Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Суспензионные сократительные модели: физико-химические свойства и функционирование

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Суспензионные сократительные модели: физико-химические свойства и функционирование"

од

САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

На права* рукописи

ОВЛУДЫЮ Николай Семенович

Суспензионные сократительные модели: физико-химические свойства и функционирование

03,СХ).02 - биофизика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации не соисктшв ученой степени доктора биологических наук

Санкт-ПатерОург 1У94

Работ» выполнена ■ Лаборатории биофизики клетки Института биологии иоря Дальневосточного отдаления Российской Академии Наук

Официальны» оппоненты:

Доктор биологических наук, профессор В.И.Воробьев

Доктор биологических наук, профессор С.Н.Дызлова

Доктор биологичаских наук, профессор Г.А.Наслепоа

Ведуаая организация - Институт биофизики ипатки РАК

Завита состоится <?„ »99* г. в II час,

иа заседании специализированного совета Д M3.ST.60 по аащита диссертаций на соискание ученой степени доктора биологических наук при Санкт-Петербургском Государственной университета по апресу - Санкт-Петербург, Университетская набережная, Т/9, 1490)*, Санкт-Петербургский Государственный университет, ауд. 90.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Санкт-Петербургского Государственного университета

Ученый секретарь специализированного совета

Э.И.Крутецкая

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблеиы. В основа большинства проявлений биологической подвижности лежит взаимодействие актина и миозина. Механизм актин-миозинового взаимодействия, регуляция этого взаимодействия и структурно-функциональная связь исследуются посредством ряда сократительных моделей, основными из которых являются живые мышечные волокна. демембрянированные волокна, миофибриллы, природный актомиоэин, синтетический актомиозин и актомиозиновые системы с иммобилизованной актиновой или миозиновой составляющей (motility аеваув). К суспензионным моделям относятся миофибриллы и актомиозины, поскольку их механо-химические свойства обычно исследуются с помош.ю препаратов, представляотих собой взвеси частиц актомиозина или миофибрилл в растворах с физиологической ионной силой. В этом классе моделей проходит граница, разделяшая естественные модели, сохраняющие природную организацию сократительного аппарата (волокна и миофмбриллы), и искусственные модели (актомиозины и актомиозиновые системы), чья структура и состав задаются исследователями. Это позволяет корректно сравнивать естественные и искусственные модели, поскольку миоСибриллы и актомиозин могут исследоваться одними и теми же методами. Следует отметить, что получившие в последнее время широкое распространение актомиозиновые системы с иммобилизованными компонентами не могут заменить суспензионше модели. Эти "двумерные" системы эффективны при изучении первичных процессов вктил-миозинового взаимодействия, однако они не являются упорядоченными белковыми комплекспми, способными имитировать структуру саркомера. Поэтому, как нам кажется, вопросы регуляции актин-миозинового взаимодействия, реализации результатов этого взаимодействия и закономерности самосборки сократительных систем предпочтительнее изучать на "трехмерных" моделях.

Взаимодействие суспензионных моделей с MgATP вызывает либо суперпрешшиташто (Szent-Gyorgyl. 1951), либо просветление (Splcer, 1952). Регистрируют зти явления обычно по изменению оптической плотности (мутности) суспензий (EbaBht, 1961). Несмотря на многолетнее исследование суперпрецигштпции (СИЛ) и просветления, нет полной картины этих яшений. неясны механизмы, лежащие в их основе, и недостаточно исследованы оптические свойства суспензионных моделей, что не позволяет теоретически

обосновать метода их изучения.

Цель и задачи исследования. Работа посвщеша выяснении механизмов суперпреципитации и просветления актомиозина. Основными задачами работы были следупцие:

1) Сравнить в различных экспериментальных условиях механо-химические свойства миофибрклл со свойствами природных и синтетических актомиозинов. полученных разними способами.

2) Изучить оптические свойства суспензия миофибрилл и различных актомиозинов.

3) Исследовать структурные изменения, связанные с функционированием суспензионных моделей.

Научная новизна работы. Впервые параллельно исследованы физико-химические и функциональные свойства суспензионных сократительных моделей всех типов в различных экспериментальных условиях. Сопоставление свойств миофибрилл, сохраняющих естественную структуру сократительного аш1арата. и разных актомиозинов, в различной степени отражающих эту структуру, позволило выявить закономерности, общие для суспензионных моделей в целом, а также особенности, присущие различным актомиозиновым моделям.

Впервые систематически изучены оптические свойства суспензионных моделей; индикатриса светорассеяния, включая область очень малых углов рассеяния, волноьой экспонент и мутность суспензий в различных условиях эксперимента. Полученные результаты позволили дать интерпретацию изменениям оптических свойств при просветлении и суперпреципитации и предложить новый метод регистрации этих явлений.

Впервые сопоставлены кинетика изменения оптических свойств и кинетика структурных изменений при функционировали суспензионных сократительных моделей. Это позволило обнаружить существование двух разновидностей суиерпрецшттации, которые, несмотря на сходные турбщшметрические свойства, основаны на различных молекулярных механизмах.

Впервые изучены закономерности самосборки актомиозина и его дезинтограции в различных экспериментальных условиях. Показано, что эти процессы не сводятся только к образованию и распаду актомиозшювых мостиков.

Нагчш-практичасков еначвгав работи. В работе описан ряд модификаций методов получения белков и сократительных моделей,

данн способы и условия регистрации механической активности моделей и предложена механизмы [гросветления и суперпрешптатации миофибрилл и пктомиозина. Эти разработки могут быть использованы в других исследованиях в области биологической подвижности.

Апробация работы и публикации. Основные результата работы были представлены на следуиши конференциях, съездах и симпозиумах: Всесоюзных конференциях по биофизике и биохимии шли (Тбилиси, 1974. Киев, 1977, Львов, i960. Тбилиси. 1983. 1987, 1990); Всесоюзных конференциях по биохимии мышц (Ленинград, 1972, Телави, 1985); Школам по проблемам биологической подвижности (Ленинград, 1976, 1965); Всесоюзном биофизическом съезде (Москва, 1982), Европейской мышечной конференции (Сегед, 1903): Международной конференции стран СЭВ и СФРЮ по молекулярным механизмам и энергетике подвижности София, 1989), Международном симпозиуме "Биологическая подвикность" (Пущино, 1994), Научной конференции Института цитологии (Ленинград, 1972), Всесоюзной конференции по морской биологии (Владивосток, 1982). Диссертация обобщает результаты 44 публикаций в научных журнала* и сборниках.

Структура и объеи работы. Диссертация состоит из Введения, Обзора литературы (две главы). Материалов и методов (две главы), Результатов и обсуждения (три главы). Выводов и Списка литературы (429 наименований). Работа изложена на 327 страницах машинописного текста (список литературы занимает 55 стр.). В диссертации 2 таблицы и 82 рисунка.

НАТЕРШИ И УЕТОЛН

Препараты. В качестве объектов исследования использовались миофйриллы, природный октомяозин, актомиозин синтетический и две разновидности введенного нами "миофибриллярного" актомиозина, имитирующие природный и синтетический актомиозин. Источником препаратов били скелетные мншш кролика и запирателыше мнпнш нескольких видов двустворчатых моллюсков.

Метод выделения миофибрилл описан ранее (Shelud'ko, (990).

Природный актомиозин выделяли методом Шяуоа и др. (Schaub et ab. 1967).

"¡.{иофибрилляркне" актомиозинн готовили растворением миофибрилл в 0.6 М KCL в отсутствие и в присутствии ТР. В первом случае препарат считали аналогом природного эитоотюзина, а во втором

случае - аналогом синтетического актомиозина. Полученные таким образом "природный" и "синтетический" актомиозин имели одинаковый состав белков, которые был идентичен составу белков миофибрилл.

Выделение миозина, актина, тропомиозин-тропонинового комплексе, тропомиозина и тропонина проводили комплексной методикой (Шелудько. 1978; Хайтлина, 1978). Для получения миозина также использовали метод Перри (Perry, 1965) с учетом рекомендаций Тартаковского (Тартаковский, 1978). а-актинин из кролика получали с помощь» КХэкстракции (Цховребова и др., 1962), а из мышц приморского гребешка - Nail СО^-экстракции (KhaUllna et, al.. 1902).

Синтетический актомиозин готовили двумя способами - путем смешивания миозина и Ф-актина в среде с высокой ионной силой с последующим ее понижением разбавлением ("традиционный" актомиозин) и путем соединения предсформированных миозиновых нитей с Ф-актином в среде с низкой ионной силой ("низкоионный" актомиозин).

Состав сократительных моделей и препаратов сократительных белков определяли электрофорезом на полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия (Шелудько, 1976). Соотношение белков в препаратах определяли денситометрированием (Shelud'ko and Premlnger. 19G9). Концентрацию белка измеряли микрооиуретовым методом (Itehakl and Gill, 1964).

Модификация сократительных модема. Для модификации использовали тепловую обработку в среде с 1шзкой ионной силой, обработку актомиозина и миозина W-атклмалекмидом в среде с низкой ионной силой, обработку глютарал ьда гидом и ультразвуком. Озвучивание проводили дезинтегратором УЙДН-I при частоте 22 kIM и токе 0.2А во льду с перерывами для охлаждения.

Тестирование сокржтителыаи моделей. Определение АТФазной активности (в присутствии Kg2', Са2* или ЭДТА) проводили либо общепринятым методом по изменению в среде концентрации неорганического фосфата (Panuag et al., 1970), либо электрометрическим методом (Oreen and Kommaerts, 1953) путем прямого определения закисления среди. (Зацепина и Шноль, 1966). Преимущество этого метода - возможность непрерывной регистрации хода реакции, начиная с ее самых ранних этапов, что позволяет получать кинетические кривые изменения АТФазной активности, сопоставимые о кривыми изменения оптических свойств.

Объем геля миофибрилл и актомиоэкнв в различных функциональных состояниях измеряли в специально изготовленном центрифужном

стакане из оргстекла или посредством гравитационной седиментации.

Размеры исходных и расслабленных миофибрилл определяли с помощью телевизионного микроскопа, пклгчапаего микроскоп "Виолам Л-2П", телекамеру "Электроника 821" и телевизор "Электроника ВЛ-100". Увеличение, приведенное к экрану монитора, составляло 1600.

Степень диссоциации актомиозина определяли по изменению вязкости и светорассеяния раствора актомиооина в O.b M KCL при добавлении 0.Б-1.0 мМ MgAT®. Вязкость измеряли капиллярным вискозиметром типа УОеллоде.

Угловые диаграммы (индикатрисы) светорассеяния определяли на нефелометре ФПС-ЗМ в интервале углов 12-160° и на специально изготовленной установке в интервале углов 0.05 - 50° (Shelud'ko, 1990). Диаграмму рассеяния в интервале углов от 0.05 до 2.0° регистрировали по почернению фотопленки на денситометре Elsckrlpt-3 (Hirschmann, ФРГ).

Светопропуекание, оптическую плотность или мутность суспензий т-2.3 D/L (Z) - оптическая плотность, I. - длина оптического пути кюветы) и зависимость i от длиин волны (М определяли на спектрофотометрах Spekol-II (Саг 1 Zèles, ГДР), Specord ITWIS (Cari Zelee, ГДР), Specord M40 (Cari Zelee. ГДР) или на установке для измерения малоуглового светорассеяния, в которой фотоэлемент располагали для регистрации проходящего света. Угол зрения Фотоэлемента (а) в последнем случае варьировали изменением расстояния между кюветой и фотоэлементом и ширины шели перед фотоэлементом. При работе на спектрофотометре Specord М40 для умен ыоегшя угла зрения фотоэлемента использовали специальную приставку (Хлебцов и др., 1988). Волновой экспонент (п), связанный с наклоном кривых зависимости D от X, вычисляли из соотношения ns-dlg-i/dlg*. (Клеган и др., Î977). Светорассеяние под углом W (I ) измеряли посредством споктрофлуориметра Spekol-Ю или Spekol-11 (Cari Zelsa, ГДР) с использованием приставок Т1 и Т1М1, модифицированных для одновременной регистрации проходящего и рассеянного света.

Определение размера частиц. Средний размер частиц и распределение частиц по размерам в суспензиях актомиозина и миофибрилл определяли с помогаып лазерного дифракционного анализатора размера чястиц 3600К 'Malvenu Англия). Первичными выходными данными приборе являются относительное распределение

частиц по объему и величина, обратная светопропусканию. Все остальные выходные результаты - средний размер частиц, объемная концентрация, удельная площадь поверхности и другие - представляют собой численные преобразования объемного распределения с представлением частиц в виде сфер. Оптическая схема прибора была модифицирована для дополнительного измерения светорассеяния под прямым углом (I90). Модификация программного обеспечения повысила временное разрешение прибора до трех измерений в секунду, что позволяет строить кинетические кривые изменения вышеперечисленных параметров при функционировании сократительных моделей.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСШЕНИВ свойства суспензионных моделей разных типов и различного

происхождения и зависимость этих свойств от условии эксперимента

Влияние условий тестирования моделей на проявление их свойств

Суспензионные сократительные модели -- миофиОрилль и различные актомиозины - различаются размерами, степенью сохранения интактной структуры и "историей", интегрирующей результаты различных воздействий при получении и хранении моделей. Кроме того, их активность тестируется в определенных средах и зависит от особенностей да состава. Имеется несколько вариантов проявления этой активности при использовании туроидиметрического теста, которые в обобщенном виде представлены на рис. I. "Выбор" того или иного варианта определяется условиями среды и особенностями модели. Однако в случае моделей из мышц иных, чем скелетные мышцы позвоночных, удовлетворительные турбидиметрические кривые можно получить далеко не всегда. Наши первоначальные попытки сравнительного изучения моделей посредством метода ЭОаши по "вертикали" (модели разного типа и различной степени сложности) и но "горизонтали" (однотипные модели из разных источников) не были успешными. В качестве примера на рис. 2, даны зависимости "степени сокращения" миофибрилл кролика и приморского гребешка от концентрации МвАТР. Видно, что эти зависимости сильно различаются, что не позволяет сравнивать свойства данных моделей. Такого рода результаты стимулировали серию исследований, направленных на выяснение зависимости механического ответа моделей от состава среды, типа модели и ее "истории".

- Т -

Cmene»» umimhio

Комд«,тпроиииМдА1Р, mM

Рисл Типичные кривые изменения мутности (верхний ряд) и светороссеяния под углом 90° (нижний ряд) суспензий сократительных моделей при немедленой СПП (сокращении) - а, при спонтанной СПП (сокращении) - а и при просветлении с ггослвдушей немедленной СПП (сокращении) - 8.

Рис.2 Степень изменения мутности и светорассеяния (I90) при сокряивнии мисйибмыл кролика и приморского гребенка различными концентрациями KgATP.

При подборе среды исходили из предпологэния о том, что в оптимальных условиях среды сократительный аппарат должен быть максимально устойчив, а его активность максимально высокой, Устойчивость сократительного вппарата определяли по экстрагируемости из него белков. Минимальная экстрагируемость сократительных белков из миофибрилл кролика была получена при 40-50 мМ KCL, а из мжхЛибрилл гребешка и устрицы при 76-100 MN. Более высокое значение ионной силы в последнем случае коррелирует с большим содержанием неорганических солей' в мышцах морских беспозвоночных. Эта значения были опорными при разработке рецептуры растворов, поскольку зависимость степени и скорости сокращения моделей от условий среды, таких как ионная сила, концентрация Мд2+, Ca2t. АТФ и значение pH носила сложный характер. Влияние этих факторов взаимозависимо - одинаковый характер механической реакции можно получить при различном сочетании компонентов средн. В итоге этих исследований были приняты стандартные условия для тестирования суспензионных моделей: 75 Ш KCl. 10 тН имилязол-HCL или грис-малеят, рЯ 7.0-7.2 И 0.5 мМ MgATP.

При изучении зависимости свойств суспензионных моделей от условий эксперимента мы обратили внимание на небольшие. но хорошо

воспроизводимые различия между миоЗибриллами и актомиозинами. Для выяснения природы этих различия были использованы "миофибрилярные" актомиозины. На рис. 3. приведены кривые зависимости степени изменения 1 суспензий миофибрилл и двух актомиозинов от ионной силы раствора. Кривые пересекают ось абсцисс в различных точках, значения которых возрастают в ряду актомиозин "синтетический", "природный" и миофибриллы. По всей вероятности. эта последовательность отражает степень сохранения моделями интактной мышечной структуры. Таким образом, при "вертикальных" сравнительных исследованиях существует опасность ошибок в результате неправильного подбора среды.

Степей изменении

«-АМ cuttnaniiisBttful • Mil прироАнш » MuofuftpUAAl*

Cmenet«, изменении

Нолмобаа Mtcnoiem) к СЬсгпграссейше • Ыутносгт»»

Uk &i им

Коы4е>трация KCL, М

■ QI 01 АЗ • « ОЬ 11«

Измвме.и« вли** са(*ом«ри. Л1 А0

Рис.3. Зависимость степени изменения мутности суспензий миофиОрилл, "природного" актомиозина и "синтетического* актомиозина от ионной силы среды при добавлении О.Ь мМ MgATP.

Рис.4. Зависимость степени изменения оптических параметров от степени изменения длины саркомера миофибрилл при сокращении.

Результаты исследования зависимости турбидиметрического ответа от условий эксперимента можно суммировать следующим образом:

D. Кинетические кривые изменения i при взаимодействии мио^иОрилл и актомиозина с MgATP включают три фазы - просветление, СПП или "сокращение" и агрегацию. Все разнообразие кинетических кривых может быть объяснено сочетанием этих фаз с различной степенью выраженности.

2). Выраженность фаз зависит от условий эксперимента: фаза просветления усиливается при увеличении концентрации MgAT® и уменьшении длины волны, фаза сокращения ослабляется при увеличении концентрации суспензии, увеличении концентрации М&АТФ и уменьшении длины волны и фаза агрегация усиливается при увеличении

концентрации И^ЛТФ и уменьшений длины волны.

Все перечисленные зависимости одинаковы для миоСнбрилл и йктомиозяна, но в случав миофибрилл вираконы сильнее.

Б целом, стандартные кинетические кривые, получаемые методом Эбвгси (рис. I), воспроизводятся в довольно узком диапазоне экспериментальных условий и диапазон этот сужается при переходе от актомиозина к миофивриллам. Нами предложен другой метод регистрации - по изменению светорассеяния под углом 90°, Кинетические кривые изменения светорассеяния, соответствующие кривым изменения мутности, приведены на рис Л. Предлагаемый метод намного "устойчивее" к изменению условий эксперимента, таких как длина волны, концентрация суспензии или конструкционные особенности регистрирующего прибора. Особенно заметно эти преимущества проявляются при "горизонтальных" сравнительных исследованиях. На рис. 2 сравниваются результаты тестирования миофибрилл гребешка и кролика по изменению т и I90. Видно, что метод светорассеяния дает сравнимые результаты для обоих объектов. Использование этого метода позволило нам провести сравнительное изучение теплоустойчивости сократительной и ферментативной активности миофибрилл из мшлц моллюсков, сопоставить сократительную активность миофибрилл рыб с морфофункционвльнымя особенностями мшш, сравнить Саг*-регуляторнне системы миофибрилл кролик» и устрицы, исследовать влияние С-белка на механическую активность миофибрилл гребешка. Вляякяэ йнактнвяруюсях воздействия на иодвля

Скорость инактивации моделей различного тала и моделей, полученных из мышц различных животных, неодинакова. Это вызывает проблемы при сравнительных исследованиях, поскольку существует опасность сравнения частично иняктивированних моделей с нативннми. Для того, чтобы быть уверенным в корректности получаемых результатов необходимо знать закономерности изменения свойств моделей при их инактивации и механизм этих изменений. Эти закономерности изучались при хранении препаратов и при воздействии на них низкоионных отмывок, ультразвука, тепла. И-оталмалеимида и глютаралыюгида. Последовательность появления признаков инактивации следупияя: потеря Са2+-чувствитйльности, снихпнив способности к просветлении. умениеегае скорости СЛЛ, уменьшение степени СПП, снижение МвАТРазноЯ активности. Причем ИкАТРазчая активность во всех случаях пер^я снижением проходит стадию

повышения, ранее описанную при термообработке (Glambalvo and Drelzen. 1978) и обработке К-этилмалэимидом (Yamahlta, I960). Таким образом, саше разные инактивирущие воздействия приводят к разобщению кривых зависимости механической и ферментативной активности от интенсивности воздействия. Механизм этою явления исследовали на примере воздействия теплом и И-этилмалеимидом. Показано, что картина разобщения может быть реконструирована путем образования актомдазина из смесей нативного и полностью инактивированного миозина. Мы полагаем. что причиной инактивашонных изменений является появление недиссоциируицих миоэиношх мостиков, "сшивающих" нити сократительного аппарата. По мере нарастания количества "сшивок" они сначала сказываются на скорости СПП, а затем на степени СПП. которая при достаточном количестве "сшивок" подавляется полностью. Нативная во часть молекул миозина остается способной к нормальному взаимодействию с АТФ и актином, что и обеспечивает наличие АТФазной активности при полном отсутствии СШ. Увеличение же уровня АТФазной активности на начальных стадиях инактивации, как мы полагаем, связано с уменьшением скорости сокращения моделей, что замедляет переход от высокой начальной ИаАТРазноЯ активности к низкой, присущей сокращенным моделям. Образование фракции недиссоциирующих мостиков тага» объясняет снижение способности к просветлению и потери Ca2*-чувствительности по аналогии с ригорными мостиками при малых концентрациях BgATP (Bremel and Weber, 1972). Описанные признаки хода инактивации моделей позволяют отличать механо-химические свойства модели в неоптимальных условиях от свойств частично инактивированной модели.

Возисяшостъ повторного расслабления в сокращения ыяофаорилд

Добавление ЭГТА и KgAl'P к суспензии сократившихся миофиорилл или суперпреципитированного в результате немедленной СШ актомиозина не вызывает каких-либо оптических изменений. Однако такие т добавления после спонтанной СПП приводят к просветлении с последующим повторным увеличением t. Природа этого явления была исследована на мио<1иДриллах. Показано, что повторное уменьшение и увеличение а соответствует реальныму восстановлению исходных размеров миофибрилл и их новому сокращению. Цикл расслабление-сокращение может быть повторен несколько раз. Таким ко свойством обладают миофЮриллы, сокращенные низкими концентрациями MgATP, Это позволяет предполагать, что необходимым

условием для повторного расслабления и сокращения является неполное первоначальное сокращение. Действительно, кривые зависимости степени первоначального сокращения и степени повторного расслабления зеркальным образом повторяют друг друге.

Вероятно, существует предал степени сокращения, при превышении которого сократительная система теряет способность к восстановлению исходных размеров. Можно думать, что в этом случав образуются неспециЛические белок-белковые связи, фиксирующие структуру сокращенных частиц.

Связь нэяду ошпггаспва и ввхаиячвстаа взмаваиммя при сокрадапяа сяофЮрялл

В отличие от актомиозина, сокращение миофибрилл можно наблюдать под микроскопом, что позволяет сопоставлять размер саркомеров и оптические свойства суспензий. Согласно световой микроскопии, сокращение изолированных миофибрилл включает две последовательные стадии: "физиологическое" сокращение, в ходе которого происходит уменьшение длины саркомеров и сверхсокрваекне - изотропное уменьшение объема миофтбрилл с потерей ими исчерченности. Для определения вклада этих стадий в сопутствующее изменение оптических свойств суспензий мы варьировали длину саркомеров миофибрилл градуальным добавлением очень низких концентраций К^ТР. Показано, что при "{изиологическом* сокращении относительное изменение длины саркомеров связано с относительными изменениями оптических параметров линейной зависимостью (рис.4), а величина этих изменений составляет не менее 90% от максимально возможных изменений. Таким образом, в случае миофибрилл существует однозначная связь мекду механическими и оптическими изменениями и можно предполагать наличие аналогичной зависимости для актомиозина.

ОПТИЧЕСКИЙ СВОЙСТВА С7СШ&Ш ССКРАТНТ8ЛЫШ ИОДОВЯ

Угловая даагрешм светорассеяния суспензий

Наиболее полную информацию об оптических свойствах частиц различного происхождения несут индикатрисы светорассеяния И1 суспензия. С помощью специально изготовленной установки нами показано, что индикатрисы изучаемых суспензий чрезвычайно асимметричны - они вытянуты вперед по направлению распространения падающего света (рис.Ь). суммирование площади под диаграммой

рассеяния суспензии с концентрацией O.I мг/мл позволяет утверждать, что под углами менее 6° рассеивается не менее 90S света.

Асимметрия диаграмм возрастает с уменьшением концентрации суспензии и длины волны свата. Такая зависимость от X является необычной. Для суспензий крупных частиц эта зависимость обратная, что связано с уменьшением дифракционной составляющей светорассеяния (Шифрин, 1961). Проведенные наш расчеты по приближенным формулам теории Ми (Федорова, 1967) с использованием экспериментально определенных параметров частиц суспензий миофибрилл показали, что высокая степень асимметрии индикатрис определяется аномальной дифракцией (van de Hulst, 1961), свойственной "мягким" частицам (показатель преломления близок к 1.0). Таким образом, оптические свойства суспензий сократительных моделей определяются в первую очередь плотностью частиц, а не их размерами. Возможно, что этот случай характерен для многих частиц биологического происхождения.

Взююяяе светорассеяния щи сокращент шофасрмл я СШ1 •ктошозока

Сразу же после добавление MgATtf в присутствии Са2+ к суспензии миофибрилл или природного актомиозина происходит быстрое уменьшение малоуглового рассеяния, значительно снижающее асимметрии диаграммы (рис.5). Вслед за быстрыми изменениями происходят изменения медленные, выражавшиеся, наоборот, в усилении малоуглового рассеяния, которое спустя несколько минут становится больше, чем у исходных суспензий (рис.Ь). Степень быстрых и медленных изменений светорассеяния при разных углах рассеяния показана на рис.6. Быстрые изменения сопровождаются значительным уменьшением рассеяния под малыми и большими углами и заметным увеличением под средними углами. Таким образом, существуют два угла (dj и CLj), пол которыми светорассеяние не меняется. Знак медленных изменений меняется тоже, однако только один раз: при очень малых углах светорассеяние возрастает, а в диапазоне всех остальных исследованных углов - уменьааатся (рис.6). Амплитуда медленных изменений возрастает с уменьшением X, что в сочетании с ростом размера частиц позволяет интерпретировать это явление как усиление обычной дифракции. Уменьшение же малоуглового рассеяния при сокращении частиц связано, по всей вероятности, с увеличением показателя преломления частиц и является ослаблением аномальной

дифракции.

Степс«» изменения

и

Рис.б Малоугловая часть индикатрисы светорассеяния суспензий миофибрилл Ц) и ее изменение при сокращении (2) и агрегации (3).

Рис.6 Степень изменения светорассеяния суспензия миофябрилл под различными углами при сокращении (I) и агрегации (2) миофибрилл.

Медленные агрегационные изменения светорассеяния уменьшаются о ростом угла рассеяния и под прямым углом практически не проявляются <рис.6). Следовательно, в этом случав уменыаенив светорассеяния отражает "чистая" сократительный ответ, кинетика которого не искажена агрегационлыми процессами. Следует отметить, однако, что теория Ми не предсказывает уменьшение рассеяния в этом интервале углов рассеяния. Расчеты по приближенным формулам Ки дают незначительное увеличение светорассеяния. Мы полагаем, что причиной этого несоответствия являются различия мевду теоретическими моделями и реальными. Теория Ми построена на гомогенных однородных частицах. Сократительные же модели, как и любые частицы биологического происхождения, неоднородны по плотности и полидисперсны по размерам. Наиболее существенным отличием представляется внутренняя неоднородность сократительных моделей. Внутренние неоднородности - белки и белковые комплексы -являются самостоятельными источниками светорассеяния. Возможно, что рассеяние суспензий миофибрилл и актомиозина под больсими углами определяется преимущественно рассеянием на внутренних неоднородностях, а рассеяние под малыми углами обеспечивается частицей как целым. Считая, что источником рассеяния под прямым углом в основном являются внутренние неоднородности, уменьшение рассеяния под этим углом при сокращении мошо связать с

уплотнением частиц, что сникает "освещенность'* внутренней структуры частиц. Такая интерпретация объясняет также отсутствие агрегационных изменений под большими углами. Агрегация связана с крупномасштабными изменениями в суспензии, которые не затрагивают уровень внутренних рассеивающих центров, иутиость суспензий сократительных иодэлой и ее изшпаниа при сокращения иио£абрши и супврпроципитации актошозпна

Мутность <х) суспензий непоглощавдих частиц является функцией размера частиц и их показателя преломления. Поэтому, если эти параметры меняются во время эксперемента, то по изменению х можно регистрировать кинетику процесса (ЕЬаеМ, 1%1).

Высокая степень асимметрии индикатрис светорассеяния исследуемых суспензий позволяет предполагать, что мутность этих суспензий определяется не только светом, прошедшим через суспензию, но и светом, рассеянным иод малыми углами. Действительно, удельная мутность (а/с) суспензий миофибрилл и актомиозшт зависит от угла зрения (а) фэтоэлемента спектрофотометра. Уменьшение а от значений, присущих промышленным спектрофотометрам (5-10°), до минимальных значений, полученных в данной работе (0.05°), приводит к возрастанию х/с в 5-6 раз. Таким образом, в обычных условиях тестирования фотомотрируется преимущестиошю свет рассеянный, а не проходящий. Это обстоятельство определяет ряд особенностей данных суспензий, в частности, необычный характер зависимости х/с от с. С помощью спектрофотометра с малым углом зрения показано, что кривые зависимости х/с от с в области низких и средних концентраций имеют разные наклоны. В области малых концентраций х/с по мере уменьшения концентрации надает, а не возрастает. Это связано с тем, по-видимому, что с уменьшением концентрации возрастает асимметрия диаграмм рассеяния. Поэтому использование для теоретических расчетов величины (1/с)0. получаемой посредством экстраполяции х/с от с к нулевой концентрации, представляется некорректным. Действительно, смысл экстраполяции заключается в моделировании ситуации, при которой примесный свет отсутствует. В данном же случае по мере снижения концентрации количество примесного света возрастает.

В результате добавления К^АТР мутность суспензий сократительных моделей меняется двухфазным образом: сначала х быстро увеличивается, а затем медленно уменьшается. Степень быстрого

изменения (степень СПП или сокращения) увеличивается в ряду миофибриллы, "природный" актомиозин, "синтетический" актомиозип (таблица), а степень медленных изменений (степень агрегации), наоборот, снимется в этом ке ряду.

Изменение свойств миофибрилл (МФ), "природного" (ПАН) и "синтетического" (САМ) актомиоэина при добавлегаш 0.5 Ш

ОА

МйАТР в присутствии Са

Оптическая плотность Размер частиц, рл Объеи осадка, ц!

Ксх. Сокр. йзызп. Hex. Сокр. Изиеп. ' Исх. Сокр. Изивя.

т 0.35 0.44 0.21 27.5 17.0 0.39 181 118 0.35

ПАИ 0.15 0.42 0.64 33.5 15.5 0.54 340 104 0.69

С/Л 0.11 0.39 0.72 41.0 16.0 0.61 355 85 0.76

Концентрация суспензии 0.2 мг/мл: К - 500 нм

Увеличение мутности суспензий сократительных моделей в результате их сокращения согласно оптическим канонам означает увеличение суммарного рассеяния. Заметное усиление светорассеяния действительно имеет место в диапазоне средних углов рассеяния а,--«^ (рис.6). Малоугловые чести "исходной" и "сокращенной" индикатрисы с точкой пересечения при aj схематично показаны на рис.7. Усилению светорассеяния в диапазоне aj-Oj противостоит его сильное уменьшение при углах меньше cij. Баланс этих изменений при измерении i зависит от угла зрения фотоэлемента. Изменение долено быть максимальным, если угол зрения равен а^ (рис.7), и должно уменьшаться как При увеличении, так и при уменьшении угла зрения. Эти рассувдения имеют экспериментальное подтверждение - наличие зависимости степени изменения мутности (Дт/т) суспензий миофибрилл от угла зрения фотоэлемента (рис.7). Кривая этой зависимости имеет максимум при угле близком к aj. Согласно этой зависимости, при а-0 степень изменения бистро уменьшается. Следовательно, не исключено, что тестирования моделей на "идеальном" спектрофотометре (а-О) не будет сопровождаться увеличением т, т.е. увеличением суммарного рассеяния. Если это так, то причиной изменения i при регистрации "ноидеальным"

спектрофотометром, является только изменение формы индикатрисы светорассеяния.

Степень квшшш

Рис.7 Зависимость степени изменения мутности при сокращении миофибрилл от угла зрения фотоэлемента спектрофотометра. Схема иллюстрирует изменение количества примесного малоуглового рассеяния при переходе от "•исходной" к "сокращенной" индикатрисе. Н - диафрагма перед фотоэлементом, 1<, - падающий свет.

Угол «¡>«шкя, гртд.

Волиоьсв »кспонент суспензий сократит«лмаи моделей а его изменение щя сокр «явная иода два

Мутность суспензии® зависит от К согласно соотношение Ангстрема (AngBtrora, 1929), где показатель г» - "волновой экспонент" -является функцией размера частиц и их показателя преломления (Heller et al., 1962). Считается, что определение п полезно в случав систем, для которых прямые расчеты на основании теории Ми затруднены неопределенностью размеров, формы и относительного показателя преломления частиц. К таким частицам относятся и частицы суспензий сократительных моделей.

При сокращении миофибрилл и СПП актомиоэина значение п уменьшается приблизительно в два раза и практически не меняется при последующей агрегации. Величина п несколько зависит от концентрации суспензии и угла зрения, однако различия по величине п мешу моделями исходными и сокращенно-агрегированными сохраняются во всем диапазоне исследованных концентраций и углов зрения. Из теоретических расчетов следует, что в случае частиц с низким показателем преломления уменьшение п монет быть связано либо с увеличением размера частиц, либо с увеличением их показателя преломления (Клешш и др., 197?). Поскольку при сокращении миофибрилл и СПП актомиоэина происходит уменьшение размера частиц и увеличение их показателя преломления, кокно вновь сделать вывод о доминирующей роли плотности частиц в формировании оптических свойств данных суспензий. Это согласуется с нечувствительностью п к агрегации и слабым влиянием на значение п ультразвуковой обработки суспензий.

Параметры частиц и мутность суспензий сократительных моделей

Поведение волнового экспонента позволяет предполагать, что ведущей причиной изменения мутности при функционировании моделей является изменение показателя преломления частиц. С другой стороны, количество примесного света, детектируемое пря регистрации мутности, определяется степенью асимметрии индикатрисы, которая также зависит от показателя преломления. Следовательно, мутность суспензий сократительных моделей и степень ев изменения при функционировании моделей должны зависеть от начальной плотности моделей и степени их последующего уплотнения при сокращении, т.е. от разницы показателей преломления исходных в сокращенных частиц. Сравнения трех сократительных моделей (таолица) подтверждают это заключение. Оптическая плотность суспензий миофибрйлл, "природного" актомиозина и актомиозина "синтетического" уменьшается в порядке перечисления, а размер частиц и объем центрифужного осадка возрастают. Последнее означает уменьшение плотности частиц, что вполне вытекает из различий в спосоОе приготовления моделей. Переход миофибриллы - "природный" актомиозин включает растворение миозиновых нитей при сохранении акто-миоэиновых (А-М) связей. Переход миофибриллы -> "синтетический" актомиозин включает кроме разрушения миозиновых нитей также диссоциацию А-И связей. Поэтому последующее восстановление Ы-М и А-Ы связей более хаотично и приводит к более рыхлой структуре. После добавления к супензиям МаАТФ различия не аду моделями уменьшаются. Это можно объяснить тем, что независимо от состояния начальной упаковки моделей, плотность их конечной упаковки в результате сократительного процесса достигает предельных значений, обусловленных стерйческими ограничениями. Поэтому относительная степень изменения показателя преломления возрастает в ряду - миофибриллы, "природный" актомиозин, "синтетический" актомиозин и этому соответствует возрастание относительной степени изменения оптической плотности (таблица).

Таким образом, мутность суспензий изсфгбралл в различных актомиозннов зависит от условий регистрации а плотности упаковка этих моделей, а степень изменения мутности пря СПП актомиозина или сокращении миофябрилл определяется разностьв "исходной" и "сокращенной" плотности частиц.

Агрегация сокращавши иоммай

Агрегацию миофибрилл мокно наблюдать под световым микроскопом, что и послужило основанием для установления связи мовду агрегацией и оптическими изменениями. Это, однако, но является строгим доказательством именно такой природы медленной фазы оптических изменений при сокращении миофибрилл и тем более актомиозина, ввиду неструктурированности которого аналогичное соответствие установить трудно. Поэтому было проведено специальное исследование, в котором необходимые доказательства основаны на соответствии закономерностей медленной фазы закономерностям агрегационннх процессов. Наиболее важным из них является прямопропорциональная зависимость скорости медленных изменений от концентрации суспензии. В рамках этого исследования показано, что кинетика медленного усиления малоуглового рассеяния при различных длинах волн совпадает с кинетикой медленного изменения 1. Степень медленных изменений зависит от размера исходных частиц - она уменьшается в результате дробления частиц ультразвуком. Однако отсутствие фазы медленных изменений не обозначает отсутствие агрегации частиц. Посредством лазерного определителя размера частиц мы показали, что в случае частиц небольшого размера их агрегация не сопровождается падением т. Это согласуется с литературными данными, полученными на частицах латекса (Latimer and Wamble, 1982), по которым зависимость t от размера частиц имеет колоколообразную фор>!у, т.е. образование агрегатов небольшие размеров может приводить к увеличению i. По-видимому, агрегаццошше процессы при регистрации сократительной активности моделей по изменению t проявляются в той или иной форме всегда и искаиают кинетические кривые СПП (сокращения).

Скорость агрегации и скорость сокращения миофибрилл сходным образом зависят с г ионной силы, что кокет служить основашем для привлекательного своей простотой предполохения о единстве механизма сокращения и агрегации: возмогло, что агрегация является продолганием сасращешя, в которое вовлекаются отдельные частицы с участием свободного миозина и актина на их поверхности. Действительно, добавление к суспензии сокращающихся миофибрилл Ф-ектина с целью экранирования миозшювых головок на поверхности частиц, значительно уменьшает степень агрегации. Но, с другой стороны, ш обнаружили зависимость агрегации от степени сокращения *яг»виршм. например, увеличение степени сскрагюния от 60 до 100»

приводит к возрастанию степени агрегации от 10 до 100®. Это позволяет связать агрегацию с уменьшением устойчивости частиц в результате их дегидратации.

Светорассеяние ц свотопропускаша суспензий ииоЗабралл и актоииозина в условиях расслабления

При помещении суспензионных моделей в условия расслабления возтжает так называемое "просветленно" (Sp)cer, )952), которое выражается в уменьшении т суспензий (ЕЬазШ, 1961). Считается, что просветление определяется диссоциацией актомиозина на Ф-актин и линейные агрегаты миозина. (Maruyania and Oergely, 1962). Хотя подобный вывод представляется естественным, так как обратный процесс - образование актомиозина - сопряжен с увеличением t, он, тем не менее, вызывает возражения, поскольку просветление свойственно и миофибриллам.

В отличие от сокращения, расслабление миоф!брилл приводит к увеличению асишетрии индикатрисы светорассеяния. Удлинение индикатрисы происходит за счет ослабления светорассеяния при больших углах (12-90°) и усиления малоуглового рассеяния (углы менее 12°). Как уже говорилось, такие изменения должны быть сопряжены с увеличением размера частиц или (и) с уменьшением их показателя преломления. Так как эти параметры взаимосвязаны, в любом случае следует ожидать увеличения размера миофибрилл. Изменение размера частиц при просветлении определяли по изменению объема гелевой фазы суспензий, световой микроскопией и лазерным измерителем размера частиц. Все три метода показали, что размер частиц в "просветленной" суспензии миофибрилл практически не отличается от размера частиц в суспензии исходной. В случае ке суспензий синтетического актомиозина результат зависит от способа приготовления модели и соотношения белков в ней. Размер частиц сразу ке после добавления MgAT® может как уменьшаться, так и увеличиваться (рис.8 и II). Однако скорость этих изменений много меньше скорости просветления. Ожидаемый se распад частиц происходит позке и не сказывается на значении i (рис.Э), что подтверждает отсутствие связи между изменением размеров частиц и изменением т при просветлении.

Из вышеизложенного следует, что изменение диаграм?.ш светорассеяния суспензионных моделей при просветлении не может быть объяснено в рамках теории (in. l!u полагаем, что этот аффект связан с внутренней неоднородностьо моделей н определяется

> t« fa 14 i« и

Вр«мя, мин

10 100 Размер частиц. *» •

Рис.8 Изменение свойств суспензии "традиционного" синтетического актомиозина при просветлении. Точками на кривой мутности отмечено время определения распределения по размерам частиц. Цифры у кривых распределения соответствуют маркировке точек на кривой мутности.

изменением их внутренней структуры при просветлении. Эти изменения включают прежде всего диссоциацию актомиозиновых мостиков. Известно, что диссоциация актомиозина в растворах с высокой ионной силой или диссоциация комплексов актина с протеолитическими фрагментами миозина в присутствии MgAT® приводит к уменьшению светорассеяния в интервале больших углов рассеяния (Rice et al.. 1963: Inoue and Топошига, 1982). Можно полагать, поэтому, что таким же образом ведет себя та часть светорассеяния суспензий, которая имеет "внутреннее" происхождение и именно этим определяется уменьшение светорассеяния в интервале углов 12-90". Формально это выглядит как уменьшение концентрации внутренних неоднорояаостей вследствие, например, "агрегации" головок миозина и стволов толстых нитей. Возможно, что и усиление малоуглового рассеяния при расслаблении также связано с уменьшением "концентрации" внутренних неоднородностей, так как они могут вторично рассеивать свет, преломляемый частицами в малые углы.

Таким образом, в случае неоднородных частиц перестройка внутренней структуры частицы может приводить к изменению оптических свойств суспензий без изменения размеров и усредненного показателя преломления частиц.

Как уже говорилось, распад актомиозиновых частиц в состоянии просветления происходит медленно и не сопряжен с оптическими язмеденилма (р-лс. 8). Можно думать, что длительное сохранение

"просветленных" частиц мояет быть связано либо с "инерционностью" структуры гидратированных частиц, либо с наличием слабосвязашшх миозиновых мостиков.

¿СЗШ&КА СТРУКТУРНЫХ НЗЫЕИЕНКЯ В СУСГП2ЕШ2 СОКРАГПТКЛЬНЩ

иодоши при взаимодействии с ыватр

До сих пор мы судили о связи между структурными и оптическими изменениями в суспензиях сократительных моделей только по начальным и конечным ("сокращенным" или "расслабленным") препаратам. Возможность сопоставить эти свойства в процессе изменения предоставляет дифракционный лазерный анализатор размера частиц, который способен регистрировать кинетику изменеюм размера частиц и их распределения по размерам. Пример сопоставления кинетики структурных и оптических изменений при Просветлении уке приводился (рис.8). При СПП. как и следует ожидать, увеличение 1 сопровождается уменьшением среднего размера частиц (рис.9). Соответствующие кривые, приведенные к одинаковому масштабу и одной направленности, полностью совпадают на начальных стадиях реакции. Более полная информация об изменении размеров частиц в процессе реакции следует из кривых распределения по размерам. Первоначально очень широкое распределение сдвигается на начальных этапах СПП влево, в сторону меньших размеров, и становится симметричным и узким, т.е. частицы становятся более гомогенными. Скорее всего в процессе СПП при стрикции крупных частиц происходит их распад на более мелкие частица. Со временем сокращенные частицы агрегируют а ширина распределения возрастает. Нзиадлэккая в спонтанная суперпрэщаштенкя ветасюиша

Напомним, что на рис.9 представлены результаты немедленной СПП. В случае ее спонтанной СШ картина событий иная (рис.10). При спонтанной СПП подъем 1 сопровождается увеличением размера частиц. Кроме того, 190 при спонтанной СПП увеличивается, а не уменьшается. Различаются также свойства суперпренигштированшх актомиозинов. Актомиозин после спонтанной СПП способен к повторному просветлению и затем к повторной СПП в отличий от актомиозина после СПП немедленной. В основе этих различий, как нам кавется, лежат разные механизмы немедленной я спонтанной СПП. В первом случае это быстрое сжатие частиц, а во втором - медленная упорядоченная латеральная ассоциация миозиновых и актиновых нитей.

Образумимся при этом частицы, видимо, соответствуют "в1еете-11ке" структурам, обнаруженным ранее электронномикроскопически акепк^о ег а1.. (966). Этим процессам вполне соответствует наблюдаемое изменение размера частиц: в первом случае они уменьшаются, а во втором - увеличиваются.

Мутноотъ Ряаыер частиц, )1Ш

Мутноот»

Рьшвр чктац,)11п

Время, ним

Время, нага

19 я»

РЮМерЧвСЯОД,}!!»

ю>

Разгнр чссавц, ра

Рис.9 Изменение свойств "традиционного" синтетического актомиозина при немедленной СПП. Обозначения такие же, как на рис.8.

Рис.10 Изменение свойств "традиционного" синтетического актомиозина при спонтанной СПП. Обозначения такие же, как на рис.8.

В фазе просветления, предшествующей спонтанной СПП, 190 уменьшается, что, км уже говорилось, связано с диссоциацией актомиозиновах мостиков. Естественно ожидать, что по исчерпании АТФ светорассеяние возвратится на прежний уровень. Действительно, это и происходит при прерывании просветления добавлением ЭДТА. Поэтому мы полагаем, что причиной повышения I90 в процессе спонтанной СИП является ригориэация миозишвых мостиков.

Ригоризация мостиков при спонтанной СПП долина возвращать к

исходному значению также и t, как это происходит в случав комплексов Ф-актин-тякелый меромиозин (Bechet and d'Albla, 1965). Однако замыкание мостиков может бить лишь одной из причин роста 1, поскольку At при спонтанной СПП значительно больше, чем при просветлении. Мы полагаем, что основной причиной роста г, также как и в случае немедленной СПП, является появление частиц с более высоким показателем преломления. Действительно, вновь образующиеся частицы при спонтанной СПП должны быть более плотными, чем неупорядоченные рыхлые частицы исходного актомиозина, поскольку образуются путем мягкой самосборки.

Итак, мы видим две причины увеличения % при спонтанной СПП: образование упорядоченных надмолекулярных актомиозиновых комплексов с более высоким показателем преломления, чем у исходных частиц, и замыкание актомиозиновых мостиков. Образование комплексов и замыкание мостиков сопряжены, но не синхронны. Для Формирования латеральных ассоциатов достаточно образования небольшого количества мостиков, а остальные замыкаются, видимо, уже в составе сформированных частиц. На это указывает более поздний подъем кривой i90 по сравнению с кривой 1. Общей чертой двух типов СПП является то, что в обоих случаях в ходе СПП образуются плотные частицы. В одном случае плотность большая, чем исходно, обеспечивается сжатием существующих частиц, а в другом случае - посредством образования новых частиц. Дауступвнчатая супврпрвцяштадая актокяозяиа

При изменении условий среды в направлении от немедленной СПП к спонтанной в промежуточных условиях появляется двуступенчатая СПП (Szoor et al.. 1963: Тикунов, 1989). Оказалось, что свойства первой и второй ступени двуступенчатой СИЛ различны. Свойства первой ступени совпадают со свойствами немедленной СПП, а второй ступени - со свойствами спонтанной СПП. Показано, что после завершения первой ступени суспензия содержит две популяции частиц, одна из которых может быть удалена низкоскоростным центрифугированием. В супернатанте. спустя такое ве время, как и в контроле, развивается вторая стадия реакции, обладащая всеми признаками спонтанной СПП.

Таким образом, одновременное протекание двух различных реакций в ходе двуступенчатой СПП обеспечивается различными частицами. Мы полагаем, что причиной появления двух популяций частиц в суспензии после добавления MgATO является исходная гетерогенность частиц по

размеру. Есть основания считать, что внутри частии актомиозина после добавления MgATP возникает градиент концентрации АТФ, определяемый скоростями растепления и диффузии АТФ (Endo, 1964). В условиях, промежуточных между условиями СШ1 и просветления, это может привести к "просветлению" небольших частиц и "сокращению" крупных. Крупные частицы сокращаются сразу, образуя первую ступеньку кривой т, а маленькие частицы после фазы просветления обеспечивают вторую ступеньку.

Двуступенчатая СПП является наиболее ярким примером одновременного протекания реакций разного типа. Чаще же одновременное протекание двух типов СПП выражается в наличии быстрого и медленного участков на кривой СШ. Таким образом, СПП в реальных условиях может одновременно включать различные процессы: стрикшпо частиц, образование латеральных ассоииатов. агрегацию и дезагрегацию частиц. Для немедленной СПП характерно преобладание стрикции. а для спонтанной - образование латеральных ассоциатов. Зависимость свойств синтетического актсшяозита от условий его реконструкция

Синтетический актомиозин, получаемый из отдельно выделенных и очинённых сократительных белков, является наиболее популярной суспензионной моделью. Он позволяет регулировать состав модели и способ ее реконструкции и может использоваться для исследования закономерностей самосборки сократительного аппарата (Hayashl et al., 1983). Каких-либо систематических литературных данных о зависимости свойств синтетического актомиозина с условиями его образования нет, хотя в исследовательской практике используются препараты, получаемые разными способами. Между тем, результаты тестирования механической активности синтетического актомиозина, полученного традиционным способом путем понижения ионной силы раствора, и актомлозина, полученного в среде с низкой ионной силой путем соединения предсфэриироватшх толстых и тонких нитей различны. В условиях, когда традиционно полученный актомиозин отвечает немедленной СПП, "ннзкоионный" актомиозин демонстрирует типичную, спонтанную СПП. Таким образом, существует зависимость функциональных свойств актомиозина от условий его реконструкции. Детально эту зависимость исследовали на примере "низкоионного" и "традиционного" актомионина, сформированных с различными соотношениями миозина к актину в среде с различными значениями pH.

Образование синтетического актомнозина в среда с низкой ионной силой сопровождается синхронным увеличением среднего размера частиц и мутности. Неожиданным оказалось то, что образующиеся частицы в высокой степени гомогенны, несмотря на гетерогенность исходных препаратов миозииовых и актиновых нитей. Это указывает на наличие определенного "сямоорганизупдего" начала в атом процессе, который не сводится только к замыканию мостиков между нитями. Свойства "низкоионного" и "традиционного" актомиозина обнаруживают различную зависимость от условий образования. С уменьшением отношения миозина к актину х и размер частиц у "низкоионного" актомиозина возрастают, а у "традиционного" падают (рис.11).

иуТИОСТ!»

J АМ традиционный АМ ниакоионный

0.5

1'ввигр частиц, ^т

ш

I

г : г

Рис.II Мутность и размер частиц в суспензиях

синтетического актомиозина, образованного в среде с высокой и низкой ионной силой при различных весовых соотношениях между миозином и актином, к изменение этих свойств при просветлении. Стрелками указаны направление и величина изменения мутности и размера частиц при просветления. Эти изменения регистрировали спустя 16 с после добавления И&АТР.

3 : 0.5 2:1 2:8

Несовов отношение ииоэин/актин

Свойства суспензий также существенным образом зависят от значения рН среды, в которой модели образуются. При этом г суспензий в большей степени определяется тем значением рН, при котором актомиоэин формируется, чем рН среда, в которой происходит измерение 1.

Мы полагаем, что различия в свойствах моделей, приготовленных разными способами и в разных условиях. связаны с различной плотностью их упаковки. Как мы видели (таблица), чем плотнее частицы, тем выше мутность их суспензий. Действительно, вполне можно ожидать, что более плотные частицы образуются из предеформированных нитей и при низком значении рН. Последнее согласуется с данными о влиянии рН на отклонение головок миозина от ствола толстых нитей (Harrington ana Hodgera, 1964). Следует отметить, что мутность практически не меняется при изменении рН в суспензиях уже сформированного актомиозина, что указывает на способность его структуры "запоминать" условия формирования.

Функциональные свойства двух типов актомиозина тоже различны. При одинаковых условиях среды "низкоионше" и "традиционные" модели могут отвечать различным образом на добавление одинаковых концентраций UgATP - или просветлением, или немедленной СПП, или ступенчатой СПП. Значение концентрации MgAT®, при которой наступает фаза просветления, кроме того, зависит от значения рН, при котором модель приготовлена. Например, для "низкоионного" актомиозина увеличение рН среды приготовления от 7.0 до 8.0 уменьшает концентрацию MgAT®, необходимую для просветления, а для "традиционного", наоборот, это же изменение рН увеличивает необходимую концентрацию. Таким образом, переход просветление-СПП зависит не только от условий среды, но и от структуры модели.

Размер частиц "низкоионного" актомиозина при просветлении всегда уменьшается, причем тем больше, чем больше отношение миозина к актину в комплекс?. В случав же "традиционного" актомиозина размер уменьшается при низком отношении миозина к актину и увеличивается при высоком (рис.II). Процесс последу пне го распада частиц тоже различен. В случае "традиционных" препаратов наблюдается распеп крупных частиц на несколько типов гомогенных по размеру частиц. В случае "ниэкоионных" препаратов мы имеем в конечном счете, только два вида частиц.

Существует ряд особенностей в ходе немедленной СПП "низкоионного" актомиозина, которые выделяют эту модель из числа прочих суспензионных моделей. В случае "низкоионного" актомиозина все регистрируемые нами параметры - t, средний размер частиц, распределение по размерам, объемная концентрация и удельная плотадь поверхности - после завершения СПП возвращаются к практически начальтам значениям. Эти наблюдения наводят па мысль о

том, что в основе СПП синтетического актомиозина, совранного из предеформированных нитей, лежит не стрикция частиц, а скорее их распад и реорганизация на основе диссоциации, ассоциации и скольжения нитей. Возможно, эти процессы Олиже к тем, которые происходят в "двумерной" антомиозииовой системе с иммобилизованными компонентами.

вивоны

1. Кинетические кривые турбидиметрического ответа суспензий сократительных моделей на добавление М^АТР могут включать три фазы - просветление, суперпреципитаиию (сокращение) и агрегацию. Все разнообразие кинетических кривых мокэт быть объяснено сочетанием этих фаз с различной степенью выраженности. Выраженность фаз зависит от типа модели, источника ее получения, условий эксперимента и "истории" модели, интегрирующей различные воздействия в процессе получения и хранения моделей.

2. В процессе хранения моделей и при инактивирующих воздействиях, способствующих "старению" моделей, их свойства меняются несинхронно, что меняет соотношение фяз в кривых оптического ответа моделей на добавление И&АТР. Последовательность появления признаков инактивации следующая: потеря Са2* -чувствительности, снижение способности к просветлению, уменьшение скорости суперпреципитации (сокращения), потенциирование КвАТРазы, уменьшение степони суперпреципитации (сокращения), снижение И^АТРазной активности. Предполагается, что разобщение кривых зависимости механической и ферментативной активности от интенсивности воздействия и потенциирование ИвАТРазы на начальных стадиях инактивации обусловлены недиссоциируюшими в присутствии МйАТР миозиновыми мостиками, которые образуются в хода инактивации.

3. Своеобразие оптических свойств суспензий миофябрилл а актомиозина определяется двумя особенностями их частиц - низким относительным показателем преломления я наличием внутренних неоднородностей. Первое обуславливает высокую степень асгоаютрии индикатрисы светорассеяния, связанную о сильным малоугловым рассеянием (аномальная дифракция), а второе приводит к усилению

светорассеяния под большими углами, источником которого является внутренняя структура частии. Функционирование моделей сопровождается изменением формы индикатрисы и интенсивности светорассеяния под большими и малыми углами:

а) в условиях суперпреципитации (сокращения) астметрия индикатрисы резко уменьшается за счет уменьшения малоуглового рассеяния (ослабление аномальной дифракции). Светорассеяние под большими углам)? уменьшается, если суперпреципитация является немедленной, и увеличивается при спонтанной суперпреципиташш;

б) агрегационноя фаза оптических изменения в условиях суперпреципиташш (сокращения) включает увеличение асимметрии индикатрисы светорассеяния, что сопряжено с увеличением малоуглового рассеяния (усиление обычной дифракции) при сохранении интенсивности рассеяния под большими углами;

в) в условиях просветления увеличивается малоугловое рассеяние и ослабляется рассеяние под большими углами. Это приводит к увеличению асимшзтрии индикатрисы светорассеяния, в основе которого по фориальнам признаке« лежит усиление аномальной дифракции. Щэелполагается, что эти оптические изменения обусловлены перестройкой внутренней структуры частиц в результате диссоцивциации вктий-югозийовьа связей.

4. механизм турбютметричесгай изменений при функционировании суспензионных моделей' базируется на изменении примесного малоуглового светорассеяния'. Уменьшение асимметрии индикатрисы светорассеяния при функционировании моделей приводит к уменьшению количества примесного света и, соответственно, к увеличению оптической плотности суспензий. Увеличение асимметрии индикатрисы. наоборот, приводит к уменьшению оптической плотности. Такой механизм обусловливает сильную зависимость результатов турйидимотрического теста Эбаши от условий эксперимента и затрудняет их интерпретацию. Предложен другой метод регистрации механической активности суспензионных моделей - по изменению светорассеяния под углом 90°. Метод "устойчивее" турбодиметрии к варьированию условий регистрации, не чувствителен к агрегации моделей и позволяет сравнивать однотипные модели из разных мышц.

5. Функционирование суспензионных моделей сопряжено с рядом структурных изменений, включающих стрикцию частиц, перестройку их внутренней структуры, распад и образование частиц и их агрегацию,

В условиях немедленной суперпреципитации (сокращения) увеличению мутности суспензий соответствует уменьшение размера частиц.

В условиях спонтанной суперпреципитации увеличению мутности суспензий соответствует увеличение размера частиц.

Предполагается, что в обоих случаях рост мутности обусловлен появлением плотных частиц. В первом случае плотность большая, чем плотность исходных частиц достигается сокращением существующих частиц, а во втором случае - посредством образования новых частиц.

После сокращения частиц в результате немедленной суперпрещтитации (сокращения) следует их агрегация. В зависимости от условий, агрегация может приводить как к уменьшению мутности суспензий, так и к ее увеличению.

В условиях просветления размеры миофибрилл не меняются, а частиин актомиоэкна медленно распадаются. Изменение оптических свойств при просветлении не связано с изменением размеров.

6. В целом, суперпреципитация и просветление суспензионных сократительных моделей являются сложными явлениями и, кроме того, сложным образом связаны с соответствующими оптическими явлениями. В зависимости от условий эксперимента и особенностей модели в основе этих явлений могут лежать различные процессы. Поэтому использований суспензионных моделей в исследовательской практика должно проводиться в контролируемых условиях, а модель и способ регистрации должны быть едекватны решаемой задаче. В частности, только условия немедленной суперпрещтитации (сокращения) позволяют получить информацию о сократительных свойствах суспензионных моделей. В этом случав существует линейная зависимость между изменением длины саркомеров миофйрилл н изменением оптических свойств их суспензий, а кинетика сокращения частиц ахтомиозина совпадает с кинетикой изменения оптических параметров. Свойства спонтанной суперпреципитация (сокращения) лишь косвенно отражают мехаио-химическиэ свойства моделей, однако эта реакция может быть полезна при изучении закономерностей самосборки сократительного аппарата.

Спясок работ, опубликования по тепе диссертации

1. Шелудько U.C. Взаимодействие белкового компонента с молекулярным весом 37000, присутствующего в препаратах тропомиозина, с Ф-актином // Цитология, 1У74, т.16. 0.594-603.

2. Шелудько, И.С. Белковый состав миофиорилл кролика, определенный методом электрофореза в присутствии додецилсульфата натрия // ЦИТОЛОГИЯ, I97&, Т.17, с.1148-1152.

3. Шелудько, Н.С., Пинаев, Г.П. Активный компонент препаратов ß-актинина // ДАН СССР, I97&, т.224, с.725-727.

4. Штранкфельд. И.Г., Шелудько, Н.С.. Хайтлина, С.1)., Мэргулис, Б.А., Каламкарова, М.Б., Москаленко, И.Е. Электрофоретическое исследование миофибрилл кролика после денервации // Биофизика, 1977, т.22, с,364-365.

5. Яснецкий, Г.II., Шелудько, Н.С. Влияние тепловой обработки на сокращение и АТФазную активность миофиорилл, выделенных из зопирательных мышц моллюсков Crasso3trea glgaa и Splaula sachalijiensls // Тез. докл. симиоз, "Биофизические и биохимические основы мышечного сокращения", Нущино, 1977, с.26.

6. Иванов, И.И., Николаева, М.В.. Резник, С.Э., Шелудько, Н.С. Состав спонтанно квлирущих легкорастворимых белков мышц // БИОЛОГИЯ моря, I97Q, Т.4, с.72-75.

7. Шелудько, Н.С. Исходные экстракты в методах выделения сократительных белков // В кн.: "Биофюичоские и биохимические методы исследования мышечных белков". Наука, Л., 1978, с.23-48.

8. Крспачева, И.В., Шелудько, Н.С. Влияние тропомиозина на взаимодействие актомиозина с АТФ // Тез. научн. сообщ. 4 биохим. съезда. Л.,, 1979, т.2, с.41.

9. Хайтлина, С.В., Шелудько, Н.С. Экстрагируемость миофибрил-лярных белков морских двустворчатых моллюсков // В кн.: Физиология и биохимия морских и пресноводных животных. Л.: Наука, 1979, с.187-193.

10. Шелудько, Н.С., Хайтлина, С.Ю., Цховребова, Л.А., Подлубная, З.А. а-актинип поперечно-полосатой мышцы приморского гребешка. Физико-химические свойстве // Биофизика, 1980, т.25, с. 161-167.

11. Oglevetskaya, K.M., Maslov, 0., Shelud'ko, H. Trace elements In phasls and tonic muscles // Eur. J. Cell Biol., 1981. v.24, p.124-127.

12. Фрейдлина, H.A., Шелудько, H.C., Подлубная, З.А. Влияние С-белка па ыохвнохшические свойства и структуру реконструированного актомиозина // Биофизика, 1981, т.26,

' 13. Кропачева, И.В., Шелудько, Н.С. Стабилизирующее влияние тропомиозина на скорость суперпрешпштации сш1тетичоского актомиозина // Тез. докл. I Всес.биодаз. съезда, М., 1982, т.2, с.35-36.

14. КреЕмер, Д.И., Кропачева. И.В., Шелудько, Н.С. Регистрация М0ха1шчоских свойств молекулярных сократительных моделей // Матер. 2 Всес. конф. по морской биологии, Владивосток. 1982, т.2, с.86.

15. Khaltllna, 5., Tskhovrebova, L., Shelud'ko, N. Unusual exe-tractlon oi a-actlnln from the adductor muscles of bivalve molluscs // Comp. Blochen). Physiol. , 1982, v. 73B, p,655-661.

16. Цховробовп, /i.A., Хайтлина. C.D., Шелудько, H.C., Подлубная, З.А. Взаимодействие а-эктинина и тропомиозина с Ф-актином // Биофизика, 1982, т.27, с.20-25.

17. Шелудько, U.C., Кропачева, И.В., Креймер, Д.И. Влияние ИйАТР на мутность и светорассеяние суспензий миофибрилл // Тез. докл. I Всес. биофиз. съезда, M., 1982, т.2. с.47.

18. Пермякова, Т.В., Шелудько, К.С. Зависимость свойств искусственных сократительных моделей от способа их сборки // Матер. 2 Всес. конф. по морской биологии, Владивосток, IS82, т.2, с.99.

19. пермякова, Т.В.. Шелудько, Н.С. Влияние условий реконструкции актомиозина на его суперпрешшитацшо // Тез. докл. I Всес. биофиз. съезда М.,, 1982а, т.2, с',36.

20. Мантуленко, В.Б., Хайтлкна, C.D., Шелудько, U.C. Высокомолекулярный устойчивый к протеолизу фрагмент актина // Биохимия, 1983, т.48. С.69-74.

21. Шелудько, Н.С. Нерешенные вопросы мешгахимии миофибрилл и актомиоэина // В кн.: "Биофизика и биохимия мышечного сокращения", "Мешшереба", Тбилиси, 1983, с.24-26.

22. Shelud'ko, H.S. Influence of MgATP on the optical properties of myofibril and actomyoaln suspensions // J. Muscle Res. Cell Motil., 1984, v.5. p.206.

23. Корчагин, В.П.. Шелудько, U.C. Способность изолированных миофибрилл, сокращенных в отсутствие Ca , к повторному расслаблению и сокращению // Тез докл. 5 Всес. конф. по биохимии мышц. Телвви, 1985, с.51.

24. Юдин. Ю.К.. Дульцев, A.B.. Шелудько. U.C. Сократительные свойства изолированных миофибрилл и актомиозина с одинаковым составом белка /7 Тез докл. & Всес. конф. по биохимии мышц, Телави, I9Ö5, с.122.

25. Граф, H.A., Дульцев, A.B., Шелудько, U.C. ультраструктура и сократительные свойства миофибрилл из красной и белой мышц рыб разной экологии // В кн.: Вопросы эволюционной физиологии. Л. Наука. 1986. с.'71-72.

26. Кропачева, И.В., Корчагин. В.П., Шелудько. Н.С. Изменение механохимичоских свойств актомиозина при десенсибилизации // Биохимия. 1986. Т.61. С.834-839.

27. Кропачева, И.В., Юдин, Ю.К., Шелудько. Н.С. Индикатрисы светорассеяния суспензий изолированных миофибрилл в исходном, сокращенном и расслабленном состоянии // Биофизика, 1986, т.31,

28. Корчагин, В.П., Премингер. U.K., Пермякова, Т.В., Шелудько, Н.С. Особешюсти сократительной активности миофибрилл и актимиозина из косоисчерченной части аддуктора устрицы Crassoetrea glgaa // Тез. докл. а. Всес. симп. биофиз. и биохим. биолог, подвижности. Тбилиси. 1907, с.73-74.

29. Шелудько, ЦгР-, Дульцев, A.B. Взаимозависимое влияние АТФ и ионной силы на Caй -чувствительность изолированных миофибрилл. // Биофизика, 1987, т.31, с.166-167.

30. Юдин, O.K.. Кропачева. И.В., Шелудько, Н.С. Изменение оптических свойств изолированных миофибрилл при расслаблении // Тез. докл. 8 Всес. сими, биофиз. и оиохим. биолог, подвижности, Тбилиси, 1987, С.100.

31. Shelud'ko, N.S., Preminger, N.K. Hyosln-actln weight ratio in phasic and tonic parts of acallop adductor // Corap. Blochen. Phyalo).. 1989, v.93A. p.327-330.

32. Shelud'ko, N'.S., Stadnlkov, V.l. Heat reslatance of MgATPase and contractility In muscle models // J. Thenn. Biol., 1909, v.14, p.325-532.

33. Шелудько. U.C., Кропачева. II.В., Юдш, D.K. Агрегация изолированных миофиорилл, стимулируемая их сокращением. I. Происхождение второй фазы оптических изменений при сокращении миофибрилл /У Биофизика. 1989, Т.34, С.473-477.

34. Шелудько, H.С., Корчагин, В.П., Кропачева, И.В.. Юдин, С.К. Агрегация изолировалиих миофибрилл, стимулируемая их сокращением. II Механизм агрегации // Биофизика, 1989, т.34, с.840-843.

35. Шелудько, Н.С., Стадников, В.Л. Причины неодинаковой теплоустойчивости Mg-АТРазы и сократимости мышечных моделей. // Цитология, 1969, т.31, с.195-201.

36. Orlova, A.A., Korchagln, V.P., Udaltzov, S.N., Shelud'ko, N.S.. Podlubnaya, Z.A. The effect of C-proteln on ßuperpreclpltaUon ol scallop myofibrils // 20th Meeting of FEBS, Budapest, 1990. p.132.

37. Shelud'ko. N.S. Optical properties ol myofibril and acto-niyosln BUspen8lona 1. Angular dependence of light scattering by myofibril suspensions and Its changes under myofibrils contraction // Blochlm. Blophys. Acta, 1990, v.1036, p.315-321.

38. Шелудько, H.С.. Юдин. D.K.. Корчагин, В.П., Грибов. А.Г. Зависимость между длиной саркомеров миофибрилл и оптическими свойствами их суспензий // Тез. докл. 9 Всес. симп. биофиз. и Оиохим. биолог, подвижности. Тбилиси. 1990, с.101.

39. Орлова, A.A.. Корчагин, В.П., Удальцов, С.Н., Шелудько, К.С., Подлубная, З.А. Действие С-белка на суперпреципитацию миофибрилл гребешка // Тез. докл. 9 Всес, симп. Оиофп. и биохлм. биолог, подвижности, Тбилиси, 1990, с.26.

40. Пермякова, Т.В., Шелудько, Н.С. Зависимость формы кинетических кривых суперпреципитации синтетического актомиозина от условий его образования и тестирования // Тез. докл. Всес. симп. биофиз. и бнохим. биолог, подвижности, Тбилиси, 1990, с.28.

41. Юдин. Ю.К., Шелудько, Н.С. О причинах изменения оптических свойств суспензий миофибрилл при расслаблении // Биофизика, 1990, Т.35, с.605-609.

42. Шелудько, Н.С..Кропачева, И.В., Пермякова. Т.в. Изменение размера частиц в суспензиях актомиозина в процессе суперпреципитации // Биохимия, 1993, т.56. с.1936-1944.

43. Шелудько, Н.С., Пермякова, Т.В., Кропачева, И.В., Юдин, Ю.К. Образование и распад актомиозиновых частиц // Тез. докл. междунар. симп. "Биологическая подвижность", Пуиино, 1994

44. шелудько, Н.С., Тикунов, Б.А., Кропачева, И.В., Пермякова. Т.В.. Юдин, Ю.К. Механизм двустадийной кинетики суперпреципитации актомиозина // Биофизика, 1994, г,39, с.418-422.

/ ■■ *

/