Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Суточные ритмы в метаболизме

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Суточные ритмы в метаболизме"

АКАДЕМИЯ НАУК СССР ОРДЕНА ЛЕНИНА ИНСТИТУТ ШОХИМЙИ имени А.Н.БАХА

Х-3

На правах рукописи

КАМИНСКИЙ Юрий Георгиевич

УЖ 577.121; 577.124.

СУТОЧНЫЕ ЮТЛЫ Б МЕТАБОЛИЗМЕ

03.00.04 - Биологическая химия

Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук в форме научного доклада

Москва - 1989

Ужа

Работа выполнена в Институте биологической физики АН СССР

Официальные оппоненты: доктор биологических наук,

профессор А.В.Котельникова

доктор химических наук Б.И.Курганов

доктор биологических наук, профессор Л.Д.Лукьянова

Ведущее учреждение:_ Институт эволюционной физиологии и

биохимии им. И.М,Сеченова АН СССР •

Защита диссертации состоится " _ "_ 1990 г.

в 10 час на заседании специализированного совета Д 002.96.01 пс защите диссертаций на соискание ученой степени доктора наук щ» Институте биохимии им. А.Н.Баха АН СССР CII707I, Москва,. Ленинский проспект, 33, корп. 2).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологической литературы АН СССР (Москва, Ленинский проспект, 33, корп.]

Автореферат разослан " _ " _ 1990 г.

Учений секретарь специализированного совета доктор химических наук

¿А

S К.Л.Гладилин

Всего около трех десятков лет отделяют нас от того периода времени, когда возникло новое учение о биологических ритмах или биоритмология (На1Ьеге et а1о, 1958,1959). Хотя интерес к биологическим ритмам прослеживался много раньше, реальный прогресс в их исследовании наметился в тридцатке годы нашего столетия и лишь еще через 30 лет эти исследования превратились в самостоятельный раздел биологии.

Насколько велика роль биоритмов в жизни на Земле, ясно уже из того неоспоримого факта, что кавдый организм, начиная от микроорганизмов и кончая человеком, содержит в себе биологические часы, не может без них существовать.

Биоритмология объединяет всевозможные ритмические проявления деятельности живых систем, включая короткопериодическш (с минутным, секунднда, более коротким периодом), суточные, лунные, месячные, сезонные, годовые и другие колебания. Основная цель биоритмологии - установление закономерностей протекания биологических процессов во времени?

Над проблемами биоритмов работали многие русские и советские физиологи, такие как члены Российской академии наук И.П.Павлов, И.М.Сеченов, Н.Е.Введенский, А.А.Ухтомский,' В.В.Парин, наши современники Ф.И,Комаров, Н.А.Агаджанян, Г.Д.Губин, Ю.А.Романов, В.ВЛернытев, Л.А.Цанин, Л.А.Николаев и многие другие, работники Института биологической физики и Научного центра биологических исследований АН СССР С.Э.Шноль, А.М.Молчанов, М.Н. Кондрашова, Е.Е.Сельков, Ю.В.Евтодиенко. Актуальность исследования биоритмов подтверждается лавиной диссертаций, защищенных в 1970-1980-е годы в Пущино и посвященных разным аспектам биоритмологии: кандидатских моей, А.В.Гюльханданяна, Э.Холмухамедова,

B.Федькиной, А.Савельева, Е.Косенко, А.Кондрашова, докторских

C.Э.Шноля, Ю.В.Евтодиенко, Е.Е.Селькова, Е.П.Четвериковой.

И тем не менее слишком много вопросов поставлено перед биоритмологией, чтобы их можно было решить в считанном числе научных исследований. Попрежнему неизвестно, что представляют собой биологические часы. Пока не выяснен ни один механизм, лежащий в основе какого-либо колебательного процесса биологической црироды.-

Одной из основных геофизических ситуаций является смена дня и ночи, которая проявляется в изменениях освещенности, температуры окружающей среды и т.д. Приспособление биологических объектов к этому режиму определило возникновение ритма их жизнедеятельности по суточному циклу. Суточные ритмы наиболее широко распространены в природа в сравнении с другими колебаниями био-

логической природы к наиболее удобны для наблюдения. Уже обнаружено множество процессор и функций в организме животных и человека, которые имеют четкий суточный ритм.

Биологические ритмы присущи не только физиологическим функциям, работе органов и систем организма, но также и способности отдельных клеток, составляющих ткани, метаболизировать проникающие в них извне питательные вещества и лекарственные препараты. Биологический ритм - это не что иное, как отражение состояния обмена веществ у организма.

Вопрос о суточных ритмах в метаболизме привлекает внимание исследователей уже потому, что энергетическому обмену приписывается роль генератора суточных, равно как и других ритмов. Однако до настоящего времени даже не выяснено, какая из реакций или какая группа реакций энергетического обмена ответственна за генерацию или косвенно участвует в генерации ритма.

Например, всем известна пионерская научная и пропагандистская работа Е.Е.Селькова, который систематически на протяжении более чем десятка лет доказывает, что у одноклеточных организмов клеточным циклом заведует одна ферментативная реакция - фос-фофруктокиназная, пируваткиназная или иная реакция. Но пока нельзя сказать, что такая гипотеза справедлива для клеток всех типов и для многоклеточных организмов. Последнее просто не было изучено.

Исследование суточной временной организации метаболизма имеет не только теоретическое, но и огромное практическое значение. Сегодня перед физиологией, медициной, ветеринарией стоит задача объективного определения нормы биохимических и физиологических параметров жизнедеятельности. Одной из перспективных задач представляется разработка хронобиологической нормы здорового организма. Хорошо известно также, что при нарушении нормального хода биологических часов нарушается обычный характер деятельности человека: падает физическая и умственная работоспособность, ухудшается аппетит, возникают различные заболевания. Нарушение суточного ритма какой-либо функции может служить одним из самых первых сигналов наступления патологии: при рассогласовании по фазе вдркадных ритмов внутри организма возникает состояние внутреннего десинхроноза.

Теоретические основы биоритмологии в метаболизме разработаны крайне слабо. Энергетический обмен с позиций биоритмологии исследован на уровне отдельных ферментов или на самом высоком уровне - по потреблению кислорода. Многоферментные системы в целом, индивидуальные ферменты промежуточного обмена в комплек-

се и метайолиты полиферментных систем не охарактеризованы в суточной динамике. Существующие теоретические представления о циркадной организации метаболизма основаны на одинаковости метаболических путей и механизмов их регуляции у разных животных и в разных органах, о которой пока можно только предполагать (Сель-ков, 1978; Нагае1апй еЧ а1., 1973).

Цель настоящей работы состоит в выяснении следующих вопросов:

- циркадной временной организации углеводного и энергетического обмена у животных в норме и при разных воздействиях;

- принципов и механизмов, лежащих в основе циркадной организации энергетического обмена.

Конкретные задачи, определяемые целями исследования:

1) Изучение циркадной организации активности ферментов углеводного обмена и сопряженных с ним метаболических путей, а также ферментов митохондрий в печени крыс и голубей.

2) Измерение концентраций субстратов, конечных и промежуточных продуктов метаболических систем в сердце, печени и крови животных в течение суток.

3) Определение лимитирукщих стадий в углеводном обмене на протяжении суток.

4) Анализ циркадной регуляции обмена адениннуклеотадов в тканях животных.

5) Выяснение роли субстратных циклов в генерации суточных ритмов углеводного обмена в печени.

6) Изучение связи мевду окислительным шосфорилированием и метаболическим состоянием митохондрий в течение суток.

7) Изучение возможности использования параметров биоритмов метаболизма в тканях животных одного вида и типа как критерия в оценке суточных ритмов в метаболизме у других видов и в других тканяхо

8) Исследование влияния старения организма, хронического потребления алкоголя и его отмены у крыс на суточные ритмы в изменениях активности ферментов и концентраций интермедиатов углеводного и энергетического обмена в печени.

Основные результаты и их научная новизна. Научная новизна исследования состоит в проведении систематического экспериментального и теоретического анализа периодических процессов в метаболизме, в одновременном измерении активности ферментов и концентраций метаболитов для анализа периодических процессов. Использован биоритмологический подход как инструмент для выяснения временной организации метаболизма, для уточнения функциональных и

молекулярных механизмов, лежащих в основе циркадной регуляции энергетического обмена, для разработки гипотез о временной организации метаболизма и ее нарушениях в разных условиях.

В работе впервые установлено или выполнено следующее:

1. Сформулировано положение, согласно которому все ферменты углеводного энергетического обмена, в том числе высокоактивные и катализирующие равновесные реакции, испытывают суточные изменения активности.

2. Измерены тканевые концентрации метаболитов и использованы в анализе метаболических потоков на протяжении суток. Обнаружено, что концентрации всех интермедиатов углеводного, аминокислотного, фосфорного обмена, метаболитов других путей в ткани и митохондриях печени крыс и голубей, ткани и митохондриях сердца животных изменяются ритмически в течение суток. Концентрации индивидуальных аденнннуклеотидов и их суша в тканях и митохондриях тканей животных изменяются в широких цределах на протяжении суток.

3. Выяснено, что концентрации субстратов в парах глюкоза/ глюкозо-6-фосфат, фруктозо-6-фосфат/фруктозо-1,6-дифосфат и пи-руват/фосфоенолпируват в печени крыс изменяются синфазно, а следовательно в циркадной регуляции углеводного обмена в печени участвуют неключевьв ферменты. Тканевые и цитоплазматические концентрации интермедиатов углеводного обмена от глюкозы до три-озофосфатов в печени голубя изменяются синфазно в течение суток, а значит соответствующий участок гликолитической цепи является квазиравновесным в суточном масштабе времени.

4. Выявленная синфазность суточных изменений концентраций интермедиатов углеводного обмена противоречит известному положению о том, что футильные субстраткш циклы гликолитической системы являются (единственными) генераторами суточных ритмов в метаболизме в печени животных двух видов.

5. Приведены доказательства того, что суточные изменения показателей обмена адениннуклеотвдов в печени крысы, печени и сердце голубя принципиально различны, то есть механизмы циркадной регуляции обмена адениннуклеотвдов в тканях трех типов отличаются по крайней мере количественно. Сформулировано положение о том и приведены доказательства того, что печень крысы, печень голубя и сердце голубя отличаются в отношении суточных ритмов в углеводном обмене и обмене аденнннуклеотидов - наиболее хорошо изученных метаболических системах.

6. Предложены два новых метода анализа метаболических потоков в животных тканях по измеренным тканевым концентрациям мета-

болитов: с использованием кажущихся констант равновесия ключевых ферментативных реакций и корреляционный метод. Этими методами охарактеризована суточная ритмическая организация всего углеводного обмена в печени крысы.

7. Обнаружена корреляционная связь между суточными изменениями концентрации гликогена и фонда аминокислот в печени крысы и на этой основе сделан вывод о том, что регуляция суточных ритмов в метаболизме может осуществляться на уровне цикла трикарбо-новых кислот и что для печени эти_ ритмы являются неэндогенными.

8. Разработаны новые методы расчета концентраций метаболитов в водных объемах митохондрий и цитозоля клеток печени по измеренным концентрациям этих метаболитов в ткани и митохондриях печени и расчета концентрационного градиента для глюкозы между водными объемами цитозоля клеток печени и плазмы крови.

9. Обнаружены изменения суточных ритмов в углеводном обмене в печени крысы при старении организма. Характер суточных изменений тканевых концентраций метаболитов, фосфатного потенциала, отношений действующих масс аденилаткиназы, фосфоенолцируваткар-боксикиназы, пируваткарбоксилазы и отношения НАД+/ИАД.Н в печени старых крыс отличен по сравнений с молодыми животными.

10. Продемонстрирована десинхронизация ритмов в суточных изменениях концентраций глюкозы, гликогена, адениннуклеотидов и других метаболитов в печени крысы при хроническом потреблении и после отмены алкоголя. Оба воздействия не просто нарушают суточные ритмы в метаболизме, но уничтожают их.

11. Выявлено возникновение патологической гипогликемии у крыс при сохранении запасов гликогена в печени после прекращения потребления алкоголя, что может оказаться главной причиной алкогольного абстинентного синдрома. Показано также, что это связано с увеличением градиента концентрации печень/кровь для глюкозы.

12. Выяснено, что суммарная концентрация адениннуклеотидов в печени крысы снижается на 25-3<Ж при естественном старении животных, что ее сниженный уровень поддерживается на всем протяжении суток и может быть нормализован введением янтарнокислого аммония и что суточные изменения в расцределении интермедиатов энергетического обмена в печени крысы нарушаются при старении.

13. В результате анализа данных литературы для гепатоцитов, тканевых срезов и изолированной перфузируемой печени и на основе экспериментальных данных собственных исследований, выполненных на печени животных in vivo, сформулировано положение о том, что гепатоциты во всевозможных экспериментальных условиях и при раз-

ных физиологических состояниях организма функционируют преимущественно на выброс глюкозы в кровь.

Апробация работы. Результаты работы доложены на: П Всесоюзном симпозиуме по биофизике мембран (Паланга, 1972); 1У Международном биофизическом конгрессе (Москва, 1972); Всесоюзном симпозиуме "Ионный транспорт через биологические мембраны" (Киев, 1970); УП, УШ, X к XI Всесоюзных симпозиумах по структуре и функциям митохондрий (Москва-Пущино, 1972-1981); Международном симпозиуме по биохимии митохондрий (Одесса, 1976); Всесоюзном совещании "Механизмы адаптации живых организмов к влиянию факторов среды" (Ленинград, 1977); У, У1 и УП Всесоюзных семинарах "Регуляция энергетического обмена и физиологическое состояние" (Пущи-но, 1977-1979); УШ и IX Международных коллоквиумах по биоэнергетике к митохондриям (Смояенице, ЧССР, 1979; Эльбингероде, ГДР,

1981); I и П Всесоюзных симпозиумах "Искусственное увеличение видовой продолжительности жизни" (Москва, 1978, 1980); Всесоюзном симпозиуме "Молекулярные и клеточные механизмы старения" (Киев, 1981); У1, УП и УШ Объединенных симпозиумах биохимических обществ СССР и ГДР (Таллинн, 1981; Лейпциг, 1983; Рига, 1985); У1 Всесоюзной конференции по экологической физиологии (Сыктывкар,

1982); I Всесоюзном биофизическом съезде (Москва, 1982); 1У Всесоюзном съезде геронтологов и гериатров (Киев, 1982); I съезде Белорусского общества геронтологов и гериатров (Минск, 1983); Всесоюзном симпозиуме "Механизмы временной организации клетки и их регуляция на различных уровнях" (Пущино, 1983); 1У Всесоюзном симпозиуме "Пентозофосфатный путь'превращения углеводов, его механизмы и регуляция" (Калинин, 1984); Всесоюзном симпозиуме "Метаболическая регуляция физиологического состояния" (Пущино, 1984); У Всесоюзной конференции по биохимии мышц (Тбилиси, 1985); Всесоюзном симпозиуме "Молекулярные механизмы и регуляция энергетического обмена" (Пущино, 1986); Совещании по мембранам для участников стран-членов СЭВ (Москва, 1987); Всесоюзном симпозиуме "Энергетические аспекты клеточной физиологии" (Пущино, 1988); Всесоюзном симпозиуме "Эколого-физиологические проблемы адаптации" (Москва, 1988); Всесоюзной конференции по биохимии мышц (Тбилиси, 1989); Международном симпозиуме "Молекулярная организация биологических структур" (Москва, 1989).

Основные результаты проведенных исследований отражены в 71 публикации.

МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Вся экспериментальная часть работы выполнена на животных (крысах, мышах, кроликах, голубях), выращенных в питомнике-виварии Института биологической физики АН СССР.

Использованные в работе методические приемы описаны в публикациях. Как правило, забой животных проводили декапитацией. В .течение 5-7 с отбирали кровь и часть печени или сердца, ткани немедленно замораживали в жидком азоте. Тканевые экстракты готовили в смеси хлоркой кислоты и этанола, охлавденной до -18°С, и центрифугировали при -Ю°С. После доведения рН'до 6,5-7 в тканевых экстрактах определяли концентрации метаболитов ферментативными методами, описанными в литературе (Bergmeyer, 1974); все применяемые методы были в той или иной степени модифицированы.

В белковых экстрактах тканей, полученных центрифугированием гомогената или осмотически разрушенных митохондрий цри 12000 g в течение 30 мин, определяли активность ферментов спектрофотомет-рическими методами (Bergmeyer, 1974).

Для ферментативного определения метаболитов в тканевых экстрактах разработан и создан специальный высокочувствительный флуориметр, в котором применены принципиально новый способ регистрации флуоресценции под углом 180° к падающему световому потоку^ (разработанный, внедренный и до сих пор используемый только на кафедре биохимии МГУ группой работников под руководством проф. А.Д.Виноградова) и принципиально новый способ пространственного разделения возбуждающего света и потока флуоресценции, ранее и теперь нигде не применявшийся.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

I. Суточные ритмы в метаболизме

Большинство наблюдаемых в животном мире биохимических, физиологических и поведенческих явлений подвержено суточным колебаниям. В организме суточные ритмы обычно синхронизуются 24-часовыми ритмами окружающей среды. Однако даже в неменяющихся окружающих условиях, которые могут быть достигнуты в лаборатории, сохраняются многие суточные ритмы. Это послужило основанием считать, что суточные колебания являются эндогенными ритмами и управляются внутренними биологическими часами.

Всякий организм испытывает потребность в питательных.веществах. Неравномерное поступление этих веществ в разное время суток приводит к изменениям концентраций субстратов и эффекторов в-воротной вене печени, к усилению или ослаблению транспортных, метаболических процессов и энергетического обмена в печени.

2. Ферменты углеводного обмена

Судя по концентрации глюкозы в крови - главному показателю углеводного обмена у высших животных,- интенсивность углеводного обмена в печени изменяется ритмически в течение суток. Долгие десятки лет исследователи оценивали интенсивность метаболических путей по активности индивидуальных ферментов этих путей. Естественно ожидать и ритмического изменения активности ферментов, участвующих в углеводном энергетическом обмане. Действительно, целенаправленные исследования подтвердили это: активность ключевых ферментов углеводного обмена в печени крысы меняется ритмически в течение суток. На Рис.1 приведены наши экспериментальные данные, полученные на крысах и включающие активность разных ферментов. в печени. Если мы внимательно проследим за характером суточных изменений активности всех этих ферментов, то мы увидим следующую картину: с суточным ритмом изменяется актшостъ каждого фермента углеводного энергетического обмена и кавдого фермента сопряженных метаболических путей. Наиболее удивительным является тот факт, что с суточными ритмами изменяется активность ферментов углеводного обмена, которые не считаются лими-

ш Я "

-А

Рис.1. Суточные изменения актив-го ности ферментов в печени крыс: А - таюкокиназы, Б - фосфофрукто-0 4 киназы,

В - фруктозодифо-

сфатазы, Г - пируваткиназы, °-г Д - лактатдегидро-геназы, Е - малатдегидро-о.1 геназы,

Ж - изоцитратде-гидрогеназы, 3 - глюкозо-6-фос-фатдегидроге-назы,

м И - малатдегидро-геназы декар-боксилирующей, К - алкогольдегид-

рогеназы. Активность выраже-о.1 на в мкмоляхДшн на I мг белка.

7 13 19 » 1 7 7 13 19 1 7

тирующими или даже катализируют равновесные реакции. Следовательно, эти ферменты могут вносить свой вклад в генерацию суточного ритма углеводного обмена.

Приведенные данные, шесте с многочисленными данными литературы, свидетельствуют о том, что не только на уровне ключевых ферментов могут генерироваться суточные колебания в углеводном обмене, что суточные ритмы присущи всей системе энергетического обмена,

В 1973 г в мировой литературе сформировалось мнение, укрепившееся до настоящего времени, что существует суточная ритмическая организация метаболизма в печени (Hardelaad et al., 19733. Такая организация подразумевает одинаковость характера суточных изменений кавдого показателя метаболизма в печени животных разных видов. Проведенный нами экспериментальный анализ суточной динамики углеводного обмена показал, что такая трактовка чрезмерно упрощает картину. Активность любого фермента энергетического обмена в печени изменяется с конкретным суточным ритмом -конкретными фазовыми положениями максимумов и минимумов, амплитудой ритма, среднесуточными значениями. Однако отсутствуют как единая для разных: видов животных закономерность в суточных изменениях активности какого-либо одного фермента, так и единая закономерность в ритмической организации всей ферментной системы у каждого вида животного.

Не только по фазе отличаются суточные изменения активности разных ферментов энергетического обмена. Характер суточных изменений активности одного и того же фермента различен в печени разных животных. Более того, отсутствует строгая закономерность в ритмических изменениях активности одного и того же фермента углеводного обмена в печени одного вида животных, измеренной в разных условиях. В частности, причиной этого может быть то, что разные' авторы используют неодинаковые методы измерения активности.

Анализ наших экспериментальных данных по активности ферментов углеводного обмена и сопряженных путей шесте с данными литературы показал также, что существуют разные механизмы регуляции каждого фермента в течение суток.

Взятые шесте, перечисленные данные означают, что для выявления временной организации метаболизма в суточном масштабе недостаточно определения активности ферментов принятыми методами. Необходимо либо усовершенствовать методы определения активности ферментов (например, развить измерение активности in vivd. либо стандартизовать существующие методы. Кроме того, крайне

желательно привлекать дополнительные методы анализа метаболических потоков.

3. Суточные изменения концентраций метаболитов

В качестве альтернативного и дополнительного способа анализа суточных ритмов в метаболизме мы предложили использовать измеренные внутриклеточные концентрации метаболитов. Поскольку эти концентрации могут быть измерены в условиях in vivo, они адекватно отражают метаболические события в живой клетке, а метод анализа, использующий концентрации метаболитов, может стать наиболее перспективным и применимым на уровне организма. Такой подход оказался очень продуктивным в исследовании метаболизма у животных в последние 30 лет, однако он пока не применялся в изучении суточной динамики метаболизма.

В печени ярые, печени и сердце голубей концентрации всех измеренных метаболитов изменяются в течение суток. На Рис.2 приведены наши экспериментальные данные по тканевым концентрациям гликогена, глюкозы, глюкозо-6-фосфата, фруктозо-1,6-дифосфата, фосфоенолпирувата, пирувата, малата и глутамата в печени крыс, на Рис.3 - суточные изменения концентраций АТФ, АДФ, АМФ, суммы адениннуклеотцдов, аденилатного энергетического заряда, потенциала фосфорилирования, отношения АТФ/АДФ и отношения действующих масс для адеяилаткиназы в печени и сердце голубя. Аналогичные данные были получены на протяжении двух последовательных суток.

Рис.2. Изменения концентраций метаболитов в печени крысы в течение суток.

Сокращения: Г6Ф - глюкозо-6-фосфат; ФДФ - фруктозо-1,6-дифосфат; ФШ - фосфоенолпи-руват.

Результаты выражены в процентах относительно среднесуточного значения.

По оси абсцисс - время суток (часы).

Звездочками отмечены значения каждого показателя на протяжении вторых суток эксперимента.

Рис.3. Суточные изменения концентраций адениннуклеотидов ж показателей обмена адениннуклеотидов в печени (слева) и сердце (справа) голубя.

Обозначения:

2АН = АТФ + АДФ + AI® -сумма адениннуклеотидов;

ЭЗ = (АТФ + 1/2 АДФ)/1АН - аденилатный энергетический заряд;

ПФ = АТФ/АДФ-Р.^ - потенциал фосфорилирования;

ГАК = АТФ.АМФ/АДФ2 - от-пшение действующих масс для аденилаткиназной реакции.

Оказалось, что по всем указанным показателям ритмы первого дня совпадают с ритмами второго дня наблюдений с коэффициентами ранговой корреляции не менее 0,8. Несколько хуже бьла корреляция между первым и вторым днями для тканевых концентраций лакта-та, аспартата, аланина, 2-окооглутарата, глюкозо-1-фосфата, Фру-ктозо-6-фосфата, триозофосфатов, глицерина, глицерол-3-фосфата, 3-гидроксибутирата, ацетоацетата, мочевины, аммония и фосфата неорганического. Однако, ни в одном случае коэффициент корреляции не был меньше 0,54.

Мы разработали специальный метод'расчета концентраций метаболитов в водных объемах цитоплазмы и митохондрий и с помощью этого метода показали, что тканевые концентрации глюкозы, глюко-зо-6-фосфата, фруктозо-6-фосфата, фруктозо-1,6-дифосфата и триозофосфатов в печени почти в точности отражают их цитоплазматиче-ские концентрации.

4. Суточные изменения концентраций и показателей обмена адениннуклеотидов

Особого внимания заслуживает тот факт, что такие фундаментальные показатели энергетического обмена, как суммарная концен-

трация адениннуклеотидов, аденилатный энергетический заряд и кажущаяся константа равновесия аденилаткиназы, изменяются в широких пределах на протяжении суток (Ркс.З). До сих пор во всей исследовательской литературе было принято считать эти показатели истинными константами, не меняющимися или изменяющимися незначительно даже при сильном стрессе. Эти новые данные в корне меняют установившееся представление о. механизмах регуляции энергетического обмена в тканях животных. Именно, 30-50^-ное изменение показателей обмена адениннуклеотидов в печени крысы на протяжении естественных суток свидетельствует о поддержании их не строго постоянными, а постоянными лишь в определенных пределах. 2-3-кратнда изменения этих же показателей в тканях голубя указывают на существование механизма регуляции энергетического обмена, не направленного на поддержание постоянства суммы адениннуклеотидов и равновесия аденилаткиназной реакции. Кроме того, эти результаты указывают на существенные различия в метаболических свойствах между тканями трех типов: печени крысы, печени голубя и сердца голубя.

Мы провели сравнительные исследования распределения метаболитов в тканях голубя и крысы в течение суток, которые подтвердили и расширили эти различия. Оказалось, что печень голубя от печени крысы и других млекопитающих многочисленными метаболическими характеристиками: концентрациями метаболитов в митохондриях и цитозоле, направлением их изменений в течение суток, окислительно-восстановительным состоянием митохондрий и цитозоля и его изменениями в течение суток, метаболическими свойствами аденилатной системы и внутриклеточной локализацией ферментов энергетического обмена. Сердце голубя отличается от печени голубя и печени крысы характером суточных изменений концентраций адениннуклеотидов, показателей обмена адениннуклеотидов, корреляционными связями между суточными изменениями различных метаболических показателей. Это является дополнительным основанием считать, что механиамы регуляции энергетического обмена в тканях трех типов отличаются количественно или даже качественно. Следовательно, интерпретацию метаболических событий в эксперименте, равно как и построение кинетических и математических моделей метаболизма, следует проводить с большой осторожностью и не вообще для любой или "усредненной" клетки, а лишь для клеток данного конкретного типа. Существующие общие клеточные модели, в которых принимаются постоянными сумма адениннуклеотидов, энергетический заряд аденилатной системы и кажущаяся константа равновесия аденилаткиназной реакции, представляются малопригол-

ними для описания динамики конкретных метаболических систем.

5. Концентрации углеводов в суточном ритме. Роль субстратных циклов

Регулирующие, или лимитирующие скорость, стадии в полиферментной системе могут быть выявлены по правилу перекреста. Кратко это правило гласит: если регуляторный фактор действует на данную ферментативную реакцию, ограничивая ее скорость, то концентрации субстратов регулируемой реакции должны с необходимостью возрастать, а концентрации ее продуктов падать. Следовательно, концентрации субстратов и продуктов регулируемой.стадии должны изменяться в противоположных направлениях (противофазно).

Наши эксперименты показали, однако, что концентрации субстратов в парах глюкоза/глзокозо-6-фосфат, фруктозо-6-фосфат/фрук-тозо-1,6-дифосфат и пируват/фосфоенолпируват в печени крысы изменяются ритмически в течение суток, но не противофазно, а син-фазно. Это означает, что все ферменты, катализирующие взаимопревращения этих субстратов, не лимитируют углеводный обмен в суточном масштабе.

Кроме того, мы нашли, что синфазно в течение суток изменяются концентрации глюкозы и глюкозо-6-фосфата в печени крыс и голубей, в печени крыс в зимний и весенний сезоны, у крыс при хроническом потреблении и после отмены алкоголя (Рис.4). Причем

Рис.4. Синхронность суточных изменений концентрации глюкозы и глюкозо-6-фосфата в печени крысы.

Пунктир - изменения концентрации глюкозы, сплошная линия -изменения концентрации глюко-зо-б-фосфата.

А - контроль, Б - после 4 месяцев потребления алкоголя животными, В - в первые сутки после отмены алкоголя.

Концентрации метаболитов выражены в мкмолях на I г ткани: глюкоза по левой ординате^ глюкозо-6-фосфат по правой оси ординат.

это происходит несмотря на то, что характер суточных ритмов в изменениях концентраций' глюкозы и глюкозо-6~фосфата несколько изменяется весной по сравнению с зимним периодом (Сравни Рис.2 и Рис,4).

Таким образом, синфазность суточных изменений концентраций этих метаболитов представляет явление, общее для печени животных двух видов в разных окружающих условиях.

Точно так, в печени голубя внутриклеточные концентрации всех интермедиатов гликолитической цепи от глюкозы до триозофос-фатов изменяются с суточным ритмом и строго синфазно (Рис.5).

Рис.5. Суточные изменения концентраций гликояитических интермедиатов в печени голубя.

Сокращения: Г6Ф - глюкозо-6-фосфат; Ф6Ф - фруктозо-6-фос-фат; ФДФ - фруктозо-1,6-дифос-фат; триозофосфаты - суша гяицеральдегид-З-фосфата и диоксиацетонфосфата. .

Концентрации метаболитов выражены в процентах относительно среднесуточного значения.

глюкоза

03 15 21 03 03

Это означает, что в печени голубя, как и в печени крысы, ритмы углеводного обмена генерируются не в этом участке гликолитической цепи.

Синфазные изменения внутриклеточных концентраций интермедиатов свидетельствуют о том, что гликолитическая система, по крайней мере соответствующий ее участок мезду глюкозой и триозо-фосфатами, изменяет активность в течение суток как единое целое, то е'сть весь этот участок является как бы "равновесным" в суточном масштабе времени.

Существует мнение, подкрепленное исследованиями на однокле-

точных организмах и в модельных системах (Сельков, 1978; Hess, Boiteux, 1968 ), что ^утильные субстратные циклы цредставляют собой метаболические генераторы автоколебаний в клетке и что в ходе автоколебаний в гликолитической системе внутриклеточные концентрации субстратов в парах глюкоза/глюкозо-6-фосфат и фрук-тозо-6-фосфат/фруктозо-1,6-дифосфат изменяются цротивофазно. Отскща следует, что противофазные изменения концентраций субстратов в указанных парах в течение периода колебаний гликолитиче-ского потока должны быть прямым следствием непосредственного участия субстратных циклов в генерации этих колебаний и, напротив, функционирование субстратных циклов является необходимым и достаточным условием для противофазных изменений концентраций этих субстратов.

В наших экспериментах концентрации глюкозы и глюкозо-6-фос-фата, фруктозо-6-фосфата и фруктозо-1,6-дифосфата в печени крыс и голубей изменяются синфазно в течение суток, а следовательно не футильньв субстратные циклы определяют колебательное поведение гликолитического потока в течение суток.

Причиной противоречия между экспериментом и математическим расчетом может быть чрезмерное упрощение математической модели, описывающей колебания в энергетическом обмене. Немаловажно также то, что модель построена для одноклеточных систем и что в основу модели положены стабильные уровни АТФ, АДФ и АШ в клетке и свойство футильного цикла фосфофруктокиназа/фруктозодифосфатаза как "переключателя" направления гликолитического потока. В модели не учтены также отличия клеток различных типов. 6. Анализ суточного ритма в метаболизме Для сравнения любых двух состояний метаболизма в литературе широко используются три метода: так называемый логический метод (Greenbaum et al., 19715 Roleston, 1972 ), теорема перекреста (Williamson, 1965; Roleston, 1972) и метод анализа синтеза глюкозы по кажущемуся синтезу фосфоенолпирувата (Garber et al.,1970; Exton, 1972 ). До сих пор все эти методы не применялись в анализе суточных ритмов в метаболизме по двум главным причинам: I) суточные ритмы в метаболизме пока не были широко исследованы на уровне метаболитов; 2) из-за очень большого объема работы и чрезвычайной сложности анализа, поскольку при измерениях через каждые 3 часа на протяжении суток могут быть выделены как минимум восемь состояний метаболизма.

Мы проанализировали суточные изменения концентраций метаболитов, измеренных в печени крыс. Наши исследования показали, что повсеместно используемые методы анализа, упомянутые выше,

малоприменимы для выяснения ритмических особенностей метаболизма. Каждый из названных методов привносит ограниченную информацию и даже приводит к выводам, противоречащим выводам других методов.

Мы предложили два новых метода анализа суточной ритмичности на уровне метаболитов. Вычисление кажущихся констант равновесия для ключевых реакций, то есть отношений действующих масс для этих реакций (Рис.6), выявило следующее. Значение Г^щ в печени крысы максимально в 19-01 ч, когда отношение глюкагон/инсулин в плазме крови крыс и мышей снижается до минимума, что противоречит известной прямой связи между этим отношением и скоростью синтеза глюкозы de novo в печени. Кроме того, известно, что в ряде случаев активность фосфоенолпируваткарбоксикиназк в печени выше активности пируваткарбоксилазы. Если рассмотреть динамику отношения ГфпК+ПК №ис»6)» то окажется, что оно снижается в 22-07 ч, го есть параллельно со снижением (или сразу после снижения) отношения глюкагон/инсулин в плазме. Поскольку отношение глюкагон/инсулин коррелирует с синтезом глюкозы в печени из глю-конеогенных предшественников, следует вывод, что для характеристики суточных изменений глюконеогенного потока недостаточно определения только отношения действующих масс для фосфоенолпиру-Еаткарбоксикиназной реакции, но необходимо учитывать также пиру-ваткарбоксилазную реакцию. Кроме того, выявлено, что в печени

Рис.6. Суточные изменения отношении действующих масс для ключевых реакций углеводного обмена в печени крысы.

Сокращения:

БбФаза - глюкозо-6-фосфа-таза,

ФДФаза - фруктозодифосфа-таза,

ФПК - фосфоенолпируват-карбоксикиназа, ПК - пируваткарбоксилаза, ГК - глюкокиназа, ФФК - фосфофруктокиназа, ПКиназа - пируваткиназа.

крысы лимитирующим гдаюнеогенез метаболическим звеном является комбинированная реакция, катализируемая фосфоенолпируваткарбок-сикиназой и пируваткарбоксилазой.

Этот метод анализа далее усовершенствован путем вычисления произведений отношений действующих масс для ключевых реакций всей гликолитической цепи. Поскольку все другие реакции, кроме ключевых, катализируют высокоактивные ферменты и поскольку эти реакции находятся в состоянии равновесия или вблизи равновесия, произведение отношений действующих масс для ключевых реакций отражает относительную активность всей системы последовательно протекающих реакций. Величина произведения

П(ГНГ) = Гфгк+пк х ГфДфаза х Гр^ддд

характеризует активность всего метаболического пути синтеза глюкозы из пирувата, а произведение П(ГЛИ) = Г^ х Г^ х ГПК1Шаза характеризует активность всего пути превращения глюкозы в шгру-ват (Сокращения см. в подписи к Рис.6). Суточные изменения величины П(ШГ) коррелируют с суточными изменениями величины 1фпК-ШК с высокой степенью надежности (г =0,976, Р <. 0,001), тогда как П(ГЛИ) не коррелирует ни с одним из анализируемых показателей (Рис.7).

Рис.7, Суточные изменения отношений действующих масс для комбинированных реакций углеводного обмена в печени крысы.

А - произведение П(ШГ) отношений действующих масс для ключевых реакций глю-конеогенеза;

Б - произведение П(ГЛИ) отношений действующих масс для ключевых реакций гликолиза;

В - отношение Гфпк+пк.

Коэффициенты ранговой корреляции между П(ГЙГ) и Гфпк+пк

составляют Г=0,976 (Р< 0,001)

а между П(ГЛИ) и П(ШГ) и между ЩГЖ) и Гф1Ж+пк -

-0,091 и-0,116, соответственно.

ВФорой предложенный наш метод состоит в отыскании корреляционных связей мезду потенциалом фосфорилирования и активностью реакций углеводного обмена в печени. Основой метода является известное положение о прямой корреляции между потенциалом фосфо-рилировйния и относительной скоростью гликолиза и обратной корреляции между потенциалом фосфорилирования и относительной скоростью глюконеогенеза (огеепЬаит еЪ а!., 1971^« Такой анализ не только подтвердил верность первого метода, но и позволил качественно разрешить всю временную организацию углеводного обмена. По нашим данным, суточный период может быть условно разделен на четыре временных интервала. В промежуток времени с 16 до 22 ч в печени протекает усиленный глюконеогенез. В 22 ч наступает переходный период, заканчивающийся в I ч. В это время суток активность глюконеогенеза снижается, несмотря на максимальную активность (максимальное отношение действующих масс) фосфоенолпиру-ваткарбоксикиназы, на снижение концентраций АДФ и АМФ в печени. Состояние углеводного обмена в период с I до 7 ч характеризуется как постепенное ослабление глюконеогенеза. Остальное время суток (с 7 до 16 ч) - переходный период, в течение которого глюконеогенез постепенно усиливается. Динамика переходов в углеводном обмене соответствует последовательности явлений, индуцируемых глюкагоном, глюкокортикоидами и катехоламинами: начальной активацией фосфорилазы и накоплением аминокислот, затем активацией фосфоенолпируваткарбоксикиназы и последующим катаболизмом аминокислот.

7. Суточные ритмы метаболизма в печени упратяются экзогенно

Какой же пункт энергетического обмена может выполнять роль генератора суточных колебаний, если ключевые ферменты углеводного обмена не наделены такой функцией?

При анализе суточных изменений концентраций метаболитов, измеренных: в печени крыс, мы обнаружили дополнительную корреляционную связь. Суммарное содержание аминокислот в печени изменялось в течение суток приблизительно так, как и содержание глуга-мата (см. Рис.2) и обратно коррелировало с содержанием гликогена (г =-0,762, Р< 0,05). Противоположные изменения размеров двух депо - углеводного и аминокислотного - в течение суток предполагают, что запасы гликогена восполняются (например в процессе глюконеогенеза) при распаде аминокислот и что аминокислоты накапливаются, когда гликоген распадается. Эти два процесса ритмически чередуются на протяжении суток; они могут быть сопряжены только на уровне цикла трикарбоновых кислот и могут ритмически

контролироваться на этом же уровне.

Мы провели исследование суточной динамики окислительной активности митохондрий, концентраций метаболитов и других показателей энергетического обмена в печени. Некоторые иллюстративные результаты приведены на Рис.8. Их анализ показал, что в разное время суток скорости дыхания митохондрий определяются доступностью субстратов для окислительного фосфорилирования, градиентом электрохимического потенциала протонов на внутренней мембране, окислительно-восстановительным состоянием внутренней мембраны и матрикса. Известно, что все эти параметры митохондрий находятся под гормональным контролем: глюкагон, глюкокортикокды и катехоламины являются их положительными эффекторами.

По данным литературы, в печени животных тлеются чувствительные к глюкозе афферентные волокна, которые посредством блуждающего нерва участвуют в передаче в гипоталамус сигнала о концентрации глюкозы в воротной вене и тем самым регулируют потребление пищи. Эти же волокна имеют ответвления в поджелудочной железе, секретирующей глюкагон и инсулин, и в надпочечниках, секре-тирушщх глюкокортикоиды и катехоламины, и тем самым контролируют гомеостаз глюкозы в крови. Основными мишенями для глюкагона, глюкокортиковдов и катехоламинов в печени являются ключевые ферменты углеводного обмена и энергопреобразовательная функция митохондрий: одновременно со стимуляцией активности ключевых ферментов глюконеогенеза гормоны активируют энергопродукцию в митохондриях. Ось глюкоза (крови воротной вены) - гормональная система - митохондриальные дыхательная цепь и цикл трикарбоновых кислот может служить тем самым генератором'метаболических колебаний, которые наблюдаются в печени в течение суток. Сопоставление данных литературы и результатов собственных исследований привело нас к предварительному выводу: колебания в гликолитиче-ской системе печени есть результат действия гормонов, а в отношении метаболизма в печени гормоны выполняют роль экзогенного регулятора суточного ритма.

С гипотезой экзогенной регуляции суточных ритмов в метаболизме в печени согласуется обнаруженное равновесие в верхней части гликолитической системы, исключающее участие этой системы в генерации суточного ритма. Такая гипотеза может объяснить также множественный характер суточных ритмов активности различных ферментов энергетического обмена в печени: изменения активности ферментов в течение суток обусловлены, вероятно, не колебательной природой ферментных систем и регуляторных связей между ними, а разним действием гормонов в разных состояниях.

Рис.8. Суточные изменения отношения внутршитохондриальных АТФ/АДФ (А), содержания глутамата в митохондриях (Б, в нмолях на I мг белка митохондрий) отношений НАД"7НАЦ.Н, вычисленных по компонентам глутаматдегидрогеназной (В) и З-Д-гидроксибутиратдегидрогеназ-ной (Г) систем, и содержания З-Д-гидро-ксибутирата в ткани печени (Д) голубя.

Концентрация З-Д-гздроксибутирата в печени ХД) выражена в мкмолях на I г ткани.

Одной звездочкой (х) обозначено достоверное отличие данного показателя от всех прочих, измеренных в другие времена суток; двумя звездочками (хх) -достоверное отличие показателя, измеренного в данное время, от каждого соседнего показателя (0,001 < Р <0,05).

8. Суточные ритмы в метаболизме при патологиях Предшествующие результаты касались состояния нормы. Как оказалось, суточные ритмы в метаболизме зависят от физиологического состояния организма. Патологические изменения в метаболизме исследованы нами, в частности, на примере хронического потребления алкоголя у крыс. Как показали исследования, концентрации глюкозы в крови, глюкозы и гликогена в печени изменяются в норме с характерными суточными ритмами (Рис.9 и 10). Хроническое потребление алкоголя приводит к нарушению характера суточных изменений этих показателей углеводного обмена. Что касается со-

400 500 200

300 200 100

Рис»9. Влияние хронического потребления и отмены алкоголя на суточные Изменения концентрации гликогена в печени крыс.

А - контроль, Б - после 3,5 месяца потребления алкоголя, В - после отмены алкоголя.

Концентрация гликогена - б мкмолях на I г ткани (в глюко-зных эквивалентах). Число 10 справа на оси абсцисс - 10 ч 3-го дня эксперимента.

Рис.10. Суточные изменения концентрации глюкозы в крови и печени крыс в норме, при хроническом потреблении и после отмены алкоголя,

А - контроль, Б - после 3,5 месяца потребления алкоголя, В -после отмены алкоголя.

Сплошная линия - концентрация глюкозы в печени в мкмолях на I г ткани, пунктирная линия -концентрация глюкозы в крови в мкмолях на I г.

Число 10 справа на оси абсцисс обозначает 10 ч 3-го дня эксперимента.

держания гликогена в печени,то согласно литературе гликогенфосфо-рилаза не активируется при остром и хроническом потреблении алкоголя, а дачных по активности гликогенсинтетазы не имеется. На этом основании мы делаем предварительный вывод, что при хроническом потреблении алкоголя способность печени синтезировать гликоген ограничивается на протяжении почти полных суток. В результате этого среднесуточный уровень гликогена в печени падает в 2 раза.

Действие хронического потребления алкоголя проявляется также в потере ритма изменений концентрации глюкозы в крови и печени, хотя абсолютные значения этих концентраций меняются несильно.

Отмена алкоголя сопровождается накоплением избыточного гликогена в печени, причем снижается и амплитуда ритма, так что среднесуточный уровень гликогена становится выше нормы; суточный ритм изменений уровня гликогена становится противоположным при сравнении с нормой. Таким образом, как хроническое потребление, так и отмена алкоголя вызывают десшхроноз в обмене гликогена.

Концентрация глюкозы в крови поддерживается неизменной лишь в первые 18 ч после отмены алкоголя (Рис.10), но затем она резко снижается, и этот сниженный уровень сохраняется до окончания вторых суток. Фактически это означает, что посла отмены алкоголя гликоген печени перестает служить адекватным источником глюкозы для крови и других тканей и органов.

9.. Градиент концентрации печень/кровь для глюкозы в течение суток и его изменения ггри хроническом потреблении и после отмены алкоголя На:РисД0 показано, что концентрации глюкозы в печени и крови, отнесенные к I г ткани, близки или даже равны на всем протяжении суток. Поскольку ткань печени и кронь отличаются по содержанию воды, следует ожидать наличия концентрационного градиента для глюкозы мевду печенью и кровью. Для более точной оценки концентраций глюкозы в водных объемах печени и крови мы разработали специальный метод. Вычисления показали, что на всем протяжении суток концентрация глюкозы в цитозоле печени приблизительно в 1,5 раза выше ее концентрации в плазме крови (Рис.11). Несильно меняется это соотношение у крыс, хронически потреблявших алкоголь, и в первые 18 ч после отмены алкоголя. Однако к окончанию 24-часового периода градиент печень/кровь для глюкозы резко увеличивается до 3,5, а к окончанию вторых суток достигает величины 4,2. В результате этого нарушения наступает тяжелая гипогликемия, несмотря на переполнение печени гликогеном (См. Рис.9).

Попытка увеличить концентрацию глюкозы в крови крыс после отмены алкоголя до физиологического уровня путем интубации глюкозы в желудок привела нас к неожиданным результатам. При введении глюкозы в I ч (ночью) уже через 30 мин у крыс усиливалось дрожа-

Рис.П. Суточные изменения концентраций глюкозы в цитозоле печени и плазме крови крыс в норме, при хроническом потреблении и после отмены алкоголя.

А - контроль, Б - после 3,5 месяца потребления алкоголя, В -после отмены алкоголя.

Сплошная линия - концентрация глюкозы в цитоплазме клеток печени в мкмолях на I мл, прерывистая линия - концентрация глюкозы в плазме крови в мМ.

Число 10 справа на оси абсцисс обозначает 10 ч 3-го дня эксперимента.

ние тела, далее нарушалась координация движений, начались судороги. Через I ч состояние животных не улучшалось, концентрация глюкозы в крови не восстанавливалась; в крови и печени били обнаружены большие количества лактата и пирувата. Аналогичные результаты были получены после введения глюкозы в 7 и 16 ч, но противоположные - после ее введения в 4 ч. В последнем случае концентрация глюкозы в крови повышалась, состояние животных не ухудшалось, лактата и пирувата в крови накапливалось не настолько много, как это было в другие времена суток. Отсюда следует, что введение глюкозы в организм с целью нормализации ее концентрации в крови возможно лишь в определенное время суток и что в другие Еремена эта же глюкоза может вызвать сильный молочнокислый ацидоз и ухудшение состояния организма.

10. Суточные -ритмы в изменениях активности ферментов при хроническом потреблении и после отмены алкоголя

Наши исследования показали, что хроническое потребление и отмена алкоголя изменяют суточные ритмы активности ферментов -глюкокиназы, фосфофруктокиназы, лактатдегидрогеназы, пируватки-казы, фруктозодифосфатазы, малатдегидрогеназы, малатдегидрогена-зы декарбоксилирумцей, глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы и изоцит-ратдегидрогеназы в ткани печени, активность малатдегидрогеназы, аспартатаминотрансферазн, алашнамшотрансферазы, пируваткарбо-ксилазы, глутаматдегвдрогеназы и НАД.Н-дегидрогеназы в митохондриях печени крыс. Наибольшему действию алкоголя и ого отмены подвержена активность митохондриальных ферментов сукцинатдегид-рогеназы и З-Д-гидроксибутиратдегидрогеназы (Рис.12 и 13); при хроническом потреблении алкоголя меняется не только суточный

,4

,3

,2

,1

10 15 22 4 10

Рис.12. Суточные изменения активности сукцинатдегидро-геназы в митохондриях печени крыс в норме, при хроническом потреблении и после отмены алкоголя.

I - контроль, 2 - после 3,5 месяца потребления алкоголя, 3 - после отмены алкоголя.

Звездочками обозначены значения активности фермента на третьи сутки после отмены алкоголя.

Активность фермента выражена в мкмолях сукцината на I мг белка митохондрий. Приведены средние значения для трех препаратов митохондрий.

Рис.13. Суточные изменения активности З-Д-гидроксибути-ратдегидрогеназы в митохондриях печени крыс в норме, при хроническом потреблении и после отмены алкоголя.

Активность фермента выражена в процентах относительно максимального значения в норме, равного 0,6 мкмоль на I мг белка митохондрий.

Остальные обозначения - как -1-1-I-1— в подписи к Рис о 12.

10.00 16(00 22(00 04(00 10(00

ритм активности обоих ферментов, но приблизительно в 3 раза снижается среднесуточный уровень активности. Даже на 3-й день после отмены алкоголя этот уровень не достигает контрольного значения.

Измерение концентраций З-Д-гидроксибутирата и ацетоацетата и вычисление отношения свободных внутримигохоадриальных НД+/ НАД.Н в печени показали, что это отношение резко снижается цри хроническом потреблении алкоголя, но в значительной стецени нормализуется уже в 1-й день после отмены алкоголя. Вообще отношение НАД+/НАД.Н не коррелирует с активностью двух анализируемых ферментов и, вероятно, не контролирует их активность.

II. Суточные ритмы в изменениях концентраций метаболитов

в печени крыс при старении В наших опытах впервые обнаружено снижение суммарной концентрации адениннуклеотидов в печени при старении крыс. К 2-летнему возрасту животных суша адениннуклеотидов снижается на 25-30$, что соответствует известному в литературе ослаблению энергетического обмена у старого организма. Мы выявили также физиологический ре!улятор энергетического обмена у старых крыс: сукцинат аммония в 6-дневном курсе введения старым крысам вызывает повышение концентрации АТФ и суммарного содержания адениннуклеотидов в печени до их уровней у молодых животных.

Наши исследования показали, что характер суточных изменений всех анализируемых показателей углеводного и энергетического обмена - тканевых концентраций лактата, пирувата, малата, глутама-та, фосфоенолпирувата, фосфата неорганического, АТФ, АДФ и АМФ, а также фосфатного потенциала, отношений действующих масс для аденилатюшазы, фосфоенолпируваткарбоксикиназы и пируваткарбок-силазы, отношения цитоплазматических НАД+/ЙАД.Н - в печени старых &рыс отличаются от соответствующих суточных ритмов у молодых животных. Суточные изменения некоторых показателей углевод-

ного и энергетического обмена в печени старых крыс приведены на Рис.14.

1000 800 600 0,8 0,6

400 200

1600 1200 300 400

■ i ч» — А ж р\г/ \/ А

, , , , К.! М-... Х- i ъ

:/ -я. 9 л j J

Ч ■ 1- 1 v т ч/тгэ Mwf 11 i \f г

Рис.14. Суточные изменения показателей углеводного и энергетического оймена в печени крыс возрастом 2 года.

А - потенциал фосфорилирования;

Б - отношение действующих масс для аденилаткиназной реакции;

В - отношение действующих масс для комбинированной реакции, катализируемой фосфоенолпируваткар-боксикиназной и пируваткарбок-силазной системами;

Г - отношение свободных цитоплазма-тических Щ^Г/НАД.Н, вычисленное по компонентам лактатдегвд-рогеназной системы.

Сплошной линией обозначены показатели печени молодых (3-4-месячных) крыс, пунктиром - старых животных. ,

16 22 4 Ю Й

12. Биоритмологический метод как инструмент в объяснении парадоксов углеводного обмена

В последние годы в литературе описаны явления в энергетическом обмене, не укладывающиеся э рамки классических представлений и поэтому названные парадоксами (Katz and Ие&агху, 1974; Katz et al., 1976). Наиболее важным в биологической науке представляется так называемый глюкозный парадокс. Он состоит в том, что глюкоза поглощается в клетках и других препаратах печени животных только из высококонцентрированного раствора и что гликоген синтезируется в этих препаратах не прямо из внешней глюкозы, а из конечных продуктов ее превращений - пирувата и лактата. Согласно же классическим представлениям, любой избыток глюкозы поглощается из крови в печени и откладывается прямо в виде гликогена. Для объяснения этого парадокса мы применили биоритмологический подход.

Известно, что контроль за гликолитическим и глюконеогенным потоками осуществляют не все ферменты гликолитической системы, а только ключевые ферменты; глюкокиназа и фосфофруктокиназа при гликолитическом распаде глюкозы или глюкозных остатков гликогена, глюкозо-6-фосфатаза и фруктозодифосфатаза в направлении

синтеза глюкозы и гликогена из глюконеогенных предшественников. Реакции, катализируемые этими ключевыми ферментами, отмечены на Рис.15 парами противоположно направленных стрелок.

пккоза кош

ппкоза

гликош

t I

Г; глюкозо-6-<{оефат

I

фруятозо-6-фосфм

11

фрутово-1,6-яв?»еф«

пжрува?

Рис.15. Схема путей обмена глюкозы в печени и между печенью и кровью. Классическое представление.

Мы провели анализ многочисленных данных литературы и обнаружили следующее. В печени крыс, мышей, морских свинок, кроликов, овец, кур, голубей и человека максимальная активность ключевых ферментов глюконеогенеза глюкозо-6-фосфатазы и фруктозоди-фосфатазы обычно в 5-10 раз и иногда в 15-100 раз выше максимальной активности соответствующих ключевых ферментов гликолиза -глюкокиназы (или гексокиназы у птиц) и фосфофруктокиназы. Такая закономерность была отмечена американским ученым Дж.Вебером еще 25 лет назад (Weber et al., 1964-1967)» но не была должным образом воспринята. Наш измерения показали справедливость такого соотношения между активностью ключевых ферментов в печени у разных животных в разнообразных условиях. Так, активность глюкозо-6-фосфатазы и фруктозодифосфатазы в печени крыс в норме, при хроническом потреблении алкоголя и после отмены алкоголя оказалась в 4-15 раз вше измеренной активности глюкокиназы и фосфо-фруктокиназы на всем протяжении суток. В печени кур и голубей активность ключевых ферментов гликолиза пренебрежимо низка - в 20-100 раз меньше - в сравнении с активностью ключевых ферментов •глюконеогенеза на воем протяжении суток.

Таким образом, распределение активности ключевых ферментов благоприятствует однонаправленному потоку углерода к синтезу глюкозы и гликогена из глюконеогенных предшественников. Такое распределение активности сохраняется на всем протяжении естественных суток,

В организме животного и человека печени отведено лишь 2-4$ массы и объема, но этот миниатюрный орган наделен очень ответственной ролью: он обеспечивает все другие ткани и клетки огромного организма энергетическим субстратом глюкозой. Окисление глю-

козц в самой печени как энергетического субстрата представляется нерациональным. Весь организм функционирует для того и всемерно .способствует тому, чтобы печень синтезировала глюкозу из предшественников неуглеводной природы или образовывала ее из собственных запасов гликогена, а потому противоестественно использовать ту же глюкозу для собственных нужд в гликолизе» Было бы логично предположить, что глюкоза вообще не поглощается в печени, а только образуется в ней и выбрасывается в кровь для обеспечения других тканей.

В литературе укрепилось мнение, что глюкоза свободно проникает через мембраны клеток печени по механизму простой диффузии (Ньюсхолм и Старт, 1977). Равновесие между глюкозой крови и глюкозой печени характеризуется отношением концентраций (градиентом) печень/кровь, равным I. Если это гак, то глюкоза может поглощаться в печени из крови только при условии, что ее концентрация в плазме выше, чем в цитоплазме клеток печени; наоборот, глюкоза может выходить из печени в кровь в случаях, когда ее концентрация в цитоплазме клеток выше, чем в плазме крови. Наш прямые измерения показали, что концентрация глюкозы в цитоплазме клеток печени в 1,5-4,3 раза выше, чем в плазме. Такое явление мы наблюдали в очень широком диапазоне условий, у многих видов животных: крыс сытых и голодавших 48 и 72 ч; крыс сытых в течение суток; крыс в течение суточного голодания; крыс после введения адреналина в микродозах и макродозах, подкожно и вну-трибрюшинно; крыс с аллоксановым и стрептозотоциновым диабетом; старых крыс в норме и при разных воздействиях, в том числе в течение суток; Крыс после однократного введения или хронического потребления алкоголя и после отмены алкоголя; крыс в течение суток в условиях хронического потребления и после отмены алкоголя; крыс с гепатитом, вызванным четыреххлористым углеродом; крыс и мышей при острой аммонийной интоксикации; кроликов, адаптированных к высотной гипоксии; голубей сытых, голодных и на протяжении суток.

Направление гликолитического потока в печени, по современным представлениям, определяется относительной активностью ферментов гликолитической системы и отклонением от состояния равновесия. Поскольку из II глик'олитических реакций восемь принято считать равновесными, основная "нагрузка" по регуляции гликолитического и глюконеогенного потоков ложится на три пары ключевых реакций. Отношения действующих масс Г для этих реакций в тканях животных очень сильно отличаются от констант равновесия К. Различия выражаются величинами отношений К/Г, достигающими

300000, тогда как для равновесия характерна величина К/Г = I.

Из литературы известно, что отношение К/Т для глюкокиназ-ной и фосфофруктокиназной реакций в печени составляют около 300000 и 100000, для глюкозо-6-фосфатазной и фруктозодифоефатаз-ной реакций - 7 и 30, соответственно. Третья пара ключевых ферментативных реакций - пируваткиназная, с одной стороны, и комбинированная фосфоенолпируваткарбоксикиназная/гшруваткарбоксилаз-ная, с другой,- сходны по величинам К/Г. Таким образом, очевидно преимущество реакций глюконеогенеза над реакциями гликолиза: они приблизительно на 3-5 порядков величины отношения Г "ближе" к термодинамическому равновесию.

Мы измерили отношения К/Г для всех четырех ключевых реакций гликолиза и глюконеогенеза в печени крыс и голубей в течение суток и нашли, что их изменения невелики. Среднесуточные значения этих отношений приведены в Табл.2. Таким образом, экспериментально доказано, что соотношения между субстратами в печени более благоцриятны для цротекания глюконеогенеза, чем для протекания гликолиза, на 7-8 порядков величины Г.

На Рис.16 отражено альтернативное представление путей обмена глюкозы между печенью и кровью. Отличие от Рис.15 в том, что на данном рисунке отсутствуют стрелки, обозначающие поглощение глюкозы из крови в клетке печени и гликолитические реакции

Таблица 2. Константы равновесия и отношения действующих масс для ключевых реакций углеводного обмена в печени крысы, а также произведения отношений действующих масс и констант равновесия для этих' реакций.

Ферментативная стадия К Г К/Т

Глхжокиназа 5000 0,016 312500

Фосфофруктокиназа 1000 0,09 11100

Пируваткиназа 5000 0,7 7140

Глюкозо-6-фосфатаза, М 850 120 7

Фруктозо-1,6~дифосфагаза, М 530 19 28

Фосфоенолпируваткарбоксикиназа

плюс пируваткарбоксилаза, М 7 0,001 7000.

ПСГНП.'М3 3153500 2,28 1,4x10®

П(ГЛИ) 25х109 0,001 2,5х10р

в самом гепатоците, а также наличием еще одного, внеклеточного по отношению к гепатоциту отдела, в котором осуществляется обмен глюкозы, поступающей из крови. Гликолиз в этом отделе завершается образованием пирувата (или лактата), который затем транспортируется в гепатоцит - например, с помощью плазмы крови. Таким внеклеточным отделом могут быть эритроцит, мышечная или любая другая клетка организма. Цикл глюкоза-пируват-глюкоза тоже не нов: это цикл Кори, открытый в 1931 году.

Фермент глюкозо-6-фосфатаза имеет высокую активность в печени, а в других тканях он определяется в относительно небольших количествах. Изображенная на Рис.16 глшозо-6-фосфатазная реакция характерна главным образом для печени. С другой стороны, в печени имеется также глюкокиназа - гексокиназа типа 1У или печеночная гексокиназа. Она отличается от других трех типов гедсоки-наз очень высокой К^ для глюкозы, равной от 10 до 45 мМ по данным разных источников (в сравнении с величиной 0,005-0,2 мМ в реакциях гексокиназ типов I, П и Ш), и в 100 раз меньшей чувствительностью к ингибитору глюкозо-6-фосфату. Кинетические особенности глюкокиназы придают и особый смысл функции клеток печени: они могут эффективно фосфорилировать глюкозу только в исключительных случаях, только при очень высокой ее концентрации. В нормальных, физиологических условиях наличие в печени глюкокиназы обусловливает одностороннее движение глюкозы - из клеток печени в кровь. Поэтому отсутствие на Рис.16 стрелки, отражающей глюкокиназную реакцию, характерно только для печени и,лишь для физиологических условий.

Обычно мы представляем печень как ткань, состоящую иэ гепа-тоцитов. Имеющимся в печени клеткам, отличным от гепатоцитов и занимающим около 10$ в общем объеме печени, обычно ле придается существенного значения в аспекте углеводного обмена. Однако два замечания могут в корне изменить отношение к непаренхиматозным

клеткам. Во-первых, количество отличных от гепатоцитов клеток в печени достигает 40% и, во-вторых, оно может увеличиваться до 75% - например, после потребления крысами карциногенов.

Из обсуждаемых в этом разделе данных видно, что в большинстве препаратов печени и в печени животных и человека глюкоза не поглощается и не обменивается: этому препятствуют концентрационный градиент печень/кровь для глюкозы, низкая активность ключевых ферментов гликолиза и, наконец, природная функциональная активность печени как органа, снабжающего все другие органы и ткани громадного организма глюкозой. Небольшие количества глюкозы, поглощаемые в печени и включаемые прямым путем в гликоген, могут быть связаны с нефизиологическими условиями проводимого эксперимента и с неконтролируемым количественным составом клеток печени - паренхиматозных и непаренхиматозных. Так, в гепатоцитах имеется полный набор ферментов для обмена и химического преобразования очень многих веществ, в том числе глюкозы, и помещение этих клеток в несвойственные для них окружающие условия неминуемо должно приводить к детоксикации веществ окружающей среды, В этом отношении высокие концентрации глюкозы ничем не отличаются от прочих вредных для организма веществ, и гепатоциты могут обезвреживать их так же, как и всякий другой яд. С другой стороны, как в печени, так и в разных препаратах печени (перфузируемый орган, тканевые срезы, гепатоциты) имеется определенное число клеток, отличных от гепатоцитов, в каждом случае в неконтролируемых количествах, достаточных для обеспечения наблюдаемого поглощения глюкозы. Анализ доступной литературы показывает, что препараты изолированных гепатоцитов никогда не регламентируются и не иопытывавртся на чистоту в отношении других, отличных от гепатоцитов клеток. Ясно, что в печени каждого данного животного и в каждом препарате гепатоцитов число клеток, отличных от функционирующих гепатоцитов, может варьировать в широких пределах - по крайней мере от 5% до 40$ - и тем самым определять относительные количества глюкозы, обмениваемые в гликолизе и прямо включаемые в гликоген, а также определять различия в скоростях поглощения и в критических концентрациях глюкозы, наблюдаемые разными авторами.

Приведенные данные свидетельствуют также о том, что классическое цредставлёние об углеводном обмене в печени нуждается в критическом пересмотре.

выводы.

1. В работе выдвинута и экспериментально обоснована совокупность представлений о ритмической суточной организации всей системы энергетического метаболизма, включающей гликолитическую цепь, дыхательную цепь митохондрий, цикл трикарбоновых кислот, обмен адениннуклеотидов и кетоновых тел, аминокислотный и фосфорный обмен, об особенностях ритмической организации метаболизма в различных органах разных животных. Продемонстрировано, что суточные ритмы в метаболизме - это одна из главных биохимических характеристик каядого органа, каждой ткани, и эта характеристика может изменяться в зависимости от физиологических и экспериментальных условий.

2. В работе показано прямым измерением, что активность ряда ферментов в цепи углеводного обмена и в сопряженных метаболических путях, в том числе ферментов, которые не считаются лимитирующими скорость или катализируют равновесные реакции, в печени животных изменяется ритмически на протяжении суток. Таким образом, существуют сигналы, управляющие каждым ферментом. Анализ всей совокупности данных показал также, что не только на уровне ключевых ферментов могут генерироваться суточные колебания в метаболизме.

3. В результате анализа собственных экспериментальных и литературных данник выяснено, что активность каждого фермента углеводного обмена и сопряженных реакций изменяется с собственным суточным ритмом. Характер суточных изменений активности одного и того же фермента и фазовые соотношения суточных ритмов различны в печени разных животных, в разных окружающих условиях.

4. Экспериментально показано, что суммарная концентрация адениннуклеотидов, аденилатный энергетический заряд и кажущаяся константа равновесия аденилаткиназной реакции в печени крыс, печени и сердце голубей изменяются в широких пределах на протяжении суток: до 50% у крыс, в 2-3 раза у голубей. Это обстоятельство следует учитывать при всех способах анализа и при моделировании метаболических потоков, при которых до сих пор учйтыва-лось лишь постоянство указанных показателей энергетического обмена.

5. Проведено систематическое.и комплексное исследование суточных ритмов в метаболизме с привлечением концентраций метаболитов и активности ферментов, измеренных в одних и тех жо тканях. Определена суточная динамика около 30 метаболитов и

20 ферментов в каждой ткани каждого животного.

6. Выявлены существенные различия в суточных изменениях метаболических свойств между тканями трех типов: печени крысы, печени голубя и сердца голубя. Следовательно, механизмы циркад-ноё регуляции энергетического обмена в тканях трех типов отличаются количественно или даже качественно, и обобщение результатов конкретного эксперимента, выполненного на одной ткани, и механический перенос этих результатов для анализа метаболических событий в другой ткани недопустимы. Интерпретацию метаболических событий следует проводить только, для клеток данного конкретного типа. Существующие общие клеточные модели малопригодны для описания динамики конкретных метаболических систем.

7. Обнаруженная синфазность суточных изменений концентраций глюкозы и глюкозо-6-фосфата представляет явление, общее для печени животных двух видов в разнообразных условиях. Следовательно, ритмическая регуляция углеводного обмена в печени осуществляется не на уровне соответствующих ферментативных реакций. Концентрации интермедиатов участка гликолитической цепи между глюкозой и триозофосфатами изменяются синфазно в течение суток. Значит, футильные субстратные циклы этого участка гликолитической цепи вносят несущественный вклад в колебательное поведение гликолити-ческого потока в течение суток.

8. На основе полученных экспериментальных данных сделан вывод, что для характеристики суточной динамики глюконеогенного потока недостаточно определения только отношения действующих масс для фосфоенолпируваткарбоксикиназной реакции, но необходимо учитывать также пируваткарбоксилазную реакцию. Лимитирующим глю-конеогенез метаболическим звеном является именно комбинированная реакция, катализируемая фосфоенолпируваткарбоксикиназой и пиру-ваткарбокеилазой, и никакой более фермент не лимитирует глюконео-генез в течение суток.

9. В работе использованы отношения действующих масс сразу для многих индивидуальных и комбинированных ферментативных стадий для анализа метаболических потоков в течение суток. Показано также, что отношения действующих масс для ключевых ферментативных реакций углеводного обмена ритмически изменяются в течение суток.

10. Сопоставление собственных и литературных данных привело к предположению, что колебания в углеводном обмене есть результат действия гормонов и генерируются экзогенными по отношению к печени факторами. Изменения активности ферментов углеводного и энергетического обмена в течение суток обусловлены не колебательной природой ферментных систем и регуляторных связей между

ними, а разным действием гормонов в разных физиологических состояниях организма.

11. Экспериментально установлено, что при хроническом потреблении алкоголя и после его отмены у крыс нарушаются суточные ритмы в изменениях тканевых концентраций многочисленных метаболитов и активности тканевых ферментов в печени. Изменения суточных ритмов в углеводном и энергетическом обмене после отмены алкоголя не всегда противоположны их изменениям, которые наблюдаются при хроническом потреблении алкоголя. Таким образом, биоритмологический подход позволил подтвердить, что действие хронического потребления алкоголя на биохимические системы необратимо.

12. Динамика обмена гликогена в печени крыс, по данным собственных экспериментов, и данные литературы об изменениях активно сти ферментов, участвующих в обмене гликогена, позволили сделать предварительное заключение, что при хроническом потреблении алкоголя способность печени к синтезу гликогена ограничивается на протяжении почти полных суток. После отмены алкоголя гликоген печени перестает служить адекватным источником глюкозы для крови и других органов и тканей. В первые сутки после отмены алкоголя резко возрастает градиент печень-кровь для глюкозы. В зависимости от времени суток вводимая глюкоза может ухудшать и улучшать состояние крыс в условиях имитации алкогольного абстинентного синдрома.

13. Выявлено, что суточные изменения активности сукцинагде-гидрогеназы и З-Д-гидроксибутиратдегидрогеназы в печени крыс нарушаются при хроническом потреблении алкоголя и неполностью восстанавливаются через 1-3 дня после его отмены. Десинхроноз наблюдается в отношении других ферментов энергетического обмена.

13. Глубокий анализ собственных и литературных данных выявил следующее. Активность ключевых ферментов глюконеогенеза в печени разных животных много выше активности ключевых ферментов гликолиза, и это наблюдается на всем протяжении суток. Ключевые реакции гликолиза смещены от состояния термодинамического равновесия на 3-5 порядков величины отношения действующих масс, тогда как ключевые реакции глюконеогенеза ближе к равновесию на 2-4 порядка величины соответствующих отношений. У разных животных и в разнообразных окружающих условиях имеется градиент печень/кровь для глюкозы; он поддерживается на протяжении суток. Перечисленные особенности печени рассматриваются как доказательства того, что на протяжении суток гепатоциты функционируют преимущественно на выброс глюкозы в кровь в нормальных физиологических условиях.

СПИСОК ОСНОВНЫХ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Каминский Ю.Г., Косенко Е.А., Кондрашова М.Н. Обмен адениннуклеотидов в печени старой крысы при голодании и введении солей янтарной кислоты. - Биохимия, 1982, т.47, 4, с.654-659 •

2. Каминский Ю.Г., Косенко Е.А. Динамика суточного содержания промежуточных продуктов углеводного обмена в печени крыс. -Укр.биохим.лпгрн., 1982. т.54, 3, с.289-292.

3. Каминский Ю.Г., Косенко Е.А., Деркачев Э.Ф., Щипакин В.Н., Кондрашова М.Н. Влияние бикарбоната и инсулина на митохондри-ально-цитоплазматические взаимодействия в печени крысы 1п. уьуо. - Вопр.мед.химии, 1982, т.28, Л 6, с.91-94.

4. Косенко Е.А., Каминский Ю.Г. Энергетический обмен в печени молодых и старых крыс под влиянием голодания. - Укр.биохим. журн., 1983, т.55, № 4, с.425-430.

5. Каминский Ю.Г. Имеются ли неравновесные реакции обмена углеводов от глюкозы до триозофосфатов в печени? - Биохимия,

1983, т.48, 16 7, с.1080-1084.

6. Каминский Ю.Г., Косенко Е.А. Суточный ритм энергетического обмена в печени крысы. - Деп.ВИНИТИ Я "407-83.

7. Косенко Е.А., Каминский'Ю.Г. Ограничение проницаемости клеточных мембран печени для глюкозы и другие метаболические нарушения после прекращения потребления этанола. - Препринт. Пу-щино, ОНТИ НрИ, 1983.

8. Каминский Ю.Г., Косенко Е.А. Корреляция между окислительной активностью и метаболическим состоянием митохондрий в лечение суток. - Укр.биохим.журн., 1984, т.56, 16 I, с.34-38.

9. Каминский Ю.Г., Косенко Е.А., Чельманова О.А., Кудрявцев Е.Я., Кондрашова М.Н. Способ интенсификации энергетического обмена.

- Авт.сввд. № 1090405 от 8.01.84 г. "Открытия, изобретения",

1984, 17, с.26.

10. Эмпирические формулы для расчета концентраций метаболитов в воде клетки, митохондрий и цитозоля. - Биофизика, 1984, т.29, й 4, с.694.

11. Косенко Е.А., Каминский Ю.Г. Лимитирующие стадии углеводного и митохондриального обмена в печени крысы при хроническом потреблении и после отмены этанола. - Деп.ВИНИТИ К 1383-84.

12. Каминский Ю.Г., Косенко Е.А. Обмен адениннуклеотидов в печени крысы: суточный ритм и взаимосвязь показателей. - Деп. ВИНИТИ гё 3950-84.

13. Каминский Ю.Г., Косенко Е.А. Несущественная роль футильных циклов в циркадной регуляции углеводного обмена в печени. -Деп.ВИНИТИ % 3285-85.

14. Каминский Ю.Г., Косенко Е.А. Обмен адениннуклеотидов в печени и сердце голубя: суточный ритм и взаимосвязь показателей.

- Деп.ВШШТИ К? 7128-85.

15. Косенко Е.А., Каминский Ю.Г. Нарушение переноса глюкозы из печени в кровь после хронического потребления и отмены этанола. - Деп.ВИНИТИ гё 7278-В85.

16. Каминский Ю.Г., Косенко Е.А. Суточные изменения в аденилат-ной системе печени и сердца голубя. - Деп.ВИНИТИ I 7279-В85.

17. Каминский Ю.Г., Косенко Е.А., Корнеев В.Н. Простой микрофлу-ориметр для Ферментативного определения интермедиатов энергетического обмена в биологических тканях и жидкостях. - В кн.: Приборы для научных исследований в области физико-химической биологии и биотехнологии. Пущино, ОНТИ НЦБИ, 1986, с.76-82.

18. Каминский Ю.Г., Косенко Е.А. Суточная динамика углеводного обмена в печени. - Деп.ВИНИТИ й 3042-В86.

19. Косенко Е.А., Каминский Ю.Г. Регуляторы активности 3-оксибу-тиратдегидрогеназы в митохондриях печени крыоы. - Укр.биохим. журн., 1986, т.58, № 2, с.20-25.

20. Каминский Ю.Г. Суточные ритмы метаболизма в печени управляются экзогенно. - В кн.: Молекулярные механизмы и регуляция энергетического обмена. Пущино, ОНТИ НЦБИ, 1987, с.94-102.

21. Каминский Ю.Г., Косенко Е.А. Суточные изменения концентраций глюкозы и гликогена в крови и печени крыс при хроническом потреблении и после отмены алкоголя. - Укр.биохим.журн., 1987, г.59, № 3, 0.47-51.

22. Каминский Ю.Г., Косенко Е.А. Суточные изменения активности 3-оксибутиратдегидрогеназы в митохондриях печени крысы при тоническом потреблении алкоголя и после его црекращения. -Укр.биохим.журн., 1987, т.59, ¡& 6, с.33-37.

23. Каминский Ю.Г., Косенко Е.А. Расчет концентраций метаболитов, проникающих через мембраны, в цитозоле и митохондриях печени крыс. - Изв. АН СССР, сер.биол., 1987, № 2, с.196-202.

24. Косенко Е.А., Каминский Ю.Г., Гончаренко М.С. Адениннуклеоти-ды и аденилатный энергетический заряд в эритроцитах при псориазе. - Вопр.мед.химии, 1987, т.33, й 6, с.37-40.

25. Каминский Ю.Г. Суточные ритмы в метаболизме (Монографии). -Пущино, ОНТИ НЦБИ, 1987.

26. Косенко Е.А., Каминский Ю.Г. Углеводный обмен, печень и алкоголь (Монография). - Пущино, ОНТИ НЦБИ, 1988.

27. Каминский Ю.Г., Косенко Е.А. Парадоксы углеводного обмена. Препринт. - Пущино, ОНТИ НЦБИ, 1988.

28. Kaminsky Yu.G., Kosenko Е.А., Kondrashova M.N. Metabolites of citric acid cycle, carbohydrate and phosphorus metabolism, and related reactions, redox and phosphorylating states of hepatic tissue, liver mitochondria and cytosol of the pigeon, under normal feeding and natural nocturnal fasting conditions.

- Comp.Biochem. Hiysiol., 1982, V.73B, If 4, p.957-963.

29. Kaminsky Yu.G. A physiological equilibrium between glycolytic intermediates, from glucose to triose phosphates, in the pigeon liver during the day. - Stud.biophys., 1983, v.93, И 1, p. 35-38.

30. Kaminsky Yu.G., Kosenko E.A., Kondrashova I.I.Ii. Alteration of adenine nucleotide pool in old rat liver and its normalization with ammonium succinate. - FEBS Lett., 1983, v.159, И 12, p.259-261.

31. Kondrashova M.17., IJayevsky E.I., Kosenko B.A., Kaminsky Yu.G. Training of the mitochondria and activation of vital activity.

- Rejuvenation, 1983, v.11, И 1, p.9.

32. Kosenko E.A., Kaminsky Yu.G. Limitation in glucose penetration through the liver cellular membrane, and other metabolic disturbances following ethanol withdrawal. - Preprint. Push-chino, 1983.

33. Kaminsky Yu.G., Kosenko E.A., Kondrashova M.tl. Analysis of the circadian rhythm in energy metabolism of rat liver. -Int. J.Biochem., 1984, v. 16, If 6, p. 629-639.

34. Kaminsky Yu.G. Some regulatory properties of 3-hydroxybutyi?a-te dehydrogenase in frozen-thawed rat liver mitochondria. -Comp.Biochem.Hiysiol., 1985, v.82B, II 2, p. 379-384.

35. Kaminsky Yu.G., Kosenko E.A. Adenine nucleotide matabolism in pigeon liver and heart: diurnal changes and correlation between indices. - Comp.Biochem.Hiysiol., 1985, v.82B, II 2,

p.385-394.

36. Kosenko E.A., Kaminsky Yu.G. Limitation in glucose penetration from the liver into blood and other metabolic symptoms of ethanol withdrawal in rats. - J?EBS Lett., 1986, v.200,

II 1, p. 210-216.

37. Kaminsky Yu.G., Kosenko E.A. Blood glucose and liver glycogen in the rat. Effects of chronic ethanol consumption and its withdrawal on the diurnal rhythms. - FEBS Lett., 1986, v.200, N 1, p. 217-220.

38. Kaminsky Yu.G., Kosenko S.A. Different effects of 2,4-dinit-rophenol on rat liver mitochondrial oxidation of various

substrates: succinate and glutamate vs 3-hydrosybutyrate and glycerol 3-pbosphate. - Int.J.Biochem., 1987, v.19, N 1, P.97-99,

39. Kaminakfr Yu.G., Kosenko E.A. Diumal rhythms in liver carbohydrate metabolism. Comparative aspects and critical review.

- Comp.Biochem.Hiysiol., 1987, v.86B, N 4, p. 763-78340. Kaminsky Yu.G., Kosenko E.A. Diumal changes in succinate

and 3-D-hydroxybutyrate dehydrogenase activities of rat .Jiyer mitochondria after chronic alcohol consumption and withdravial

- Corap.Bioohem.Ihysiol., 1988, v.90C, N 1, p.79-82.

Т-1Э631 18.12.89 г. Зак. 2279P Тку. 150 экз. Уч.изд.л.- 2.0 Отпечатано на ротапринте в ОНТИ НЦБИ