Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Сульфатредуцирующие бактерии - продуценты углеводородов

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Сульфатредуцирующие бактерии - продуценты углеводородов"

С5 #

На п рз? лс-'. ^ у г-'- • п I; з 11 УДК 579.844.51.017

Вагаева Татьяна Еадимовна Сульфатредуцирущце бахяецл! - продуценты углеводородов (03.00.07 - микробиология и 02.00.04 - бисхикпя'>

А в т о р е ф е р а т

диссертации на соуекание ученой е??п?ни доктора биологических наук

Казань - 1998

Работа выполнена в Казанском ордена Ленина и Трудового Красного Знамени государственном университете

Официальные оппоненты: доктор биологических наук,

академик РАН, ИваноЕ М.Е. доктор биологических наук, профессор. Ивановский Р. Н. доктор технических наук, профессор, Решетник O.A.

Ведущее учреждение: Институт биохишш имени А.Н.Бача,

РАН, г.Москва

Защита состоится 1993 г. в ^_^часов

на заседании разового диссертационного совета по гаидте диссертаций на соискание ученой степени доктора наук гАР QSl.-lb.Ct в Казанском государственном университете по адресу: 420008, г.Казань, ул.Кремлевская, 18

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биолого-почвенного факультета Казанского государственного университета.

Автореферат разослан " "_19Э8 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, к.б.и.

о/яад х&'лктеристнка работы

Актуальность проблема. Синтез углеводородов различными организмами привлекает внимание учены.", t.rhpa в связи с проблемой происхождение нефти. Существующие теории неорганического и органического происхождения нефти не исключает возможность микробиологического пути образования углеводородов в природе. Исследования в этой области были начаты еще в 30-ые годы. В этот период появляются сообщения об обнаружении "углеводородоподобных веществ", синтезируемых бактериями и водорослями (Селибер, 1937; Jankowski, Zobel 1., 1944; Zobel 1,1945; Oakwood, 1945).

Дальнейшее развитие в изучении углеводородов связано с разработкой метода газожидкостной хроматографии (Oppenheimer,1965; Joneau et.al.,1969; Han et.al., 1969; Albro et.al., 1970; Tornabene et.al... 1970; Weete et.al.,1970; Ерошин, Дедюхина, 1972). В ряде работ исследовались отдельные этапы образования углеводородов (Albro, Meehan, Dittmer, 1970; Bird, Lynch, 1974; Tornabene, 1976, 1981), однако в целом, механизм синтеза остается до сих пор не изученным.

В настоящее время особый интерес вызывает метаболизм анаэробных бактерий, осуществляющих значимые процессы в анаэробных зонах биосферы (Заварзин, 1972; Кузнецов, 1974; Розанова, Кузнецов, 1974; Германов и др.,1981; Hansen, 1988; Иванов с соавт.,1991). К числу таких процессов относится и синтез углеводородов. Наиболее вероятными продуцентами углеводородов в природе, наряду с метаногенами, являются сульфатредуцк-рукщие бактерии, так как именно этим бактериям принадлежит главная роль в терминальных путях анаэробной деструкции органического вещества и в преобразовании морских ос ад,ков.

Анализ проблемы показан, что опубликованные работы, в основном, посвящены бактериальному синтезу газообразных углеводородов, особенно образованию метана (Fukuda, 1984 а,Ь; 1990; Беляев, 1988; Варфоломеев и др., 1988; Панцхава, 1989; Thauer, 1990; Wolfe, 1990 ; Jetten et.al., 1992), а также изопреноидным углеводородам (Zhou, White, 1991). Способность у. синтезу внеклеточных -жидких и твердых углеводородов одной из наиболее активных групп анаэробных микроорганизмов, какими являются сульфатредуцируюице бактерии, остается неизученной. Это и определило актуальность настоящей работы, посвященной изучению метаболизма сульфатредуцируюшдх бактерий ъ связи с возможным их участием в синтезе углеводородов з природе.

Цель и задачи исследований. Целью настоящей работы является доказательство способности сулъфатредуцирующих бактерий к синтезу внеклеточных углеводородов и разработка научных основ, обеспечивающих осуществление атого процесса.

В соответствии с основной целью работы были определены слодующт задачи:

- изучить способность сульфатредуцирующих бактерий продуцировать внеклеточные углеводороды в условиях гетеротрофного, литогетеротрофно-го и автотрофного роста;

- установить наиболее активных продуцентов углеводородов сред! физиологически и биохимически различных видов сульфатредуцирующих бактерий;

- определить состав внеклеточные и внутриклеточных углеводороде! Desulfovibrio desulfuricans для их сравнительной характеристики;

- установить закономерности влияния химического состава питательной среды и физико-химических условий культивирования на процесс образования внеклеточных углеводородов с-ульфатредуцирующими бактериями;

- изучить механизм синтеза внетаеточных углеводородов Desulfovibrio desulfuricans;

- исследовать процесс образования углеводородов в природных объектах, содержащих сульфатредуцирующие бактерии.

Научная новизиа. Показана способность сульфатредуцирующих бактерий, принадлежащих к разным метаболическим типам, к синтезу внеклеточных углеводородов, включающему широки! спектр алканов от Сц до Установлено, что синтез углеводородов происходит в условиях гетеротрофного, литогетеротрофного и автотрофного роста бактерий. Однако на; большее их количество образуется в условиях роста клеток на среде с лактатом в атмосфере Нг+СОо с минимальным количеством сульфатов в питательной среде. Определено, что наиболее активным продуцентом углеводородов среди изученных видов бактерил является Desulfovibrio desulfuricans. Методами газожидкостной хроматографии и масс-спектрометрического анализа установлено, что углеводороды, синтезируемые Desulfovibrio desulfuricans, представлены, в основном, алканами нормальней строения. В отличие от внутриклеточных углеводородов, содеркащю 70-80%. отн. высокомолекулярных углеводородов (С25-С35), максимально* количество внеклеточных углеводородов приходится на низкомолекулярнур часть (С11-С24 80% отн.).

Установлена закономерность влияния активирующих и икгибирующи: факторов питательной среды и условий культивирования клеток на синте; углеводородов сульфатредуцирующими бактериями: наличие доноров и акцепторов электронов в питательной среде, соотношение C:N, присутствие фосфатов, влияние таких факторов, как Eh и рН, соотношения Нг:С02 :

азовой фазе. Определена активность Формиатдегидрогеназы у ОезиН'спчЬ-10 de.su]Iипоап;.:, изучен мехам зм синтеза внеклеточных углеводороде*, помощью меченых соединений (Н14СООН, 14СНзСНОНСООН, СНэСНОЯ14С00Н, 1з14С00Н, 14СНзС00Н, МаН14С0з, а также 3ТеО и 3Тг) показано, что син-зз углеводородов сульфатредуцирующими бактериями осуществляется путем Эразования жирных кислот (формиата, ацетата) с последующим их восста-эвлением и конденсацией. В реакциях восстановления участвуют протоны эдорода воды и молекулярный водород газовой фазы. Синтез углеведоро-эв возможен только при низком (-290мВ)- (-ЗбОмВ) окислительно-восста-эвителыюм потенциале среды.

Исследован процесс- образования углеводородов в природных объектах ш, грунт, пластовая вода, керны), содержащих сульфатредупирующие зктерии. Установлены закономерности активации процессов синтеза угле-здородов в образцах, содержащих большее количество сульфатредупирую-IX бактерий и обогащенных органическим веществом, при наличии в газо-зй фазе Н2+СО0.

Практическая значимость. Результаты проведенных исследований поз-зляют по-новому оценить научные и практические проблемы. Это прежде ;его возможность современного образования углеводородов в природе и дополняемость запасов углеводородного сырья. Расширение и дополнение ¡едений о физиологии сульфагред/цирующих бактерий, о цикле углерода б шроде. Необходимость разработка рациональных методов борьбы с корро-гей металла без резкого нарушения экосистем, отрицательно влияющих на ¡знедеятельнооть сульфэ.тредуцирующих бактерий.

Способность сульфатредуцирующих бактерий продуцировать внеклеточ-:е углеводороды делает реальным осуществление микробиологического [нтеза углеводородов в условиях производства. Метод получения углево-|родов с помощью сульфатредуцирукяцих бактерий зарегистрирован в заяв-> N 4920514/14 с приоритетом от 01.02.91. На способ получения углево-родов с помощью сульфатредуцирующих бактерий получен патент КИ '27760 И от 23.07.93.

Апробация рабош. Материалы диссертации доложены и обсуждены на седаниях кафедры микробиологии МГУ (1991, 1994), на отчетных научных -нференциях ¡-ТУ (1937. 1989, 1996), на Всесоюзной конференции "Регу-ция микробного метаболизма" (Пущино, 1989), на международном семина-"Современные технологии повышения нефтеотдачи и государственная потока по рациональному использованию нефтяных ресурсов" (Казань, 94), на 8 международной конференции молодых ученых "Синтез, исследо-

вание свойств, модификация и переработка высокомолекулярных соединений" (Казань, 1996), на конференции "Автотрофные микроорганизмы" (Москва, 1996), на 8 Европейском конгрессе по биотехнологии (Вуда пешт, 1997).

Пубмисации. Основные материалы диссертации опубликованы в ?Л печатных работах, одном обзоре, патенте , а также оформлены в отчетах кафедры микробиологии КГУ, 3 статёй приняты в печать.

ОСНОВНЫЕ ЗАЩИЩАЕМЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ ДИССЕРТАЦИИ

1. Сульфатредуцирующие бактерии способны к синтезу внеклеточных углеводородов, которые не являются продуктами разрушения клеток и этот процесс является регулируемым.

2. Способностью к образованию и накоплению углеводородов в кулъ-туральной среде обладают большинство видов сульфатредуцирующих бактерий. Исключением является штамм 0ези1ГоЬас1ег роз1£а1е1, обладающий восстановительным циклом трикарбоновых кислот. ОезиН'оуПэгю <ЗезиИ'и-г1сапз штамм, который наиболее активно образует углеводороды. Способность к синтезу углеводородов определяется как ростовыми процессами клеток, так и их физиологическими особенностями.

3. Синтезируемые углеводороды ге'.'ерогенны по своему составу. Установлено, что они представлены, главным образом, алканами Сц-Со^ нормального и изостроения. В отличие от внутриклеточных углеводородов, состоящих ив высокомолекулярных соединений С25-С35 (70-80% отн.), максимальное количество внеклеточных углеводородов содержит более низкомолекулярные алканы Сц-С24 (80£-отн.

4. Синтез углеводородов возможен в различных анаэробных зонах биосферы, поскольку осуществляется сульфатредуцирующими бактериями в условиях гетеротрофного, литогетеротрофного, автотрофного роста. Однако в присутствии органических соединений процесс образования внеклеточных углеводородов происходит более интенсивно.

5. Синтез углеводородов и их количество зависит от определенных физико-химических условий окружающей среды, основными из которых являются низкий окислительно-восстановительный потенциал среды при значениях рН близких к нейтрапьным, а также присутствие в газовой фазе Н2+СО0, Наиболее значимым активирующим фактором синтеза углеводородов является отсутствие конкурирующих с СОг акцепторов электронов, особенно сульфатов, являющихся наиболее активными конечными акцепторами электронов. Синтезу углеводородов способствует присутствие в среде

оиологически активного водорода (Н+), фосфатов, органических форм азота в определенных концентрациях.

о. Сульфатредуцирувщие бактерии в гетеротрофных условиях роста осуществляют синтез углеводородов путем образования лирных кислот, наиболее активными из которых являются формиаг и ацетат, и дальнейшим их восстановлением и конденсацией в углеводороды. В метаболизм синтеза углеводородов сульфатредуцирующие бактерии способны вовлекать и другие жирные кислоты, не являющиеся субстратами для их роста. В реакциях восстановления участвует как газообразный водород, так и водород воды.

7. Синтез и накопление углеводородов сульфатредуцирующими бактериями происходит и в природных оЗъектах, что свидетельствует о современном образовании углеводородов в природе и роли, изучаемых бактерий в этом процессе.

Структура и объем работай. Диссертация изложена на 271 странице машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, из 4 глав собственных результатов, обсуждении полученных данных и выводоз. Текст иллюстрирован 50 рисунками и 89 таблицами. Список литературы содержит 305 наименований, в том числе на английском языке.

СОДЕРЖАНИЕ Р Л В О Т М Обзор литературы Глава 1. Углеводороды бактрий

Прозеден анализ литературы по способности бактерий, принадлежащих к различным физиологическим группам, к синтезу углеводородов. Представлена сравнительная характеристика углеводородов, синтезируемых бактериями и другими микроорганизмами. Рассмотрены известные и предполагаемые этапы механизма синтеза углеводородов. Указаны имеющиеся данные по локализации углеводородов в клетках бактерий и возможные пути транспорта этих соединений. Обсулдаются работы, которые являлись предпосылкой для изучения способности сульфатредуцирующих бактерий к синтезу внеклеточных углеводородов.

Глава 2. Физиологии и биотшя сульфатродуцируюи^их бактерий Рассмотрены основные вопросы физиологии и метаболизма сульфатредуцирующих бактерии по окислению лактата, пирувата, ацетата; представлены работы по способности сульфатредуцирующих бактерий использовать в своем метаболизме водород, формиат, а также фиксировать двуокись углерода. Указаны возможные конечные акцепторы электронов. Рассмотрены

- b

процессы брожения, вызываемые сульфагредуцирумцнми бактериями. Особо< внимание обращено на анализ работ посвященных De.-sulfovibrio clesulfuri-caris, как штамма наиболее широко распространенного в природе и нефтяных месторождениях.

Глава 3. Объекты и методы исследований

Объекты исследований. В работе использовали 11 штаммов сульфатре-дуцирующих бактерий, полученных из Российской коллекции микроорганизмов (г. Пущино) и штаммы бактерий, выделенных из природных объектов ил, грунт, керн, пластовая вода (БИ, БГ, БК, БП - кафедра микробиологии КГУ).

Культивирование бактерий. Основные эксперименты, представленные ] работе, были проведены на среде Постгейта Д (Postdate, 1984), где пи-руЕат был заменен на лактат (3,5 г/л), содержание сульфатов составлял* 0,5 г/л ("модифицированная среда Постгейта Д"). Газовая фаза -Н2+С02=90Х+10%.

Газовые смеси. Двуокись углерода и аргон исспользоваяи из баллонов. Молекулярный водород получали с помощью генератора водорода тип; СГС-2. Анализ концентрации и чистоты газов осуществляли на "Газохром- 3101".

Определение роста бактерий. О способности сульфатредуцирующи: бактерий расти в условиях эксперимента судили по приросту биомассы определяемой по белку (Горина, Яковлева, 1980) и образован™ сероводорода (Лурье, Рыбников, 1866; Widdel, 1980).

Получение экстрактов клеток бактэрий. При изучении внутриклеточных углеводородов и определении активности формиатдегидрогеназы клетга сульфатредуцирующих бактерий, полученные центрифугированием и отмытьн фосфатным буфером, разрушали с помощью ультразвукового диспергатор; УЗДН-2Т, затем центрифугировали. В опытах использовали супернатантну; фракцию.

Определение углеводородов. Анализ углеводородов проводили газо-хроматографическим и масс-спектрометрическим методами, используя приборы "Chrom-5" (ЧССР) и "Hitachi -80М" (Япония).

Продуктивность сульфатредуцирующих бактерий рассчитывали по количеству углеводородов, синтезируемых на 1 мг белка.

Определение кислородсодержащих продуктов. Анализ кислот и спирто: проводили методом газожидкостной хроматографии на "Chrorn-5" и методо! тонкослойной хроматографии на пластинках "Slluf'ol UV-25" (Avaalier Chechoslovakia).

Определение включения 1'1С и 'll в биомассу бшаперий и щюдуюш м/знсдеятелыюсгяи клеток. Содержание метки в биомассе, углеводородах и кислородсодержащих продуктах определяли на приборе "Delta-300", а в OOg на - "Intertechnigue 3L-30" по общепринятым методам. Эффективность счета составляла 80-90%.

Определение лантала и пиру вата. Концентрацию лактата и пирувата устанавливали с помощью ферментативного действия на эти субстраты -лактатдегидрогеназы (Асатиани, 1369).

Определение активности фор>лиал[дегидрогепззи. Формиатдегидрогеназ-нуга .активность определяли спектрофотометрически на "Specord - М40". За единицу активности фермента принимали восстановление 1 мкМ метилви-ологена в 1 мин 1 мг белка (Andreesen, Ljundahl, 1974).

Характерно,тика биореаюю^а, используемого для моделирования экспериментов. Биореактор имел объем 2,5 л. Его конструкция позволяла регистрировать значения рН и Eh питательной среды, создавать условия протока газовой смеси и питательной среды, производить отбор проб в течение эксперимента.

Матештгическая обрабопиы результатов исследований. Полученные экспериментальные данные обрабатывали согласно общепринятым методам (Птахинский, 1978).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Глава 4 Cnoco6nocmj сульфатгрсдуцирутцих бактерий продуцировать внеклеточные углеводороды

4.1 Способность Desulfovibrio desulfuricans к синтезу внеклеточных углеводородов в условиях гетеротрофного роста

Для решения данного вопроса были использованы два штамма сульфат-редуцирующих бактерий (Desulfoviorio desulfuricans ВКМ 1388 и Desulfovibrio desulfuricans ВКМ 1799), наиболее широко распространенные в природе и постоянно обнаруживаемое в нефтяных месторождениях.

Изучая метаболизм этих бактерий в различных условиях культивирования, обнаружили, что средл внеклеточных продуктов метаболизма этих штаммов, в основном состоящих из кислородсодержащих соединений (кислот и спиртов), в питательней среде присутствуют углеводороды.

Поскольку наиболее значимые результаты по образованию и накоплению углеводородов в культуральнол жидкости были получены на модифицированной среде Постгейта Д, результаты данного эксперимента на примере Desulfovibrio desulfuricans ВКМ 1799 представлены на рис.1.

3> ñ

а Ё t

cj Щ

' g 1

10 5 I

§ ï3 S |¡l

* В §

HI

* S, 5

0 Й gE ïè 2.

За о Ut. n>

Cl

1 sa îf

о, a 8 с Щ h-о fi ч

- Ьа

п

S"

I

£ Ь—i

S» to

I

I

о

ï

За

б о .Q s

ft

5 s

tal $

О

I_1_I_I_L

IO

ui

№

О

-J

Ul

О О

-1—1 ■ I 1 I I i i i i I i i i I t КСмг/л*Ю

M

о

I.J

о

I I I I I I I I .J. I I I I I I I i I I I УВ кр/Л

мыАслт^тюо — fo ú

t i I i I i I i I рост

мг flenxa/n lq

H^ мг/л

Ul

о о

o L" о

Iiiiii_1 I I_I_I.I.J_I_1_1_J_I_I__1_I KC) 1£г/л*10

U

о

о

ООО

L_i_i_i_i__1_i_i_t_i_I_i i i_l-J_I—i—l I J УБ мг/л

_*r*T*r'"^r*r*~"_'r*î0r0t0t0tJt0

o-^MÔjVcjibî^jbaioo^Fobiïvbi

I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I РОСТ

иг бплка/п, IQ

i

rt 0 P> v

25

50

75

100

о !_i_____i . i_i_I__i i i_i_I_i_i__j_!_I_i_I_I_i_I

H2S 5 мг/л

у -

Результаты исследований покрали, что по мере нарастания биомассы, происходит увеличение количестг.а пн^кяиточных продуктов, что отмечалось и в опытах при росте штаммов на среде Постгейта В. Основные изменения в этом процессе связаны с образованием углеводородов. На среде Постгейта В в атмосфере аргона и> количество в период стационарной Фазы роста штаммов было незначительно выше значений, определяемых в питательной среде до начала опыта за счет внесения дрожжевого экстракта и посевного материала (1,5-2,0 mi/л), в атмосфере Н2+СО2 количество углеводородов составляет 5,5-6,5 мг/л. При росте штаммов на модифицированной среде Постгейта Д образование углеводородов повышалось в 3,0 раза и составляло в атмосфере аргона 6,0-8,0 мг/л, а в атмосфере Н2+СО2 - 15-15 мг/л.

Таким образом, установлено, что сульфатредуцирующие бактерии D.desulfuricans ВКМ 1388 и D.desu11игicans ВКМ 1799 при росте на средах с лактатом в атмосфере Н2+СО0, способны синтезировать внеклеточные углеводороды.

4.Z Сравнительная xapaianepucnmœ спектров внутри и внегслеточних углеводородов Desulfovibrio desulfuricans

Сравнительное изучение параметров внутри и внеклеточных углеводородов, синтезируемых D.desulfuricans ВКМ 1338 и D.desulfuricans ВКМ 1799, показало, что углеводороды, вьщелрнные из меток и культураньной жидкости этих бактерий, выросших в атмосфере аргона или Н2+С02, представлены в основном алканами Сц-Сз-.

Однако основная доля внутриклеточных н-алканов приходится на высокомолекулярную часть О95-С35 (-70-80% отн.), что соответствует результатам, полученным в работе Девиса (Davis, 1958). Количество изомеров и изопреноидов невелико. Коэффициент нечетности близок к 1,0, что согласуется с данными литературы.

Внеклеточные углеводороды характеризуются более низкомолекулярными алканами Ci1-C18 (~80% отн.), количество которых возрастает в 2,0-3,0 раза в атмосфере Н2+СО2 (табл. Г).

Таким образом, сравнительная характеристика внутри и внеклеточных углеводородов Desulfovibrio desulfuricans показала, что обнаруживаемые нами в различных экспериментах внеклеточные углеводороды не являются результатом лизиса клеток, так как углеводороды С25 ~ С35, характерные для клеток Desulfovibrio desulfuricans, присутствуют в них в следовых количествах.

Таблица 1

Характеристика спекторов внутри и внеклеточных углеводородов, выделенных из клеток ОеэиНо'ЛЬг^о с1ези1Гиг1сапз БКМ 1799 и культуральной жидкости, на период начала стационарной фазы роста (34 часа)

1 | Локализация 1 Газовая| Количество углеводородов, % отн. 1 1

1 С11-С18 1 С19-С24 1 1 С25-С35 1 £ Ссо2+н2/Саг | 1 ) £ С норм £ С изо 1 £ Снеч/Счет| 1

! внутриклет. ! углеводор. аргон | Н2+СО2 | 8,8±1,5 | 8,5±2,4 | 10,412,8 18,712,0 1 1 80,8±4,2| | 1 1,5 ± 0,5 | 72,8±3,0| | 82,0±3,4 84,011,5 18,0±3,0 16,013,0 1,08±0,08 1 I 1,1010,01 | 1

| внеклеточ. | углеводор. 1 аргон | Ни+СОг 1 ...... ! 45,3±3,0| 52,4±3,3| 40,9±2,6 44,212,8 1 1 13,8±2,4| | | 2,5 ± 0,5 | 3,412,0! 1 | 1 88,0±3,2 86,0±2,5 12,0±1,8 14,0±2,0 1 1,03+0,02 | 1 1,04+0,03 | 1

4.3 Способность других представителей сульфатредуцирующих 6;штс-miü ic сиптспу внеклеточных углеводородов в условиях ¿.'оке1Х>трпф1;о;ю жст/i

Исследование девяти штаммов сульфатредуцирующих бактерий, различных по морфологии и физиологии, показало, что способностью к синтезу внеклеточных углеводородов обладают и другие представители этой группы Зактерий (табл.2). Исключением является Desulfobacter postgatei проду-дирующий всего 0,03 мкг алканов на 1мг белка, поскольку этот штамм 1меет особый метаболический тип окисления ацетата в обращенном цикле грикарбонсвых кислот (ЦТК) (Thauer et.al., 1989). Среди других штаммов сульфатредуцирующих бактерий большее количество углеводородов продуди-ковали Desulfovibrio desulfuricans ВНМ 1799, Desulfomlcrobium bacula-:us BKM 1378, Desulf otomaculiirn nigrificans В KM 1492, общим свойством которых является окисление лактата до ацетата и С02-

Анализ зависимости количества образуемой биомассы сульфатредуци-зуюпц-ши бактериями и синтезируемых ими внеклеточных углеводородов по-сазал, что прямой корреляции между этими показателями не наблюдается. Гак при активном росте и накоплении биомассы Desulfobacter postgatei синтезирует следовые количества углеводородов, а Desulfovibrio iJosui-"uricans при таком »? количестве биомассы синтезирует наибольшее их соличество по сравнению с другими изученными нами видами. Однако в це-юм, по результата изучения девяти штаммов, снижение прироста биомассы приводит к уменьшению конценрации углеводородов, накапливаемых в ■ультурачьной жидкости.

Несмотря на разнообразие видового состава сульфатредуцирующих »актерий, спектры углеводородов имели большое сходство и характеризо-;ались длиной цепи СЦ-С24» с преобладанием нормальных алканов Сц-Саа ,85-91%). Количество изоформ составило 9-15% для различных представи-■елей.

Таким образом, полученные нами результаты показывают, что коли-;ество синтезируемых сульфатредуцирующими бактериями углеводородов оп-юделяется количеством продуцируемого юли белка, т.е. связано с росто-■ыми параметрами, а также зависят от типа метаболизма.

4.4 Способность сульфатредуцирующих бактерий к синтезу впеклегпоч-ых углеводородов в условиях липогстеротрофпого роста

Известно, что ряд штаммов Desulfovibrio desulfuricans способны к осту в литогетеротрофных условиях (Сорокин,1966; Brandis, Thauer, 981), поэтому представляло интерес изучить способность D.desulfuri-

Таблица 2

Показатели роста культур и синтеза внеклеточных на период стационарной фазы

углеводородов,продуцируемых

1 1 1 1 I | Белок ......... " — Количество ! Продуктив- | 1 Углеводо- |

Вид Микроорганизмов | и | мг/л углеводо- ность МКГ 1 роды % от |

! 1 родов , мг/л УВ/мг белка| белка, |

! 1 0ези1Гоу1Ьг1о 1 1

с1е5и1Гиг1сапБ ВКМ 1799 | 0,13 | 170,511,9 18,910,8 0,11 | 11,0910,34 |

1 2 0езиИоу1Ьг1о 1

е^аэ ВКМ 1382 | ' 0,08 | 150,012,0 11,210,7 0,07 | 7,47+0,36 |

1 з 0ези1Гоу1Ьг1о 1

уи1даг15 Б КМ 1670 | 0,06 | 145,011,8 9,910,9 0,07 | 6,83Ю,63 |

1 4 0ези1Го1отаеи1ит 1

п1дг1Г1сапз ВКМ 1492 | 0,08 | 138,2±1,6 14,9Ю,6 0,11 | 10,7810,31 |

1 5 0ези1Го1отаси]ит 1

кигпе1зоуЦ ВКМ 1805 | 0,06 | 138,0±1,8 9,5Ю,6 0,07 | 6,8810,34 |

1 6 ОеэиКоЬасЬегшт 1

тасезШ ВКМ 1593 1 0,07 | 140,011,9 9,8Ю,8 0,07 | 7,00Ю,4 7 |

1 7 ОезиНопйсгоМит 1

Ьаси1а1из ВКМ 1378. I 0,08 | 150,012,0 16,210,9 0,11 1 10,80+0,45 |

1 8 ТЬето<Зе5и1ГоЬас1е- 1 |

г1иш шоЫ1е ВКМ 1128 | 0,06 ! 150,212,0 9,610,7 0,06 1 6,3910,38 |

1 9 Dssulfobact.Gr 1 1 ! ! 1

pOSt.y3.tOi ВКМ л п л о 1 I о л гт и, 10 | 176,012,5 * о-»-п с: '1, о^о, 0 о.оз | О ГЧОАП " О 1 С , (О-ЧЛ 1С |

I

cans EKM looo и D. desul f urican;; BKjM 1793 к росту и накоплению внеклеточных углеводородов Е этих условиях.

Исследования показали, что прирост биомассы по белку укаганних штаммов на питательных средах в отсутстЕки лактата был в 1,2-1,5 раз слабее по сравнению о ростом этих бактерий в гетеротрофных условиях, однако в культуралыюй жидкости также были обнаружены углеводороды, концентрация которых составляла 3,8-5,0 мг/л для штаммов на среде Постгейта В и 6,6-8,5 мг/л - на модифицированной среде Постгейта Д в отсутствии лакгата. Газовэя фаза содержала Н9+С09=95%+5%.

По сравнению с гетеротрофным условиями роста бактерий в качественном составе углеводородов отмечались небольшие изменения в концентрации отдельных фракций углеводеродов и уменьшение игоформ алканов. На спектрах также не было отмечено преимущества отдельных углеводородов. Иеопреноиды не обнаружены. Коэффициент нечетности близок к 1.

Мэос-спектрометрический анализ подтвердил однотипность спектров углеводородов, синтезируемых Desulfovibrio desulfuricans ВКМ 1288 и Desulfovibrio desulfuricans ВШ 1799 в условия:-: гетеротрофного и лито-гетеротрефного роста.

4.5 Способность сульфашредуцирукчиимх башперий к синтезу внеклеточных углеводородов в условиях автотрофного роста

Среди известных видов сульфатредуцируюш:-: бактерий тлеется лишь небольшая часть штаммов, способных к росту в автотрофных условиях (Розанова, Нагина,1989; Fauque et.al.,1991). К последним относятся штаммы Desuliotomaculuro orientls и Desulfotomaculum kuznetsovii (Klemps et.al., 1985; Назина и др., 1983).

Проведенные нами исследования показали, что указанные бактерии в условиях автотрофного роста синтезировали внеклеточные углеводороды, максимальное накопление которых (7,2-8,1 мг/л) наблюдалось в период начала стационарной фазы роста (50-66 час) и далее сохранялось на одном уровне. Поздний еыход штаммов на стационарную фазу роста можно объяснить длительностью lag-периода в автотрофных условиях, что соответствует данным литературы (Klemps et.al.,1985).

Углеводороды, синтезируемые Dtm.orientis БКМ 1628 u Dtm.kuznetsovii ВКМ 1805 по количеству и характеристике близки к спектрам углеводородов, синтезируемых D.desulfuricans в условиях литогетеротрофного роста, что было подтверждено маоо-спектрометрическим анализом.

Таким образом, исследуемые нами сульфатредуцируюшие бактерии при росте в гетеротрофных, хемолктогетеротрофных (Desulfovibrio desulfuri-

cans) и автотрофных условиях (Desulfctomaculum or lentis, Desulfotoma-culiim kuznetsovii) способны синтезировать внеклеточные углеводороды.

Глава 5 Влияние различных фаюааров на рост и образование внеклеточных углеводородов сульфгипредуцирунщими бактериями

5.1 Влияние различных источиикоь углерода и энергии на рост и образование углеводородов Desulfovibrio desulfricans BUM 1799

Основными источниками углерода и энергии для роста Desulfovibrio desulfuricans являются 3-х и 4-х углеродные органические кислоты, такие как: лактат, пируват, а также спирт - этанол (Gibson, 1990).

Исследование влияния этих соединений на синтез внеклеточных углеводородов D.desulfuricans ВКМ 1799 показало, что большее количество углеводородов синтезируется сульфатредуцирующими бактериями на лактат-содержащих средах. Замена лактата на пируват или этанол приводит к незначительному снижению продуктивности углеводородов бактериями. Следует отметить, что, если увеличение концентрации лактата в питательной среде не оказывало существенного влияния на характеристику качественного состава углеводородов, то замена его на пируват приводила к увеличению содержания углеводородов с длиной цепи Cig-C24. в основном, за счет Ci9~C22 алканов, а также к увеличению количества изоформ в спектрах. Состав углеводородов, полученных при росте D.desulfuricans ВКМ 1799 на этаноле значительно ближе к спектру углеводородов, синтезируемых штаммом при росте на среде с лактатом. Однако в данном варианте опытов в составе углеводородов обнаруживается большее количество изоформ.

Ь.2 Влияние иеорганичестх акцепторов электронов на рост и образование углеводородов Desulfovibrio desulfuricans

Среди неорганических акцепторов электронов в природе наиболее распространены сульфаты, нитраты и карбонаты.

Влияние сульфатов на рост и образование углеводородов Desulfovibrio desulfuricans ВКМ 1739

Окисление органического вещества при сопряженном восстановлении сульфатов до сероводорода является естественным физиологическим процессом сульфатредуцирующих бактерий.

Присутствие сульфатов в питательной среде способствовало активному росту D.desulfuricans ВКМ 1799 и образованию сероводорода, однако, количество синтезированных бактериями углеводородов невелико и составляет на среде с FeS04 - 6,0±0,4 мг/л, а при внесении MgS04 - 5,9±0,2 мг/л. Это объясняется, вероятно, тем, что в присутствии сульфатов по-

ток электронов распределяется между процесса«! восстановления сульфата железа пли сульфата магния о восстановлением С0->, находящимся в газовой фазе.

Таким образом, процесс восстановления сульфатов у оульфатредуци-руклцих бактерий является конкурирующим процессу образования углеводородов.

Влияние нитратов на рост и образование углеводородов Desulfovib-rio desulfuricans ВКМ 1799

Нитраты рассматриваются б литературе как альтернативные акцепторы электронов для некоторых видов сульфатредуцируюцих бактерий (Keith, Herbert, 1383; Mo Cready et.al..1983).

Проведенные нами исследования показали, что Desulfovibrio desulfuri cans ВКМ 1799 в присутствии нитратов в атмосфере Н2+СО2 растет хуже, чем на средах с сульфатами. Прирост биомассы по белку на 66 часов составляет 65,4*1,2 мг/л. Параллельно с ростом бактерий происходит понижение концентрации нитратов, что свидетельствует об использовании их Desulfovibrio desulfuricans ВКМ 1799 как для ростовых процессов, так и для осуществления нитратного дыхания, что соответствует данным литературы (Золотухина, 1-;85).

Количество внеклеточных углеводородов несколько больше (8,5*0,3 мг/л), чем на средах, содержаще: сульфаты, что, поводимому, объясняется более продуктивной утилизацией энергии бактериями.

Таюм образом, нитраты ингибируют рост Desulfovibrio desulfurians ВКМ 1799, но они являются мене^ эффективными акцепторами электронов, чем сульфаты, что позволяет клеркам увеличить синтез углеводородов.

Влияние карбонатов на рост и образование углеводородов Desulfovibrio desulfuricans ВКМ 1799

Исследования по влиянию карбонатов на рост D.desulfuricans ВКМ 1799 и образование углеводородов показали, что количество белка на 66 час роста бактерий в присутствии МагСОз в 1,2 раза выше, чем в присутствии НаНСОз и составляет 85,0±1,3 мг/л. По мере роста бактерий количество карбонатов в питательных средах уменьшается, а синтез углеводородов резко возрастает и достигает 22,8±1,2 мг/л при использовании На<2С0з и 19,6*0,9 мг/л - при внесении в питательную среду N3HCO3.

Таким образом, исследования показали, что каждый из изучаемых нами неорганических акцепторов электронов обладает специфическим действием на рост и образование внеклеточных углеводородов Desulfovibrio desulfuricans в условиях культивирования на органическом субстрате в

■ lti -

атмосфере H2+CO2.

Спектры углеводородов D.desulfuricans BKM 1799 в присутствии различных акцепторов электронов изменяются незначительно. Это преимущественно н-алканы. Присутствие сульфатов, в питательной среде способствует более интенсивному синтезу углеводородов с длиной цепи С19-С24. а нитратов или карбонатов с длиной цепи Сц-Схв- Коэффициент нечетности близок 1,0.

5.3 Влияние физика-химических факторов на рост и образование углеводородов сульфатредуцирующиш бактериями

5.3.1 Влияние рИ среды на рост и образование углеводородов Desul-fovibrio desulfurJeans BKM 1799

Поддержание определенного уровня pH во время роста бактерий важно прежде всего для микроорганизмов, продуцирующих кислоты, к которым относятся сульфатредуцирующие бактерии (Postdate, 1984).

Проведенные нами исследования показали, что культура Desulfovib-rio desulfuricans BKM 1799 растет ь широком интервале рН 5,5-9,0 (рис.2). Оптимальный рост штамма наблюдается при рН 7,0, что соответствует результатам, полученным ранее (Postgate, 1984; Widdel, Pfennig, 1984). Начальные значения рН,влияя на рост бактерий, изменяют и содержание внеклеточных продуктов метаболизма. Максимальное накопление кислородсодержащих продуктов и углеводородов в питательных средах нгйлю-дается при рН 7,0. При этом значении рН алканы имеют более разнообразный состав в связи с наличием в спектрах изоформ углеводородов.

Таким образом, наиболее оптимальным начальным значением рН среды для роста Desulf'ovibrio desulfuricans BKM 1799 и образования углеводородов в культуральной жидкости является рН 7,0.

5.3.2 Влияние окислитсльно-восспановшпелыюго потенциала среда на рост и образование углеводородов Desulfovihrio desulfuricans BKM 1799

Распространение сульфатредуцирующих бактерий и их метаболизм в значительной степени определяются Eh питательной среды (Mahmand et.al.,1979; Вайнштейн и др.,1985).

Исследования по изучению роста С.desulfuricans BKM 1799 и их способности к синтезу углеводородов при различных начальных значениях Eh питательной среды показали, что штамь: растет в широком диапазоне Eh от -100 до -400 мВ (рис.8). Наиболее интенсивный рост D.desulfuricans BKM 1799 наблюдается при Eh среды -290 мВ. Увеличение потенциала среды до -190 мВ и выше приводит к постепенному уменьшению прироста биомассы, однако, даже при Eh -100 мВ его значения были достаточно велики и сос-

о *

к

ä

и к

к

и а

я

в

8 3

О V

а. о

100-1 40 —I -1 Ej _ 2.4 -

2.2 -

2.0 -

1.8 -

1.6 -

1.4 -

1.2 -1.0

50 -

20-

1 1 I I | f i l I I !

5.0 6.0 7.0

• i ' 1 ' " I 8.0 9.0

3 pH

Piic. 2 Влияние pH питательной среды на рост, образование углеводородов и кисло1юдсодержаи!ш< продуктов Desulfovibrio desult'uricans MM 1799; 1 - биомасса, мг белка/л,lg, 2 - углеводороды, ыг/л 3 -кислородсодер.хл/цие продукты, мг/л о „

и 5

и £

к >

100-л 40-, -л

- - 2.4 -

- - 2.2 -

2.0 -

50- 20- 1.6 -

- - 1.6 -

- - 1.4 -

1.2 -

0- 0- 1.0 -

-400

I 11 Ii I |!I i i | i i I : I -250 -200 -150 -100

Ел

Рис. 3 Влияние ЕЛ питап-елыюй среди на рост, образование углеводородов и кислородсодержащих продуктов ОсБи1ГоуИ>Г10 (1е^1Гиг1сапз ВКМ 1799; 1 - биомасса, мг белка/л,1с, 2 - углеводороды, яг/л 3 -кислородсодержащие продукты, иг/л

о

Jí'j -

тавлялн iav,t.<íj,u мг-'л. В гi'iих условиях наблюдалось максйчач!.нсч oop.-j оопани'.' кисло; »>дс.одерл.чцих продуктов. Наиболее актитчя ос >;::•?••!•» • •op.-t совании углеводородов расположена ь интервалу En среды (. ; i i ¿Un мВ. Изменение значений h'h среды вьпае -290 мВ приводило к ¡>.>::кему они жению синтеза углеводородов, что объясняется, по-видимому, активмзаци-ей окислительных процессов. При Eh питательной среды (-100) мВ синте; углеводородов прекращается.

Синтезируемые Desulfovibrio desulfuricans ВКМ 1799 углсЕОДородь по мере понижения окислительно-восстановительного потенциала среды характеризовались увеличением количества алканов с более короткой длиной цепи (Сц-Cis). а также небольшим увеличением количества изоформ. Изменение начальных значений Eh среды не оказывало существенного влияли? на коэффициент нечетности углеводородов.

Таким образом результаты исследований показали, что наиболее благоприятными условиями для роста и синтеза углеводородов DKSUliovjbric desulfuricans ВКМ 1799 является Eh питательной среды в интервале (-290)-(-360) мВ.

S.3.Л Влияние соотношения Но : СО? в газовой фазе на ¡юсгл и oófxt-вование углеводородов Ücsulfovibrio desulfuricans ВКМ 179У

Окислительно-восстановительные условия питательной среди завися! не в малой степени от введения в опытные флаконы смеси га./л; ; СОо), поэтому в первой серии опытов изучали изменения в состав*.- газовой фазы в процессе роста Desulfvibrio desulfuricans ВКМ 1799.

Результаты исследований показали, что рост бактерий и накоплена внеклеточных продуктов метаболизм;: в атмосфере H2:C0¿ сопрог-овдается потреблением как водорода, так и углекислого газа (рис. 4). Однакс влияние молекулярного водорода и СОг на образование углеводородо! сульфатредуцирующими бактериями различно. Если газовая фаза содержал; только 5% CÜ2, количество углеводородов было в 1,6 раза меньше не сравнению с углеводородами, синтезируемыми бактериями в атмосфере Н2+СО2. Введение в газовую фазу только 95% молекулярного водорода не оказывало заметного влияния на синтез углеводородов по сравнению с т количеством, синтезируемым D.desulfuricans ВКМ 1799 в атмосфере аргон;

Дальнейшее изучение влияния соотношения Но и СОг в газовой Фаз.-на процесс образования углеводородов Desulfovibrio desulfuricans BKf. 1799 показало, что наибольшее количество алканов синтезируется сульфатредуцирующими бактериями при концентрации водорода - 90% и СО2 -10% (соотношение Нг:С02= 9:1), когда высокая концентрация молекулярно-

-а с учетом газов образующихся на лактате в атмосиер^ Аг Рис. 4 Изменения в соста,зе газовой фазы в процесса роста и образования внеклеточних прод.паюв 1)С5и1 Гоу!Ьгш (¡ехи1Гшчаик; ВКМ 1799 и,1 среде с ла/даллюм в атюсфере Но/СОо (19:1): 1 - биомасса, мг белка /л. 1ц, 2 - текпеточпне продукта, м;:/л, 3 - поннащюния II ,2 4 - концентрация СО.., X

го водорода в газовой фазе способствует созданию низкого потенциала гппательной среды, с-.г^гс.приятнсго для роста бактерий и для синтеза клетками восстановленных продуктов, к которым относятся углеводороды. Увеличение концентрации СОо в газовой фазе выше '¿5% с соответствующим уменьшением концентрации Не усиливает синтез кислородсодержащих продуктов .

Таким образом, изменение состава газовой смеси (Нг:СОо) позволяет регулировать процесс образования ВеБиИоуИзгю сЗеБиН'игхсапБ ВКМ 1799 более окисленных (органические кислоты, спирты), либо восстановленных продуктов метаболизма (углеводороды).

5.4 Вттше других факторов на рост и образование углеводородов Пеки 1 Гоу ¡Ьг10 (1еяи1 Гиг / саля ВШ 1799

5.4.1 Влияние оргшгмеского азота, на рост и образование углеводо-родоп ОехиКоу^Ьг^о ВКМ 1799

Известно, что на еьерхпродукцию липидов бактериальных культур, а таклее микроводорослей, дрожжей, плесневых грибов, оказывает влияние соотошения углерода и азота, где предпочтительным является значение = 50:1 (Кегапка, 1991). Для синтеза метана это отношение соответс-

т.»-...^/-1 ^ \ . л /Пл.«.»,,.^^^ ^ поо \

1лугг1 и1"10;. : (исшцллг.с!, хзоэу.

Исследования, проведенные с заменой неорганического а;.отл (NH.i»:i • на органический (казеин) в среде для роста n.rtf-sult'ui icans t<KM ivw при изменении его концентрации (1-5 г/л), показали, что наибольшее накопление биомассы и количества углеводородов наблюдалось при концент рации казеина 5г/л, что соответствует весовому соотношению углерода я азота как 2:1.

Ь.4.2 Влияние фосфатов па рост и обргкювгшис углеводородов суль-фатредуиирушицми бактериями

Физиологическая роль фосфатов у микроорганизмов проявляется в ряде важных биохимических процессов, преимущественно связанных с получе нием энергии (Wood, 1987).

Результаты исследований показали, что увеличение в питательной среде концентрации фосфата в виде КН2РО4 приводит к активации ростовых процессов в клетках Desulfovibrio desulfuricais ВКМ 1799, что соответствует результатам, полученным pai-iee (Postgate, 1984), а также к небольшому увеличению синтеза углеводородов.

В присутствии К2НРО4 в различных концентрациях D.desulfurican." ВКМ 1799 растет слабее, однако, количество синтезируемых бактериями углеводородов на 1 мг белка в 1,3-1,5 раз больше, чем в опытах с КН2РО4.

• >. 4.3 Синто:! углеподородов Desiulfovibrio ucsaHuricans ВАМ 1799 при bbtpaiuusanuu бактерий в лабораторном биореашюрс

С целью увеличения выхода целевого продукта и моделирования образования углеводородов Desulfovibrio Cesulfuricans ВКМ 1799 нами был сконструирован биореактор, объемом 2,5 л, в котором в течение 7 дней при 37ис культивировали бактерии. Газовая фаза Н2+СО2 = 9:1. Соотношение объема питательной среды к объему газа соответствует 1:2.

Исследования показали, что в процессе роста D. desulf'uricans ВКМ 1799 происходит активное потребление газовой смеси (150-200 мл в сутки), новой порцией которого ежедневко дополняли реактор. В результате проведенного анализа было показанс, что количество углеводородов к концу опыта составило 85,2±2,4 мг/л.

Синтезируемые штаммом углеводороды определялись, в основном,в области Сц-С24- По мере роста клеток отмечалось увеличение во времени как нормальных, так и изоформ углеводородов с длиной цепи Cig-C24-

Таким образом, увеличение объема питательной среды и, особенно, объема газовой фазы способствует увеличению количества углеводородов, синтезируемых сульфатредуцирующими бактериями.

Г).4.4 Моделирование образования углеиодо{юдов Desulf'ovibrio de-su Ifиг icans BUM 1790 при росте пульту pu it биореашмцю

Математическое моделирование проц-ссог.. осу^ствляемых сульфатре-дупирующими бактериями, сосредоточено, в основном, на моделировании скорости сульфатредукции и роста бактериальных клеток (Okabe, Charack-iis, 1091; Okabe et.al.,1992; Okabe, 1994). Изучены потребности D. desulfuricans (шт.1359) в лактате и сульфате в процессе периодического и хемостатного культивирования в биореакторах (Непага et.al., 1991).

Нами проведено изучение механизма взаимосвязи показателей рН и Eh среды в процессе роста Desulf'ovibrio desulfuricans BKM 1799 и их значимой роли в синтезе углеводородов, а также возможности вовлечения в синтез углеводородов дополнительно внесенной жирной кислоты.

В опытах была использована олеиновая кислота, которая не является субстратом для роста D.desulfuricans (Розанова, Назина, 1989). Однако добавление этой кислоты в модифицированную среду Постгейта Д, где росли сульфатредуцирующие бактерии, в атмосфере Нг+ОО^ увеличивало синтез углеводородов в 5 раз, в основвом, за счет синтеза алканов с длиной ниш С19-О04. Количественное преимущество нормальных углеводородов оставалось без изменений.

Гаккм образом, приведенные результаты подтверждают возможность мклелироиания синтеза углеводородов Uesult'ovibno desulfш leans BKM

в процессе роста штамма в Сиореакторе.

Глава б Механизм синтеза внеклеточных углеводородов Desulfovibrio desulfuricans BKM 1799

Одним из глазных вопросов образования углеводородов микроорганизмами является выяснение механизма синтеза этих соединений. Для суль-фатредуцирующих бактерий он связан с их геохимической деятельностью и возможностью применения в биотехнологии.

С целью изучения механизма синтеза внеклеточных углеводородов использовали меченые соединения, которые вводили в питательную среду в фазу экспоненциального роста сульфатредуцирующих бактерий (18-20 часов с момента посева штамма), растущих в гетеротрофных или литогетеротроф-них условиях.

6.1 Участие лактата в миишзе углеводородов Desulf'ovibrio desulfuricans BliM 1799

Результаты исследований участия лактата меченого по первому, либо по третьему углеродному атому на синтез углеводородов D. desulfuricans

ВКМ 1799 пбказали, что лактат активно попользуется сульфатреду цирущи-ми бактериями. Количество потребленного 14С значительно больше при внесении меченого лактата в питательную с-р^ду бактерий, растущих в ли-тогетеротрофных условиях. Это объясняется, тем, что рост 0. с)езиН'иг1-сапэ ВКМ 1799 в гетеротрофных условиях является предпочтительным и добавление меченого лактата в среду культивирования штамма приводит к активному вовлечению его в метаболизм бактерий.

Основная доля потребленного меченого лактата (82-987») обнаруживается в биомассе 0.с1ези1Гиг1сап5 ВКМ 1799 независимо от условий культивирования штамма. Остальная часть (2-18%) 14С лактата используется клетками на синтез углеводородов. При гетеротрофном росте 0.с1е5и1Гиг1-сапб ВКМ 1799 меченый углерод лактата обнаруживается в углеводородах е 1,2-1,8 раз. больше, чем при литогетеротрофком росте штамма, что связано с более активным синтезом углеводородов в этих условиях.

Меченый углерод обнаруживается в углеводородах, как из метилыгай, так и карбоксильной групп лактата. Количество 14С незначительно (в 1,2-1,3 раза) выше при использовании лактата меченого по карбоксильной группе (табл.3).

Таблица 3

Включение 14С в углеводороды 0о:л1Гт',Ьг1о (1ези1 Гиг¿сапа ВКМ 1799 из меченого лактата

1 1 I Условия I опыта Время экспозиции | Количество 14С в углевсдородах,ммкС1|

1 | СНЭСН(0Н)14С00Н 1 ' 1 1 | 14СНзСН(0Н)С00Н | 1 1

I литогете-| трофные | гетеро-| трофные I 4 18 4 18 1 | 3,41±0,30 | 5,50+0,50 | 4,65±0,15 | 9,17+0,12 1 I 1 | 3,90±0,04 | | 4,18+0,83' | | 3,65+0,05 | | 7,74±0,30 ! | |

Таким образом, лактат используется сульфатредуцирующими бактериями как для синтеза самих углеводородов, так и для накопления биомассы, участвующей в этом процессе.

6.2 Участие ацетата в синтезе углеводородов 0сзи1ТоУ1Ьг1о с1сБи1-ГиПсапБ ВКМ 1799

Ацетат является одним из конэчньк продуктов окисления лактата Бе-зи1Гоу1Ьг1о дезиНщисапэ, 10% которого вовлекается сульфатредуцирую-

bum! бактериями в s •< >нстру ктккиый метпо^лизм клеток (.Battel огцг et. al. , 1979). Являясь мирной !• и-йотой, ацетат может участвовать в синтезе углеводородов, что било ¿t •ковано экспериментально.

Меченый углерод 1 ''СИзСОСИ и СНз14СШ1 обнаруживался в биомассе D.desulfurican? ВКМ 1и синтезируемых ими углеводород;« при росте как в гетеротрофных, так и литогетеротрофных условиях.

При литогетеротрофном росте штамма основное количество потребленного меченого ацетата (91-9и%) обнаруживается в биомассе, поскольку Desulfovibrio desulf'uricans р.KM 1799 в этих условиях использует углерод ацетата как из мегильной, так и карбоксильной групп на конструктивный метаболизм, что соответствует данным литературы (Badziong et. al., 1979; Klemps et. aî., l'Ait ). На синтез углеводородов используется 2-9% меченого углерода ацетата.

Основное количество потребленного меченого углерода ацетата (54-92%) при гетеротрофном росте- D. desulf'uricans ВКМ 1799 обнаруживается в углеводородах, что сЕя;-.аю с большим накоплением биомассы и активным синтезом углеводородов в данных условиях. Интересно отметить, что из акзогенно внесенного -»ж-тата на синтез углеводородов, как и в случае о 14с-лактатом, испогл.-лется меченый углерод, как карбоксильной, так и метильной групп, ч-нако в данном варианте опытов наблюдалось более активное (в 1.2-1,Г. :лз> включение в синтез углеводородов ацетата меченого по 14и- метильнмй группе, что свидетельствует об участии в атом процессе реакций дегарСогссидироЕания (табл.4.).

Таблица 4

Сравнительные даиные количества 1'1С ацетата, используемого Desulfovibrio desulfuricaiis Ш1 1799 для синтеза углеводородов

1 ! 1 i [ Условия 1 | опыта | Время экспозиции | Количество l4C углеводородах,mmkCî|

I 1 | СНз14С00Н i 1 | 14СН3С00Н 1 i i

I ■ ■ ■■ 1 | литогете- | 4 ! | 3,40+0,05 1 1 i 4,08*0,13 |

| ротрофные | 18 | 6.87*0,13 | 8,24*0,75 |

| гетеро- | 4 | 91 18*0,22 ! 136,22*3,72 |

| трофные | i i 18 | 263. 88*1,54 i 1 330,78*0,85 i i i

Таким образом, результаты исследований подтвердили участие ацетата в синтезе углеводородов 0^е:зиИиг1сапз ВКМ 1799.

6.3 Участие СО;, в синтезе углеводородов 1)с5и1[оУ1Ьг1о беяи!ГиП-сапя ВКМ 1799

Доказательство участия Шг г. синтезе углеводородов сульфатредуцч рующими бактериями осуществляли с помощью исследования распределения меченого углерода бикарбоната в продуктах метаболизма.

Исследования показали, что активное включение меченого углерода бикарбоната во внеклеточные продукты метаболизма (кислородсодержащие соединения и углеводороды), а также ь биомассу 0.с1е5иН''иг1сапз ВКМ 1799 наблюдается как в гетеротрофных, так и литогетеротрофных условиях роста бактерий (табл.Б).

Таблица 5

Включение ЫаН14С0з во внеклеточные продукты метаболизма Вези}Го'/1Ьгн> <1еБи] Гиг1салн ВКМ 1799 в атмосфере

|-----1-------;-----------1--------------------------1

I Время ! Доля | Распределение 14С, % от |

Условия|экспо-|потреблен-| введенного НаН14С0з |

опыта |зиции,|ного ве- ^------т-----1----1

I час ¡щестьа, % | Углево- |Кислор.сод| Биомасса | ! | | дороды |соединения| !

------_!---;----------^-----1------(

литоге- ! | | | | !

теро- | 4 162,34±0,12 | 3,76: 0,06128,89+0,09 | 9,75±0,05| трофные | 18 174,94±0,33| 4,95--:0,05134,15±0,15135,85±0,15| гетеро- ! 4 ! 59,29±0,66| 12,10: 0,19 116,86±0,06|:30,39±0,28| трофные | 10 |72,33+0,33|13,75:-0,25|Й6,33±0,32.|32,25+0,251

I_______I__1_______I_____1

Основное количество меченого углерода обнаруживается в ¡сислород-содержащих соединениях и в биомассе.

На синтез углеводородов в гетеротрофных условиях роста сульфатре-дуцирующих бактерии приходится 19-20% от потребленного меченного бикарбоната, в литогетеротрофных условиях роста штамма - 6%, поскольку основная часть С0о вовлекается бактериями в конструктивные процессы.

Аналогичные результаты по влиянию МаНСОз на синтез углеводородов в гетеротрофных условиях роста были получены и для ВезиН'стЬгю с!е-зиП'иПсапБ БКМ 1308 (Беляева и др., 1992).

Таким образом, результаты исследований свидетельствуют об активном участии СОг в процессах синтеза внеклеточных углеводородов 0ези1-ГОУ^ЬГЮ сЗезиП'итсапБ ВКМ 1799.

6.4 Участие формиата в синтезе углеводородов ОеяЯГоуИпЧо (1сяи1-Гипслп;; Ш<М 1799

Из данных литературы известно, что прямое восстановление ГУ? приводит к образованию формиата. Данный процесс установлен для некоторых видов бактерий рода иго (.т'паиег, 1970; Аг^егсеп, уипгйаМ,

1974; иипсйаЬ!, 1986). Поскольку, как отмечалось выше, в атмосфере Н2+СО2 происходит увеличение синтеза углеводородов Б.desulfuricanз ВКМ 1799, можно предположить, что одним из промежуточных продуктов, участвующим в синтезе этих соединений, является формиат.

Изучение участия меченого формиата в синтезе углеводородов суль-фатредуцирующими бактериями показало, что он ассимилируется клетками как в гетеротрофных, так и в литогетеротрофных условиях роста П^еги]-ГигхсапБ ВКМ 1799. Общее количество потребленного Н14С00Н в гетеротрофных условиях роста штамма было в 1,5 раза выше, чем при литогете-ротрофном культивировании бактерий, что связано с более активным накоплением биомассы П^езиКипсапэ ВКМ 1799 на среде с лактатом (табл.6).

Е литогетеротрошных условиях роста бактерий 78-84% потребленного меченого углерода формиата определяется в биомассе О^егиН иг 1сала ВКМ 1799 п 16-2ГЙ обнаруживается в углеводородах. Активное включение формиата в биомассу объясняется недостатком органического углеродного питания для роста штамма в этих условиях.

При росте сульфатредуцирующих бактерий на лактатсодержащей среде включение метки из Н14С00Н в углеводороды достигает 95% уже в первые часы экспозиции формиата с 0.desulfuricans ВКМ 1799 и сохраняется в процессе роста штамма.

Таблица б

Включение печеного форкиата в углеводорода 0еви1Тоу1Ьг1о ёе$и№иг1сапз ВКМ 1799 при различных условиях кульшвирования

Г ■ ' 1 1 Условия ! 1 1 I опыта | 1 1 Время экспозиции Доля потребленного вещества, X Распределение i Углеводороды | i 14С, % Í i i Биомасса ! i

! 1 !литогете- | 4 54,87+0,13 11,71±0,29 | 1 43,16+0,16 |

|рстрофные| 18 58,90+0,10 12,75+0,25 | 44,15+0,15 !

I гетеро- | 4 84,71+0,13 80,35+0,55 | 4,36+0,36 |

I трофкые | 1 1 18 87,24+0,55 81,32+0,68 1 i 5,92±0,12 | i

-

Таким образом, формиат являемся наиболее активным соединением, участвующим в синтезе углеводородов сульфатредуцирующими бактериями.

Подтверждением этому являются опиты с дополнительным внесением формиата (2,0 г/л) в питательную среду для культивирования Олк-зиИ'и-гасапз вкм 1799. когда наблюдалось незначительное (в 1,1 раза) увеличение прироста биомассы за счет использования формиата, как дополнительного источника питания бактерий, а количество углеводородов повышалось в 1,3-1,5 раза. Кроме того, изменялся и спектр алканов, поскольку увеличивалось количество нечетных углеводородов и алканов с более короткой длиной цепи (Сц-Сав), пак и в случае роста 0. с1ези1Гиг1-сапз в атмосфере Но+СОо-

Синтез формиата в клетках бактерий катализируется формиатдегидро-геназой. Проведенные нами исследования показали, что в бесгслеточном экстракте П.с1е5иН'иг1сапз ВКМ 1799 содержится формиатдегкдрогеназа. Частично очищенные препараты формиатдегидрогеназы были получены из штаммов О^еаз и 0.уи1^аг1з (Уае1, 1969; Rledeг-Henderзon еЬ.а1.,1986).

Таким образом, формиат, участвующий в синтезе углеводородов, г. наших исследованиях может быть образован Б^езиП'игЛсапз ВКМ 1799.

6.5 Распределение меченого углерода в про душках метаболизма Оеьи//ЪуИ^п о (ип ВКМ 1799 при синтезе углеводородов

С целью определения меченого углерода в промежуточных продуктах синтеза углеводородов и установления взаимосвязи между ними, из куль-туральных жидкостей после экспозиции и^еэи^игюалз ВКМ 1799, растущей в литогетеротрофных условиях, с мечеными веществами (С'.НзСН(01-1)14С0-0Н, МаН14С0з, Н14С00Н) выделяли гидразоны производных, присутствующих в них органических кислот, и исследовали методом тонкослойной хроматографии.

Результаты исследований показали, что при росте бактерий е присутствии 14С-лактата были обнаружены: лактат - РГ 0,62; пируват - И 0,55; ацетат - РГ 0,87. О&ормиат не имел четко выраженного пятна, но радиоактивный счет в этой области 0,80) обнаруживался. Меченый углерод карбоксильной группы лактата был обнаружен во всех перечисленных соединениях. Основное количество 14С (98,9%) определяется в пирувате. В ацетате и формиате содержание меченого углерода составляет менее 1%. Эти результаты соответствуют схеме окисления лактата сульфатредуцирующими бактериями (Чеботарев, Вербина, 1978; Роз^аЬе, 1984). По данной схеме известно, что углерод метальной группы лактата участвует в синтезе ацетата, поэтому распределение метки из 14СНзСН(0Н)С00Н не изучалось.

При внесении в питательную среду меченого бикарбоната были выяв-1Ч'ИЫ пятна, соответствующие ацетату, формиату, а таган пирувату. Появ-ш.'иие пирувата связано, по-видимому, с образованием его в конструктив-юм процессе при участии СО2, что соответствует данным литературы (Вас^оп!?, ТЬаиег, 1980).

Наиболее активно меченый углерод из бикарбоната включается в фор-/1иат (37%) и ацетат (41Х), что свидетельствует об участии СОг в мета-5олигме этих соединений.

При внесении в культуральную среду меченого формиата выявлялись тятна, соответствующие ацетату и формиату. В ацетате было обнаружено в 3 раза больше меченого углерода (78-79%), чем в формиате. Следовательно, углерод формиата используется Б. с1ези1Гиг1сапз ВКМ 1799 для синтеза ацетата, что соответствует схеме использования одноуглеродных соединений, предложенной для анаэробных бактерий (СаМа, ге1киз,1983).

Среди внеклеточных продуктов метаболизма О.ё^зиНигюапз ВКМ 1799 на лактатсодержащей среде в атмосфере Н2 + СОо были обнаружены спирты, 'шализируя их эфирные экстракты, полученные из культуральных жидкостей после экспозиции 0.с1ези1Гиг1сап2 ВКМ 1799 с СНзСН(0Н)14С00Н. Н14СООН или МаН^СОз, было показано, что во всех изученных вариантах опытов ¡мелись пятна, соответствующие этиловому (К£' 0,62) и метиловому (1?Г -',5) спиртам. При внесении в питательную среду меченного лактата преимущественно обнаруживался в этаноле (80-82), >, а при внесении в-питательную среду бикарбоната или формиата - в метаноле (63-65%). Следовательно, этанол и метанол являются промежуточными продуктами в трансформации этих соединений в углеводороды.

В синтезе углеводородов микроорганизмами возможно участие и других веществ, например кетонов. Однако в наших исследованиях при добавлении ацетона в питательную среду для роста Р^ези11иг1сапз ВКМ 1799 в £

атмосфре (Н2+СО2), где происходил синтез углеводородов, не вызывало увеличения количества продуцируемых углеводородов.

Таким образом, проведенные исследования позволили выявить основной путь образования внеклеточных углеводородов, осуществляемый суль-фатредуцирующими бактериями ОеэиИ^оуПэгю (ЗезиКиггсапэ, который включает образование ацетата из СОг, по-видимому, по восстановительному :ю-дегидрогеназному пути и дальнейшему восстановлению жирных кислот и их конденсацией в углеводороды.

6.6 Участие молекулярного подорода и водорода воды в синтезе углеводородов 0сБи1ГоУ1Ьг1о (¡е$и1Гиг1сапз ВКМ 1799

Одним из элементов, входящим в состав структуры углеводородов и

участвующим с реакциях восстановления, являются ,'кч'мн водород«-, но.-,то му представляло интерес изучить их происхождение.

В первой серии опытов использовали гагюобрг&нкь тритий, замечи часть По, входящего в состав газовой фаьы (Н2+СО2) при культивировали ОеБиЬ'оуЦэгао г^зиН'иооапз ВКМ 1799.

Результаты исследования показали, что по мер.- роста и образовали внеклеточных углеводородов 0. (Зези1Гиг1салз, происходит постепенно включение метки газообразного трития в их состав. В период стационар ной фазы роста культуры, когда синтезируется максимальное количеств углеводородов 19,6±0,4 мкг/мл, потребление газообразного трития сос ■тавляет 1,2мкС1, т.е. 0,06 мкС1 на 1 мкг углеводородов.

Во второй серии опытов исследовали роль водорода воды, использу для этой цели тритиевую воду. Включение трития ь углеводороды иг три тиевой воды изучали в двух вариантах, как в присутствии немеченног водорода в газовой фазе, так и без чего.

Результаты исследований показали, что тритий из воды активно ис пользуется клетками для синтеза углеводородов. Интенсивность включени трития е углеводороды на период экспоненциальной роста П.с)е5и1Ги

г1сг»П5 ВКМ '1799 в 2,0-2,5 раза выше о варианте опытов без введения мс лекулярного водорода в газовую фазу. На период сташ*л>нарной фазы рост бактерий количество трития, используемого на сшпч": углеводородов присутствии водорода в газовой фазе л без него, снижается ь 1,2 раза составляет 1,4 мкС1 на 23,5±0,4 мкг/мл или 0,06 мкС1 на 1 мкг углеЕО дородов, что соответствует количеству потребленного газообразного три тия исполняемого 0.<1е5иН'иг1сап5 ВКМ 1799.

Несмотря на то, что количество синтезируемых углеводородов в от сутстеии молекулярного водорода накапливается в среде в 1,6 раз мень ше, чем в его присутствии и составляет 14,7+0,4 мкг/мл, включение мет ки в их состав в 1,2 раза выше и составляет 1,7 мкС1. Расчет количест ва потребленного трития в этом случае составляет 0,12 мкСЗ на 1 мк синтезированных углеводородов, что в 2 раза больше количества трити потребленного при добавлении в среду культивирования газообразного во дорода. Участие водорода воды (Н+) в синтезе метана обсуждается в ряд работ (РисЬз et.aL.1979; Варфоломеев и др., 1988).

Общая доля потребленного трития Б.с1ези1Гиг1сачз в изучаемых экс периментах достаточно высока (40-50%) (табл. 7).

Часть газообразного трития (18%) и трития из тритиевой вод] (15-16%) обнаруживается в биомассе Р. сЗези11Гиг1сапз ВКМ 1799. В углево дородах, меченого трития в 1,2-2,0 раза больше, чем в биомассе.

Таблицн 7

Инлючение трития на a;vion6p;inno:;o состояния и тритиекой воды, в биомассу и углеводороды Desulfovibrio dcsul/uricans HIW 1709, в период стационарной фазы роста культуры (34-3(~> час)

I----1-------------■)-------------------------1

! | Доля I Распределение трития. 2, ]

| Варианты | потребленного |------------1-------]

| опыта | трития, % | Углеводороды | Биомасса |

|---,-------+--------}---1

I -T?. + C02 I 39,62+0,10 | 21,62+0,07 | 18,00+0,02 |

| 3T20+H2+C02| 42,97+0,10 | 27,75+0,05 | 15,22+0,04 |

| 3T20+Ar+C02| 50,09+0,15 | 33,33+0,06 I J6,76+0,04 I

Таким образом, из полученных результатов видно, что на синтез углеводородов Desulfovibrio desuliuricans вKM 1799 может использоваться {ак газообразный тритий, так и тритий из тритиеЕой воды. В случае отсутствия в атмосфере роста и синтеза углеводородов сульфатредуцирующих зактерий газообразного трития его количество в синтезе углеводородов компенсируется тритием воды.

Глава 7 Применение газохроматографического метода для определения штонси мости об/хшоватт углеводородов сульфатредунирупщини баюхерия-iu в ра-%хичпих природных объемы

Материалом для исследований служили, иды Балтийского моря; образ-J.if грунта Прикаспийской впадины; пластовые воды нефтяных месторождений, образны кернов газонефтеносных пластов, любезно предоставленные iav сотрудниками институтов Океанологии, БНИИЯГ, института ПО Тат-1ефть,

Данные образцы предварительно исследовались на содержание общего количества микроорганизмов и изучаемой нами группы сульфатредуцирующих ¡актерий.

Оброним ила Балтийского мори были взяты по профилю залегания горских осадков, в основном, верхнеголоценового возраста. Общая чис-[енность микроорганизмов в изучаемых нами образцах составляла 1,6-6,4х109 кл/г сырого ила. Независимо от горизонта отбора проб (0-50 :м), количество сульфатредуцирующих бактерий было достаточно велико и [аходилось в пределах 1х102-104 кд/г ила.

Образни грунта Прикаспийской впадиии исследовали из зон нефтяных юсторождений и вне их. Общее количество микроорганизмов в этих образ-[ах составляет 0,6-1,2 х108 кл/г грунта. Сульфатредуцирующих бактерий

в контуре месторождения нефти несколько больше (1x10"1 га/г образца), чем вне контура (1х10г кл/г образца), что объясняется более интенсивными био- и геохимическими процессами, проходящими в этих зонах.

Керны из нефтегазоносных районов Татарстана и Западной Сибири показали, что все исследуемые образцы кернов независимо от своей структуры содержат сульфатредуцирующие бактерии, однако, количество их невелико и составляет 15-27 кл/г образца.

Пластовые воды Ромаикинского и Бавлинского месторождений нефти Татарстана имели рН 6,8-7,2 и содержали различное количество сульфатов (0,1-0,5г/л). Исследование общего количества микроорганизмов показало, что в пластовых водах оно составляет 315-340 кл/мл. Сульфатредуцирую-щих бактерий - 7-17кл/мл.

Определение интенсивности обрааопания углеводородов газохроматог-рафическим методом в природных образцах, содержащих сульфатредуцирующие бактерии, проводили в двух опытных и двух контрольных вариантах.-а) опытные варианты: 1. исходный образец в атмосфере Н2+СО2, 2. исходный образец в атмосфере аргона; б) контрольные варианты: 1. образец, прогретый 2 часа в автоклаве при 1,5 атм.(к опыту первого варианта), 2. образец, прогретый в автоклаве при 1,5 атм.(к опыту второго варианта). Предварительно контрольные варианты проверяли на отсутствие жизнеспособных микроорганизмов и их спор. Образцы инкубировали при 37°С в течение 1 месяца.

Через месяц инкубации было отмечено увеличение количества углеводородов в 4-5 раз, в диапазоне С18-С2<к, в образцах ила (станция 4973, глубина - 0-10 см), где присутствовали сульфатредуцирующие бактерии в атмосфере Н2+СО2. В атмосфере аргона увеличение количества углеводородов было незначительным (рис.5).

Данные результаты были подтверждены и на других образцах ила и грунта, содержащих большее количество сульфатредуцирующих бактерий и культивируемых в атмосфере Н2+СО2.

В образцах кернов и пластовой воды газохроматографический анализ не выявил изменений в процессе образования углеводородов несмотря на то, что сульфатредуцирующие бактерии (штамм БК и БП), выделенные из битуминозного сланца и пластовой воды Ромалкинского месторождения, в лабораторных условиях, на среде Постгейта В в атмосфере Н2+СО2 проявляли способность к образованию углеводородов (7,8±0,2 мг/л и 8,0±0,2 мг/л соответственно). Это объясняется, по-видимому, отсутствием в кернах и пластовой воде достаточного количества доступного для сульфатредуцирующих бактерий питательного субстрата.

аг -

а)

V

б)

в)

КС12 нСае нСго НС24

Рис. 5 Спектра углеводородов ила Балтийского моря (ст. 4967): а - опитой вариант - исходит образец в атмосфере Я2+СО2; 6 ~ опшшй вариант - исходный образец + аргон; в ~ контрольный вариант - образец в отсутствии жизнеспособных микроорганизмов + (¡¡г+СО-г)

Таким образом, проведенные исследования показали возможность ио пользования га&охроматографического метода для выявления количествен ных и качественных изменений в содержании углеводородов, в различны природных объектах. Необходимо отметить, что во всех изученных нам экспериментах были определены алканы СЦ-С04, характерные для деятель ности сульфатредуцирующнх бактерий, что подтверждает возможность сов ременного образования углеводородов с помощью этих бактерий в природе

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Проведенные исследования показали, что большинство видов сульфат редуцирующих бактерий способны к образованию и накоплению углеводоро дов в культуральной жидкости, особенно штаммы, осуществляющие неполно окисление субстратов. Установлено, что наиболее активным штаммом син тезирующим углеводороды, является 0еги1Гоу1Ьг1о с1е5и1Гиг1сапз, которы широко распространен в природе.

Синтезируемые сульфатредуцирующими бактериями внеклеточные угле водороды являются, главным образом, алканами с длиной цепи Сц-С.24 Они не являются следствием разрушения клеток, поскольку продуцируйте бактериями в процессе роста штаммов, и отличаются по составу от внут риклеточиых углеводородов сульфатредуцирующих бактерий.

Синтез углеводородов сульфатредуцирующими бактериями может осу ществляться в различных анаэробных зонах биосферы, характеризующие наличием или отсутствием органического вещества, присутствием водород и СО2, а также другими факторами, поскольку доказана способность суль фатредуцирующих бактерий к синтезу углеводородов как в гетеротрофных литогетеротрофных, так и автотрофных условиях роста. Большее количест во углеводородов синтезируется сульфатредуцирующими бактериями в уело виях гетеротрофного роста. Это объясняется более интенсивным росто бактерий в присутствии органического вещества, а также возможность вовлечения его в синтез углеводородов.

Способность сульфатредуцирующих бактерий к образованию и накопле нию внеклеточных углеводородов зависит и от других условий окружающе среды. Это прежде всего присутствие в атмосфере роста сульфатредуциру ющих бактерий смеси газов Н2+СО2 и их активное потребление, сопровож дающееся накоплением внеклеточных углеводородов в культуральной жид кости.

Значительное влияние на синтез углеводородов сульфатредуцирующим бактериями оказывает отсутствие конкурирующих с СОг акцепторов элект ронов. Установлено, что наибольший ингибирующий эффект на синтез угле водородов оказывают сульфаты (5,9-6,0 мг/л), в меньшей степени - нит

рать; с'.,о кг/..:}. Если нитраты отрицательно влияют на рост сульфат -редуцирующих 0<и:т-.'рий, то сульфаты являются конкурентами за восстановитель. Карбонаты стимулируют синтез углеводородов (19.6-22,8 мг/л.1.

Синтез углеводородов суль(}атредуциурющими бактериями зали-.ит о? физико-химических факторов средь. Он происходит только при сочетании низкого окислительно-восстановительного потенциала (-290)-(-360) мВ и нейтральных значений рН питательной среды, что наблюдается когда скорость образовании кислот равнозначна скорости образования углеводородов.

С помощью увеличения концентрации различных соединений в питательной среде (лактата, фосфата, казеина), изменения соотношения между Н£ и С02. продолжительности времени культивирования, возможено осуществление процесса регуляции синтеза не только общего количества углеводородов сульфатредуцирующими бактериями, но и с изменением их качественного состава.

Используя меченые соединения,было установлено, что в синтезе углеводородов участвуют жирные кислоты. Наиболее активен формиат, поскольку 80% меченого углерода этого соединения уже в первые часы экспозиции с клетками определяется в углеводородах. Уксусная кислот* более инертное соединение, чем формиат, но и она участвует в синтезе углеводородов, поскольку до 64-75% меченого углерода ацетата в течение времени взаимодействия с клетками обнаруживается в углеводородах.

Разнообразие получаемых алканов позволяет предположить, что синтез углеводородов связан с процессом конденсации промежуточных продуктов метаболизма клеток. Наиболее вероятно, что в этом процессе участвует формальдегид. Не исключено и образование из уксусной кислоты под действием водорода - ацетальдегида. Кроме того, синтез углеводородов сопровождается, по-видимому, реакциями декарбоксилирования, поскольку в составе углеводородов отмечалссь преимущество 14С-ацетата метальной группы. Образующиеся альдегиды далее могут вступать в процесс альдоль-ной или кротоновой конденсации с наращиванием углеродной цепи. Однако при кротоновой конденсации в состав получаемых углеводородов должны входить в значительном количестве ненасыщенные углеводороды, тогда как получаемые нами углеводороды - глканы, поэтому альдольная конденсация более вероятна. Этот процесс объясняет и наличие в спектрах углеводородов почти равных количеств синтезируемых четных и нечетных углеводородов, так как конденсация ацетальдегида будет приводить к синтезу четных углеводородов, а конденсация с формальдегидом к образован™ как четных, так и нечетных углеводородов.

А

Рассматриваемый процесс не исключает и возможности ьезимодеис-твля альдегида с другими соединениями и, в частности, о лирными кислотами, по механизму, предложенному Алъбро и Дитмером (,А1Ьго, титег, 1669 .>. Согласно этой схемы жирные кислоты (лактат, иируват. образующаяся уксусная кислота) в виде производных взаимодействуют с формальдегидом, либо ацеталъдегидом с образоваванием спиртов, а затем углеводородов.

Все рассмотренные пути конденсации могут быть использованы Рени1-£0у1Ьг10 desuП,,JГicans в процессе синтеза углеводородов.

Так™ образом, синтез углеводородов сульфатредуцирующими бактериями осуществляется путем образования жирных кислот, с последующим к> восстановлением и конденсацией до углеводородов.

Значительную роль в механизме образования углеводородов сульфатредуцирующими бактериями играет как газообразный водород, так и водород воды, участвующие в восстановите;кьных реакциях. Проведенные нам] исследования показали высокую скорость включения трития в углеводород; из тритиеьой еоды. Это свидетельствует о том, что генерация восстановителя из воды является необходимым процессом е синтезе углеводородов сулъфатредуцирующими бактериями. Однако водорода воды для гидрогенизации органических кислот, образующихся в процессе роста культур, недостаточно и дополнительное введение в реакционную среду активного водород ь (Н+) способствует синтезу углеводородов.

Исследования участия в синтезе углеводородов сульфатредуцирующпи: бактериями различных предполагаемых соединений и установление вгашос-вязи между ними, позволило нам предложить схему механизма синтез, внеклеточных углеводородов для штаммов, растущих в гетеротрофных уело виях: Н2 (газ) - СНзСН(0Н)С00Н

+ СОг

/

I

Н+ (вода)

-СНзСОСООН

НСООН

СНзСО-СоА Сн'зСОО-Р

Н00 —»- ОНгС-Х

I

снзсоон

I

I

сизссон

процесс конденсации

углеводороды

В процесс синтеза углеводородов могут вовлекаться и другие жирны« кислоты, не являющиеся субстратами для роста сульфатр^дуцируетцих бактерий, что отмечалось в опытах с использованием олеиновой кислоты. Дополнительное внесение которой увеличивало количество синтезируемых углеводородов в 5 раз по сравнению с контролем, в -.-«том случае, по-видимому, наблюдалась реакция совосстановления олеиновой кислоты в углеводороды.

Процесс синтеза углеводородов сульфатредуцирующими бактериями возможен и в природных условиях, поскольку изучаемые нами микроорганизмы широко распространены в природе, и накопительные культуры, выделенные из образцов ила, грунта, кернов и пластовой воды, обладают способностью к указанному выше метаболизму. Подтверждением возможности современного образования углеводородов в природе являются результаты модельных опытов с образцами, содержащими значительное количество с.ульФатредуцирующих бактерий и инкубированных в атмосфере Нг+СОг, где происходило значительное увеличение содержания углеводородов в исследуемых образцах.

В нефтяных пластах благоприятные условия для синтеза углеводородов создают,по-видимому, сообщества микроорганизмов. Наличие значительного количества органических веществ, являющихся субстратами для роста сульфатредуцирующнх бактерий и бактерий-г лутн.чков. анаэробные ••л уюьин существования - все это способстует образования углеводородов ь природе.

выводи

i. На 15 штаммах сульфатредуцирующнх бактерий, принадлежащих к разным метаболическим типам, показана способность синтеза внеклеточных углеводородов, включающих широкий спектр соединений от Сц до 024-

Z. Методами газожидкостной хроматографии и масс-спектрометрического анализа установлено, что yiлеводороды, синтезируемые Desuifovib-rio desulfuricaris, представлены, в основном, алканами нормального строения. В отличие от внутриклеточных углеводородов, состоящих из высокомолекулярных соединений C¿5 ~ Сз5 70-80% отн., максимальное количество внеклеточных углеводородов содержит более низкомолекулярные вещества Сц - С24 80%. отн.

3. Синтез углеводородов осуществляется сульфатредуцирующими бактериями в условиях гетеротрофного, литогетеротрофного, автотрофного роста.

4. С помощью меченых соединений (14СН3СН(ОН)СООН,СНзСН(ОН)14СООН,

Н1,гШОН, 14СНэСООН, СНз14СООН, НаН14»Х)д, Зт.>0, показано, что углерод этих соединении включается в углеводороды, а водород используется как газообразный, так и из воды.

5. На основании определения промежуточных продуктов метаболизм; сульфатредуцирующих бактерий установлено, что синтез углеводородов этими бактериями осуществляется путем образования жирных кислот (фор-миата, ацетата) с последующим их восстановлением и конденсацией в углеводороды.

6. Условия,- необходимые для синтеза углеводородов сульфатредуцирующими бактериями, включают:

- полноценную питательную среду, обеспечивающую хороший рост бактерий и образование жирных кислот,

- низкий окислительно-восстановительный потенциал среды (ЕЬ = (-290)-(-360) мВ),

- оптимальное значение рН среды (рН = 7,0),

- соответствующую штамму температуру роста.

7. Количество углеводородов, синтезируемых сульфатредуцирующими бактериями, зависит также от присутствия активирующих и ингибирующих факторов:

- наличия в газовой фазе Н2+СО2, обеспечивающих синтез углеводородов. Оптимальное соотношение Нг и СО2 для синтеза углеводородов 9:1.

- присутствия в среде биологически активного водорода (Н+), фосфатов, органических форм азота в необходимых концентрациях,

- отсутствия конкурирующих с СОг акцепторов электронов (БОд, N03).

8. В лабораторных экспериментах гоказана возможность применения

-.,30. ф

газохроматического метода для определения интенсивности образования углеводородов сульфатредуцирующими бактериями в различных природных объектах.

9. Способность сульфатредуцирующих бактерий продуцировать внеклеточные углеводороды делает вполне реальным разработку микробиологического синтеза углеводородов е условиях производства.

Автор выражает глубокую благодарность академику РАН, профессору МГУ Е.Н.Кондратьевой за ценные советь' при проведении и обсуждении полученных результатов.

Список работ, опублшюымчшх по материалам диссертации:

1. Багаева Т.В. , Беляева М.И. Продукты метаболизма сульфатредуцирующих бактерии при роете на opi анических субстратах в атмосфере окислов углерода и молекулярнотю водорода / В сб.: Вопросы физиологии и биохимии сульфатредуцирующих бактерий. - Казань, 1987.- С.21-26.

2. Вагаева Т.В., Усаноьа Г.В., Золотой A.B. Микрофлора илов Балтийского моря и грунтов Прикаспийской впадины, их гидрогеназная и С0-дегидрогеназная активность /Б сб.: Вопросы физиологии и биохимии сульфатредуцирующих бактерий,- Казань, 1987,- С.64-72.

3. Егоров С.Ю., Багаева Т.В. Влияние РНКазы Bacillus intermedius на рост анаэзробных микроорганизмов /Тезисы докл."Регуляция метаболизма микроорганизмов". - Пущино, 1989.- С. 20.

4. Захарова Н.Г..Багаева Т.В. Систематика и Функциональная морфология микроорганизмов.- Казань.:ИГУ, 1989.- 89 с.

5. Чернова Т.Г., Багаева Т.В. Роль фациаяыю-генетического типа органического вещества в процессе газообразования в донных морских осадках // Доклады АН СССР., серия Геохимия. - 1991.- Т.321,- N4,-С.822-824.

6. Беляева М.И., Мухчтоъз Ф.К., Золотухина Л.М.. Кияшко С.В., Багаева Т.В., Карпилова й.Ю. Внеклеточные продукты метаболизма сульфатредуцирующих бактерий рода Desulfovibrio //Микробиология.- 1992,-Т.61,- Bim.2,- С.194-200.

7. Беляева М.И., Золотухина Л.М., Багаева Т.В. Способ получения жидких углеводородов. Патент ри ?08'*?60 С1 от 23.07.93.

S. Багаева Т.В., Чернойа Т.Г. Сравнительная характеристика внутри- и внеклеточных углеводородов Desulfovibrio desuli'uricans // Биохимия.- 1994.- Т.59.- Вып.1.- С.31-34.

9. Багаева Т.В., Беляева М.И. Влияние неорганических акцепторов электронов на рост и образование углеводородов сульфатредуцирующими Эактериями // Известия Российской Академии, серия Биологическая. 1994,- N1,- С.141-144.

10. Багаева Т.В., Золотухина Л.М. Образование углеводородов сульфатредуцирующими бактериями в /словиях хемолитогетеротрофного роста '/Микробиология. - 1994.- Т.63.- Вып.6. С.993-995.

11. Багаева Т.В. Жизнедеятельность сульфатредуцирующих бакте-эий.- Казань. :ЭТ0К, 1995,- 20 с.

12. Багаева Т.В. Изучение процесса образования углеводородов в фиродных объектах в присутствии содержащихся в них сульфатредуцирую-

щих бактерий газохроматографическим методом // Микробиология.

1996. - Т. 65. -N1. - С. 1 Зг'-139.

13. Багаева Т.В. Использование метода газохроматографическог анализа в изучении продуктов метаболизма сульфатредуцируялдих бактерий - Казань.:ЭТОК, 1996,- 12 с.

14. Багаева Е.Е. , Багаева Т.Е:. Влияние начальных значений рН пи тательной среды на рост и образование углеводородов сульфатредуцирую щгши бактериями /Тез.докл. 8 Международной конференции молодых учены "Синтез, исследование свойств, модификация и переработка высокомолеку лярных соединений". - Казань, 1996.-С.141-142.

15. Багаева Т.В. .Беляева М.И. Синтез внеклеточных углеводороде сульфатредуцирукщиыи бактериями в условиях автотрофного рост /Тез.конф. Автотрофные'микроорганизмы.- М.: Диалог-МГУ, 1996,-0.58.

16. Багаева Т.Е., Зинурова Е.Е. Зависимость образования углеводе родов от концентрации сульфатов питательной среды при росте Desulfc vibrio desulf'uricans //Деп. в ВИНИТИ 22.01.97, N187-E97.-С.1-9.

17. Багаева Т.В., Беляева М.П. Способность сульфатредуцирующ; бактерий к синтезу внеклеточных углеводоролдов в условиях автотрофног роста // Деп. в ВИНИТИ 22.01.97..N188-B97. -С. 1-12.

18. Багаева Т.В., Зинурова Е.Е. Елияние рН среды на рост и oSps зование углеводородов Desulfovibrio desulf'uricans // Деп. в ВИНИТ!] 20.02.97, N540-B97.-C.1-12.

19. Багаева Т.В. Микроорганизмы - продуценты углеводородов //Деп в ВИНИТИ 20.02.97, N541-B97.-С.1-27.

20. Багаева Т.Б. Определение включения трития в углеводороды De sulfovibrio desulf'uricans //Биотехнология.-1997.-N3.-С.18-21.

21. Bagaeva Т.V.; Zinurova Е.Е. Fotmate role in hydrocarbor. synthesis / Abstracts 8th European Congress on Biotechnology,Budapest

1997.-P.168

22. Багаега Т.В.,Багаев Е.И, Влияние начальных значений окиелг тельно-восстановительного потенциала питательной среды на рост и обрг зование углеводородов сульфатредуцирующими бактериями // Деп.в ЕИНИТ1. 03.12.97, М3544-В97.-С.1-12.

23. Багаева Т.В..Зинурова Е.Е. Влияние фосфатов на рост и образование углеводородов сульфатредуцирующими бактериями // Деп.в ВИНИТ! 03.12.97, N3546-B97.-С.1-9.