Сульфатредуцирующие бактерии в экосистемах с экстремальными значениями pH

Герасимчук, Анна Леонидовна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Сульфатредуцирующие бактерии в экосистемах с экстремальными значениями pH
ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Сульфатредуцирующие бактерии в экосистемах с экстремальными значениями pH"

На правах рукописи

111111111111111111!

003485742

Герасимчук Анна Леонидовна

СУЛЬФАТРЕДУЦИРУЮЩИЕ БАКТЕРИИ В ЭКОСИСТЕМАХ С ЭКСТРЕМАЛЬНЫМИ ЗНАЧЕНИЯМИ рН

03.00.07 - Микробиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

- з ДЕК 2009

Москва - 2009

Работа выполнена в Томском государственном университете

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор

Карначук О. В.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, зав. лабораторией

Бонч-Осмоловская Е. А.

доктор биологических наук, профессор Вайнштейн М. Б.

Ведущая организация: Институт общей и экспериментальной

биологии СО РАН

Защита диссертации состоится 21 декабря 2009 года в часов на

заседании диссертационного совета Д.002.224.01 в Институте микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН по адресу: 117332, Москва, Проспект 60-лет Октября, д.7, корп. 2. Факс (495) 1356530

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН.

Автореферат размещен на сайте: http://www.initii.ru/dissovet.php Автореферат разослан 19 ноября 2009 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук:

O^^f Т.В.Хижняк

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. В последние годы существенно возрос интерес к биоразнообразию и экологии микроорганизмов экстремальных местообитаний. Изучение экстремально кислых местообитаний (рН<3) становится значимым, так как кислотность природных и техногенных экосистем часто является последствием микробной активности (Ehrlich, 1996; Hallberg, Johnson, 2001; Nordstrom, Southam, 1997; Nordstrom, Alpers, 1999).

СРП, обнаруженные в кислых местообитаниях, в основном представлены спорообразующими организмами. Известны примеры выделения СРП рода Desulfosporosimis как с использованием культивирования (Johnson B.D., Hallberg, 2003), так и молекулярными методами (Küsel et al., 2001; Nevin et al., 2003; Saunders et al., 2005; Winch et al., 2009; Kimura et al., 2006 и др.) из кислых местообитаний, загрязненных металлами. Немногие полученные из таких экосистем чистые культуры были активны при рН<4,9 (Johnson et al., 2006; Kimura et al., 2006).

Изучение биоразнообразия СРП в кислых шахтных дренажах, загрязненных металлами, имеет большое практическое значение. В последние годы возрос интерес к изучению возможностей стимулирования активности аборигенной микрофлоры в загрязненных местообитаниях. Целью подобных исследований является поиск новых путей развития биоремедиационных технологий. В связи с этим, данные о численности и биоразнообразии СРП в экосистемах, загрязненных стоками металлургических и горнодобывающих производств, представляют особую ценность.

Другим местообитанием, характеризующимся экстремальными условиями рН, являются глубоководные гидротермальные поля - области на поверхности океанического дна, характеризующихся выходами геотермальных растворов, обогащенных восстановленными соединениями серы, газами и тяжелыми металлами. Микробные сообщества глубоководных гидротерм представляют значительный интерес с точки зрения эволюции биосферы и, по мнению многих исследователей, являются аналогами сообществ, доминировавших на ранних этапах развития жизни на Земле (Заварзин, 2001; Nisbet, 1986; Walter et al., 1998; Nisbet, Sleep, 2001).

Уникальное глубоководное гидротермальное поле Лост Сиги, отличающееся от всех известных глубоководных гидротерм низкой температурой (40-90°С), щелочным рН (9-9.8)и составом гидротермального раствора, рассматривается некоторыми авторами как аналог экосистемы, где могли зародиться первые формы жизни (Proskurowski et al., 2008). Изучение биоразнообразия микробных сообществ флюидов и построек Лост Сити, проведенное американскими учеными (Brazelton et al., 2006) с помощью молекулярного клонирования, по мнению авторов, не показало присутствия организмов, способных восстанавливать сульфат. Однако наличие процессов сульфатредукции в поле Лост Сити показано методом измерения скоростей сульфатредукции (Леин и др., 2002; Дулов и др., 2005) и посевом на

элективные питательные среды (Дулов и др., 2005). В связи с этим, представляется важным поиск и идентификация СРП, обитающих в этой уникальной экосистеме.

Изучение структуры и разнообразия микробных сообществ природных экосистем долгое время было ограничено морфологическим описанием микроорганизмов, а физиолого-биохимические исследования проводились с чистыми культурами на лабораторных питательных средах. Однако лабораторное культивирование не дает полного представления о разнообразии микробного сообщества. Использование молекулярных методов, основанных на анализе универсального филогенетического маркера, гена 16Б рРНК, а также некоторых функциональных генов, комбинируемых с физиологической характеристикой выделенных штаммов, позволяет более подробно изучить филогенетическое разнообразие микробных сообществ разнообразных экосистем (Напшеп е! а1., 1997; 81оЬос11ап « а!., 2001; Така1 е1 а!., 2003).

Цель и задачи исследования. Цель настоящей работы состояла в выяснении филогенетического разнообразия микробного сообщества с целью поиска СРП в кислых осадках хвостохранилища золотообогатительной фабрики на месторождении «Новый Берикуль» в Кузбассе и микробных обрастаниях карбонатной постройки глубоководного гидротермального поля Лост Сити.

Для достижения цели поставлены следующие задачи:

1. Определить численность сульфатредуцирующих микроорганизмов микробиологическими методами в осадках хвостохранилища.

2. Выделить культивируемые формы СРП из осадков хвостохранилища и изучить их физиологию и филогению.

3. Определить филогенетическое разнообразие микробного сообщества, диссимиляционно восстанавливающего сульфаты в осадках хвостохранилища, методами денатурирующего градиентного гель-электрофореза и молекулярного клонирования генов 16Б рРНК и функционального гена на сульфатредукцию скгАВ.

4. Определить филогенетическое разнообразие сульфатредуцирующих организмов в пробах микробных обрастаний карбонатной постройки глубоководного гидротермального поля Лост Сити методом молекулярного клонирования генов 16Б рРНК и с/хгАВ.

электрофореза (ДГГЭ) и молекулярного клонирования. Установлено, что микроорганизмы, способные к восстановлению сульфатов, представлены в исследуемом местообитании филотипами, родственными спорообразующим СРП рода Desulfosporosinus. Также обнаружены последовательности, родственные генам dsrAB некультивируемых микроорганизмов, существенно удаленных от всех Bacteria, для которых известна способность к диссимиляционной сульфатредукции и, вероятно, относящихся к неизвестным сульфидогенам. Комбинирование методов молекулярной биологии (ДГГЭ и молекулярное клонирование генов) и традиционных методов культивирования позволило наиболее подробно охарактеризовать сообщество микроорганизмов в кислых осадках хвостохранилища.

Из микрокосмов, полученных из проб осадков хвостохранилища на среде с лактатом и низким рН (2,5) с содержанием меди (И) 200 мг/л, выделена чистая культура Desulfosporosinus sp. DB, отличающаяся от известных представителей рода Desulfosporosinus умеренно-ацидофильным характером роста и устойчивостью к высоким концентрациям тяжелых металлов (меди, никеля, кобальта и кадмия). Изучена способность штамма образовывать сульфиды меди, показано накопление сульфидов в виде микрокристаллов на поверхности бактериальных клеток.

Исследовано бактериальное разнообразие в пробе микробного обрастания карбонатной постройки гидротермального поля Лост Сити. Впервые в этом местообитании обнаружены гены dsrAB, родственные представителям СРП рода Desulfotomaculum. Параллельное клонирование генов 16S рРНК и dsrAB свидетельствует, что спорообразующие Firmicutes, родственные Desulfotomaculum, являются единственными организмами в сообществе микробного обрастания из Лост Сити, для которых вероятна способность к диссимиляционной сульфатредукции.

Личный вклад соискателя. Автор принимал участие в отборе проб с территории бывшего хвостохранилища золотообогатительной фабрики на месторождении «Новый Берикуль» в Кузбассе, определении численности СРП и получении микрокосмов. Выделение чистой культуры и изучение ее физиологических характеристик проводилось совместно со студентами лаборатории биотехнологии и биоинженерии ТГУ. Изучение разнообразия микроорганизмов с помощью молекулярного клонирования генов проводились автором самостоятельно, ДГГЭ-анализ - совместно с магистрантом ТГУ Г.А. Стыкон. Филогенетический анализ микробных сообществ выполнен в партнерстве с научным руководителем — д.б.н. О. В. Карначук. Формулирование целей, задач и обсуждение полученных результатов проводилось под руководством научного руководителя.

стимуляции аборигенного сообщества микроорганизмов, способных к переводу растворенных металлов в нерастворимую форму.

Чистая культура СРП, выделенная и охарактеризованная в ходе настоящей работы, обладает свойствами, важными с точки зрения использования в биотехнологиях осаждения металлов, а именно: устойчивостью к металлам, ацидотолерантностью, способностью к использованию дешевых органических субстратов (этанола, глицерина). Осаждение ионов меди в виде халькопирита и ковеллита в процессе роста штамма делает его перспективным для использования в технологиях биоремедиации. Штамм может быть рекомендован для тестирования в in situ и ex situ технологиях очистки стоков от металлов.

Результаты исследования микробного сообщества гидротермального поля Лост Сити позволили идентифицировать представителей СРП в изученной экосистеме.

Основные защищаемые положения:

1. Спорообразующим Desulfosporosinus принадлежит важная роль в процессе диссимиляционного восстановления сульфатов в осадках хвостохранилища, характеризующихся высоким содержанием металлов и низкими значениями рН.

2. Выделенный штамм СРП Desulfosporosinus sp. DB является перспективным для использования в технологиях биоремедиации загрязненных металлами и сульфатами экосистем.

3. Диссимиляционное восстановление сульфата в микробных обрастаниях карбонатных построек Лост Сити могут осуществлять родственные Desulfotomaculum организмы.

Апробация работы. Материалы исследований по теме диссертации были представлены на II Международной молодежной школе-конференции «Актуальные аспекты современной микробиологии» (Москва, 2006); 11th International Symposium on Microbial Ecology (Vienna, Austria, 2006); II International Conference on Environmental, Industrial, and Applied Microbiology (Seville, Spain, 2007); Международной научной конференции «Микроорганизмы и биосфера» (Москва, 2007); 6th International Copper Meeting «Copper and related metals in biology» (Alghero, Sardinia-Italy, 2008); IV Молодежной школе-конференции с международным участием «Актуальные аспекты современной микробиологии» (Москва, 2008); Российской школе-конференции «Генетика микроорганизмов и биотехнология» (Москва-Пущино, 2008); школе-семинаре «Современные фундаментальные проблемы физиологии и биотехнологии растений и микроорганизмов» (Томск, 2008), V Молодежной школе-конференции с международным участием «Актуальные аспекты современной микробиологии» (Москва, 2009).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 11 печатных работ, включая 2 статьи и 9 тезисов докладов. Одна статья находится в печати.

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, содержащей методы, результаты исследования и обсуждение, выводов и списка литературы. Материалы диссертации изложены на 132 страницах машинописного текста и включают 39 рисунков и 18 таблиц.

Место проведения работы. Работа выполнена в лаборатории биотехнологии и биоинженерии при Кафедре физиологии растений и биотехнологии Томского государственного университета под руководством д.б.н. О. В. Карначук. Молекулярное клонирование проведено во время стажировок в рамках Инновацонно-образовательной программы ТГУ и гранта РФФИ по программе «Мобильность молодых ученых» в Лаборатории генетики биодеградации и биотрансформации ГосНИИгенетика под руководством д.б.н. А. С. Яненко.

Автор выражает глубокую признательность научному руководителю д.б.н. О. В. Карначук, д.б.н. А. С. Яненко, д.б.н. Н. В. Пименову, к.б.н. Ю.А. Франк, науч. сотр. А. Д. Новикову за полезные советы, помощь при выполнении работы и обсуждении результатов. Искренне признательна д.б.н.

A. Ю. Леин и к.б.н. И. И. Русанову за любезно предоставленные пробы из глубоководного гидротермального поля, доктору Александру Лою (Университет Вены) за помощь в филогенетическом анализе генов ¿ягАВ, доктору Дэвиду Бэнксу (Университет Ньюкасла) и доктору Бьорну Френгстаду (Норвежская геологическая служба) за анализ металлов в пробах осадков хвостохранилища, А. А. Миллеру за помощь в электронном микроскопировании, А. В. Козловой за проведение микроанализа осадков сульфида, О. В. Забудченко за проведение дифракционного анализа и помощь при построении дифрактограмм. Особая благодарность д.б.н. Т. Н. Назиной, д.б.н. Е. А. Бонч-Осмоловской, д.б.н. А. Е. Ивановой, академику М.

B. Иванову, д.б.н. Д. Ю. Сорокину за помощь в формулировании положений автореферата диссертации. Автор приносит благодарность всем соавторам, а также коллегам и друзьям за содействие и поддержку.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объекты исследования. Объектом исследования служили микробные сообщества осадков хвостохранилища золотообогатительной фабрики на месторождении «Новый Берикуль» в Кузбассе и микробные обрастания карбонатной постройки глубоководного гидротермального поля Лост Сити.

Месторождение «Новый Берикуль» расположено на территории Кемеровской области. Одной из основных ассоциированных сульфидных руд на месторождении является пирит, также присутствуют арсенопирит, галенит, сфалерит. Количество сульфида в среднем составляет 10%, из них на долю пирита - 6-7% (Геращенко, 2000). Процессы окисления отходов приводят к образованию многочисленных высачиваний, характеризующихся

низким pH и высокой концентрацией растворенных металлов (Таблица 1). О присутствии в данном местообитании сообщества СРП свидетельствует измеренная скорость сульфатредукции, которая составила 30 нм Б/(л сут) (Пименов, неопубликованные данные).

Гидротермальное поле Лост Сити расположено вблизи вершины массива Атлантис Срединно-Атлантического хребта на глубине 750-800 м. Гидротермальные постройки высотой от нескольких сантиметров до 60 м состоят из арагонита, кальцита и брусита. Активные постройки омываются «мерцающими» теплыми (40-90°С) водами (pH 9), поднимающимися вдоль стенок построек. Карбонатные постройки в местах сочения флюида с поверхности покрыты нитевидными микробными обрастаниями, а вблизи грифончиков отлагаются ярко-белые желеподобные выделения, состоящие из микроорганизмов и карбонатов, образующих не литифицированную массу (Леин и др., 2002). Скорость сульфатредукции составляла 17-28 мг Б/(л сут) (Леин и др., 2002; Дулов и др., 2005).

Методы отбора проб. Пробы верхнего окисленного слоя осадков и придонной воды с территории бывшего хвостохранилища золотообогатительной фабрики на месторождении «Новый Берикуль» в Кузбассе были отобраны в июле 2006 г. (образцы Ха 115 и 116) и августе 2007 г. (Ха 201). Температуру, pH и электропроводность воды определяли на месте рН-метром HANNA HI 8314F. Определение концентрации ионов металлов проводилось в лаборатории Норвежской Геологической Службы методами масс-спектрометрии с индуктивно-связанной плазмой (ICP-MS) и атомно-эмиссионной спектроскопии с индуктивно-связанной плазмой (ICP-AES). Концентрацию анионов определяли там же с помощью ионного хроматографа (Dionex 120 DX).

Части гидротермальной постройки Лост Сити, содержащей скопления микроорганизмов, были отобраны 28 августа 2005 г. в 50 рейсе НИС «Академик Мстислав Келдыш» с помощью глубоководного обитаемого аппарата Мир-2 на вершине гигантской постройки «Посейдон». Проба была доставлена на борт в специальном контейнере с плотно прилегающей титановой крышкой и заморожена при температуре -20 °С.

Методы, основанные на культивировании. Численность СРП определяли методом предельных разведений на жидкой пресноводной среде Видделя. Растворы витаминов, микроэлементов и органических веществ, доноров углерода и электронов, также готовили по методу Видделя и Бака (Widdel, Bäk, 1992). Пенициллиновые флаконы доливали средой доверху, в качестве дополнительного микро-источника железа использовали стальную скрепку, которая также способствовала поддержанию низкого окислительно-восстановительного потенциала среды за счет выделения катодного водорода и служила сайтом нуклеации при образовании сульфида железа. Инкубировали при различных условиях pH (2 и 7) при температуре 28°С. В качестве доноров углерода и электронов в среду вносили лактат, этанол и ацетат. Использовали 3 ряда последовательных десятикратных разведений.

Подсчет СРП проводили ежемесячно. Рост определяли визуально, по почернению среды вследствие образования сульфида железа, а также по приросту сероводорода, измеряемого спектрофотометрически методом Пахмайера. Наиболее вероятное число клеток бактерий в образцах рассчитывали с использованием таблиц Мак-Креди (Koch, 1994).

Таблица 1. Концентрация некоторых анионов и катионов в пробах осадков хвостохранилища и флюиде гидротермального поля Лост Сити.

Параметры Ха115 Ха11б Ха 201 Лост Сити*

Т°С 20.9 20.4 16.6-17 40-90

pH 2.8 1.97-2.4 2.36-2.46 9-9,8

СГ, мг/л 10.2 15.2 20 19357-19460

Вг", мг/л <5.0 5.23 <5.0 нд**

SO/", мг/л 8448 22876 5287 566-1240

Si", мг/л 75.5 72.4 27.5 нд

Ali+, мг/л 286 518 223 нд

Fei+, мг/л 2020 9100 1525 0.0446

Mg'!+, мг/л 267 445 193 210-460

Саг+, мг/л 502 357 343 840-1200

Na+, мг/л 25.7 6.89 1,2 11010-11150

Мп^"1", мг/л 32.9 52.5 24.3 нд

Си'1*, мг/л 12.6 35.2 12.5 0.0127-0.0444

Zn*\ мг/л 133 351 162 0.013-0.045

РЬ"\ мг/л 1.27 8.49 0.5 0.0145-0.0248

Ni*'+, мг/л 4.29 4.88 4.9 0.00352-0.074

Со"+, мг/л 2.35 4.77 2.3 0.00825-0.00943

Cdz+, мг/л 2.03 5.72 2.8 нд

As+, мг/л 24.2 1910 178 нд

* по литературным данным

** нет данных

Накопительные культуры СРП получены путем пересевов на среду Видделя из серий предельных разведений для определения численности. Лактат, ацетат и этанол использовали в качестве субстратов роста, культивирование проводили при +28 °С.

Для выделения чистой культуры использованы последние в серии разведений флаконы с заметным ростом СРП из осадков. Устойчивость к ионам металлов изучали, используя растворы CdCl2 х 2.5Н20, CuS04 х 5Н20, №СЬ, СоС12 х 6Н20 различных концентраций. Для поддержания культуры в активном состоянии делали регулярные пересевы. Концентрацию биомассы в культуре определяли методом Лоури (Lowry et al., 1951).

Молекулярные методы. Выделение ДНК микроорганизмов из проб микробных обрастаний карбонатной постройки Лост Сити проводили в соответствии с модифицированной методикой Жоу (Zhou et al., 1996). Из осадков хвостохранилища ДНК выделяли набором реактивов МО ВЮ PowerSoil DNA Kit (МО BIO Laboratories, Inc, Carlsbad, CA).

Для анализа микробного сообщества методом денатурирующего градиентного гель-электрофореза (ДГГЭ) проводили амплификацию гена 16S

рРНК с праймерами BacV3f и 907R. ДГГЭ проводили, используя систему «Dcode System (Biorad laboratories, Hercules, CA, U.S.)». Применяли 8 % полиакриламидный гель с денатурирующими градиентами от 30 % до 65 % (100 % денатурирующий раствор содержал 7М мочевину и 40% формамид). Добавляли 10 % APS и TEMED в качестве полимеризующих агентов. Лунки промывали ТАЕ. Электрофорез проводили 16 часов в ТАЕ-буфере при 60°С и 100 V.

Для амплификации гена 16S рРНК использовали праймеры 27F и 1492R. Амплификацию генов проводили с использованием Mastercycler (Eppendorf) по следующей программе: первоначальная денатурация при 95 °С в течение 20 сек; последующие 6 циклов денатурация при 95 °С в течение 10 сек, отжиг праймеров при 45 °С в течение 20 сек, элонгация праймеров при 72 °С в течение 1.5 мин; последующие 27 циклов денатурация при 95 "С в течение 10 сек, отжиг праймеров при 55 °С в течение 20 сек; элонгация праймеров при 72 °С в течение 1.5 мин; окончательная элонгация при 72 °С в течение 3 мин.

ПЦР-амплификацию генов dsrAB осуществляли с использованием смеси вырожденных праймеров dsrlF и dsr4R (Wagner et al., 2005). Для амплификации генов dsrAB опытным путем был установлен следующий цикл: после первоначальной денатурации в течение 1 мин при 95°С следовали 30 циклов: денатурация 10 сек при 95°С, отжиг праймеров 20 сек при 61°С, элонгация 1 мин при 72°С, на заключительной стадии элонгацию проводили 10 мин при 72°С. Продукты амплификации разделяли электрофорезом в 1 % агарозном геле и экстрагировали с помощью набора реактивов DNA Extraction Kit (Fermentas).

Для молекулярного клонирования генов использовали набор реактивов InsT/Aclone™ PCR Product cloning Kit (Fermentas). Некоторое количество ПЦР-продуктов генов 16S рРНК и dsrAB клонировали в вектор pTZ57, и вводили путем электропорации в клетки Е. coli sp. XL1. Трансформанты отбирали на среде LB с агаром, содержащей Xgal, 1PTG и ампициллин. Наличие встроенных фрагментов в клонах определяли с помощью ПЦР-амплификации с праймерами на внутренний участок вектора M13/pUC F и R.

Анализ полученных библиотек клонов 16S рРНК и dsrAB проводили методом анализа полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (RFLP), Клоны, показавшие одинаковые рестрикционные профили после проведения электрофореза в 2% агарозном геле, объединяли в операционные таксономические единицы (OTU). Из каждой OTU отбирали случайным образом по одному клону для дальнейшего анализа последовательности.

Секвенирование последовательностей ДНК осуществляли на автоматическом секвенаторе Beckman Coulter CEQ 8000 в ГосНИИгенетика. Анализ последовательностей ДНК проводили с использованием программы BioEdit и инструмента BLAST GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Филогенетический анализ проводили с использованием пакета ARB (http://www.arb-home.de). Филогенетические деревья были построены

методом ближайшего соседа (neighbor-joining) для полных или близких к полным последовательностям.

Микроскопирование и микрофотосъемка. Фазово-контрастную микроскопию культур СРП проводили с помощью микроскопа Axiolmager A1 (Carl Zeiss). Микрофотосъемку осуществляли при увеличении хЮОО с использованием фотосистемы Axiocam HS и компьютерной программы Axio Vision 4.

Ультраструктуру бактериальных клеток изучали методом трансмиссионной электронной микроскопии с использованием электронного просвечивающего микроскопа "JEM-100 CXI1" ("JEOL", Япония).

Анализ осадков сульфида проводили с помощью сканирующего электронного микроскопа Philips SEM515 с анализатором EDAX ECON IV и методом рентгено-фазового анализа на дифрактометре Shimadzu XRD 6000.

ИССЛЕДОВАНИЕ БИОРАЗНООБРАЗИЯ СУЛЬФАТРЕДУЦИРУЮЩИХ БАКТЕРИЙ В ОСАДКАХ ХВОСТОХРАНИЛИЩА

Численность сульфатредуцирующих бактерий в осадках хвостохранилища. Максимальная численность СРП, зафиксированная в пробе осадков Ха 115, составляла 9,5х 102 кл/мл (рис. 1а). Численность СРП в пробах осадков Ха 116 была значительно меньше и не превышала 9,5 кл/мл (рис. 16). Максимальную численность СРП в пробе 115 обнаруживали при культивировании при низких значениях рН среды (рН 2) и повышенной концентрации ионов меди (начальная концентрация Cu(II) 200 мг/л).

(5)

SpH7Cu200

0рН-2

врН2Си:оо

Ха116

Лактат

Этанол

Ацетат

Лактат Этанол Ацетат

Рис. 1. Численность СРП в осадках Ха115 (а) и Ха116 (б), определенная методом предельных разведений с различными донорами электронов, рН и концентрацией меди в среде.

Клонирование генов 16S рРНК и dsrAB из осадков хвостохранилища. Анализ микробного сообщества проводили по схеме, представленной на рисунке 2. Из пробы осадка Ха 201 была выделена тотальная ДНК и получена библиотека генов 16S рРНК, состоящая из 130 клонов, объединенных в 46 OTU на основе рестрикционного анализа. Анализ полученных последовательностей показал, что бактериальная популяция относится к разным филогенетическим группам, включая классы Alpha- и Gammaproteobacteria и филумы Nitrospira, Firmicutes, Acidobacteria и Actinobacteria.

ДНК сообщества

ДНК микрокосма

^_\

гены dsrAB (смесь Овтр,

гены 163 рРНК (27Р, 1492К, ДГГЭ-праймеры)

Библиотеки клонов

клонов

дггэ

г 1

Филогенетический анализ

Рис. 2. Схема проведения анализа проб Ха 201, Ха] 15 и Ха116

Гены 16Б рРНК, относящиеся к Саттарго1еоЬас1епа, составляли 60% микробного сообщества (рис. 3) и большей частью были представлены последовательностями, родственными культивируемым и некультивируемым представителям рода Лс1с/ИЬ1оЬасИ/и$ (рис. 4). Во всех исследованных нами осадках обнаружены последовательности генов 168 рРНК, родственные А. /еггоох!с1ат, а в Ха116, кроме того, и А. са\дт. Эти микроорганизмы могут играть важную роль в окислении арсенопирита и снижении рН среды.

Остальные полученные филотипы были не столь многочисленны. Обнаруженные последовательности, относящие к Пгт1си1е.ч, А!ркарго1еоЬас1епа и Ас^поЬаМепа, составляли примерно по 10% от исследуемого микробного сообщества в составе библиотеки генов 16Б рРНК (Рис. 3). Самыми немногочисленными были гены 168 рРНК, относящиеся к М/гозртУае (около 1,5%) и Ас:^оЬасгег:а (менее 5%).

Рис. 3. Основные филогенетические группы, обнаруженные в пробе Ха 201 в результате анализа бактериальных генов 165 рРНК

ш 6эттарю1еоЬэс1епз и Firrnicul.es □ ШтоЬасЛепа о Д/р/1арго(еоЬас(епа ■ /Мговр/гае т 163рРНКэукариот п Ас1ёоЬас>епэ

a Acidithiobacteriaceae Q Symbiobacterium spül Aciüospaera sp. В Митохондриальная РНК мхов О РНК хлоропластов папоротников

■ некультивируемые Actinobacteria

■ некультивируемые Alphaproteobacteria ¡3 Acidobacteriaceae ÖB Gluconobacter sp. a Bacillus sp. В Leptospirillum sp.

□ Gluconacetobacter sp. В Clostridium sp. mAcidithiobacillus sp. S Acidiphilium sp.

□ Ferrimicrobium sp.

Рис. 4. Разнообразие микроорганизмов в пробе Ха 201 на основе анализа генов 16S рРНК.

Следует отметить, что многие обнаруженные нами клоны показывали высокую степень гомологии с последовательностями некультивируемых микроорганизмов, выделенных из экстремально кислых экосистем, ассоциированных с Иберийским колчеданным поясом и рекой Рио Тинто в Испании (Garcia-Moyano et al., 2007) и другими местообитаниями, связанными с кислыми шахтными дренажными водами.

Анализ библиотеки генов 16S рРНК, амплифицированных из нативной ДНК, не выявил наличия в пробе последовательностей, для представителей которых была бы известна способность к сульфатредукции. Однако нам удалось амплифицировать и клонировать один из ключевых генов на сульфатредукцию - ген диссимиляционной бисульфитредуктазы (dsrAB).

Была получена библиотека генов dsrAB. Обнаруженные нами филотипы группировались внутри трех отдаленных между собой кластеров (рис. 5). Большая часть филотипов (82%) была родственна (уровень гомологии от 84 до 90%) генам dsrAB некультивируемых микроорганизмов, полученных при анализе микробного разнообразия хвостохранилищ отходов добычи урана (Chang et al., 2001) (на рисунке 5 этот кластер обозначен В). Культивируемые организмы, принадлежащие к этому кластеру, не известны.

Несколько последовательностей (кластер А на рисунке 5) были наиболее близки гену dsrAB некультивируемого микроорганизма из кислых болот-фенов в Германии (AY167476) (Loy et al., 2004). Мы не можем утверждать, что описанные выше обнаруженные нами последовательности генов dsrAB принадлежат организмам, диссимиляционно восстанавливающим сульфаты, так как существуют сообщения о присутствии этих генов у других сульфидогенных микроорганизмов, не способных к диссимиляционному восстановлению сульфата. Однако секвенирование уникальных последовательностей из библиотеки клонов dsrAB выявило присутствие филотипа (кластер С на рисунке 5), родственного гену dsrAB СРП Desulfosporosinus orient is.

100% -i

с 90% " с 80%

* 70% -5 60% -

* 50%

£ 40% -I 30% -

I 20% -

I 10% -

0% -

Hill

10%

Desulfovibrionace ae

Desulfohalobium retbaense, AF418190 Desulfonatronovibrio hydrogenovorans, AF418197

Desulfobacteraceae

Desulfonatronum lacustre. AF418189 Desulfomonile tiedjei. AF334595

¿7 Firmicutes (with laterally acquired dsrAB)

Desulfobacterium anilini, AF482455

Desulfobulbaceae ^genus Thermodesulfobacterium

- CloneXa201_32r CloneXa201_81b CloneXa201_55b_OTU10

- Acidic fen soil done dsrSbl-75, AY167476 ■ Deep-sea sediment clone NTdV06, AB263177 - Wadden Sea sediment fosmid ws7f8, CT025836 Wadden Sea sediment fosmid ws39f7, CT025835 Desulfobacca acetoxidans, AY167463

r—CloneXa201 1Jr h CloneXa201_27r_OTU1 CToneXa201_66b_OTU1 ClonsXa201_25b I

j Uranium mill tailings site clone UMTRAdsr82625. AY015500, AY015592 1 Uranium mill tailings site clone UMTRAdsr8267, AY015502, AY015591

-Deep soil clone W38, DQ855258

Deep soil done W11, DQ8552S4 Solid waste digester clone MSA01, AB114345 Hot spring clone BSP102. AY237257 Deep soil done D70, DQ855248

-e

Hot spring done BLV6, AY2372S9 Desulfitobacterium dehalogenans, AF337903 Desulfosporosinus orientis, AF271767 CloneXa201_S7b В С

Desultotomaculum alkaliphilum, AF418195 Desultotomaculum halophilum, AY626024 Pelotomaculum sp. MGP, AB154391 Desultotomaculum aemnauticum, AF273033 Desultotomaculum ruminis, U58118. U58119 Desultotomaculum putei, AF273032 Desultotomaculum nigriticans, AF482466

Thermodesultobium riarugense, AB077818

" genus Archaeoglobus

-^ genus ThQrmodesulfovibho

Рис. 5. Филогенетическое дерево, показывающее положение клонов dsrAB из пробы Ха 201 осадков хвостохранилшца.

ДГГЭ-анализ и клонирование генов 16S рРНК из накопительных культур. С целью анализа сообщества культивируемых форм, обладающих способностью восстанавливать сульфат, создавали микрокосмы, содержащие осадки хвостохранилища и питательную среду для СРП, которые потом анализировали с помощью разделения амплифицированных генов/фрагментов гена 16S рРНК методом клонирования или ДГГЭ.

После трех месяцев культивирования анаэробные микрокосмы, полученные из проб Ха 115, Ха 116 и Ха 201, показывали явные следы развития сульфатредукции. Осадок чернел, что вероятнее всего происходило в результате осаждения сульфидов железа и других металлов.

Анализ микробного сообщества в микрокосме Ха 201, полученного на среде Видделя с лактатом, содержащей 200 мг/л Cu (II) при начальном pH 2,5, изучали с помощью молекулярного клонирования генов 16S рРНК. Филогенетический анализ библиотеки из 66 клонов показал, что филотипы всех OTU образовывали один кластер, ближайшими культивируемыми родственниками которого были виды Desulfosporosinus.

Филогенетический анализ филотипов из микрокосмов Ха115, разделенных методом ДГГЭ, также показал, что большинство обнаруженных последовательностей организмов, для которых известна способность к сульфатредукции, относилось к роду Desulfosporosinus (рис. 6).

Секвенирование и филогенетический анализ фрагментов гена 16S рРНК филотипов, разделенных с помощью ДГГЭ, позволил обнаружить в микрокосмах Ха 115 и Ха 116 не только гены 16S рРНК организмов, способных осуществлять диссимиляционное восстановление сульфата, но и другие группы домена Bacteria. Прежде всего, нужно отметить филотипы, родственные железоокисляющим Acidithiobacillus ferrooxidans (рис. 6 ).

Большое количество филотипов, обнаруженных в Ха115, образовывало отдельный кластер внутри Peptococcaceae (рис. 6). Их ближайшим валидно описанным родственником была синтрофная бактерия Pelotomaculum isophtalicum, гомология последовательностей с которым составляла не более 91%. К этой же группе относилось большинство организмов, обнаруженных в микрокосмах Ха116.

Несколько филотипов, обнаруживаемых как в микрокосме Ха115, так и в Ха116, последовательности генов 16S рРНК которых относились к Firmicutes, попадало в группу организмов, ближайшим валидно описанным родственником в которой был Thermincola carboxydiphila. Гомология последовательностей Т. carboxydiphila и филотипов из Ха116 и Ха115 не превышала 93%, поэтому физиологическая роль этой группы организмов, к которой относятся обнаруженные филотипы, остается невыясненной.

Способность получать энергию за счет диссимиляционной сульфатредукции к настоящему времени обнаружена у микроорганизмов, относящихся к семи различным филумам филогенетического дерева (Stahl et al., 2007). Самые многочисленные группы представителей сосредоточены в классе Deltaproteobacteria и отделе Firmicutes. Исключительной

особенностью исследованных осадков хвостохранилищ является тот факт, что нам не удалось обнаружить в них ни одного представителя Ве\1арго1еоЪас1ег1а. Все полученные филотипы и выделенная чистая культура СРП относились к спорообразующим ГгткШея.

Desulfosporosjius уо ипдь, D0117470 DGGE_Xa115, LaepH7 05 DGGEJCJl15_EthpH7J72

83} 1— Desulfosporvsinus sp. 44a-73a. AY0624^2 DGGEXal 15LacpH7M

— DesuUosporosinus bcus STP12, A.I5S2757 DGGE_LacpH2 42

39r DGCE_Xa115_Etl)pH7Cu200_59

33J1-DesHfosporosmis orientis, У11570

Vh— DesiiHbspDrosinus neridiei. AF076247 jjjP- Dcstrtcspcrasims aaripqmenti. AJ493051

1— Desulfosporosinus sp. VS. АУгэЗЕвО — Desulfosporoslnus sp, D3 0GGE_Xa11S_Laq)H7_Be

Desulfitot&ctenum metaHifeducens, AF297S7! 881 DQGE_Nanlsk_79JI 2f 44bDGGE_Xa115 ЕШрН7_82 99PDGGE Nonlsk_T9 12g 44P QGGE__Xa1t5_EthpH2Cu200 18 L DGGE_Norilsk_TS_1 Id

-Sou'h African gold mine clare, АУТЭЗМЗ

-Pebtomaculum sp. МвР, AB154330

Paotomicjlum isophthalicum, АВ2327Я5 wstlanc soil done, AB273864

— constructed wetland done, AY799083

— and с sedments dona, AY527740 DGGE_X»115_AcpH7_SA

DGGEJU115_L»CpH2Cu200_34

Thermncaa carboxydiphfa, AY8G30UO 3Si YAwstonedono, AY6782S4 32 f-— П10 Tno ctone, EF446231

J- methytonercuiycontamnatec mine done, EF434644 60 DGGEXil15_E№pH2Cu200_12 L Addithiobadlijs ternxxidans, EF485493

Desulfosporoslnus

Pelotomaculum

Thermlncola

Acidithfobacillus

010

Рис. 6. Филогенетическое положение генов 16S рРНК, полученных при ДГГЭ-анализе из микрокосмов Xal 15 и штамма Desulfosporoslnus sp. DB. Более короткие последовательности добавлены с использованием parsimony analysis к дереву, построенному ранее методом ближайшего соседа (neighbor-joining). Methanobacterium formicicum, AF169245 (не показан на дереве) был выбран в качестве удаленной группы.

ВЫДЕЛЕНИЕ ЧИСТОЙ КУЛЬТУРЫ СУЛЬФАТРЕДУЦИРУЮЩЕЙ БАКТЕРИИ И ИЗУЧЕНИЕ ЕЕ ФИЗИОЛОГИЧЕСКИХ СВОЙСТВ

Из пробы осадков (Ха 201) хвостохранилища на месторождении «Новый Берикуль» в Кузбассе, характеризующихся низким значением рН (2.36-2.46) и высокой концентрацией ионов металлов (таблица 1) была получена накопительная культура СРП (рН 2.5, Си2+ 200 мг/л), путем пересевов которой методом предельных разведений с постепенным повышением концентрации меди до 650 мг/л выделена чистая культура спорообразующих СРП, обозначенная как штамм БВ. Культура представлена подвижными слегка изогнутыми палочками размером 2-5x0.7-1.5 мкм (рис. 7).

Филогенетический анализ последовательности гена 16Б рРНК длиной 1473 и.о. (номер доступа в СепВапк ЕШ37112) поместил штамм в филум Г/У;и/ег//е.?, род Деуы^олрогаи'игю (рис. 6).

Штамм способен к росту при начальных рН среды 2.0 и не растет при начальном нейтральном значении рН, что отличает его от валидно описанных представителей рода Ое5и//а?/?опшиг«, диапазон значений рН для роста которых составляет 6.1 - 8.3. В процессе роста происходило увеличение значения рН среды (до 5.5), частично это происходило за счет химических реакций вследствие присутствия в среде стальной скрепки, но дальнейшее повышение рН все же обусловлено жизнедеятельностью микроорганизмов. В эксперименте заметный прирост биомассы начинался после продолжительной лаг-фазы (20 суток) при значении рН 4.0.

Рис. 7. Микрофотография клеток штамма БВ. Фазово-контрастиая микроскопия.

В качестве органических субстратов для роста штамм использовал лактат, этанол, малат, ацетат, фумарат, пируват и глицерин. Менее активный рост наблюдается на глюкозе, сахарозе, изобутаноле, формиате, и фруктозе. Слабый рост зафиксирован при внесении цитрата и никотиновой кислоты. Бактерия не росла на пропионате и пропаноле.

Диапазон солености среды, при которой возможен рост штамма, составил от 0 до 3% ЫаС1 с оптимумом в отсутствие хлорида натрия.

Штамм Веаи^озрогозтш яр. ПВ рос при добавлении к основной среде культивирования ионов никеля (II), кобальта (II), кадмия (II) и меди (II). Визуальные наблюдения образования сульфидов (потемнение и образование нерастворимого осадка), а также микроскопирование культуры на разных стадиях культивирования выявило активный рост штамма в присутствии ионов никеля (II) в концентрации до 300 мг/л, 200 мг/л ионов кобальта (II), 50 мг/л ионов кадмия (II) и ионов двухвалентной меди в концентрации до 5 г/л. Указанные концентрации никеля и кобальта не являются предельными для роста штамма, в то время как дальнейшее повышение концентраций кадмия и меди лимитировало рост бактерий.

Изучение ультратонких срезов клеток, культивированных в среде с добавлением 200 мг/л ионов меди, выявило способность штамма накапливать на поверхности клеток микрокристаллов, предположительно сульфида меди (рис. 8). Рентгено-фазовый анализ показал, что в процессе роста штамма в присутствии ионов меди (200 мг/л) происходит накопление сульфидов меди.

2 Thêta

Рис. 9. Дифрактограммы осадков, полученных при росте Desulfosporosinus sp. DB в присутствии 200 мг/л Си2+, 54 суток культивирования (1); 200 мг/л Си2+, 41 сутки культивирования (2); без добавления ионов Си2т, 46 суток культивирования (3); в контроле без добавления инокулята с внесением 200 мг/л меди (4) и контроле без инокулята с добавлением 100 мг/л NaiS и 200 мг/л меди (5). С\ - ковеллит, Ch - халькопирит, Си -медь, Сс - халькоцит.Ср - куприт, Gr - грейгит FejS_t.

Основными фазами, обнаруженными в осадках, были халькопирит (СиРеЗг) и ковеллит (СиБ) (Рис. 9).

200

100 ' & À СР Gr Gr

—•-1-■-1-1-1-

30 40 50

; ^^^

10 20 30 40 50 60 70

400 ■ 300 ■ 200 -100 ■ 0 -

10 20

Рис. В. Трансмиссионная электронная микроскопия срезов клеток ер.

ОВ, культивированных в течение 41 суток с добавлением 200 мг/л ионов двухвалентной меди. Стрелками показаны образующаяся в клетке спора (А) и микрокристаллы на поверхности клетки (Б). Линейка 1 мкм.

1100

1000

900

1 700 О 600

500

1300 -, 1200

400 300

Глава 5. ИЗУЧЕНИЕ БИОРАЗНООБРАЗИЯ СУЛЬФАТРЕДУЦИРУЮЩИХ БАКТЕРИЙ НА ГИДРОТЕРМАЛЬНОМ ПОЛЕ ЛОСТ СИТИ

Определение структуры микробного сообщества с помощью клонирования генов 16S рРНК. Была создана библиотека последовательностей генов 16S рРНК из 100 клонов. Анализ полиморфизма длины рестрикционных фрагментов позволил выделить 75 OTU.

Секвенирование последовательностей генов 16S рРНК выявило присутствие последовательностей микроорганизмов, относящихся к Gammaproteobacteria, Alphaproteobacteria, Epsilonproteobacteria, Firmicutes, a также представителей с неопределенным таксономическим статусом, относящихся к так называемой группе «Candidate division OD1» (Рис. 10А).

100%

В Candidate division OD1 S Alphaproteobacteria S Epsilonproteobacteria Ш Firmicutes В Gammaproteobacteria

о g

100% 90% 80% 70% 60% 50% 40% 30% 20% 10% 0%

шяш

— —

пШшшшШшшш

. ;.....'

В Geosporobacter ■ Marinosulfomonas 0 Anaerovirgula □ неизвестные Bacteria Ш Rhodobacteraies 0 Desutfotomaculum 0 Vibrio Ш Alteromonas П Roseobacter О Sutfospirillum В Thiomicrospira

Рис. 10. (А) Структура микробного сообщества и (Б) состав микробного сообщества на основе анализа генов 16Б рРНК.

Наибольшее число полученных клонов принадлежало роду Ткюппсгсщпга класса Саттарго1еоЬас1епа (Рис. 10Б). Ближайшим валидно описанным родственником клонов, объединенных в ОТШ, была последовательность гена 168 рРНК, родственная Т. crunogenа (93.8%). Филогенетический анализ показал, что филотип принадлежал к отдельному кладу, включающему полученные ранее последовательности из карбонатных построек гидротермального поля Лост Сити (Вга/екоп Ы а1„ 2006).

Следующая по количеству группа клонов (ОТШ) представлена последовательностями, близкими к Еи^игоиртИит класса

Epsilonproteobacteria, для которых характерна способность восстанавливать серу с использованием Н2 в качестве донора электронов (Finster et al., 1997). То, что группа клонов OTU2 была второй по численности в нашей библиотеке клонов, а также тот факт, что Брэзелтон с соавторами (Brazelton et al., 2006) обнаружили значительное число похожих филотипов в пробах построек и флюидов, может указывать на потенциальную важность родственных Sulfurospirillum организмов в окислении Н2 в данной экосистеме.

Единственными представителями, которые могут обладать способностью к сульфатредукции, могут быть микроорганизмы, последовательности генов 16S рРНК которых относились к кластеру филотипов, родственных Desulfotomaculum (рис. 11). Этот кластер образован последовательностями клонов, гомология которых с генами 16S рРНК валидных Desulfotomaculum не превышает 90%.

0.1 а

51 - LCClonelOO f—LC С1опе59

J— Lost City clone (DQ270Q39)

\JL

LCCIone2

DesuHolomacuium sp. Lac2 ¡DQ386219j DesuHo!om3culunih3bphHm ¡1188891) DesullotonaailumaikaUphibm (AF097024) — Lost Cit/ clone (DQ270651) ■ DesuHolomaculumgeolherniiainiOlux])

!-LC_Clone73

-Lost City clone (DQ228571)

rcrustal fluid clone (AY704403) '— Last City clone DQ270635 -LCCIonefi!

Fracutes

—Anaerwiigufa tnuliivonns (AB201750) - alkaline soil done (FJ152949) -Geosporobactersubi'errenus (DQ643978) —LC_Clone77

-methane hydrate clone (AB177137)

- candidate division DP11 done 0PB92 (AF027030S

- uncultured candidate division ODl bacter ¡AY193203)

— uncultured candidate division 001 bacter (DQ67M87)

Candidate division 0D1?

Рис. 11. Филогенетическое дерево, отражающее положение Рттсшея и Вааегш с неопределенным таксономическим положение»! генов 165 рРНК. Дерево построено методом ближайшего родственника, масштаб показывает одну замену на 10 нуклеотидов. МщкапиЬас1епит /огтккит (не показан) выбран в качестве удаленной группы. Полученные нами филотипы обозначены жирным шрифтом.

Выявление сульфатредуцирующих микроорганизмов методом клонирования генов dsrAB. Анализ библиотеки клонов dsrAB выявил присутствие нуклеотидных последовательностей, близкородственных гену dsrAB Desulfotomaculum halophilum DSM 11559 (гомология последовательностей ДНК составляла 73%) (рис. 12).

Thermodesulfobacteriurn species \

Desulfoba cca acetoxidans

Desulfotomaculum subcluster If

Desulfotomaculum halophllum Desulfotomaculum alkaliphllum Desulfotomaculum sp. 0ac2

LC clone dsr 14

Desulfotomaculum —

subcluster la

Desulfitobacterium Ф

Desulfosporoslnus orientis Pelotomacul

sp. MGP

Thermodesulfobium narugense

Archaeoglobus species

Desulfotomaculum subcluster Ib+lc+ld+le

Moorella thermoacetica

Sulfate-rsducing strain mXyS1

Desulfobacterlum anllini

Desulfomonlle tledjel Desulfonatronum lacustre

esulfovlbrlonaceae

.Other Desulfovlbrlo species

Desulfohaloblum retbaense

Desulfonatronovibrio hydrogenovorans

Desulfomicroblaceae Desulfobacteraceae

Thermodesulfovibrio species

Рис. 12. Филогенетическое дерево DsrAB (FITCH distance matrix, основанное на аминокислотных последовательностях, транслированных из последовательностей нуклеотидов dsrAB длиной более 1750 пар оснований), показывающее положение клона 14 из микробных обрастаний Лост Сити. Частичная последовательность LC clone dsr_l 4 (показана пунктирной линией) встроена в дерево с использованием 'ARB parsimony interactive option' пакета ARB. Масштаб показывает 10% расхождение последовательностей. Значения бутстреппинга (bootstrap values) показаны черными (90%) или белыми (от 75 до 90%) кружками. Ветви без кружков имеют значения бутстреппинга ниже 75%.

Эти данные согласуются с проведенным анализом генов 16Б рРНК, в результате которого обнаружены последовательности, родственные гену 168 рРНК £>£5и1/оЮтаси1 ит Иа1орЫЫт и йеьи^отасЫит а1каИрЫ1ит и свидетельствуют о том, что единственными способными к сульфатному дыханию микроорганизмами в микробных обрастаниях карбонатных построек глубоководного гидротермального поля Лост Сити могут быть спорообразующие СРП рода Оези1/(Нотаси1ит.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Наши исследования показали, что СРП могут существовать в экстремальных условиях низких рН и высоких концентраций ионов металлов в осадках хвостохранилища и щелочных значениях рН гидротермального поля Лост Сити. В исследованных пробах хвостохранилища нами обнаружены только спорообразующие Р'нткЫев, для которых известна способность получать энергию за счет восстановления сульфатов. Представителей наиболее многочисленной и изученной группы Оекарго1еоЪас1ег'ш не удалось зафиксировать ни одним из использованных методов. Таким образом, важной группой микроорганизмов, ответственной за восстановление сульфата в кислых экосистемах, содержащих высокие концентрации металлов, являются представители рода Оехи1/оьрогох¡пт и родственные им организмы. Источником сульфата в исследованной экосистеме может служить процесс окисления представителями АЫс1ШоЪасИ1из /еггоох1с1ат сульфидов, поступающих с твердыми отходами хвостохранилища.

Выделенный и изученный нами ацидотолерантный штамм ОезЫ/озрогоз'тиз Бр. БВ использует широкий круг субстратов, устойчив к высоким концентрациям металлов и способен к осаждению ионов меди в виде халькопирита и ковеллита, что делает его перспективным для обезвреживания загрязненных металлами экосистем.

Анализ генов 16Б рРНК из пробы карбонатной постройки глубоководного гидротермального поля Лост Сити позволил обнаружить последовательности, родственные генам 16Э рРНК спорообразующих СРП рода Бгхм//о?ошаси/м/и. У. Брэзелтон с соавторами (Вгагекоп е1 а!., 2006) ставили под сомнение возможность осуществления сульфатредукции организмами, принадлежащими к этому кластеру, в силу значительного расхождения последовательностей, а также неудачных попыток амплифицировать ген (кгАВ из тех же проб. Получение нами клонов гена ¿ягАВ из проб мата свидетельствует о возможности протекания сульфатредукции в микробных обрастаниях карбонатных построек Лост Сити. Более того, полученные нами фрагменты последовательности гена сЬгАВ характеризовались наибольшей гомологией с генами диссимиляционной бисульфитредуктазы Д Иа1орЫ1ит и О. ЫкаНрИНит, что подтверждает гипотезу о том, что именно эта группа организмов ответственна за восстановление сульфата в карбонатных постройках и флюидах Лост Сити. Донором для развития СРП здесь может служить

глубинный Нз, присутствующий в высоких концентрациях, а образующийся сероводород становится субстратом для развития бактерий рода Thiomicrospira.

Таким образом, сочетание методов молекулярного клонирования гена 16S рРНК и функционального гена на сульфатредукцию из тотальной ДНК природных образцов, ДГГЭ-анализ и молекулярное клонирование гена 16S рРНК культивируемых в селективных условиях микроорганизмов из исследованных местообитаний, а также выделение чистой культуры СРП и изучение ее свойств позволило наиболее полно охарактеризовать сообщество, ответственное за диссимиляционное восстановление сульфата в таких экстремальных экосистемах, как осадки хвостохранилища золотообагатительной фабрики на месторождении «Новый Берикуль» (Кузбасс) и микробные обрастания карбонатной постройки глубоководного гидротермального поля Лост Сити.

ВЫВОДЫ

1. В осадках хвостохранилища золотоперерабатывающего завода на месторождении «Новый Берикуль» (Кузбасс), характеризующихся кислыми условиями среды и высокой концентрацией металлов, обнаружены сульфатредуцирующие микроорганизмы, максимальная численность которых в среде с добавлением металлов и низким значением кислотности среды (рН2) составляла 9.5х102кл/мл.

2. Определено бактериальное разнообразие в осадках хвостохранилища методами молекулярного клонирования генов 16S рРНК и dsrAB. Обнаружены последовательности генов, родственные представителям Acidithiobacillus ferrooxidans, Ferrimicrobium acidiphilum, Actinobacteria, Acidiphilium sp., Acidobacteriaceae, Clostridium sp., Leptospirillum ferrooxidans, Gluconacetobacter sp., Bacillus sp. Клонирование генов 16S рРНК из осадков хвостохранилища не выявило последовательностей, родственных СРП. Однако получены клоны генов dsrAB, родственные Desulfosporosinus, а также неизвестным сульфидогенным микроорганизмам.

3. Анализ культивируемого сообщества СРП из осадков хвостохранилища, проведенный методами денатурирующего градиентного гель-электрофореза и молекулярного клонирования, показал присутствие генов 16S рРНК организмов, родственных Desulfosporosinus. Выделена чистая культура Desulfosporosinus sp. DB, характеризующаяся умеренно-ацидофильным характером роста и устойчивостью к повышенным концентрациям ионов металлов.

4. Анализ микробных обрастаний карбонатной постройки глубоководного гидротермального поля Лост Сити методом молекулярного клонирования гена 16S рРНК показал присутствие организмов, родственных Thiomicrospira sp., Sulfospirillum arcachonense, Marinosulfonomonas methylotropha, Anaerovirgula multivorans, Rhodobacterales, Alteromonas marina, Vibrio tubiashii, Geosporobacter subterrenus и Desulfotomaculum halophilum.

5. Молекулярное клонирование гена 16S рРНК и функционального гена dsrAB свидетельствует о том, что спорообразующие Firmicutes, родственные Desulfotomaculum, вероятно, являются единственными организмами в сообществе мата из гидротермального поля Лост Сити, которые могут осуществлять процесс диссимиляционной сульфатредукции.

6. Методы молекулярной биологии и традиционные микробиологические методы являются взаимодополняющими и позволяют наиболее полно охарактеризовать сообщество сульфатредуцирующих организмов в экстремальных экосистемах с экстремальными значениями рН.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Экспериментальные статьи

1. О. V. Karnachuk, К. Sasaki, A. L. Gerasimchuk, О. Sukhanova, D. А. Ivasenko, А. Н. Kaksonen, J. A. Puhakka, and О.Н. Tuovinen. Precipitation of Cu-sulfides by copper-tolerant Desulfavibrio isolates. II Geomicrobiology J. 2008. Vol. 25. P. 219-227.

2. О. В. Карначук, А. Л. Герасимчук. Д. Бэнкс, Б. Френгстадт, Г. А. Стыкон,

3. Л. Тихонова, А. X. Каксонен, Я А. Пухакка, А. С. Яненко, Н. В. Пименов. Бактерии цикла серы в осадках хвостохранилища добычи золота в Кузбассе. // Микробиология. 2009. Т. 78. № 4. с. 483-491.

3. Герасимчук А. Л.. Шаталов А. А., Новиков А.Д., Буторова О. П., Пименов Н. В., Леин А. Ю., Яненко А. С., Карначук О. В. Поиск сульфатредуцирующих бактерий в пробах мата из гидротермального поля Лост Сити методом молекулярного клонирования. // Микробиология. 2010. №1. В печати.

Тезисы

4. А. Л. Герасимчук. О. П. Буторова, Г. А. Стыкон, А. С. Лисина, 3. Л. Тихонова, У. Н. Полуэктова, О. С. Суханова, О. В. Карначук. Численность сульфатредуцирующих бактерий в рудничных водах, загрязненных отходами добычи золота и каменного угля. // II Международная молодежная школа-конференция «Актуальные аспекты современной микробиологии». Тезисы. Москва, 2006. с. 9-10.

5. О. V. Karnachuk, N. V. Pimenov, S. К. Yusupov, Y. A. Frank, A. L. Gerasimchuk. V. Dedinsky, A. H. Kaksonen, E. B. Lindstrom, M. V. Ivanov, J. A. Puhakka, О. H. Tuovinen. Sulfate reduction in the oxic zone of mine tailings and metal-polluted sediments in boreal ecosystems. // In: Book of Abstracts. 11th International Symposium on Microbial Ecology. Vienna, Austria, August 20-25, 2006. P.A77.

6. О. V. Karnachuk, N. V. Pimenov, A. L. Gerasimchuk. G. A. Stykon, A. H. Kaksonen, J. A. Puhakka, and O.H. Tuovinen. Diversity and activity of sulfate-reducing prokaiyotes in oxic mine tailings and metal-polluted sediments. // In: Book of Abstracts. II International Conference on Environmental, Industrial, and Applied Microbiology. Seville, Spain, 28 November- 1 December, 2007. P.166.

7. A. JI. Герасимчук. Г. А. Стыкон, Н. В. Пермякова, Е. В. Дейнеко, О. В. Карначук. Поиск АТФаз типа Р-1В в геномах сульфатредуцирующих прокариот. // Международная научная конференция «Микроорганизмы и биосфера». Тезисы. Москва, 2007. с. 27-29.

8. О. В. Карначук, А. Л. Герасимчук. Г. А. Стыкон, 3. Л. Тихонова, Б. Френгстадт, Д. Бэнкс, А. X. Каксонен, Я А. Пухакка. Разнообразие культивируемых сульфатредуцирующих бактерий в осадках ветландов, загрязненных добычей и производством золота. // Международная научная конференция «Микроорганизмы и биосфера». Тезисы. Москва, 2007. с. 53-54.

9. О. Karnachuk, A. Gerasimchuk. G. Stycon, I. Lytovchenko, M. Solioz. How sulfidogenic bacteria handle copper: still a black box. // Copper and related metals in biology. 6th Intl. Copper Meeting. October 11-15, 2008, Alghero, Sardinia-Italy. P. 107.

10.А. Л. Герасимчук, О. П. Буторова, Н. В. Пименов, О. В. Карначук. Изучение разнообразия культивируемых и некультивируемых сульфатредуцирующих бактерий в местообитаниях, содержащих высокие концентрации металлов. // Актуальные аспекты современной микробиологии. IV Молодежная школа-конференция с международным участием. Тезисы. Москва, 2008. с. 13-14.

11 .Герасимчук А. Л„ Буторова О. П., Тихонова 3. Л., Стыкон Г. А., Яненко А. С., Карначук О. В. Выделение и изучение Desulfosporosinas sp. DB -перспективного для биогеотехнологии осаждения металлов. // Генетика микроорганизмов и биотехнология. Российская школа-конференция. Тезисы. Москва-Пущино, 2008. с. 123-124.

12.0. П. Буторова, А. Л. Герасимчук, Л. Н. Еренко, А. В. Козлова, О. В. Забудченко, А. А. Миллер, О. В. Карначук. Образование сульфидов металлов чистыми культурами сульфатредуцирующих бактерий, устойчивых к ионам меди. // Актуальные аспекты современной микробиологии. V Молодежная школа-конференция с международным участием. Тезисы. Москва, 2009. с.73-74.

Тираж 100. Заказ 1074. Томский государственный университет систем управления и радиоэлектроники 634050, г. Томск, пр. Ленина, 40 Тел.: 53-30-18

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Герасимчук, Анна Леонидовна

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

1 БИОРАЗНООБРАЗИЕ СУЛЬФАТРЕДУЦИРУЮЩИХ БАКТЕРИЙ В ЭКСТРЕМАЛЬНЫХ МЕСТООБИТАНИЯХ

1.1 Характеристика сульфатредуцирующих бактерий

1.1.1 Особенности физиологии сульфатредуцирующих бактерий

1.1.2 Филогения сульфатредуцирующих бактерий

1.1.3 Экология и распространение сульфатредуцирующих бактерий

1.2 Распространение и активность сульфатредуцирующих бактерий в 23 экосистемах, связанных с добычей и переработкой металлов

1.3 Сульфатредуцирующие микроорганизмы глубоководных гидротерм

1.3.1 Разнообразие СРП в глубоководных гидротермальных 26 источниках

1.3.2 Микробное разнообразие глубоководного гидротермального 35 поля Лост Сити

1.4 Использование методов молекулярной экологии для изучения 40 биоразнообразия сульфатредуцирующих бактерий

2 ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1 Описание экосистем

2.2 Методы отбора проб

2.3 Методы, основанные на культивировании

2.3.1 Приготовление питательной среды и добавок

2.3.2 Приготовление растворов ионов металлов

2.3.3 Получение накопительных и чистых культур

2.3.4 Определение численности СРП

2.3.5 Определение круга используемых доноров и акцепторов для 50 сульфатредукции

2.3.6 Измерение рН среды

2.4 Аналитические методы

2.4.1 Определение сероводорода по Пахмайеру

2.4.2 Определение белка по методу Лоури

2.5 Молекулярные методы

2.5.1 Выделение ДНК

2.5.2 Электрофорез в агарозном геле

2.5.3 Полимеразная цепная реакция

2.5.4 Денатурирующий градиентный гель-электрофорез (ДГГЭ)

2.5.5 Молекулярное клонирование генов

2.5.6 Рестрикционный анализ

2.5.7 Филогенетический анализ

2.6 Микроскопирование и микрофотосъемка

2.7 Программное обеспечение и статистическая обработка

3 ИССЛЕДОВАНИЕ БИОРАЗНООБРАЗИЯ СУЛЬФАТРЕДУЦИРУЮЩИХ 60 БАКТЕРИЙ В ОСАДКАХ ХВОСТОХРАНИЛИЩА

3.1 Численность сульфатредуцирующих бактерий в осадках 60 хвостохранилища

3.2 Клонирование генов 16S рРНК и dsrAB из осадков хвостохранилища

3.3 ДГГЭ-анализ и клонирование генов 16S рРНК из накопительных 78 культур

4 ВЫДЕЛЕНИЕ ЧИСТОЙ КУЛЬТУРЫ СУЛЬФАТРЕДУЦИРУЮЩЕЙ 83 БАКТЕРИИ И ИЗУЧЕНИЕ ЕЕ ФИЗИОЛОГИЧЕСКИХ СВОЙСТВ

5 ИЗУЧЕНИЕ БИОРАЗНООБРАЗИЯ СУЛЬФАТРЕДУЦИРУЮЩИХ 93 БАКТЕРИЙ В МИКРОБНЫХ ОБРАСТАНИЯХ ГИДРОТЕРМАЛЬНОГО

ПОЛЯ ЛОСТ СИТИ

5.1 Определение структуры микробного сообщества с помощью 93 клонирования генов 16S рРНК

5.2 Выявление сульфатредуцирующих микроорганизмов методом 99 клонирования генов dsrAB

Введение Диссертация по биологии, на тему "Сульфатредуцирующие бактерии в экосистемах с экстремальными значениями pH"

Актуальность темы. Способность некоторых прокариот использовать сульфат как терминальный акцептор электрона для получения энергии в процессе анаэробного роста (диссимиляционное восстановление сульфата) является неотъемлемой частью глобального биогеохимического цикла серы. В связи с этим, структура сообщества и экофизиология сульфатредуцирующих прокариот (СРП) в природных местообитаниях вызывает большой научный интерес (Loy, 2003).

Важным вопросом экологии микроорганизмов, включая СРП, является определение физико-химических границ их роста и выживания и понимание молекулярных механизмов, определяющих эти границы. Исследования окружающей среды привели к обнаружению жизни в экосистемах, ранее считавшихся необитаемыми. Поэтому в последние годы существенно возрос интерес к биоразнообразию и экологии микроорганизмов экстремальных местообитаний. Изучение экстремально кислых местообитаний (рН<3) становится значимым, так как кислотность природных и техногенных экосистем часто является последствием микробной активности (Ehrlich, 1996; Hallberg, Johnson, 2001; Nordstrom, Southam, 1997; Nordstrom, Alpers, 1999).

СРП, обнаруженные в кислых местообитаниях, в основном представлены спорообразующими организмами. Известны примеры выделения СРП рода Desulfosporosinus как с использованием культивирования (Johnson B.D., Hallberg, 2003), так и молекулярными методами (Nevin et al., 2003; Petrie et al., 2003; Saunders et al., 2005; Winch et al., 2009; Kusel et al., 2001; Kimura et al., 2006; Church et al., 2007; Labrenz, Banfield, 2004; Kusel et al., 2001) из кислых местообитаний, загрязненных металлами. Немногие полученные из таких экосистем чистые культуры были активны при рН<4,9 (Johnson et al., 2006; Kimura et al., 2006). Кислые экосистемы в основном ассоциированы с добычей и переработкой сульфидных руд и содержат большое количество металлов (Johnson, 1998). Описано осаждение таких ионов металлов как цинк (Kimura et al., 2006) и алюминий (Senko et al., 2009) в процессе сульфидогенеза в кислых осадках и дренажах.

Другим местообитанием, характеризующимся экстремальными условиями рН, являются глубоководные гидротермальные поля — области на поверхности океанического дна, характеризующихся выходами геотермальных растворов, обогащенных восстановленными соединениями серы, газами и тяжелыми металлами. Микробные сообщества глубоководных гидротерм представляют значительный интерес с точки зрения эволюции биосферы и, по мнению многих исследователей, являются аналогами сообществ, доминировавших на ранних этапах развития жизни на Земле (Заварзин, 2001; Nisbet, 1986; Walter et al., 1998; Nisbet, Sleep, 2001).

Уникальное глубоководное гидротермальное поле Лост Сити, отличающееся от всех известных глубоководных гидротерм низкой температурой (40-90°С), щелочным рН (9-9.8)и составом гидротермального раствора, рассматривается некоторыми авторами как аналог экосистемы, где могли зародиться первые формы жизни (Proskurowski et al., 2008). Изучение биоразнообразия микробных сообществ флюидов и построек Лост Сити, проведенное американскими учеными (Brazelton et al., 2006) с помощью молекулярного клонирования, по мнению авторов, не показало присутствия организмов, способных восстанавливать сульфат. Однако наличие процессов сульфатредукции в данном гидротермальном поле показано методом измерения скоростей сульфатредукции (Леин и др., 2002; Дулов и др., 2005) и посевом на элективные питательные среды (Дулов и др., 2005). В связи с этим, представляется важным поиск и идентификация СРП, обитающих в этой уникальной экосистеме.

Изучение структуры и разнообразия микробных сообществ природных экосистем долгое время было ограничено морфологическим описанием микроорганизмов, а физиолого-биохимические исследования проводились с чистыми культурами на лабораторных питательных средах. Однако лабораторное культивирование не дает полного представления о разнообразии микробного сообщества. Использование молекулярных методов, основанных на анализе универсального филогенетического маркера, гена 16S рРНК, а также некоторых функциональных генов, комбинируемых с физиологической характеристикой выделенных штаммов, позволяет более подробно изучить филогенетическое разнообразие микробных сообществ разнообразных экосистем (Harmsen et al., 1997; Slobodkin et al., 2001; Takai et al., 2003).

Цель ■ н задачи исследования. Цель настоящей работы, состояла в выяснении филогенетического разнообразия микробного сообщества с целью поиска СРП в кислых осадках хвостохранилища золотообогатительной фабрики на месторождении «Новый Берикуль» в Кузбассе и микробных обрастаниях карбонатной постройки глубоководного гидротермального поля Лост Сити.

Для достижения цели поставлены следующие задачи:

2. Выделить культивируемые формы СРП из осадков хвостохранилища и изучить их физиологию и филогению.

3. Определить филогенетическое разнообразие микробного сообщества, диссимиляционно восстанавливающего сульфаты в осадках хвостохранилища, методами денатурирующего градиентного гель-электрофореза и молекулярного клонирования генов 16S рРНК и функционального гена на сульфатредукцию dsrAB.

Научная новизна работы. Впервые исследовано разнообразие и численность СРП в осадках хвостохранилища золотообогатительной фабрики на месторождении «Новый Берикуль» в Кузбассе с помощью традиционных микробиологических методов и методов, основанных на анализе последовательностей ДНК. Анализ разнообразия генов универсального филогенетического маркера 16S рРНК и функционального гена-маркера сульфатредукции dsrAB проведен методами ПТДР-амплнфикации и последующего разделения методами денатурирующего градиентного гель-электрофореза (ДГГЭ) и молекулярного клонирования. Установлено, что микроорганизмы, способные к восстановлению сульфатов, представлены в исследуемом местообитании филотипами, родственными спорообразующим СРП рода Desulfosporosimis. Также обнаружены последовательности, родственные генам dsrAB пекультивируемых микроорганизмов, существенно удаленных от всех Bacteria, для которых известна способность к диссимиляционной сульфатредукции и, вероятно, относящихся к неизвестным сульфидогенам. Комбинирование методов молекулярной биологии (ДГГЭ и молекулярное клонирование генов) и традиционных методов культивирования позволило наиболее подробно охарактеризовать сообщество микроорганизмов в кислых, осадках хвостохранилища.

Из микрокосмов, полученных из проб осадков хвостохранилища на среде с лактатом и низким рН (2,5) с содержанием меди (II) 200 мг/л, выделена чистая культура Desulfosporosinus sp. DB, отличающаяся от известных представителей рода Desulfosporosimis умеренно-ацидофильным характером роста и устойчивостью к высоким концентрациям тяжелых металлов (меди, никеля, кобальта и кадмия). Изучена способность штамма образовывать сульфиды меди, показано накопление сульфидов в виде микрокристаллов на поверхности бактериальных клеток.

Исследовано бактериальное разнообразие в пробе микробного обрастания карбонатной постройки гидротермального поля Лост Сиги. Впервые в этом местообитании обнаружены гены dsrAB, родственные представителям СРП рода Desulfotomaculum. Параллельное клонирование генов 16S рРНК и dsrAB свидетельствует, что спорообразующие Firmicutes, родственные Desulfotomaculum, являются единственными организмами в сообществе микробного обрастания из Лост Сити, для которых вероятна способность к диссимиляционной сульфатредукции.

Личный вклад соискателя. Автор принимал участие в отборе проб с территории бывшего хвостохранилища золотообогатительной фабрики на месторождении «Новый Берикуль» в Кузбассе, определении численности СРП и получении микрокосмов. Выделение чистой культуры и изучение ее физиологических характеристик проводилось совместно со студентами лаборатории биотехнологии и биоинженерии при кафедре физиологии растений и биотехнологии ТТУ. Изучение разнообразия микроорганизмов с помощью молекулярного клонирования генов проводились автором самостоятельно, ДГГЭ-анализ - совместно с магистрантом ТГУ Г. А. Стыкон. Филогенетический анализ микробных сообществ выполнен в партнерстве с научным руководителем — д.б.н. О. В. Карначук. Формулирование целей, задач и обсуждение полученных результатов проводилось под руководством научного руководителя.

Практическая значимость работы. Данные о численности и разнообразии СРП в осадках хвостохранилища золотообогатительной фабрики на месторождении «Новый Берикуль» в Кузбассе могут быть использованы при разработке технологий ремедиации, основанных на стимуляции аборигенного сообщества микроорганизмов, способных к переводу растворенных металлов в нерастворимую форму.

Основные защищаемые положения:

1. Спорообразуюгцим Desulfosporosinus принадлежит важная роль в процессе диссимиляционного восстановления сульфатов в осадках хвостохранилища, характеризующихся высоким содержанием хметаллов и низкими значениями рН.

Апробация работы. Материалы исследований по теме диссертации были представлены на II Международной молодежной школе-конференции «Актуальные аспекты современной микробиологии» (Москва, 2006); 11th International Symposium on Microbial Ecology (Vienna, Austria, 2006); II International Conference on Environmental, Industrial, and Applied Microbiology (Seville, Spain, 2007); Международной научной конференции «Микроорганизмы и биосфера» (Москва, 2007); 6th International Copper Meeting «Copper and related metals in biology» (Alghero, Sardinia-Italy, 2008); IV Молодежной школе-конференции с международным участием «Актуальные аспекты современной микробиологии» (Москва, 2008); Российской школе-конференции «Генетика микроорганизмов и биотехнология» (Москва-Пущино, 2008); школе-семинаре «Современные фундаментальные проблемы физиологии и биотехнологии растений и микроорганизмов» (Томск, 2008), V Молодежной школе-конференции с хмеждународным участием «Актуальные аспекты соврехменной микробиологии» (Москва, 2009).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 10 печатных работ, включая 2 статьи и 9 тезисов докладов. Одна статья находится в печати.

ОбъехМ и структура диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, содержащей методы, результаты исследования и обсуждение, выводов и списка литературы. Материалы диссертации изложены на 134 страницах машинописного текста и включают 39 рисунков и 18 таблиц.

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Герасимчук, Анна Леонидовна

выводы

2. Определено бактериальное разнообразие в осадках хвостохранилища методами молекулярного клонирования генов 16S рРНК и dsrAB. Обнаружены последовательности генов, родственные представителям Acidithiobacillus ferrooxidans, Ferrimicrobium acidiphilum, Actinobacteria, Acidiphilium sp., Acidobacteriaceae, Clostridium sp., Leptospirilium ferrooxidans, Gluconacetobacter sp., Bacillus sp. Клонирование генов 16S рРНК из осадков хвостохранилища не выявило последовательностей, родственных СРП. Однако получены клоны генов dsrAB, родственные Desulfosporosinus, а также неизвестным сульфидогенным микроорганизмам.

3. Анализ культивируемого сообщества СРП, проведенный методами денатурирующего градиентного гель-электрофореза и молекулярного клонирования, показал присутствие генов 16S рРНК организмов, родственных Desulfosporosinus. Выделена чистая культура Desulfosporosinus sp. DB. характеризующаяся умеренно-ацидофильным характером роста и устойчивостью к повышенным концентрациям ионов металлов.

4. Анализ микробных обрастаний карбонатной постройки глубоководного гидротермального поля Лост Сити методом молекулярного клонирования гена 16S рРНК показал присутствие организмов, родственных Thiomicrospira sp, Sulfospirillum arcachonense, Marinosulfonomonas methylotropha, Anaerovirgula multivorans, Rhodobacterales, Alteromonas marina, Vibrio tubiashii, Geosporobacter subterrenus и Desulfotomaculum halophilum.

5. Молекулярное клонирование гена 16S рРНК и функционального гена dsrAB свидетельствует о том, что спорообразующие Firmicutes, родственные Desulfotomaculum, являются единственными организмами в сообществе мата из гидротермального поля Лост Сити, которые могут осуществлять процесс диссимиляционной сульфатредукции.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Наши исследования показали, что СРП могут существовать в экстремальных условиях низких рН и высоких концентраций ионов металлов в осадках хвостохранилища и щелочных значениях рН гидротермального поля Лост Сити. В исследованных пробах хвостохранилища нами обнаружены только спорообразующие Firmicutes, для которых известна способность получать энергию за счет восстановления сульфатов. Представителей наиболее многочисленной и изученной группы Deltaproteobacteria не удалось зафиксировать ни одним из использованных методов. Таким образом, важной группой микроорганизмов, ответственной за восстановление сульфата в кислых экосистемах, содержащих высокие концентрации металлов, являются представители рода Desulfosporosinus и родственные им организмы. Источником сульфата в исследованной экосистеме может служить процесс окисления представителями Acidithiobacillus ferrooxidans сульфидов, поступающих с твердыми отходами хвостохранилища.

Выделенный и изученный нами ацидотолерантный штамм Desulfosporosimis sp. DB использует широкий круг субстратов, устойчив к высоким концентрациям металлов и способен к осаждению ионов меди в виде халькопирита и ковеллина, что делает его перспективным для обезвреживания загрязненных металлами экосистем.

Анализ генов 16S рРНК из пробы карбонатной постройки глубоководного гидротермального поля Лост Сити позволил обнаружить последовательности, родственные генам 16S рРНК спорообразующих СРП рода Desulfotomaculum. У. Брэзелтон с соавторами (Brazelton et al., 2006) ставили под сомнение возможность осуществления сульфатредукции организмами, принадлежащими к этому кластеру, в силу значительного расхождения последовательностей, а также неудачных попыток амплифицировать ген dsrAB из тех же проб. Получение нами клонов гена dsrAB из проб мата свидетельствует о возможности протекания сульфатредукции в микробных обрастаниях карбонатных построек Лост Сити. Более того, полученные нами фрагменты последовательности гена dsrAB характеризовались наибольшей гомологией с генами диссимнляционной бисульфитредуктазы D. halophilum и D. alkaliphilum, что подтверждает гипотезу о том, что именно эта группа организмов ответственна за восстановление сульфата в карбонатных постройках и флюидах Лост Сити. Донором для развития СРП здесь может служить глубинный Н2, присутствующий в высоких концентрациях, а образующийся сероводород становится субстратом для развития бактерий рода Thiomicrospira.

Таким образом, сочетание методов молекулярного клонирования гена 16S рРНК и функционального гена на сульфатредукцию из тотальной ДНК природных образцов, ДГГЭ-анализ и молекулярное клонирование гена 16S рРНК культивируемых в селективных условиях микроорганизмов из исследованных местообитаний, а также выделение чистой культуры СРП и изучение ее свойств позволило наиболее полно охарактеризовать сообщество, ответственное за диссимиляциониое восстановление сульфата в таких экстремальных экосистемах, как осадки хвостохранилища золотообагатительной фабрики на месторождении «Новый Берикуль» (Кузбасс) и микробные обрастания карбонатной постройки глубоководного гидротермального поля Лост Сити.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Герасимчук, Анна Леонидовна, Томск

1. Богданов Ю. А. Подводные гидротермальные источники как среда обитания морских организмов. // В: А. В. Гебрук (отв. ред) Биология гидротермальных систем . М., КМК Press. 2002. С. 72-112.

2. Дулов Л. Е., А. Ю., Леин, Г. А. Дубинина, Н. В. Пименов. Микробиологические процессы на гидротермальном поле Лост Сиги, Срединно-атлантический хребет.// Микробиология. 2005. Т. 74. № 1. С. 111-118.

3. Геращенко А. А. Анализ минерально-сырьевой базы золота в Кемеровской области. // В: Золото Кузбасса. Кемерово: Изд-во Кемеровский полиграфкомбинат. 2000. С. 69-213.

4. Дубинина Е. О., И. В. Чернышев, П. С. Бортников, А. Ю. Леин, А. М. Сагалевич, Ю. В. Гольцман, Э. Д. Баирова, А. В. Мохов. Изотопно геохимические характеристики гидротермального поля Лост Сити. // Геохимия. № 11. 2007. С. 1223-1236.

5. Заварзин Г. А. Алкалофильное микробное сообщество как аналог наземной биоты протерозоя. // Эволюция биосферы и биоразнообразия. К 70-летию А. Ю. Розанова. М.: Т-во научных изданий КМК. 2006. С. 97-119.

6. Леин А. Ю. Геохимия и биогеохимия гидротермальных флюидов. Бактериальная продукция на активных гидротермальных полях. //В: М. Е. Виноградов, А. Л. Верещака (отв. ред.) Экосистемы атлантических гидротерм. М.: Наука. 2006. С. 68-95.

7. Леин А. Ю., Ю. А. Богданов, А. М. Сагалевич, В. И. Пересыпкин, Л. Е. Дулов. Белые столбы покинутого города. // Природа. № 12. 2002. с. 40-46.

8. Леин А. Ю., Иванов М. В. Биохимический цикл метана в океане. / Отв. Ред. Лисицын А. П. Ин-т Микробиологии им. С. Н. Виноградского РАН. М.: Наука. 2009. 576 с.

9. Карначук О. В. Образование и растворение серосодержащих минералов сульфатредуцирующими батериями. // Автореф.д.б.н. Москва. 2006. 53 с.

10. Alazard D., Dukan S., Urios A. et al. Desulfovibrio hydrothermalis sp. nov., a novel sulphate-reducing bacterium isolated from hydrothermal vents. // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2003. V. 53. P. 173 -178.

11. Allgaier M., H. Uphoff, A. Felske, I. Wagner-Dobler. Aerobic anoxygenic photosynthesis in Roseobacler clade Bacteria from diverse marine habitats. // Appl. Environ. Microbiol. 2003. V. 69. N 9. P. 5051-5059.

12. Altschul S. F., Madden T. L., Schaffer A. A., Zhang J. Zhang Z., Miller W., Lipman D. J., Gapped. BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs. // Nucleic. Acids. Res. 1997. V. 25. P. 3389-3402.

13. Alvarez M.T., Quillaguaman J., Mattiasson B. Clostridium boliviensis sp. nov. and Clostridium sulfatireducens sp. nov., xylan degrader, sulfate-reducing bacteria isolated from the Bolivian Andean region. // Unpublished (as of 15 March 2005).

14. Baumgartner L. K., R. P. Reid, C. Dupraz, A. W. Decho, D. H. Buckley, J. R. Spear, K. M. Przekop, P. T. Visscher. Sulfate reducing bacteria in microbial mats: changing paradigms, new discoveries. // Sedimentary Geology. 2006. V. 185. P. 131-145.

15. Berndt M. E., S. E. Allen, W. E. Seyfried. Reduction of CO2 during serpentinization of olivine at 300°C and 500 bar. // Geology. 1996. V. 24. P. 351-354.

16. Blowes D. W., Ptacek C. J., Weisener C. G. The geochemistry of acid mine drainage. // Treatise on Geochemistry. 2003. V. 9. P. 149-204.

17. Brazelton W. J., M. O. Schrenk, D. S. Kelley, J. A. Baross. Methane- and sulfur-metabolizing microbial communities dominate the Lost City hydrothermal field ecosystem. // Appl. Environ. Microbiol. 2006. V. 72. N 9. P. 6257-6270.

18. Brinkhoff Т., G. Muyzer. Increased species diversity and extended habitat range of sulfur-oxidizing Thiomicrospira spp. // Appl. Environ. Microbiol. 1997. V. 63. P.3789-3796.

19. Brock T. D., Madigan M. T. Biology of microorganisms. 5th Ed. Prentice-Hall, Englewood Cliffs, NJ. 1988. 835 P.

20. Bruneel O., R. Duran, C. Casiot, F. Elbaz-Poulichet, J.-C. Personne. Diversity of microorganisms in Fe-As-rich acid mine drainage waters of Carnoule's, France. // Appl. Environ. Microbiol. 2006. V. 72. № 1. P. 551-556.

21. Bryant M. P., L. L. Campbell, C. A. Reddy, M. R. Crabill. Growth in Desulfovibrio in lactate or ethanol media low in sulfate in association with H2-utilizing methanogenic bacteria. // Appl Environ Microbiol. 1977. V. 33. P. 1162-1169.

22. Burggraf S., Jannasch H. W., Nicolaus В., Stetter К. O. Archaeoglobus profundus sp. nov., represents a new species within the sulphate-reducing Archaebacteria. // Syst. Appl. Microbiol. 1990. V. 13. P. 24-28.

23. Chang I. S., P. K. Shin, В. H. Kim. Biological treatment of acid mine drainage under sulphate-reducing conditions with solid waste materials as substrate. // Water Res. 2000. V. 34. P. 1269-1277.

24. Chen G. Reductive dehalogenation of tetrachloroethylene by microorganisms: cunent knowledge and application strategies. //Appl. Microbiol. Biotechnol. 2004). V. 63. P. 373-377.

25. Church C. D., Wilkin R. Т., Alpers C. N., Rye R. O., McCleskey R. B. Microbial sulfate reduction and metal attenuation in pH 4 acid mine water. // Geochemical transaction. 2007. V. 8. P.14.

26. Cypionlca H. Oxygen respiration by Desulfovibrio species. // Annu. Rev. Microbiol. 2000. V. 54. P. 827-848.

27. Cottrell M. Т., Сагу S.G. Diversity of dissimilatory bisulfite reductase genes of bacteria associated with the deep-sea hydro thermal vent polychaete annelid Alvinella pompejcma. II Appl. Env. Microbiol. 1999. V. 65. P. 1127-1132.

28. Daly K., Sharp R. J., McCarthy A. J. Development of oligonucleotide probes and PCR primers for detecting phylogenetic subgroups of sulphate-reducing bacteria. // Microbiology. 2000. V. 146. P. 1693-1705.

29. Dannenberg S., Kroder M., Dilling W., Cypionka H. Oxidation of H2, organic compounds and inorganic sulfur compounds coupled to reduction of 02 or nitrate by sulfate-reducing bacteria. //Arch. Microbiol. 1992. V. 158. P. 93-99.

30. DeLong E. F. Archaea in costal marine environments. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1992. V. 89. P. 5685-5689.

31. Dhillon A., Teske A., Dillon J., Stahl D. A., Sogin M. L. Molecular characterization of sulphate-reducing bacteria in the Guaymas Basin. // Appl. Environ. Microbiol. 2003. V. 69. P. 2765-2772.

32. Dilling W., H. Cypionka. Aerobic respiration in sulfate-reducing bacteria. // FEMS Microbiology Letters. 1990. V. 71 (1),P. 123-127.

33. Dolla A., M. Fournier, Z. Dermoun. Oxygen defense in sulfate-reducing bacteria. // Journal of Biotechnology. 2006. V. 126. P. 87-100.

34. Dopson M., Lindstrom E. B. Potential role of Thiobacillus caldus in arsenopyrite bioleaching. //Appl. Environ. Microbiol. 1999. V. 65. P. 36-40.

35. Edwards K. J., Bond P. L., Gihring Т. M., Banfield J. F. An archaeal ironoxidizing extreme acidophile important in acid mine drainage. // Science. 2000. V. 287. P. 1796-1799.

36. Ehrlich H. L. Geomicrobiology. 3rd ed. Marcel Dekker Inc. New York. 1996.

37. Fareleira P., Santos B. S., Antonio C., Moradas-Ferreira P., LeGall J., Xavier A. V., Santos H. Response of a strict anaerobe to oxygen: survival strategies in Desulfovibrio gigas. II Microbiology. 2003. Y. 149. P. 1513-1522.

38. Fauque G., Ollivier B. Anaerobes: the sulphate-reducing bacteria as an example of metabolic diversity. // In A. Bull (ed.), Microbial diversity and bioprospecting. Washington, DC: ASM Press. 2004. P. 169-176.

39. Fiebig K., G. Gottschalk. MeLhanogenesis from choline by a coculture of Desulfovibrio sp. and Melhanosarcina barkeri. II Appl. Environ. Microbiol. 1983. V. 45. P. 161-168.

40. Finster K., W. Licsack, B. J. Tindall. Sulfurospirilium arcachonense sp. nov., a new microaerophilic sulfur-reducing bacterium. // Int.l J. Syst. Bacterid. 1997. V. 39. P. 159-167.

41. Fishbain S, Dillon J. G., Gough H. L., Stalil D. A. Linkage of high rates of sulfate reduction in Yellowstone hot springs to unique sequence types in the dissimilatory sulfate respiration pathway. //Appl. Environ. Microbiol. 2003. V. 69. P. 3663-3667.

42. Foustoukos D. I., W. E. Seyfried. Hydrocarbons in vent fluids: The role of chromium-bearing catalysts. // Science. 2004. V. 304. P. 1002-1005.

43. Friedrich M. W. Phylogenetic analysis reveals multiple lateral transfers of adenosine-5'-phospliosulphate reductase genes among sulphate-reducing microorganisms. // J. Bacteriol. 2002. V. 184. P. 278-289.

44. Fruh-Green G. L., D. S. Kelley, S. M. Bernasconi, J. A. Karson, K. A. Ludwig, D. A. Butterfield, C. Boschi, G. Proskurowski. 30,000 years of hydrothermal activity at the Lost City vent field. // Science. 2003. V. 301. P. 495-498.

45. Gammons C. G., Metesh J. J., Snyder D. M. A survey of the geochemistry of flooded mine shaft water in Butte, Montana. // Mine Water and the Environment. 2006. V. 25. P. 100107.

46. Garcia-Moyano A., Gonzalez-Toril E., Aguilera A., Amils R. Prokaryotic community composition and ecology of floating macroscopic filaments from an extreme acidic environment, Rio Tinto (SW, Spain). // Syst. Appl. Microbiol. 2007. V.30. P. 601-614.

47. Garrity G. M., J. A. Bell, T. G. Lilburn. Bergeys manual of systematic bacteriology. 2th ed. Taxonomic outline of the prokariotes release 5.0. Springer, New York. 2004. P. 401.

48. Gazea В., Adam K., Kontopoulos A. A review of passive systems for the treatment of acid mine drainage. // Min. Eng. 1996. V. 9. P. 23-42.

49. Geets J., Borremans В., Diels L. et al. DsrB gene-based DGGE for community and diversity surveys of sulphate-reducing bacteria. // J. Microbiol. Methods. 2006. V. 66. P. 194205.

50. Girguis P. R., A. E. Cozen, E. F. DeLong. Growth and population dynamics of anaerobic methane-oxidizing archaea and sulfate-reducing bacteria in a continuous-flow bioreactor. // Appl. Environ. Microbiol. 2005. V. 71. P. 3725-3733.

51. Hallberg К. В., D. B. Johnson. Biodiversity of acidophilic prokaryotes. // Adv. Appl. Microbiol. 2001. V. 49. P. 37-84.

52. Hallberg К. В., D. B. Johnson. Novel acidophiles isolated from moderately acidic mine drainege waters. //Hydrometallurgy. 2003. V. 71. P. 139-148.

53. Hansen T. A. Metabolism of sulfate-reducing prokaryotes. // Antonie van Leeuwenhoek. 1994. V. 66. P. 165-185.

54. Hartzell P., D. W. Reed. The Genus Archaeoglobus. II In: M. Dworkin, S. Falkow, E. Rosenberg, K.-H. Schleifer, E. Stackebrandt. The prokaryotes. 3rd. ed. Springer, New York. 2006. V. 3. P. 82-100.

55. Head I. M., Jones D. M., Larter S. R. Biological activity in the deep subsurface and the origin of heavy oil. //Nature. 2003. V. 426. P. 344-352.

56. Isaksen M. F., A.Teske. Desulforhopalus vacuolatus gen. nov., sp. nov., a new moderately psychrophilic sulfate-reducing bacterium with gas vacuoles isolated from a temperate estuary. //Arch. Microbiol. 1996. V. 166. P. 160-168.

57. Itoh Т., К. Suzuki, Т. Nakase. Thermocladium modestius gen. nov., sp. nov., a new genus of rod-shaped, extremely thermophilic crenarchaeote. // Int. J. Syst. Bacteriol. 1998. V. 48. P. 879-887.

58. Itoh Т., К. Suzuki, P. C. Sanchez, T. Nakase. Caldivirga maquilingensis gen. nov., sp. nov., a new genus of rod-shaped crenarchaeote isolated from a hot spring in the Philippines. // Int. J. Syst. Bacteriol. 1999. V. 49. P. 1157-1163.

59. Janecky D. R., W. E. Seyfried. Hydrothermal serpentinization of peridotite within the oceanic crust: Experimental investigations of mineralogy and major element geochemistry. // Geochem. Cosmochim. Acta. 1986. V. 50. P. 1357-1378.

60. Jannasch H. W., Mottl M. J. Geomicrobiology of deep-sea hydrothermal vents. // Science. 1985. V. 229. P. 717-725.

61. Jensen A., Finster K. Isolation and characterization of Suljurospirillum carboxydovorans sp. nov., a new microaerophilic carbon monoxide oxidizing epsilon Proteobacterium. // Antonie van Leeuwenhoek. 2005. V. 87.P. 339-353.

62. Johnson D. B. Biodiversity and ecology of acidophilic microorganisms. // FEMS Microbiol. Ecol. 1998. V. 27. P. 307-317.

63. Johnson D. B. Chemical and microbiological characteristics of mineral spoils and drainage waters at abandoned coal and metal sites. // Water Air and Soil Pollution. 2003. V. 3. P. 47-66.

64. Johnson D. В., Sen A. M., Kimura S., Rowe O. F., Hallberg К. B. Novel biosulfidogenic system for selective recovery of metals from acidic leach liquors and waste streams. // Mineral Processing and Extractive Metallurgy. 2006. V. 115. P. 19-24.

65. Jeanthon C. Molecular ecology of hydrothermal vent microbial communities. // Antonie van Leeuwenhoek. 2000. V. 77. P. 117-133.

66. Jonkers H. M., van der Maarel M. J. E. C., van Gemerden H, Hansen, T. A. Dimethylsulfoxide reduction by marine sulphate-reducing bacteria. // FEMS Microbiol. Lett. 1996. V. 136. P. 283-287.

67. Johnson B. Biological removal of sulfurous compounds from inorganic wastewaters. // In: Lens P.N.L., Hulshoff L. (Eds). Environmental technologies to treat sulfur pollution: principles and engineering. London: IWA Publishing. 2000. P. 175-205. 1

68. Johnson B. D., Hallberg К. B. The microbiology of acidic mine waters. // Research in Microbiology. 2003. V. 154. P. 466-473.

69. Johnson D. В., Sen A. M., Kimura S., Rowe O. F., Hallberg К. B. Novel biosulfidogenic system for selective recovery of metals from acidic leach liquors and waste streams. // Trans. Inst. Min. Metall. 2006. V. 115. P. 19-24.

70. Kallmeyer J., A. Boetius. Effects of temperature and pressure on sulfate reduction and anaerobic oxidation of methane in hydrothermal sediments of Guaymas Basin. // Appl. Environ. Microbiol. 2004. V. 70. N. 2. P. 1231-1233.

71. Kelley D. S., Fruh-Green G. L., Karson J. A., Ludwig K. A. The Lost City hydrothermal field revisited. // Oceanography. 2007. V. 20. N 4. P. 90-99.

72. Kelley D. S., Karson J. A., Blackman D. K. et al. An off-axis hydrothermal vent field near the Mid-Atlantic Ridge at 30°N. // Nature. 2001. V. 412. P. 145-149.

73. Kimura S., Hallberg К. В., Johnson D. B. Sulfidogenesis in low pH (3,8 4,2) media by a mixed population of acidophilic bacteria. // Biodegradation. 2006. V. 17.1. 2. P. 159-167.

74. Kjeldsen K. U., Kjellerup В. V., Egli K., Frolund В., Nielsen P. H., Ingvorsen K. Phylogenetic and functional diversity of bacteria in biofilms from metal surfaces of an alkaline district heating system // FEMS Microbiol.Ecol. 2007. V. 61. P. 384-397.

75. Koch A. L. Most probable number. // In: Gerchard P., Murray R. G. E., Wood W. A., Krieg N. R. (Eds). Method for general and molecular bacteriology. American Society for Microbiology. Washington DC. 1994. P. 257-260.

76. Kodama Y., Ha L. Т., Watanabe K. Sulfurospirillum cavolei sp. nov., a facultatively anaerobic sulfur-reducing bacterium isolated from an underground crude oil storage cavity. // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2007. V. 57. P. 827-831.

77. Kolmert A., Johnson D. B. Remediation of acidic waste waters using immobilised, acidophilic sulfate-reducing bacteria. // J. Chem. Technol. Biotcchnol. 2001. V. 76. P. 836-843.

78. Kosaka Т., Kato S., Shimoyama Т., Ishii S. Abe T. and Watanabe K. The genome of Pelotomaculum thermopropionicum reveals niche-associated evolution in anaerobic microbiota. // Genome Res. 2008. V. 18. P. 442-448.

79. Koschorreck M., Frommichen R., Herzsprung P., Tittel J., Wendt-Potthoff K. Functions of straw for in-situ remediation of acidic mining lakes. // Water Air and Soil Pollution Focus. 2002. V. 2. P. 97-109.

80. Koschorreck M., Wendt-Potthoff K., Geller W. Microbial sulfate reduction at low pH in sediments of an acidic lake in Argentina. // Environ. Sci. Technol. 2003. V. 37. P. 1159 — 1162.

81. Krekeler D., Cypionka H. The preferred electron acceptor of Desulfovibrio desulfuricans CSN. // FEMS Microbiol. Ecol. 1995 V. 17. P. 271-278.

82. Kusel K. Microbial cycling of iron and sulfur in acidic coal mining lake sediments. // Water Air and Soil Pollution. 2003. V. 3. P. 67-90.

83. Kiiesel K., Roth U., Trinkwalter Т., Peiffer S. Effect of pH on the anaerobic microbial cycling of sulfur in mining-impacted freshwater lake sediment. // Environmental and Experimental Botany. 2001. V. 46. P. 213-223.

84. Labrenz M., Banfield J. F. Sulfate-reducing bacteria-dominated biofilms that precipitate ZnS in a subsurface circumneutral-pH mine drainage system. // Microbial Ecology. 2004. V. 47. P. 205-217.

85. Lane D. J. 16S/23S rRNA sequencing. // In: Stackebrandt E., Goodfellow M. (Eds). Nucleic acid techniques in bacterial systematics. Chichester: John Wiley & Sons. 1991. P. 115175.

86. Lee Y.-J., C. S. Romanek, J. Wiegel. Desulfosporosinus youngiae sp. nov., a sporeforming, sulfate-reducing bacterium isolated from a constructed wetland treating acid mine drainage. II Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2009. V. 59. P. 2743-2746.

87. Lemos R. S., Gomes С. M., Santana M., J. LeGall, A. V. Xavier, M. Teixeira The "strict" anaerobe Desulfovibrio gigas contains a membrane-bound oxygen respiratory chain. // J. Inorg. Biochem. 2001. V. 86. P. 314.

88. Loubinoux J., Могу F., Pereira I. A. C„ Le Faou A. E. Bacteremia caused by a strain of Desulfovibrio related to the provisionally named Desulfovibrio fairfieldensis. // Journal of Clinical Microbiology. 2000. V. 38. P. 931-934.

89. Lovley D. R., Coates J. D., Woodward J. C., Phillips E. J. P. Benzene oxidation coupled to sulphate reduction. // Appl. Environ. Microbiol. 1995. V. 61. 953-958.

90. Lovley D. R., Holmes D. E., Nevin K. P. Dissimilatory Fe(III) and Mn(IV) reduction. // Adv. Microb. Physiol. 2004. V. 49. P. 221-286.

91. Lovley D. R., E. J. Phillips. Reduction of uranium by Desulfovibrio desulfuricans. II Appl. Environ. Microbiol. 1992. V. 58. P. 850-856.

92. Lovley D. R., E. J. P. Phillips. Reduction of chromate by Desulfovibrio vulgaris and its c3 cytochrome. // Appl. Environ. Microbiol. 1994. V. 60. P. 726-772.

93. Lovley D. R., Roden E. E., Phillips E. J. P., Woodward, J. C. Enzymatic iron and uranium reduction by sulphate-reducing bacteria. // Mar. Geol. 1993. V. 113. P. 41-53.

94. Lowry О. H., Rosebrough N. J., Farr A. L., Randall R. J. Protein measurement with Folin phenol reagent.//J. Biol. Chem. 1951. V. 193. N 1. P. 265-275.

95. Ludwig K. A., D. S. Kelley, D. A. Butterfield, B. Nelson, G. Fruh-Green. Formation and evolution of carbonate chimneys at the Lost City Hydrothermal Field. // Geochem. Cosmochim. Acta. 2006. V. 70. P. 3625-3645.

96. Macy M., Nunan K., Hagan K. D., Dixon D. R., Harbour P. J., Cahill M., Sly L. Chrysiogenes cirsenatis gen. nov., sp. nov., a new arsenate-respiring bacterium isolated from gold mine wastewater. // Int. J. Syst. Bacteriol. 1996. V. 46. P. 1153-1157.

97. Macy J. M., J. M. Santini, В. V. Pauling, A. H. O'Neill, L. I. Sly. Two new arsenate/sulfate-reducing bacteria: mechanisms of arsenate reduction. // Arch. Microbiol. 2000. V. 173. P. 49-57.

98. Maukonen J., Saarela M., Raaska L. Desulfovibrionales-related bacteria in a paper mill environment as detected with molecular techniques and culture. // J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 2006. V. 33. P. 45-54.

99. McCollom Т. M., J. S. Seewald. A reassessment of the potential for reduction of dissolved C02 to hydrocarbons during the serpentinization of olivine. // Geochem. Cosmochim. Acta. 2001. V. 65. P. 3769-3778.

100. Mullins T. D., Britschgi Т. В., Krest R. L., Giovannoni S. J. Genetic comparisons reveal the same unknown bacterial lineages in Atlantic and Pacific bacterioplankton communities. // Limnology and Oceanography. 1995. V. 40. P. 148-158.

101. Myers C. R., Nealson К. H. Bacterial manganese reduction and growth with manganese oxide as the sole electron-acceptor. // Science. 1988. V. 240. P. 1319-1321.

102. Nakagawa Т., M. Fukui. Molecular characterization of community structures and sulfur metabolism within microbial streamers in Japanese hot springs. // Appl. Environ. Microbiol. 2003. V. 69. P. 7044-7057.

103. Nakagawa, Т., S. Sato, Y. Yamamoto, M. Fukui. Successive changes in community structure of an ethylbenzene-degrading sulfate-reducing consortium. // Water Res. 2002. V. 36. P. 2813-2823.

104. Neal C., G. Stanger. Hydrogen generation from mantle source rocks in Oman. // Earth and Planetary Science Letters. 1983. V. 66. P. 315-320.

105. Neculita С. M., Zagury G. J., Bussiere B. Passive treatment of acid mine drainage in bioreactors using sulphate-reducing bacteria — a critical review. // J. Environ. Qual. 2007. V. 36. P. 1-16.

106. Neria-Gonzalez I., Wang E. Т., Ramirez F., Romero J. M., Hernandez-Rodriguez C. Characterization of bacterial community associated to biofilms of corroded oil pipelines from the southeast of Mexico. // Anaerobe. 2006. V. 12. P.122-133.

107. Nevin K.P., Finneran K.T., Lovley D.R. Microorganisms associated with uranium bioremediation in a high-salinity subsurface sediment. // Appl. Environ. Microbiol. 2003. V. 69. P. 3672-3675.

108. Newman D. К., T. J. Beveridge, F. M. M. Morel. Precipitation of arsenic trisulfide by Desulfotomaculum auripigmentum. II Appl. Environ. Microbiol. 1997a. V. 63. P. 2022-2028.

109. Newman D. К., E. K. Kennedy, J. D. Coates, D. Ahmann, D. J. Ellis, D. R. Lovley, F. M. M. Morel. Dissimilatory arsenate and sulfate reduction in Desulfotomaculum auripigmentum sp. nov. // Arch Microbiol. 1997b. V. 168. P. 380-388.

110. Nordstrom D. K., G. Southam. Geomicrobiology of sulphide mineral oxidation // In: J.F. Banfield, K.H. Nealson (Eds). Geomicrobiology: Interactions between Microbes and Minerals. Mineralogical Society of America, Washington DC. 1997. P. 361-390.

111. Nordstrom D. К., C. N. Alpers. Negative pH, efflorescent mineralogy, and consequences for environmental restoration at the Iron Mountain Superfund site, California. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96. 1999. P. 3455-3462.

112. Odom J.M., Peck H.D. Hydrogenase, electron transfer proteins, and energy coupling in the sulfate-reducing bacteria Desulfovibrio. // Annu. Rev. Microbiol. 1994. V. 38. P. 551-592.

113. Ohmura N., Sasaki K., Matsumoto N., Saiki H. Anaerobic respiration using Fe(3+), S(0), and H(2) in the chemolithoautotrophic bacterium Acidithiobacillus ferrooxidans. II J. Bacterid. 2002. V. 184. P. 2081-2087.

114. Ollivier В. R. Cord-Ruwisch, E. C. Hatchikian, and J. L. Garcia. Characterization of Desulfovibrio fructosovorans sp. nov. //Arch. Microbiol. 1988. V. 149. P. 447-450.

115. Overmann J., Coolen M. J. L., Tuschak, C. Specific detection of different phylogenetic groups of chemocline bacteria based on PCR and denaturing gradient gel electrophoresis of 16S rRNA gene fragments. // Arch. Microbiol. 1999. V. 172. P. 83-94.

116. Phelps C. D., Kerkhof L. J., Young L. Y. Molecular characterization of a sulphate-reducing consortium which mineralizes benzene. // FEMS Microbiol. Ecol. 1998. V. 27. P. 269279.

117. Porsch K., J.Meier, S. Kleinsteuber, K. Wendt-Potthoff. Importance of different physiological groups of iron reducing microorganisms in an acidic mining lake. 11 Microbial Ecology. 2009. V. 57. N 4. P. 701-717.

118. Poulson, S. R., P. J. S. Colberg, J. I. Drever. Toxicity of heavy metals (Ni, Zn) to Desulfovibrio desulfuricans. II Geomicrobiol. J. 1997. V. 14. P. 41-49.

119. Praharaj Т., Fortin D. Indicators of microbial sulfate reduction in acidic sulfide-rich mine tailings. // Geomicrobiol. J. 2004. V. 21. P. 457-467.

120. Proskurowski G., M. D. Lilley, D. S. Kelley, E. J. Olson. Low temperature volatile production at the Lost City Hydrothermal Field, evidence from a hydrogen stable isotope geothermometer. // Chemical Geology. 2006. V. 229. P. 331-343.

121. Proskurowski G., M. D. Lilley, J. S. Seewald, G. L. Friih-Green, E. J. Olson, J. E. Lupton, S. P. Sylva, D. S. Kelley. Abiogenic hydrocarbon production at Lost City hydrothermal field. // Science. 2008. V. 319. P. 604-607.

122. Rabus R., T. A. Hansen and F. Widdel. Dissimilatory Sulfate- and Sulfur-Reducing Prokaryotes // In: M. Dworkin, S. Falkow, E. Rosenberg, K.-H. Schleifer, E. Stackebrandt (Eds). The Prokaryotes. 3rd ed. Springer, New York. 2006. V. 2. P. 659-768.

123. Rampinelli L. R., R. D. Azevedo, M. C. Teixeira, R. Guerra-Sa, V. A. Leao. A sulfate-reducing bacterium with unusual growing capacity in moderately acidic conditions. // Biodegradation. 2008. V. 19. P. 613-619.

124. Ravenschlag К., Salira К., Knoblauch С., Jorgensen В. В., Amann R. Community structure, cellular rRNA content, and activity of sulphate-reducing bacteria in marine arctic sediments. //Appl. Environ. Microbiol. 2000. V. 66. P. 3592-3602.

125. Reysenbach A.-L., Longnecker K., Kirshtein J. Novel bacterial and archaeal lineages from an in situ growth chamber deployed at a Mid-Atlantic Ridge hydrothermal vent. // Appl. Environ. Microbiol. 2000. V. 66. P. 3798-3806.

126. Robertson W. J., Bowman J. P., Franzmann P. D., Мее B. J. Desulfosporosinus meridiei sp. nov., a spore-forming sulfate-redusing bacterium isolated from gasolene-contaminated groundwater. // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2001. V. 51 (1). P. 133-140.

127. Ruby E. G., Wirsen С. O., Jaimasch H. W. Chemolithoautotrophic sulfur-oxidizing bacteria from the Galapagos Rift hydrothermal vents. //Appl. Environ. Microbiol. 1981. V.42. P. 317-342.

128. Rueter P., Rabus R., Wilkes H„ Aeckersberg F., Rainey F. A., Jannasch H. W., Widdel F. Anaerobic oxidation of hydrocarbons in crude oil by new types of sulphate-reducing bacteria. //Nature. 1994. V. 372. P. 455-458.

129. Sani R. К., В. M. Peyton, L. T. Brown. Copper-induced inhibition of growth of Desulfovibrio desulfuricans G20: assessment of its toxicity and correlation with those of zinc and lead. // Appl. Environ. Microbiol. 2001. V. 67. P. 4765-4772.

130. Sass H., H. Cypionka. Isolation of sulfate-reducing bacteria from the terrestrial deep subsurface and description of Desulfovibrio cavernae sp. nov. // System. Appl. Microbiol. 2004. V. 27. P. 541-548.

131. Sass H., J. Overinann, H. Rutters, H.-D. Babenzien, H. Cypionka. Desulfosporomusa polytropa gen. nov., sp. nov., a novel sulfate-reducing bacterium from sediments of an oligotrophic lake. // Arch. Microbiol. 2004. V. 182. P. 204-211.

132. Saunders J.A., Lee M-K., Wolf L.W., Morton C.M., Feng Y., Thomson I., Park S. Geochemical, microbiological, and geophysical assessments of anaerobic immobilization of heavy metals. // Bioremediation J. 2005. V. 9. P. 33-48.

133. Scheid D., Stubner S. Structure and diversity of Gram-negative sulphate-reducing bacteria on rice roots. // FEMS Microbiol. Ecol. 2001. V. 36. P. 175-183.

134. Sen A. M. Acidophilic sulphate reducing bacteria: candidates for bioremediation of acid mine drainage pollution. Ph D thesis. University of Wales. 2001.

135. Senko J. M., J. D. Istok, J. M. Suflita, L. R. ICrumholz. In-situ evidence for uranium immobilization and remobilization. // Environ. Sci. Technol. 2002. V. 36. P. 1491-1496.

136. Senko J. M., G. Zhang, J. T. McDonough, M. A. Bruns, William D. Metal reduction at low pH by a Desulfosporosinus species: implications for the biological treatment of acidic mine drainage. // 2009. In press.

137. Seth A. D., Edyvean R.G.J. The function of sulfate-reducing bacteria in corrosion of potable water mains. // International Biodeterioration & Biodegradation. 2006. V. 58. P. 108111.

138. Shen Y. A., Buick R., Canfield D. E. Isotopic evidence for microbial sulphate reduction in the early Archaean era. //Nature. 2001. V. 410. P. 77-81.

139. Sierra-Alvarez R., Karri S., Freeman S., Field J. A. Biological treatment of heavy metals in acid mine drainage using sulfate reducing bioreactors. // Water Sci. Technol. 2006. V. 54(2). P. 179-185.

140. Sievert S. M., Kuever, J. Desulfacinum hydrothermale sp. nov., a thermophilic, sulphate-reducing bacterium from geothermally heated sediments near Milos Island (Greece). // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2000. V. 50. P. 1239-1246.

141. Stackebrandt E., Schumann P., Schiiler E. and Hippe H. Reclassification of Desulfotomaculum auripigmentum as Desulfosporosinus auripigmenti corrig., comb. nov. // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2003. V. 53. P. 1439-1443.

142. Stackebrandt E., C. Sproer, F. A. Rainey, J. Burghardt, O. Pauker, H. Hippe. Phylogenetic Analysis of the Genus Desulfotomaculum: Evidence for the Misclassification of Desulfotomaculum guttoideum and Description of Desulfotomaculum orientis as

143. Desulfosporosinus orientis gen. nov., comb. nov. // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 1997. V. 47. N 4. P. 1134-1139.

144. Stahl D.A., Fishbain S., Klein M., Baker B.J. Wagner M. Origins and diversification of sulfate-respiring microorganisms. // Antonie van Leeuwenhoek. 2002. V. 81. P. 189-195.

145. Stetter К. O. Archaeoglobus fulgidus gen. nov., sp. nov.: A new taxon of extremely thermophilic archaebacteria. // Syst. Appl. Microbiol. 1988. V. 10. P. 172-173.

146. Stetter К. O., R. Huber, E. Blochl, M. Kurr, R. D. Eden, M. Fielder, H. Cash. I. Vance. Ilyperthermophilic archaea are thriving in deep North Sea and Alaskan oil reservoirs. // Nature. 1993. V. 365. P. 743-745.

147. Takai К., K. Horikoshi. Genetic diversity of archaea in deep-sea hydrothermal vent environments. //Genetics. 1999. V. 152. P. 1285-1297.

148. Tebo В. M., A. Y. Obraztsova. Sulfate-reducing bacterium grows with Cr(VI), U(VI), Mn(IV), and Fe(III) as electron acceptors. // FEMS Microbiol. Lett. 1998. V. 162. P. 193-198.

149. Tuttle L. H., Dugan P. R., Randies С. I. Microbial sulfate reduction and its potential utility as an acid mine water pollution abatement procedure. // Appl. Microbiol. 1969. V. 17. P. 297-302.

150. Utkin I., C. Woese, J. Wiegel. Isolation and characterization of Desulfitobcicterium dehalogenans gen. nov., sp. nov., an anaerobic bacterium which reductively dechlorinates chlorophenolic compounds // Int. J. Syst. Bacteriol. 1994. V. 44. P. 612-619.

151. Vatsurina A., D. Badrutdinova, P. Schumann, S. Spring, M. Vainshtein. Desulfosporosinus hippei sp. nov., a mesophilic sulfate-reducing bacterium isolated from permafrost. // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2008. V. 58. P. 1228-1232.

152. Wagner M., A. Loy, M. Klein, N. Lee, N. B. Ramsing, D. A. Stahl, M. W. Friedrich. Functional marker genes for identification of sulfate-reducing prokaryotes. // Methods in ensimology. 2005. V. 397. P. 469-489.

153. Wagner M., Roger A. J. Flax J. L., Brusseau G. A., Stahl D. A. Phylogeny of dissimilatory sulfite reductases supports an early origin of sulfate respiration. // J. Bacteriol. 1998. V. 180. P. 2975-2982.

154. Wawer C., Muyzer G. Genetic diversity of Desulfovibrio spp. in environmental samples analyzed by denaturing gradient gel electrophoresis of Ni Fe hydrogenase gene fragments. //Appl. Environ. Microbiol. 1995. V. 61. P. 2203-2210.

155. Weber А., В. B. J0rgensen. Bacterial sulfate reduction in hydrothermal sediments of the Guaymas Basin, Gulf of California, Mexico. // Deep- Sea Res. 2002. Part I. V. 49. P. 827841.

156. Weisburg W.G., Barns S.M., Pelletier D.A., Lane D.J. 16S ribosomal DNA amplification for phylogenetic study. // J. Bacteriol. 1991. V. 173. P. 697-703.

157. White С., A. K. Sharman, G. M. Gadd. An integrated microbial process for the bioremediation of soil contaminated with toxic metals. // Nat. Biotechnol. 1998. V. 16. P. 572575.

158. Widdel F. Microbiology and ecology of sulfate- and sulfur-reducing bacteria. // In: A. J. B. Zehnder (Ed). Biology of Anaerobic Microorganisms. John Wiley & Sons, New York. 1988. 469-585.

159. Widdel F. The genus Desulfolomaculum. II In: M. Dworkin, S. Falkow, E. Rosenberg, K.-H. Schleifer, E. Stackebrandt (Eds). The Prokaryotes. 3rd ed. Springer, New York. 2006. Y. 4. P. 787-794.

160. Widdel F., N. Pfennig. Studies on dissimilatory sulfate-reducing bacteria that decompose fatty acids. II. Incomplete oxidation of propionate by Desulfobulbus propionicus gen. nov., sp. nov. // Arch. Microbiol. 1982. V. 131. P. 360-365.

161. Willow M. A., Cohen R. R. H. pH, dissolved oxygen, and adsorption effects on metal removal in anaerobic bioreactors. // Journal of Environmental Quality. 2003. V. 32. P. 12121221.

162. Winch S., Mills H. J., Kostka J. E., Fortin D., Lean D. R. S. Identification of sulfate-reducing bacteria in methylmercury-contaminated mine tailings by analysis of SSU rRNA genes. //FEMS Microbiol. Ecol. 2009. V. 68 (1). P. 94-107.

163. Zhou J., Bruns M. A., Tiedje J. M. DNA recovery from soils diverse compositioms. // Appl. Environ. Microbiol. 1996. V. 62. P. 316-322.

164. Zverlov V., Klein M., Lucker S., Friedrich M. W., Kellermann J., Stahl D. A., Loy A., Wagner M. Lateral gene transfer of dissimilatory (bi)sulfite reductase revisited. // J. Bacteriol. 2005. V. 187. P. 2203-2208.

Информация о работе

Герасимчук, Анна Леонидовна
кандидата биологических наук
Томск, 2009
ВАК 03.00.07

Диссертация

Сульфатредуцирующие бактерии в экосистемах с экстремальными значениями pH - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы