200

„V -

- -

- 0 -

—-*

i i 1

О 5 10 15

Интенсивность света, Вт • и'

. 4-0

и

а зо

я t;

§20

° 10 и

3

V

S о 3

л И

-10

JVa—ПР ОПИОНАТ i

" OQQO£> 0

50 V^v

• ппппп 100 у

150

- -

- OOOie

1 i 1

й40 \

О 5 10 15 Интенсивность света, Вт

30

I 20

w 10 о

н

я

<а

§ О

3

л

аз -10

в

KHC03(C02) 1

mnnn 5(0.8), рН 7.1 ~ ллллл 15(2.4), pH 7.1 QDOOD 49(7.8), pH 7.1 - ОДйДО 65(Ю.4),рН 7.1 ***** 67(2.5). pH 7.8 oV*

y

lili

О 5 10 15 Интенсивность света, Вт

20 > ы~

5

Рис. 3. Влияние Ыа-формиата (А), Ыа-пропионата (Б) и сверхоптимальных концентраций С02 (В) на восходящий участок световой кривой видимого фотосинтеза протопластов гороха.

В скобках над каждой кривой указана степень излона восходящего участка (пояснение на рис. 1 ). Концентрации (ыМ) действующих веществ указаны во вставках на рисунках. В опытах А и Б рН среды 7.2 и содержание КНС03(С»2) 4.1 нМ(0.54 мМ). В опыте В рН среды 7.1 или 7.8 (см. вставку).

Каждая кривая определена в 1-2 повт. (опыт А), 2 повт (опыт Б), или 3 повт (опыт В).

кислот обусловлено сдвигом внутрихлоропластного pH в кислую сторону, далее было исследовано влияние Ntí^ci на фотосинтез протопластов гороха. Опыты, проведенные при постоянной невысокой интенсивности света (18.5 Вт/м2), показали, что в интервале концентраций 0-10 мМ NH^ci почти не влиял на фотосинтетическую активность контрольных протопластов. Более высокие концентрации NH^Cl подавляли активность протопластов и в присутствии 20, 50 и -100 мМ ЫНд01 она составляла 70, 30 и 10% от исходного уровня. Когда фотосинтетическая активность протопластов была предварительно подавлена солями слабых кислот, то в отличие от контроля, умеренные концентрации NH^ci приводили к ее заметному росту. Для достижения максимальной скорости фотосинтеза в присутствии 100 мМ Na-форми-ата, 200 мМ Na-формиата, 100 мМ Na-пропионата и 10 мМ С02 требовалось соответственно 10-15, 25, 50 и 60 мМ HH^Cl. Максимальные скорости в первых двух случаях были всего лишь на 11% и 11% ниже, чем в контроле, и значительно превосходили таковые в присутствии 100 мМ и 150 мМ пропионата натрия или 10 мМ' двуокиси углерода. Это указывает на то, что формиат, как подкисляющий агент, более специфичен в своем действии на фотосйнтетический аппарат, чем пропионат или С02. Увеличение количества NH^Ol с 10-15 до 25 мМ для достижения максимальной скорости фотосинтеза при увеличении концентрации Na-формиата со 100 до 200 мМ объясняется тем, что во втором случае хлоропласты содержат больше "лишних" протонов -больше следовательно и расход аммония ца их нейтрализацию и возвращение рНвн к исходному оптимальному для фотосинтеза уровню.

При одновременном определении скорости фотосинтеза по выделению 02 и фиксации 14С02 не было обнаружено каких-либо существенных различий ни в значениях, ни в измененише обоих показателей фотосинтетической активности при добавлении формиата или пропионата и при последующем увеличении концентрации NH^Cl в суспензии протопластов. То же самое имело место в контроле, где кривые, отражающие ингибирующее действие NH^Cl на фотосинтетическую фиксацию WC02 и выделение 02 практически совпадали. Это означает, что в наших экспериментах NH^Cl выступал главным образом в роли регулятора стромального и внутритилакоидного pH, а не разобщителя фотосинтетического электронного транспорта и фотофосфорилирования.

Проверка влияния солей слабых кислот и NH^ci на поглощение 14С02 и 02 протопластами в темноте показала, чго изменения этих показателей в абсолютных единицах были столь малы, что их возможным вкладом в газообмен 'протопластов на свету, а значит и в обна-

руженное нами специфическое влияние солей слабых кислот и NH^Gl на световую кривую фотосинтеза можно пренебречь.

Поскольку NH^Ol устранял ингибирующее действие солей слабых кислот на фотосинтез протопластов, можно было ожидать, что он устранит и индуцированный солями слабых кислот излом восходящего участка световой кривой фотосинтеза. Как оказалось (рис. 4), под действием NH^Cl указанный излом действительно становился менее заметным (вариант с пропионатом), или пропадал вовсе (вариант с формиатом). Наряду с увеличением угла наклона восходящего участка световой кривой фотосинтеза при интенсивностях света вше 5 Вт/м2, аммоний в варианте с формиатом увеличивал также уровень светового насыщения фотосинтеза и высоту плато световой кривой, т.е. восстанавливал, хотя и не полностью, нарушенные солями слабых кислот параметры световой кривой фотосинтеза. Опыты с NH^Oi доказывают, что обнаруженное нами влияние солей слабых кислот на световую кривую фотосинтеза протопластов обусловлено чрезмерным закислением внутренней фазы тилакоидов.

Таким образом, очень большое сходство в поведении световой кривой фотосинтеза у протопластов и световой кривой реакции Хилла у хлоропластов гороха в условиях, вызывающих разную степень за-кисления содержимого тилакоидов, убеждает как в том, что in vivo у регуляции фотосинтетического транспорта электронов внутритила-коидным рН имеется световой порог, так и в том, что его величина полностью соответствует таковой у изолированных хлоропластов.

3-5. Влияние 02 и субоптимальных концентраций С02 на световую кривую фотосинтеза хлореллы, фасоли и протопластов гороха.

Подобно тому, как это было при чрезмерном закислении внутренней фазы тилакоидов, излом восходящего участка световой кривой фотосинтеза у протопластов гороха (рис. 5), хлореллы и фасоли появлялся в условиях субоптимального содержания С02 и атмосферного (или выше) содержания 02 в окружающей среде. Указанный излом у интактного листа и протопластов фасоли усиливался при снижении отношения COg/Og в среде (т.е. снижении содержания С02 и/или увеличении содержания 02). В случае хлореллы излом был ярче выражен у клеток, имеющих более низкую активность (^-концентрирующего механизма, а значит и более низкое отношение С02/02 в центрах карбоксилирования. То же самое имело место у протопластов гороха, когда отношение С02/02 уменьшали снижением концентрации С02 в среде (рис. 5). При этом, одновременно с усилением излома восхо-

Ыа-ФОРМИАТ Ыа-ПРОПИОНАТ

Рис. 4. Влияние Ш4С1 на восходящий участок световой кривой фотосинтеза протопластов гороха, подвергнутых действию формиата (слева) и пропионата (справа) натрия.

В скобках над восходящими участками указаны степени их излома (пояснение на рис. 1 ). Во вставках на рисунках указаны концентрации действующих веществ. рН среды 7.15, концентрация КНСО^ (СО,,)

4.1 мМ(0.б мМ). га не более (п=3).

дящего участка уменьшалась интенсивность света, требуемая для выхода световой кривой на плато, и высота самого плато. Излом восходящего участка световой кривой выделения 02 протопластами гороха в СС^-лимитиругацих условиях был очень похож на таковой у протопластов и хлоропластов гороха при чрезмерном закислении внутренней фазы тилакоидов, и полностью совпадал с двумя последними по интенсивности света. В СС^-лимитирующих условиях, однако, излом восходящего участка световой кривой устранялся низкими концентрациями 0>2 (рис. 6А), тогда как снижение концентрации 02 в условиях, вызывающих чрезмерное закисление содержимого тилакоидов, не приводило к его устранению ни у протопластов (рис. 6БВ), ни у изолированных хлоропластов гороха. В разной зависимости от концентрации 02 состояло единственное, но весьма существенное отличие двух последних несомненно родственных явлений от первого.

I I 1 1 . АЛЛЛД 0 ni1??uU С07 1 1 1

□ШОР 0.02+0мМ ссц

QQQQD 2.5000ыМ со. Лч/

j// -

| 1 I 1 • 1

Рис. 5. Влияние субоптимальных концентраций С02 на восходящий участок световой кривой фотосинтеза протопластов гороха.

В скобках над восходящими участками указана степень их излома (пояснение на рис. 1 ). Концентрации СО ^ указаны во вставке на

рисунке. Эй. не более 3% (п=3).

О 5 10 15 20 Интенсивность света, Вт •

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

С изломом восходящего участка световой кривой фотосинтеза вблизи СКП (эффектом Кока), аналогичным таковому в наших опытах, исследователи часто сталкиваются при проведении экспериментов на одноклеточных водорослях, цианобактериях, С3- и САМ-растениях. Хотя история изучения эффекта Кока насчитывает больше сорока лет, у исследователей до сих пор нет единого мнения относительно причины данного явления. Одни полагают, что эффект обусловлен фото-ингибированием митохондриального (Kok, 1949; van der Veen, 1949; Peisker and Apel, 1981; Sharp et al, 1984) или хлоропластного дыхания (Peltier and Schmidt, 1991 ) ниже СКП. По мнению других, у растений с Сд типом фотосинтеза он связан с активацией фотодыхания выше СКП (Decker, 1957; Ludlow and Jarvis, 1971; Comic and Jarvis, 1972; Ishii et al, 1977; Ishi'i and Murata, 1978). Наконец есть мнение, что по крайней мере у цианобактерий за появление эффекта в одинаковой мере ответственны и световое ингибирование темнового дыхания и активирование фотодыхания (Graham, 1980).

При проведении настоящей работы нами были получены доказательства того, что к появлению эффекта Кока может привести слишком сильное подкисление содержимого тилакоидов. По нашему мнению, именно чрезмерное закисление внутренней фазы тилакоидов, происходящее вслед за подкислением стромы хлоропластов угольной кислотой, явилось причиной обнаружения эффекта Кока у Co-растений в

30

с. я

• 20

С О

а

и

й 10 N

О

ш 8

а п

1) 0

ч

V

Н

а

ю

-ю

А

6.5 1 1 1 мкМ СОг 1 1

00000 280икМ 0а, 654юеМ С02

-ллллл 260шсЫ 05, 6.5икЫ С02 "

АААА1 бОикМ 0:, 6.5икМ С02

>{80!

Н27|

>1171 -

1 . 1 |

О 5 10 15

Интенсивность света, Вт «

12

О О

0! Я К

Щ

К .

V

Ч

з ю

■ ~8.

I ' | " 9.4 мМ С02

_ ллллл 270чкМ 02

ААЛЛ+ бОикМ 0г

■

-

......

О

10

15

В

к с о а и

я О

и 3

га

-8

220 мМ Ыа- -ФОРМИАТ

ллллл о,

АААМА 50МКМ 02

■

г ......

О

сг> I

10

15

Интенсивность света, Вт • ы~

Интенсивность света, Вт • и~

и

Рис. 6. Влияние 02 на восходящий участок световой кривой фотосинтеза протопластов гороха, подвергнутых действию субоптимальной С02 (А), сверхоптимальной С02 (Б) и формиата (В).

В круглых скобках над восходящими участками в опыте А указаны степени их излома (пояснение на рис. 1 }. Скорости выделения на плато световых кривых указаны в фигурных скобках против каждой кривой. Концентрации СО^: опыты А и Б - указаны на рисунках, опыт В - 0.66 нМ. Концентрации 02 указаны во вставках на рисунках. рН среды: 8.1, 7.1 и 7.1 в опытах А, Б и В соответственно. Бс1 показано барами (в опытах А и Б п=4 и в опыте В п=3).

тех случаях, когда исследователи использовали в опытах сверхвысокие (> 3.6%), гарантирующие ингибирование фотодыхания концентрации С02 (van der Veen, 1949; Gabrielsen and Vejlby, 1959; Osborne, 1989). Усиление эффекта Кока в экспериментах Gabrielsen and Vejlby (1959) и Osborne (1989) при снижении температуры вполне согласуется с данным умозаключением, поскольку может быть объяснено во-первых, усилением подкисляющего действия С02 из-за большей растворимости данного газа в водной фазе клеток, и во-вторых, обнаруженным нами действием температуры на. излом восходящего участка световой кривой нециклического электронного транспорта. Наличие эффекта Кока у CAM-растений (Adams III et al, 1986; Martin et al, 1989) также скорее всего связано с сильным закислением внутренней фазы тилакоидов, поскольку клетки этих растений на свету накапливают очень много„COg (1-4%) и органических кислот. Вывод о фотохимической природе эффекта Кока в условиях сверхвысоких концентраций С02 устраняет путаницу, возникшую в литературе из-за феноменологического сходства между данным явлением и эффектом Кока, индуцированным субоптимальными концентрациями С02 в. присутствии высоких концентраций 02.

Причина появления эффекта Кока у хлореллы, фасоли и протопластов гороха при низком содержании С02 и высоком содержании 02 нам пока не вполне ясна. Поскольку, даже в условиях атмосферного воздуха, скорость образования фотодыхательного гликолата в хло-ропластах Cg-растений вполне соизмерима со скоростью фотосинтеза, ею может быть сильное закисление внутренней фазы тилакоидов из-за подкисления стромы хлоропластов гликолевой кислотой. Еще одной причиной сильного зачисления содержимого тилакоидов в этих условиях может быть активация псевдоциклического фотофосфорилирования и следующее за этим подавление выхода Н4" из тилакоидов в сторому высоким уровнем фосфорилирующего потенциала в хлоропласте.

Не исключено также, что эффект Кока в С02-лимитирующих условиях появляется из-за резкой активации/инактивации фотодыхания при интенсивности света, соответствующей данному явлению. У очищенной РуБФ-карбоксилазы резкое усиление оксигеназной активности происходит при pH >8.5 (Tolbert, 1973). Поскольку светозависимое подщелачивание среды по нашим данным и светозависимое подщелачи-вание стромы хлоропластов по данным Heidt et al (1973) и Enser and Heber (1980) при интенсивности света 5 Вт/м2 близко к максимуму, то возможно указанная и более высокие интенсивности света посредством pH стромы активируют in vivo оксигеназную функцию

РуБФ-карбоксилазы и, в итоге, фотодыхание по гликолатному пути. В соответствии с этой гипотезой, излом восходящего участка световой кривой фотосинтеза в эффекте Кока происходит не на уровне фотосинтетического транспорта электронов, а обусловлен противоположной направленностью фотосинтетического и фотодыхательного газообмена и увеличением затрат энергии на фиксацию С02.

выводы

о

1. Интенсивность света около 5 Вт/м является пороговой в регуляции фотосинтетического электронного транспорта внутритила-коидным рН у гороха. Вследствие этого, при чрезмерном закислении внутренней фазы тилакоидов, у восходящих участков световой кривой реакции Хилла и фотосинтеза при' интенсивности света около 5 Вт/м2 появляется излом (эффект Кока), делящий восходящие участки на два линейных отрезка: нижний - крутой и верхний - пологий.

2. Температура влияет на эффективность регуляции нециклического электронного транспорта внутритилакоидным рН, но не влияет на значение пороговой интенсивности света в данной регуляции. Влияние температуры объяснено существованием возможной связи между температурой и значением рН внутренней фазы тилакоидов.

3. Величина пороговой интенсивности света в регуляции электронного транспорта внутритилакоидным рН не зависит от степени закисления содержимого тилакоидов. Поэтому наличие светового порога объяснено тем, что чувствительное к рНвн окисление пластохи-нола в цитохром ъ6/í комплексе становится местом регуляции транспорта электронов лишь при интенсивностях света выше 5 Вт/м2.

4. Эффект Кока, появляющийся при чрезмерном закислении внут-ритилакоидного пространства, идентичен эффекту Кока, появляющемуся при низком отношении С02/02 в окружающей среде, но в отличие от последнего его устранению способствует не снижение концентрации 02 в среде, а подщелачивание внутренней фазы тилакоидов.

5. На насыщающем свету концентрации С02 от 0 до 0.06 мМ, от 0.06 до 0.60 мМ и выше 0.6 мМ являются соответственно субоптимальными, оптимальными и сверхоптимальными (неблагоприятными) для протопластов гороха. В отличие от насыщающего света, много больше (>2.5 мМ) С02 требуется для подавления фотосинтеза протопластов при освещенностях, соответствующих восходящему участку световой кривой фотосинтеза.

Работы, опубликованше по материалам диссертации

1. Бородин В.Б., Демидов Э.Д. Эффект Кока и световой порог фотофосфорилирования. //Сб. научных работ республ. конфер. "Растительность и пути регуляции ее жизнедеятельности." Баку-ЭЛМ, 1986, С. 105-106.

2. Бородин В.Б., Егоров В.П., Белл JI.H. Эффект Кока и его проявление у хлоропластов, протопластов и интактного листа фасоли. //Физиология растений, 1988, Т.35, Вып.5, Стр. 977-985.

3. Бородин В.Б., Игнатова Л.К. 0 связи между эффектом Кока и процессом переноса электронов в электрон-транспортной цепи хлоропластов. //ДАН СССР, 1989, Т. 304. X 5. С. 1276-1279.

4. Бородин В.Б., Игнатова JI.K. 0 вкладе фотосинтетического электронного транспорта в эффект Кока. //Тезисы докладов IV Конференции молодых ученых. Пущино, 1989, С. I13—I15.

5. Бородин В.Б., Егоров В.П. Эффект Кока и его проявление у хлоропластов, протопластов и интактного листа фасоли. //Тезисы докладов IV Конференции молодых ученых. Пущино, 1989, С. 115.

6. Borodin V.B., Ignatova' L.K. The Kok effeot in photosynthesis of pea protoplasts. "//Abstr". of 7th Congr. of the FESPP -Physiologie Plantarum, 1990, V. 79, Faso. 2, Part 2, P. A59.

7. Бородин В.Б. Сравнительное изучение электронного транспорта у промытых и непромытых хлоропластов гороха. //Тезисы докл. и сообщений международной конференции "Фотосинтез и фотобиотехнология." Пущино, 1991, С. 46-47.

8. Бородин В.Б. Эффект Кока у гороха. Сравнительное изучение электронного транспорта у промытых и непромытых хлоропластов. // Физиология растений, 1992, Т. 39, Вып. 2, С. 344-352.

9. Бородин В.Б., Опанасенко В.К. Зависимость восходящего участка световой кривой реакции Хилла от протонной проницаемости тилакоидных мембран: роль внутритилакоидного pH. //Докл. Акад. Наук, 1994, Т. 339, № 5, С. 694-696.

10. Бородин В.Б. Фотосинтетический обмен 02 у Chlorella при адаптации к низкой концентрации С02 на свету разного спектрального состава. //Физиология растений, 1995, Т. 42, J6 I, С. 38-44.

11. Бородин В.Б., Опанасенко В.К. Световой порог в регуляции линейного электронного транспорта внутритилакоидным pH. //Тезисы международной конференции "Биоэнергетика фотосинтеза", Пущино, 1996, с. 45.