Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Структурно-функциональные перестройки в клетках корней пшеницы при изменении протонной проводимости плазмалеммы 2,4-динитрофенолом

ВАК РФ 03.00.12, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "Структурно-функциональные перестройки в клетках корней пшеницы при изменении протонной проводимости плазмалеммы 2,4-динитрофенолом"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК КАЗАНСКИЙ ИНСТИТУТ БИОЛОГИИ КНЦ РАН

На правах рукописи

РГ8 ОД

УДК 581.17:581.12

БУТАКОВА Ирина Владимировна

СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ ПЕРЕСТРОЙКИ В КЛЕТКАХ КОРНЕЙ ПШЕНИЦЫ ПРИ ИЗМЕНЕНИИ' ПРОТОННОЙ ПРОВОДИМОСТИ ПЛАЗМАЛЕММЫ 2, 4-ДИНИТРОФЕНОЛОМ

03.00,12 - физиология растений

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

КАЗАНЬ - 1994

Работа выполнена в Казанском институте биологии Казанскс научного центра РАН

Научный руководитель

доктор биологических наук, профессор Л. X ГОРДОН

Соруководитель

кандидат биологических наук, О. О. ПОЛЫГАЛОВА

Официальные.оппоненты - доктор биологических наук,

профессор Л. П. ХОХПОВА

доктор биологических наук, профессор И. Ю. УСМАНОВ

Ведущая организация

- а -Новгородский государственн! университет

Зашита состоится

"•/Л" ^ши?

1994 г. в

на заседании специализированного Совета К 002.16.01 по пр: суждению ученой степени кандидата биологических наук (спец альность - физиология растений) при Казанском институте би логии КНЦ РАН (420503, г.Казань, ул. Лобачевского, 2/31).

а/х зо

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Казанек го института биологии КНЦ РАН.

Автореферат разослан " ^/^/¿^¿¿-У 1994 г.

Ученый секретарь зированного Совета 1Г. биологических наук

Е Л. ЛОСЕВА

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы исследования

В последнее время внимание многих исследователей все более ривлекает проблема механизмов адаптации растительных клеток тканей к различного рода воздействиям биогенной и абиоген-ой природы. Особое значение при этом придается выявлению ре-уляторных основ, которые обеспечивают включение репаративных адаптивных реакций и их энергетического обеспечения. Изуче-ие изменений физиологических параметров клетки и ее структу-ы в' ответ на различные воздействия необходимо для понимания ногих вопросов клеточной патологии. Изучение процессов пов-еждения и выявление причин "срыва" адаптации является особой для разработки приемов, обеспечивакйоа предотвращение тих нарушений.

Одним из основных элементов клетки, который отвечает за ачало формирования адаптивных процессов, является поверхност-ая плазматическая мембрана. Степень изменения ее структур-о-функциональных свойств определяет течение многих процес-ов, обеспечивающих адаптацию или её "срыв". ИввестнЬ, что на лазматической мембране существует определенный электро-хими-еский градиент ионов, и прежде всего протонов, изменение ко-орого рассматривается в. качестве пускового механизма ответ-ой реакции клеток на воздействие (Конев, 1987). Поэтому наше нимание было обращено именно на возможность в различной сте-ени модифицировать протонную проводимость плазмалеммы.

В работе было использовано хорошо известное вещество -пецифический ингибитор окислительного фосфорилирования, про-онофор - 2,4-ДНФ. Он широко используется для изучения меха-измов реакций фосфорилирования в дыхательной цепи, так как ействует ближе всего к пункту накопления энергии. Изменение оглощения кислорода и неорганического фосфата в присутствии нгибитора дает представление об уровне окислительного фосфо-илирования в изучаемых объектах. Специфика действия 2,4-ДНФ ыла показана на выделенных митохондриях, а затем характерные зменения в их функциях и структуре автоматически стали при-исываться и органеллам в целых тканях. При этом не учитыва-

- 3 -

лось, что 2,4-ДНФ, являясь протонофором, может оказывать влияние и на другие мембранные системы, в первую очередь, на плазмалемму. Следовательно, не принимались во внимание и те процессы, которые происходят в клетке при изменении барьерной фуйкции"плазматической мембраны. Исследования последних лет показывают, что проблема использования сведений, полученных на одном уровне организации, к интерпретации на другом очень сложная и требует от исследователей осторожного и корректного подхода.

В связи с этим было валено проследить за динамикой изменений, происходящих в клетках целых растительных тканей, от начальных этапов действия 2,4-ДНФ. до полного разобщения окислительного фосфорилирования в митохондриях,_ выявить на этом фоне переходные процессы от ранних ответов клетки к адаптации или к ее "срыву".

Большое значение в понимании механизмов ответной реакции клеток имеет изучение проблемы корреляции изменений морфологии клеток и их физиологических состояний. Это связано с тем, что присущая митохондриям способность к обратимым изменениям ультраструктуры оказывает значительное воздействие на механизмы сопряжения, влияющие, в итоге, на процессы окисления субстратов, окислительное.фосфорилирование, транспорт ионов, метаболитов и т.д. Для решения очерченных проблем необходимо сочетание современной биохимии, молекулярной биологии, электронной микроскопии и гистохимии, с одной стороны, и методов, оценивающих функциональное состояние клетки,с другой.

Цель и задачи исследования

Целью данной работы явилось исследование динамики структурных и функциональных изменений в клетках целых растительных тканей при действии 2,4-ДНФ в двух различных концентрациях, а также выявление роли и вклада протонной проводимости плазмалеммы растительных клеток в формирование адаптивных и патологических процессов.

Были поставлены следующие задачи;

1. Исследовать действие субкритических и критических концентраций протонофора 2,4-ДНФ на динамику изменений дыхательного газообмена и содержания АТФ в отсеченных корнях пшеницы;

- 4 -

2. Изучить особенности эл^ктрогенеза и К+/Н+-обмена отсеченных корней в ходе многочасовой инкубации и увеличения протонной проводимости плазмалеммы;

3. Проследить за ультраструктурными перестройками в клетках отсеченных корней пшеницы на фоне действия 2,4-ДНФ разных концентраций.

Научная новизна

Впервые проведено комплексное исследование структурно-функциональных изменений в клетках' корней пшеницы в динамике (дыхательного газообмена, электрогенеза, проницаемости плазмалеммы, содержания внутриклеточного АТФ и ультраструктуры клеток).

Было установлено, что 2,4-ДНФ прежде всего оказывает воздействие на плазматическую мембрану клеток в качеств« прото-нофора.

Показано, что увеличение протонной проводимости плазмалеммы 2,4-ДНФ приводит к сдвигу ионного гомеостаза клетки, кото-ргй сопровождается увеличением энергетических затрат ка его восстановление, вероятно, связанное с активацией Н+-АТФ-аз. В результате этого происходит усиление процессов окислительного фосфорилирования и возрастание потребления кислорода.

Впервые показано, что стимуляция потребление кислорода целыми тканями при воздействии 2,4-ДНФ (30-60%) является отражением активации процессов окислительного фосфорилирования, а стимуляция, превышающая 100-150%, есть признак разобщения.

Получены новые данные о возможности адаптации растительных тканей к 2,4-ДНФ.

Практическая значимость

Полученные результаты могут служить методической основой в исследованиях проблем митохондриального дыхания и процесса окислительного фосфорилирования на уровне целой растительной ткани.

Перспективным является динамический структурно-функциональный подход в изучении клеточной адаптации и регенерации.

2,4-ДНФ в определенной концентрации может быть использован как инструмент для направленного изменения протонной проводимости плазмалеммы растительных клеток.

- 5 -

Кроме того, полученные нами данные о некоторых неспецифических эффектах при индукции протонной проводимости плазма-леммы необходимо учитывать в исследованиях ионного обмена растительных клеток.

Апробация работы. Результаты исследований были доложены на IV Всесоюзн. симпозиуме "Ультраструктура растений", г.Киев, 1988г.; на Всесоюз. совещании "Клеточные механизмы адаптации", г.Чернигов, 1991; на1отчетных конференциях Казанского института биологии КНЦ РАН (Казань, 1992); на совместном заседании научного семинара лаборатории ионного обмена и дыхания растений, биоэнергетики растений, фотоэнергетики растений (Казань, 1993); на III съезде Всесоюзного общества Физиология растений (С.-Петербург, 1993).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано б работ

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, 4 глав, заключения, выводов и списка литературы. Работа изложена на 128 стр. машинописного текста, включает S рис., 3 таб., 14 фотографий. Список литературы включает 16i наименования, из них 132 на русском языке.

ГЛАВА II. ОБЪЕКТ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объектом исследования явились отсеченные корни 5-6-дневны-проростков яровой пшеницы (Triticum vulgare muticum L.) сорт. Московская-35. Семена замачивали в водопроводной ьоде, а за тем раскладывали на стекло, покрытое влажной марлей и поме ¡денное в кювету с раствором CaClg (2,5-10~4 М). В работе ис пользовали 2,4-динитрофенол (2,4-ДНФ) в концентрациях 5'Ю-5 (pH 5.6) и Ю-4 М (pH 4.5). Растворы 2,4-ДНФ готовили н CaClfc (2,5-Ю-4 М), pH контрольной среды доводили до значени опытного варианта.

Интенсивность потребления кислорода отсеченными корням определяли манометрическим методом в аппарате Варбурга к протяжении 6 часов, показания снимали каждый час (Семихатовг 1965). В инкубационной среде регистрировали содержание ионе К+ (на пламенном фотометре ГШ), измеряли pH, а корни испол! зовали для электронномикроскопических исследований. Врали к1,

- 6 -

сочки ткани корня длиной 1-2 мм из зоны растяжения. Образцы фиксировали 2.5% раствором глютарового альдегида на фосфатном буфере, постфиксировали 1% раствором 0sC>4 на том же буфере с добавлением сахарозы. Далее образцы дегидратировали в спиртах восходящей концентрации, ацетоне и окиси пропилена. Заливочной средой служил Эпон -812. Срезы получали на ультрамикротоме LKB-III (Швеция). Препараты просматривались на электронном микроскопе ЭМ-200 (СССР) и Jem-lOOCX (Япония).

Для измерения мембранного потенциала корневых клеток использовали стандартную микроэлектродную технику. Микроэлектроды изготавливали из стекла пирекс и заполняли KCl (3.0 M).

Концентрацию АТФ определяли люциферин-люциферазным методом. Для этого в реакционную стеклянную кювету наливали 0.7 мл дистиллированной воды и 0.2 мл светлячкового экстракта, помещали в светонепроницаемую камеру и измеряли собственный уровень свечения. При помощи автоматической системы подачи в кювету вводили 0.1 мл испытуемой пробы. Регистрировали вспышки свечения в 4 сек интервалы от начала биолюминисцентной реакции.

Результаты опытов обработаны статистически.

ГЛАВА III. ВЛИЯНИЕ 2,4-ДНФ НА СТРУКТУРУ И ФУНКЦИИ КЛЕТОК КОРНЕЙ ПШЕНИЦЫ

1. Изменения в клетках корней пшеницы после отсечения и

в процессе многочасовой инкубации

Отсечение корней от интактных проростков оказывает воздействие на корневые клетки, что приводит к снижению мембранного потенциала плазмалем^ы (рис.1) и уровня АТФ (таб. 1), которое фиксировалось нами уже в первые 15 мин. Одновременно наблюдался выход в среду ионов К+ (рис.2). Кроме того, до 4 часа практически не изменяется потребление 0z отсеченными корнями (рис.3).

С увеличением времени инкубации (к 4-5 часу) происходит восстановление исходных физиологических показателей: мембранный потенциал достигает уровня интактных растений, наблюдается поглощение клетками вышедших ионов калия, через 4 часа с

- 7-

90.00 л

80:00

70.00

60.00

50.00

0.00

' 2.00

Рис. 1. Влияние 2,4-ДНФ (5'10~5 М) на изменение мембранного потенциала в клетках корней пшеницы -* контроль; - - - 2,4-ДНФ.

30.00

20.00

10.00

К, МК8КВ/Г

0.00

V Л. \

1

'1

0.00

2.00

4.00

6.00

8.00 чис

Рис. 2. Влияние 2,4-ДНФ (5-10-5 М) на выход в среду инкубации ионов К+ -- контроль; - - - 2,4-ДНФ.

момента начала инкубации содержание внутриклеточного АТФ превышает уровень первого часа. Дальнейшая инкубация корней в контрольном растворе часто приводит к гиперполяризации плаз-малеммы"(6 час), что отмечается в литературе (Leonard, 1972; Gronewald,- 1979, 1982; Cerana, 1981), и к снижению потребления кислорода.

Возможно, что в основе описанных явлений лежит механизм активации ионных насосов плазмалеммы, и прежде всего Н+-АТФаз (Лялин, 1979; Gronewald, 1979; Воробьев, 1980; Полевой, 1980; Шахов, . 1987). Это приводит к увеличению расхода АТФ. Таким образом, мы полагаем, что снижение внутриклеточного уровня АТФ в первые часы инкубации отражает не нарушение синтеза высокоэнергетических соединений, а их интенсивную трату на работу ион-переносящих систем и восстановление нарушенного го-меостаза. Параллельно происходит и переход клеток отсеченных корней в новое метаболическое состояние (Пахомова, 1S85; Гордон, 1992), характеризующееся экономичным режимом работы .энергетического аппарата, о чем можно судить по снижению потребления кислорода и по уровню внутриклеточного АТФ (уровень АТФ снижается) к 6 часу инкубации.

Проведенное электронномикроскопическое исследование клеток отсеченных корней пшеницы выявило, что изменения в* мембранных структурах на протяжении всех б часов инкубации незначительны. Митохондрии в клерках овальной или округлой формы, со средней плотностью матрикса и многочисленными нечетко очерченными кристами (ортодоксальный тип). Следовательно, ни сам процесс отсечения корней от проростков, ни дальнейшая их инкубация в растворе СаС1г существенным образом не отражается на структуре органелл. Лишь к 4 часу, когда в клетках происходит восстановление мембранного потенциала, поглощение ионов К+ и увеличение содержания АТФ, матрикс слегка уплотняется, кристы становятся четко очерченными. Такая структура соответствует активно работающим митохондриям (Hackenbrok,1981). Эти изменения наблюдаются не более часа, после чего органеллы вновь приобретают ортодоксальный вид.

ТАБЛИЦА 1

Влияние 2,4-ДНФ на содержание АТФ (мкМ/г сыр.вещества) в клетках корней пшеницы

исходные: 16,3 + 0,5

Время (час) Контроль 2,4-ДНФ -2,4-ДНФ

(5-10"5М) (10~4М)

0,4 13,81 ± 1,7 8,77 + 2.8 3,05 + 0,4

1 4,2.3 ± 0,6 2,99 ± 0,02 1,54 ± 0,2

2 2,67 ±0,5 2,40 ±.0,19 1,89 ± 0,3

3 2,39 + 0,4 2,66 + 0,30 2,04 ± 0,19

4 8,19 + 0,8 5,48 ± 0,50 4,57 + 0,46

5 3,88 ± 0,4 4,48 + 0,47 1,58 + 0,2

6 ,2,25 + 0,5 2,59 ± 0,20 1", 17 + 0,18

Оий/Ьч

1500.00 т 2

0.00 -I-1-1-1-1-т-1

0.00 1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00

час

Рис. 3. Интенсивность потребления кислорода клетками

корней пшеницы при инкубации с 8,4-ДНФ (5-Ю"5 М) —- контроль; - - - 2,4-ДНФ.

2. Изменения в клетках корней пшеницы при действии 2,4-ДНФ в концентрации 5"Ю-5 М

. О разобщающем эффекте 2,4-ДНФ как in vitro, так и in vivo в основном судят по стимуляции потребления Ог, однако к такому же результату приводит и активация окислительного фосфорилирования, особенно это относится к целым клеткам, .внутри которых условия не могут контролироваться исследователями. Кроме того, 2,4-ДНФ вызывает ряд эффектов,' не связанных с разобщением окислительного фосфорилирования, в частности, деполяризацию плазмалеммы с последующим возрастанием ее сопротивления (Лялин, 1979; Воробьев, 1982), увеличение проницаемости клеточных мембран для ионов (Шарытев,1979; Jackson, 1982-, Грабов, 1990; Касумов, 1992; Опрйтов, 1993), изменение липид-ного состава (Jackson, 1982).

Значительные изменения в структуре и функциях клетки наблюдаются уже через 15 мин, от начала воздействия 2,4-ДНФ. Прежде всего происходит снижение мембранного потенциала (рис.1) и нарушение ионного гомеостаза. клетки, в частности, увеличение проницаемости для ионов калия. При этом выход ионов К+ в среду, . фиксируемый нами через 1 час. инкубации, значительно выше, чем в контроле (рис.2). Мы-полагаем, что эти эффекты, вызываемые 2,4-ДНФ, обусловлены в первую очередь его действием на плазматическую мембрану в качестве протонофора. Подобного мнения придерживается и ряд других исследователей (Jackson, 1*982; Hobmle, 1987).

2,4-ДНФ способствует поступлению ионов Н+ внутрь клеток, о чем свидетельствует подщелачивание среды инкубации Стаб. 2). В ответ на зачисление цитоплазмы происходит активация работы Н+-АТФаз на плазмалемме. Они начинают выкачивать поступившие протоны в наружную среду (Калинин, 1979; Конев, 1985; Скула-чев, 1989; Опрйтов, 1993). Активация АТФазных систем сопровождается увеличением расхода АТФ, что мы реально наблюдаем в наших экспериментах (таб.1). Снижение уровня АТФ происходит уже в течение первых 15 мин. и продолжается на протяжении 2-х часов инкубации. Подобные результаты'были получены Калининым В.А. с сотрудниками (1979). Мы-полагаем, 'что столь быстрое

- 11 -

ТАБЛИЦА 2

Влияние 2,4-ДНФ на рН среды инкубации

Варианты Iисходный рН 1 1 1____ Время (час)

! ! 1 2 5 6

2,4-ДНФ (5-10 "5 М) СаС1г 5.6 5.6 6.3 6.0 6.2 6.0 6.5 6.2 6.7 6.4

2,4-ДНФ (Ю-4 М) СаС1г 4.5 4.5 5.9 5.4 '6.1 ¿.5 6.2 5.9 6.2 51 в

снижение количества АТФ в клетках не связано с нарушением его синтеза. Того же мнения придерживаются и другие авторы (Калинин, '1979). Вероятнее предположить, что при действии 2,4-ДНФ активируется работа Н+-помп,1 которые стремятся восстановить исходное значениечто приводит к увеличению расхода АТФ.

Параллельно с падением мембранного потенциала, уровня АТФ и выходом в среду ионов К+, наблюдается увеличение потребления кислорода. Причем, стимуляция дыхания сохраняется на протяжении всех 6 часов инкубации с 2,4-ДНФ (рис. 3), и обнаруживается два пика - через 1 час. (30-40%) и через 5-6 часов (40-50%). Мы полагаем,' что наблюдаемое нами усиление потребления Ог связано со снятием ограничения дыхания со стороны фосфорилирующих систем и активацией процессов окислительного фосфорилирования. В результате ускоряется транспорт электронов в ЭТЦ (стимуляция дыхания), то есть митохондрии переходят в активное метаболическое состояние. Это сопровождается кон-формационными перестройками мембран. Если в клетках корней контрольных растений присутствуют органеллы ортодоксального тила, то уже через 15 мин действия 2,4-ДНФ митохондрии конденсируются, их матрикс уплотняется, кристы набухают и становятся ярко очерченными. Такая структура сохраняется на протяжении всего опыта, а к 5-6 часам частично возвращается к норме - в клетках наряду с митохондриями конденсированного типа находятся органеллы ортодоксальной конформации.

- 12 -

По-видимому, конденсированная структура митохондрий соот-етствует усилению процессов окислительного фосфорилирования. 5 этом свидетельствуют и данные по изменению содержания в летке АТФ. Через 4 часа после начала воздействия 2,4-ДНФ ровень АТФ в клетках увеличивается (по сравнению с 1-3 часа-и), хотя и в значительно меньшей степени, чем в контроле, ледовательно, в течение первых часов инкубации с 2,4-ДНФ не роисходит его непосредственного воздействия на митохондрии, процесс фосфорилирования не нарушается, а напротив, наблю-зется даже его активация.

Последнее подтверждается восстановлением' мембранного по-энциала и поглощением вышедших ионов К+ из инкубационной реды к 7-8 часам.

Подводя итог вышеизложенному, можно заключить, что в ин-актных системах 2,4-ДНФ в концентрации 5'10~5 М не действует ак разобщитель окислительного фосфорилирования, поскольку не эстигает митохондрий, а наблюдаемая стимуляция дыхания 30-602) соответствует активации процессов окислительного эсфорилирования. Мы считаем, что изменения, которые наблюда-гся в структуре и функциях клеток, вызваны действием динит-эфенола как протонофора на плазматические мембраны.. Исполь-эвание такой концентрации на целой ткани для определения яергетической эффективности дыхания мы считаем нецелесооб-азным.

3. Изменения в клетках корней пшеницы при действии критических концентраций 2,4-ДНФ (10~4 М)

При работе с целыми тканями, необходимо иметь в виду, что роме действия 2,4-ДНФ на плаэмалемму возможно множество ругих побочных эффектов (особенно при использовании высоких энцентраций). По данным ряда авторов, эффективность тормозя-эго действия на дыхание высоких доз разобщителей не коррели-/ет с их разобщающей способностью и действием на мембраны Зкулачев, 1969; Humphreys, 1975). В связи с этим нами была гтально рассмотрена природа подавления и стимуляции дыхания азобщающим агентом, при этом исследовались динамика физиоло-

- 13 -

Рис. 4. Влияние 2,4-ДНФ (Ю-4 М) на изменение мембранног потенциала в клетках корней пшеницы - контроль; - - - 2,4-ДНФ.

чдс

Рис. 5. Влияние 2,4-ДНФ (Ю-4 М) на выход в среду, инкубации ионов К+ - контроль; --- 2,4-ДНФ,

у

ических и структурных изменений в клетках отсеченных корней :ри действии критической концентрации-2,4-ДНФ (Ю-4 М).

Воздействие 2,4-ДНФ на отсеченные корни пшеницы приводит : резкому снижению мембранного потенциала, уже черев 15 мин. еполяризация составляет около 50 мВ и держится приблизи-ельно на одном уровне в течение всего эксперимента (рис. 4). дновременно происходит и значительная потеря клетками эндо-енных ионов калия (рис. 5). К первому часу выход в среду онов калия приблизительно в 2 раза превышал контрольные зна-ения. На этом фоне происходит подщелачивание среды инкубации таб. 2).

Инкубация корней в растворе критической концентрации ,4-ДНФ приводит и к более существенному снижению уровня АТФ таб.1), в первые 15 мин он ниже контрольного приблизительно 4 раза. Факты уменьшения количества внутриклеточного АТФ на оне снижения мембранного потенциала и увеличения проницае-ости клеточных мембран отмечаются в ряде работ (Чиркова, 983; Lew Roger, 1984). Мы полагаем, что такой значительный асход АТФ связан с более сильным воздействием 2,4-ДНФ на лазматическую мембрану как протонофора в сравнении с низкой энцентрацией. Таким образом, 2,4-ДНФ, способствуя значитель-эму поступлению протонов внутрь клетки, снижает рН цитоплаз-ы, что является одной из основных причин активации Н+-АТФаз.

Исследование изменений ультраструктуры митохондрий поэво-яет заключить, что 2,4-ДНФ в первые часы еще lie оказывает на их непосредственного воздействия, и снижение АТФ не отражает арушения их функций. Митохондрии на протяжении 4-5 часов ин-/бации имеют конденсированную структуру, а такое конформаци-чное состояние йнутренней мембраны характеризуется как бога-зе энергией (Hackenbrok, 1981).

Следовательно, на протяжении всех 4 часов непрерывного гйствия 2,4-ДНФ идет активная выработка АТФ на фоне значи-эльных расходов энергии на нужды клетки. Доказательством мо/т служить данные о том, что к 4 часу происходит даже некото-зе накопление фонда внутриклеточного АТФ (относительно пер-эго часа), что было бы невозможно при нарушении функций ми-эхондриального аппарата.

1500.00 л 1200.00 900.00 г.00.00 -Л00.00 -

02, мкл/г-ч

0.00

X

-1-1-1-1-1-1

0.00 1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00

час

Рис. 6. Интенсивность потребления кислорода клетками

корней пшеницы при инкубации с 2,4-ДНФ (1СГ4 М) - контроль; - - - -2,4-ДНФ.

..Изменения электрогенеза клеток и связанные с этим сдви: ионных потоков являются, вероятно, одной из причин изменен и в дыхательном газообмене (рис. 6). В течение первых час инкубации с 2,4-ДНФ интенсивность потребления' кислорода он жается на 20-30%. Торможение дыхания на фоне действия высок доз разобщителя нйблю'далось многими исследователями (Бабако 1968;' Скулачев, .1969; Ратников, 1972; Рубин, 1974; Поляков 1983; Усманов, 1987; Маркова, 1989), и большинство из и связывает этот процесс с торможением работы ряда ферментов, выключением дыхания и повреждением мембран самих митохондр» В наших экспериментах действие в течение первых 4 час 2,4-ДНФ в концентрации 10~4 М, по-видимому, не вызывает пс реждащего воздействия на органеллы. Таким образом, наблю; ется парадоксальное явление - снижение потребления кислорс

-16 -

а фоне интенсивного производства митохондриями АТФ. Предпо-ожительно это явление можно объяснить следующим образом. В ервые часы действия яда в клетки поступает значительное отечество 'ионов Н+, в результате чего цитоплазма закисляется. [ротоны начинают поступать в митохондрии по искусственно соз-анному градиенту (происходит своеобразный "подпор" митохонд-1ИЙ поступившими в клетку протонами), за счет чего может проводить усиление синтеза АТФ (Маленкова', 1984; Скулачев, 989). В сложившейся ситуации митохондриям не нужно создавать ¡лектро-химический градиент на мембране. При этом ф©«^ работа !ТЦ может затормаживаться, а интенсивность потребления кисло- " юда снижаться. Поступающие в органеллы протоны будут выво-;иться за счет работы АТФаз. В литературе встречаются сведе-гия о том, что на фоне подкисления цитоплазмы под влиянием )азличных соединений (в том числе 2,4-ДНФ), происходит сниже-[ие интенсивности дыхания (Барский, 1989). В последнее„время шимание многих исследователей привлекает проблема роли рН [итоплаямы в запуске ответных реакций клетки на различные юздействия (Борин, 1988; Гуковская, 1988).

Доказательством того, что ингибирование дыхания нн связано_ : нарушением работы энергопроизводящей системы, служит приос-'анавливание выхода ионов К+ в инкубационную среду (первые 4 [аса), а в ряде случаев наблюдается даже небольшой "закачива-[ие" вышедших ионов. Кроме того, в это время происходит неко-'орая стабилизация .мембранного потенциала и увеличение пот->ебления кислорода, которое к 4 часу достигает контрольных шачений. Мы полагаем, что все процессы, которые наблюдаются 5 течение первых 4 часов инкубации корней с 2,4-ДНФ .(10 -4М), :вязаны с его воздействием на плазматическую мембрану, так же сак и при действии низкой концентрации (5'10~°МЬ Отличие юстоит лишь в силе воздействия, а следовательно, и р степени ¡арушения проницаемости плазмалеммы.

Длительное присутствие в среде инкубации 2,4-ДНФ высокой

концентрации приводит к тому, что после 4 часа наблюдается

(альнейшее снижение мембранного потенциала, увеличение потерь

¡нутриклеточных ионов К+, крпмн того, происходит резкое уве-

шчение потребления кислорода. По всей видимости, все яти фи-

_ 1 ^ —

чапологические изменения являются отражением процесса разобщения окисления и фосфорилирования в митохондриях. При этом необходимо обратить внимание на то, что процент стимуляции дыхания в этом случае составляет порядка 250%.

Создается впечатление, что 2,4-ДНФ после первоначальное воздействия на плазмалемму постепенно поступает в клетку. ОС этом можно судить и по изменениям ультраструктуры. Происходя1] значительные изменения в эндоплазматическом ретикулуме (ЭДР' ко второму часу инкубации. Наблюдается пролиферация мембран I их концентрическое закручивание. Подобные изменения в клетка) корней наблюдались при действии мембранотропного соединена аминазина (10~4 М) (Полыгаюва, 1984).

Данные по динамике ультраструктурных изменений митохондри] также свидетельствуют о том, что в первые часы 2,4-ДНФ н< оказывает на них непосредственного воздействия. На протяженш 4-5 часов инкубации митохондрии сохраняют конденсированны] вид, а к 6 часу'органеллы становятся неправильной формы, происходит их набухание, сильное просветление матрикса и резко! снижение количества крист. Подобная структура при полном ра - зобщении окислительного фосфорилирования наблюдается в ряд| исследований, проводимых как на выделенных митохондрия (МигсаЬеПо, 1975), так и на целой ткани (Лейкина, 1977).

Исходя из представленного материала мы полагаем, что вс эффекты, вызываемые действием 2,4-ДНФ в критической концент рации (Ю-4 М) на корневые клетки в первые часы (деполяриза ция плазмалеммы, нарушение проницаемости, снижение уровн АТФ), связаны с непосредственным воздействием его на плазма тическую мембрану в качестве протонофора. К 5-6 часам, когд защитные системы клетки не справляются с оказанным воздейс твием, наблюдаются эффекты непосредственного воздействи 2,4-ДНФ на митохондриальный аппарат, т.е. разобщение окислу тельного фосфорилирования, что характеризуется высокой сте пенью стимуляции дыхания, значительными потерями эндогенног калия, низким уровнем мембранного потенциала и АТФ и специф» ческими изменениями ультраструктуры митохондрий.

Г Л А В А IV. ВОЗМОЖНОСТИ ФОРМИРОВАНИЯ АДАПТИВНЫХ И ПАТОЛОГИЧЕСКИХ ПРОЦЕССОВ ПРИ ИЗМЕНЕНИИ ПРОТОННОЙ ПРОВОДИМОСТИ

ПЛАЗМАЛЕММЫ

При анализе результатов наших исследований по воздействию ;а отсеченные корни пшеницы 2,4-ДНФ в различных концентрациях !етко выявилась фазность ответной реакции, 0 принципе двух->азного реагирования живых систем указывается в работах многих исследователей (Муртази, 1959; Жолкевич, 1968; Кондрашо-1а, 1987.; Александров, 1985). Любая живая система по мере 'силения или удлинения срока действия раздражителя сначала юпытывает возбуждение (стимуляция физиологической деятель-юсти), а затем торможение (угнетение физиологической дея-■ельности). Нами были зафиксированы две фазы в развитии от-зетной реакции клеток корней пшеницы на воздействие 2;4-ДНФ.

На протяжении первой фазы (первые 4 часа) картина ответной реакции на действие 2,4-ДНФ в двух различных концентрациях ;5-Ю-5 М и 10~4 М) однотипна. Происходит снижение мембранного потенциала, сопровождающееся выходом в среду инкубации ио-юв К+, уменьшение Фонда внутриклеточного АТФ и специфические юрестройки ультраструктуры. При этом необходимо отметить, 1То эти изменения находятся в зависимости от интенсивности юздействия: чем выше используемая концентрация 2,4-ДНФ, тем значительнее нарушения физиологических функций.

Смещение ионного баланса в клетке может служить сигналом к зключению защитных реакций, направленных на устранение оказы-заемого воздействия. В частности, увеличивается энергсзависи-лый транспорт через плазмалемму (активация АТФаз) (Скулачев, 1969, 1972, 1989; Конев, 1988; Полевой, 1989; Опритов, 1993 и цр.), способствующий восстановлению нарушенного гомеостаза, сохранению клеточных систем и их жизненно важных функций. В результате этих реакций мы и наблюдаем восстановление (до некоторого уровня) мембранного потенциала, прекращение или приостановку выхода ионов К+, возрастание потребления кислорода, повышение уровня внутриклеточного АТФ к 4 часу инкубации. По всей видимости, в наших экспериментах именно 4 час является переломным в развитии ответной реакции клеток корней пшеницы

- 19-

Бп,п*

30.00 1 И I I I I I I I 1 11 1 1 1 "" I I' 1 "" 1 1 I " 1 I п I II |1 I П I I I Щ1 I I I......

0.00 1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00

час

Рис. 7. Изменение мембранного потенциала на фоне лостоянноп действия 2,4-ДНФ (10~4М) и'после удаления протонофо из среды инкубации

-. контроль; - .- - 2,4-ДНФ; \ "*смена раствора.

100.00 90.00 80.00 70.00 -60.00 -50.00 -40.00 '30.00 г 20.00 -10.00

К* мкзкь/г

0.00

£

0.00 1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 . 6.00

' час

Рис; 8. Выход ионов К* из клеток корней пшеницы на фоне постоянного действия 2,4-ДНФ (10"4М) и после удаления протонофора из среды инкубации - контроль; - --- 2,4-ДНФ; \-*смена раствора.

отсечение и последующее действие 2,4-ДНФ. К 4 часу происходит накопление клеткой некоторого энерге-4еского потенциала для перехода в иное физиологическое сос-*ние.- При этом в контрольном варианте к 6 часу инкубации леченных корней восстанавливается нарушенный гомеостаз этки и осуществляется переход на новый стационарный уровень ахомова,Гордон, 1984 ). При более значительных нарушениях, 1ример, изменении протонной проводимости плазмалеммы 4-ДНФ, этот стационарный уровень будет отличен от контроль-го, а в зависимости от силы воздействия возможны варианты.

фоне низкой.концентрации (5'10~5М) происходит частичная эмализация клеточных функций, а воздействие- критической здентрации (Ю-4 М) приводит в конечном итоге к значитель-л повреждениям клетки, которые становятся заметными к 6 ча-инкубации, т.е. происходит "срыв" адаптивных процессов. Подтверждением того, что в первые 4 часа инкубации с про-яофором в клетках не происходит нарушения важнейших физио-гических функций, и прежде всего энергетических, могут слу-гь данные экспериментов по удалению 2,4-ДНФ (в концентрации ~4 М) из среды инкубации (замена на контрольный раствор 312)• Смену растворов проводили через 3 часа, так как более эдолжительное воздействие высокой концентрации, скорее все, приводит к необратимым изменениям в метаболизме. При этом по установлено, что интенсивность дыхания через 3 часа пос-"отмывки"_приближается к контрольному уровню (рис. 9), е. предотвращается гигантская стимуляция (200-250%), кото-я наблюдается при непрерывном действии 2,4-ДНФ. Восстанов-ние мембранного потенциала наблюдается уже через 1 час пос-смены растворов (рис. 7 ), при этом происходит приостанов-выхода ионов К+ в инкубационную среду (рис. 8 ). Таким об-зом, можно говорить о том, что изменения, произошедшие в етках к 3 часу инкубации,обратимы.

Подводя итог, можно заключить, что первая фаза - это ответ еток на изменение протонной проводимости плазмалеммы. На ой стадии не вызывает сомнений защитный, приспособительный рактер ответнсй реакции клетки на воздействие. После неко-рого периода подъема метаболической активности наступает

- 21 -

1500.00

1000.00

500.00

0„ икА/г-ч

0.00 1-1-1-1-1-1-г->

0.00 1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00

час

Рис. 9. Интенсивность потребления кислорода клетками корнеу пшеницы на фоне постоянного действия 2,4-ДНф (10~4>> и после удаления.протонофора из среды инкубации - контроль; - - - 2,/4-ДНФ; \ смена-раствора.

стадия нормализации (4 час), сопровождающаяся увеличением п. раметров, характеризующих физиологическое состояние клетк Продолжительность первой фазы определяется не только уровн энергетического потенциала, а будет зависеть также и от и тенсивности воздействия. Далее происходит переход во втор фазу. При.действии низкой концентрации 2,4-ДНФ клетки корн адаптируются и переходят в новое физиологическое состояни При действии же высокой концентрации адаптации не происходи что приводит в конечном итоге к гибели.

ОСНОВНЫЕ ВЫВОДЫ

1. 2,4-ДНФ в концентрации 5-Ю"5. М и Ю-4 М, являясь гсротонофором, в первую очередь воздействует на плазматическую мембрану клеток, изменяя ее проницаемость, вследствие чего нарушается ионный гомеостаз, и все наблюдаемые в первые часы воздействия изменения структуры и функций клетки, связаны с зго восстановлением. ,

2. Вызываемая 2,4-ДНФ в концентрации '5•Ю-5 М при рН 5.6 в клетках корней пшеницы стимуляция- потребления кислорода -30-60% является отражением активации' работы митохондриально-го аппарата и усилением синтеза АТФ, а увеличение потребления кислорода - 150-250%, которое наблюдается при воздействии концентрации Ю-4 М при рН 4.5 - есть признак разобщения окислительного фосфорилирования.

3. Конденсация митохондрий при действии 2,4-ДНФ связана с усилением процессов окисления и фосфорилирования, а сильное просветление матрикса, значительное снижение количества крист (вплоть до их исчезновения) - с разобщением этих двух процессов.

4. Явления, наблюдаемые нами после 4 часов действия на клетки отсеченных корней пшеницы 2,4-ДНФ в концентрации 5-Ю-5 М,свидетельствуют о происходящих в клетках процессах адаптации и репарации.

5. Ингибирование дыхания в течение первых часов при воздействии 2,4-ДНФ в концентрации 10~4 М не связано с нарушением целостности .митохондрий.

6. Установлено, что клетки отсеченных корней пшеницы адаптируются к воздействию 2,4-ДНФ в концентрации 5'Ю-5 М, при этом происходит их переход на новый дискретный стационарный уровень. В случае с действием 2,4-ДНФ в концентрации 10~4 М наблюдается "срыв" адаптивных процессов (после 4 часа).

7. 2,4-ДНФ не может быть использован на целой ткани как

разобщитель окислительного фосфорилирования в концентрации,

которая вызывает стимуляцию дыхания 30-60%, но может служить

хорошим инструментом для направленного изменения протонной

проводимости плазмалеммы. Использование же концентрации, которая приводит к разобщению окислительного фосфорилирования

на целой ткани нежелательно, так как при этом 2,4-ДНФ оказывает в клетке множество побочных эффектов.

Основное содержание диссертации опубликовано в работах: 1. Полыгалова 0.0., Гордон Л.X., Алексеева В.Я., Ценце-вицкий А.Н.. Упшинская И.В. Структурно-функциональные изменения в клетках корней пшеницы при действии низкой концентрации 2,4-ДНФ// Тез.докл. VI Всесоюзн. симпозиума "Ультраструктура растений", г. Киев, 1988. С. 169.

2. Полыгалова 0.0., Гордон Л.Х., Алексеева В.Я., Ценце-вицкий А.Н., Упшинская И.В. Ответная реакция клеток корней пшеницы на воздействие высокой концентрации 2,4-ДНФ// Тезисы докл. VI Всесоюзн. симпозиума "Ультраструктура растений", г. Киев, 1988. С. 169.

3. Полыгалова 0.0., Гордон Л.X., Бутакова И.В., Алексеева В.Я., Ценцевицкий А.Н., Швец И.М. О неоднозначности эффектов 2,4-ДНФ.на уровне целой растительной ткани// Физиология и биохимия-культурных растений. 1991. Т. 23. N 4. С.343-349.

4. Полыгалова 0.0., Гордон Л.Х., Бутакова И.В., Алексеева

B.Я., Ценцевицкий А.Н. Адаптация клеток корней пшеницы к измененной протонной проводимости плазмалеммы// Тез. докл. и сообщ. на Всесоюзн. совещании "Клеточные механизмы адаптации", Чернигов, 22-24 апр., 1991. Цитология. 1991. Т. 33. N 5.

C. 127.

5. Бутакова И.В., Полыгалова 0.0., Гордон Л.Х. О фазности физиологических процессов в клетках отсеченных корней пшеницы при нарушении протонной проводимости// Тез. докл. III съезд Всесоюзн. общ. физиологии растений. С.-Петербург, 1993. 0. 71.

6. Гордон. Л.X., Алексеева В.Я., Минибаева Ф.В., Лыгин А.В., Николаев Б.А., Полыгалова 0.0., Фильченкова В.И..'Балашова Т.К., Бутакова И.В.Переходные процессы при адаптивном старении отсеченных корней// Тез. докл. и сообщ. на Всесоюзн. совещании "Клеточные механизмы адаптации", Чернигов, 22-24 апр., 1991. Цитология. 1991. Т. 33. N 5. С. 88. ^^Г^/У

Сдано в набор 04.04. 94 г. Подписано в печать 06.04.94 г. Форм.бум. 60 х 84 1/16. Печ.л. 1. Тираж 100. Заказ 125.

Лаборатория оперативной полиграфии КГУ.420008 Казань, Ленина, 4/5