Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Структурно-функциональные характеристки субфрагмента-1 миозина скелетных мышц

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Структурно-функциональные характеристки субфрагмента-1 миозина скелетных мышц"

академия наук украшу Институт Окохкмии им. А.В.Паыадииа

на правах рукописи

БАБИЙЧУК Эдуард Бориславоаич

СТтТУРКО-ФУНКЩЮНАЛЬНЬЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ СУБ®АГМЕНТА-1 МИСШНА СКЕЛЕТНЫХ ШЛЩ

03.00.04 - биохимия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Киев - 1992

Работа выполнена в ЩИ физиологии Киевского университета «м.Тараса Шевченко

Научный руководитель: кандидат биологических наук

А. и. Силенко

Официальные оппоненты: доктор биологических наук С. А. Костерил доктор биологических наук Н.С. Мирошниченко

Ведущая организация: Институт физиологии им. А.А.Богомольца АН Украины

Зада» состоится " ШСК<-(_1992 г.

в М^У часов на заседании специализированного Совета К 016.07.01 по присуждению ученой степени кандидата биологических наук в Институте биохимии им. А. В. Палладии» АН Украины (262030, Киав-30, уд. Леонтовича, 0 )

С диссертацией можно ознакомиться в библиотека Института биохимии им. А.В.Падладина АН Украины.

Автореферат разослан " " 1 ¿¿/"¿Л 1002 г.

Ученый секретарь специализированного Совета кандидат биологических вдук ¿и^с^**-. О.В.Кирсенко

овдая характеристик работы.

Актуальность проблемы. Одним из основных свойств живого является ч способность к движению, наиболее специализированной формой которого-является мышечное сокращение. Процесс мышечного сокращения обеспечивается за счет скольжения друг относительно друга двух типов нитей: толстых - миозиновых и тонких -актиновых, причем активную роль при таком скольжении играет миозиновая нить, формирующаяся в результате агрегации отдельных молекул миозина.

Молекула миозина состоит из двух тяжелых и четырех легких цепей. Тяжелые цепи образуют стержневую часть молекулы ("хвост"), ответственную за образование биполярных миозиновых нитей, и две глобулярные головки , с которыми ассоциированы легкие цепи ("существенные" и "регуляторные" - по две легкие цепи на каждую головку) (Левицкий,1987). Головки являются наиболее важными в функциональном отношении частями миозина: на них расположены активные центры миозиновой АТФазы и центры связывания актина. Между стержневой частью и головками миозина имеется гибкий шарнирный участок, благодаря которому головки могут перемещаться относительно оси толстой филаменты. При взаимодействии с АТФ и актином молекула миозина претерпевает ряд ответственных за генерацию силы информационных изменений. До недавнего времени было принято, что такие (информационные изменения локализованы в шарнирном участка (Perry,1979). Однако в последнее время появляются данные, заставляющие вносить существенные коррективы в гипотезу о молекулярном механизме мышечного сокращения (Toyoshlma et al.1987) и позволяющие сдэ-аать вывод о том, что участки, ответственные за генерацию движения, находятся внутри головки миозина. В связи с этим особо актуальным представляется исследование структурной организация головки миозина и связанных с ней особенностей формирования и функционирования активных центров.

Накопившиеся к настоящему времени литературные данные свидетельствуют о том, что АТФаэный центр миозина имеет слод-?ую структуру и формируется за счет взаимодействия между собой отдельных доменов тяжелых цепей головки миозина. В структуре ИФагного центра разл:гчаит участок связывания полифосфата и 'гидрофобный карман", ответственный за связывание основания

(Audemard et al.1988). Однако остается открытым вопрос о роли и.характере изменений структуры "гидрофобного кармана" АТФаз-ного центра на различных стадиях гидролиза АТФ миозином; до сюс пор нет удовлетворительного объяснения механизма действия модифицирующих АТФазу веществ, ее субстратной специфичности и ряда других характеристик.

Другой вопрос, связанный с работой головки, относится к изучению . роли легких цепей миозина в формировании структуры * головки и в регуляции взаимодействия между миозином и актином. Регуляторные легкие цепи в некоторых типах мышц и немышечных . клеток принимают непосредственное участие в регуляции взаимодействия миозина с актином. В гладких мышцах позвоночных такая регуляция осуществляется путем фосфоршшрования регуляторных легких цепей специфическим ферментом - киназой легких цепей миозина. В поперечно-полосатых мышцах позвоночных Са2+-регуляция сокращения осуществляется иным путем - при помощи тропо-нин-тропомиозиновой системы, ассоциированной с актиновыми нитями. В то же время известно, что аналогичные "регуляторные" легкие цепи миозина скелетных и сердечной мышц (ДТНЕ-ЛЦ) также способны связывать Са2+ и фосфорилиропаться, однако непосредственного участия в регуляции запуска сокращения мышц они не принимают.

Исходя из вышеизложенного, представляется актуальным получение ответа на вопросы о роли "регуляторных" легких цепей в функционировании миозина скелетных мышц, а именно: влияют ли ДТК6-легкие цепи на конформацию его головки? Принимает ли они участие в регуляторных механизмах актин-миозинового взаимодействия? *

Неясными до сих пор остаются и вопросы о том, какую роль играют "существенные" (щелочные) легкие цепи в формировании нативной структуры миозина вообще и функционировании его активных центров в частности.

На некоторые из перечисленных выше вопросов мы попытались ответить в настоящей рабо.те.

Дели и задачи исследования.Работа посвящека игучен'яв роли легких цепей миозина в стабилизации структуры и функционировании головки ыиозиновой молекулы из быстрых скелетных мышц кролика, а также изучении особенностей организации и функционирования АТФааного центра миозина.

Основное внимание было уделено решению следующих задач:

- наладить методы выделения миозина и его протеолитических фрагментов: препаратов тяжелого меромиозина, содержащих полностью фосфорилированные или полностью дефосфорилиро-ванные ДТНБ-легкие цепи; препаратов субфрагмента-1 миозина (изолированных головок миозина), содержащих различные наборы легких цепей; препаратов изолированных тяжелых цепей головки миозина;

- провести сравнительные исследования АТОазной активности и температурной стабильности препаратов субфрагмента-1 (С1) миозина, содержащих разлотные наборы легких цепей, и препаратов изолированных тяжелых цепей С1 миозина;

- исследовать влияние связывания Са2+ и фосфорилироззния ДТНВ-легких цепей на чувствительность препаратов мзюэина и тяжелого меромиозина (ТШ) к ограниченному трипсиноли-эу;

- проЕести сравнительное исследование температурной стабильности триптических фрагментов тяжелых цепей С1 миозина;

- изучить влияние различных нуклеозидтри- и нуклеозидди-фосфатов (НТФ и НДФ) на температурную стабильность препаратов И миозина.

Научная новизна работы. В настоящей работе впервые показано, что фосфоршзирование ДТНБ-легких цепей миозина и связывание ими Са2+ способны вызывать информационные изменения тяжелых цепей головки миозина при его взаимодействии с актином. Такие изменения затрагивают структуру фрагмента тяжелой цепи' головки миозина с мол.массой 50кДа (50К), который принимает непосредственное участие в формировании актинсвязывавдего и АТФазного центров.

Впервые проведены сравнительные исследования влияния различных нуклеозидтри- и куклеозиддифосфатов на стабильность фрагмента БОК при воздействии на него повышенных температур. На основании полученных результатов сформулирована гипотеза о двух состояниях "гидрофобного кармана" АТФазного центра миозина, реализующихся, по-видимому, на различных стадиях гидролиза АТФ миозином. На стадии образования "долгоживущего комплекса" М**АДФ 'Он (миозин-АДФ-неорганический фосфат) взаимодействие осуществляется между полярными группами кольца аденина и комп-

лементарныыи группами АТФазнего центра. На стадиях, предшествующих гидролизу АТФ и следующих ва стадией распада "долгожи-вущего комплекса", АГФазньш центр связывает яукяеотщ за счет слабых гидрофобных взаимодействий.

Практическая значимость работы. Полученные результаты вносят существенный вклад в понимание тонких механизмов,-лежащих в основе элементарного акта мышечного сокращения и,' следовательно, углубляют понимание физико-химических основ сократительной деятельности мышц в целом. Они могут быть использованы специалистами в области биохимии, биофизики и молекулярной биологии, занимающимися проблемами биологической подвижности.

Результаты используются при чтении курса лекций "Биофизика мышечного сокращения и клеточной подвижности" на кафедре биофизики Киевского университета им.Тараса Шевченко.

Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы были представлены и обсуждены на Б-ом Украинском биохимическом съезде (Киев,1987); 8-ом и 9-ом Всесоюзных симпозиумах "Биофизика и биохимия биологической подвижности (мышечное сокращение)" (Пущино,1987,Тбилиси,1990); 6-ой Всесоюзной конференции по биохимии мышц (Тбилиси,1989); XX Европейской конференции по мышечному сокращению.и клеточной подвижности (Великобритания, Оксфорд, 1991) . По материалам диссертации опубликовано 20 работ.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания методик экспериментов, изложения полученных результатов и их обсуждения, -выводов. Работа изложена на 128 страницах, включая 25 рисунков, 1 таблицу и список цитируемой литературы из 204 наименований.

идтдошы м мвтода иссвдованкя.

Ыиозин из скелетных мышц кролика выделяли согласно методике, описанной в работе (Тартаковский,1978) с некоторыми модификациями.

Выделение полностью фосфорилированного и полностью де-фосфорилированного миозина и ТШ из скелетных мышц кролика проводили в соответствии с методикой (Stepkovski et al-,1985) с некоторыми,модификациями (Bablychuk et al.,1991).

Для выделения Cl, содержащего регуляторные легкие .цепи .(Мг-С1), и не содержащего регуляторных легких цепей (ЭДТА-С1) га основу принимали методику, описанную в работе (Margosslen &

Lovey,1973). Некоторые этапы были модифицированы (Бабийчук и др.,1990). ;

Изолированные тяжелые цепи С1 получали в основном по методике, описанной в работе (Slvaramakrishnan & Burke,1983) с нашими модификациями (Бабийчук и Гарбарент,1989).

Актин из скелетных мышц кролика ползали из ацетонового порошка по методике, описанной в работе (Хай-глина, 1978).

Измерение собственной триптофановой флуоресценции белков проводили на установке, сконструированной в нашей лаборатории (Филенко и Зима,1937). Изменение общей флуоресценции белков регистрировали также с помощью спектрофотометра Specord М 40. За развертыванием белка в процессе термической денатурации следили по изменении светорассеяния с помощью указанной выше установки или с помощью спектрофотометра Specord М 40.

Ограниченный трипсинолиз исследуемых препаратов проводили при температуре 25°С при весовом соотношении белок : трипсин -100:1. Трипсинолиэ останавливали, добавляя в раствор соевый ингибитор трипсина в отношении трипсин : ингибитор - 1:2, или равный объём кипящего денатурирующего буфера, • содержащего (в ммоль/д): НзВ0з-770, тристНС1-200 (рН7.0); SZ додецилсульфата натрия (SCNa); юх меркаптоэтанола и 40£ сахарозы. После проведения электрофореза, окрашивания и отмывки несвязавшегося красителя окрашенные полосы геля, соответствующие фрагменту БОК, вырезали и помещали для экстракции связавшегося красителя б раствор, содержавший 40% изобутилового спирта и 10Z трихло-руксусной кислоты. Количество белка из соответствующей полосы геля оценивали по интенсивности поглощению при 590 нм (D500) на приборе Specord М-40 или с помощью установки, созданной в институте имени Ненцкого Польской академии, наук.

Электрофорез в блоке градиентного полиакриламидного геля в присутствии ДСЫа проводили в соответствии с методикой, описанной в работе (Трегубов и Сопин,198Э). Использовался также диск-электрофорез (Laemmll,l970). Электрофорез в мочеыгае проводили в соответствии с методикой, предложенной в работе (Stepkovskl et al.,1985).

Об АТФазной активности препаратов судили по количеству отщепленного от АТФ в процессе реакции неорганического фосфата, который определяли по методу Фиске-Суббароу (Flske & Subbarcw,1925).

- о -

Концентрацию белков в растворах определяли по биуретовой реакции, по методу Бредфорд (Bradford, 1076), а так.г.е скектро-фотометрически, используя выражения Си-(Б2во-1-50э2о)/ 0.533, Ca-(D280-1.5D220)/l.l, Cs-D2oo/0.75, st ch-D230/ö.65 (Jenson & Taylor, 1978), где Сн, Ca, cs к Сь. - концентрации 'миозина, актина, С1 и ТММ, соответственно, а Пгео и D320 - поглощение при 280 и 320 нм.

результаты ксспдо2л::гЛ и кх обсэтдешз.

До недавнего времен;: существовало представление, что щелочные легкие цепи принимают непосредственное участке в формировании АТФазного центра миозина, так как при попытках препаративно разделить тяжелые и легкие цепи "миозина получаемые препараты не обладали АТОззной активностью (Тарта-ковский,1978). Поэтому такие легкие цепи были названы "существенными". Однако в последнее время удалось изолировать тяжелые цепи субфрагмента-1 шгазика и показать, что такие препараты обладают АТФазной . активностью, сравнимой с активностью исходного CI (Slvaramakrlshnan £- Burke,1953). При этом вопрос о роли щелочных легких цепей, казавшийся до недавнего времени практически полностью решенным, вновь встал на повестке дна.

Используя метод ограниченного протеолиэа миозина с последующим применением ионообменной хроматографии при 37°С в присутствии Mgz+ATö (щадящие условия для отделения щелочных легких цепей от тяжелых цепей), на;.! удалось получить препарата изолированных тяжелых цепей С1 и показать, что они обладают АТШазной активностью, сравнимой с - таковой неходкого С1 (ЭД-ТА-С1), содержащего только щелочные легкие цепи, а также препаратов С1 (М£-С1), содержащих, .помимо щелочных, ДТНБ-легкие цепи (табл.1). Однако препарата изолированных тяжелых цепей полностью теряли АТФазную активность в течение двух -суток при 0°С, в то время как активность препаратов С1, содержащих легкие цепи (ЭДТА-С1 или Ug~Cl) практически не изменялась при таких условиях по крайней мере в течение недели. Потеря А'Иаэной • активности тяжелыми цепями С1 сопровождалась значительным уве-'личением мутности их растворов, что свидетельствуем об irpera-тообраэовании в этих препаратах.

С помощью метода светорассеяния проведено изучение агре-гатообразования в препаратах ЭДТА-С1 и Mg-Cl, содержащих различные наборы легких цепей, при повышенных температурах. Сле-

Таблиц-! 1. АМсяная активность фрэтмептсв му.сзэтл (мкмоль <1'г!/мг мин). Среда инкубации содерж?_ча (в ммоль/л): KCI - 100; гис-

тидшюш.'н бу£эр - Ш (рН

7.0) СаСЬ ' ил и MgCl2 -2,5: АТ'З - 1.Концентрация белка состзгжд-а 0.05 иг/ мл. Время шку&щкк-б »яга., тем1юратура-250с. п-5-7.

Фрпгменти миозина са2+ . Mg2+

тяжелые цепи 01 1,22+0,27 0,05+0,01

Mg-Cl 1,20+0,2 0,05+0,01

ЗДТА-С1 1,24±0,3 0,06±0,02

дует отметить, что препараты М£-С1 содержали также дополнительный участок тяжелых целей с мол.массой бкДа, ответственный за взаимодейстзке мгжду тяжелы:,<и я ДТНБ-легкими цепями. Обнаружено (рис.1), что при отсутствие а растворе двухвалентных катионов (в условиях, когда ДТНЕ-.ЛЦ и тяжелые цепи диссоциированы (Маг£озз1ап et з1.,1975)) препараты Мз~С1 сильно агрегировали при длительном воздействии повышенных температур (37°С). В то же время агрегация таких препаратов практически

т

А. 50 ICO мин. 50 100 мин.

Рис..1.Изменение ео времени оптического поглощения при 400 нм tA4ool препаратов субфрагмента-1 миозина,• вызванное воздействием повышенных температур (3?иС) в присутствии и отсутствие двухвалентных катионов. Препараты С-1 содержали " (А)'и не содержали - (Б) ДТНБ-легкие цепи. Условия опыта: препараты • С1(0.5 мг/мл) инкубироЕали в среде, содержавшей (в ммоль/л): трисН01-30 (рН 7.8); КС1-100; NaN3-l; ДТТ-1; MgCl2-l (А) или ЭДТА-1 (О).

не наблюдалась в присутствии когда ДТНВ-легкие цепи были

ассоциированы с тяжелыми цепями (при этом препараты также содержали щелочные легкие цепи). . Значительной агрегации не наблюдалось и для препаратов ЭДТА-С1 независимо от наличия/ отсутствия двухвалентных катионов (в таких препаратах ДТНБ-легкие цепи отсутствовали). Эти аффекты связаны по-видимому с тем, что ДТНБ-ЛЦ, взаимодействуя в присутствии Mg2+ с тяжелой цепью, стабилизируют структуру Cl. При отсутствии же такого взаимодействия, О концевой участок, тяжелой цепи с мол.массой 6«Да, ответственный за взаимодействие с ДТНБ-ЛЦ (Yamamoto & Seklne,1980), по-видимому, экспонируется и служит дополнительным центром агрегации. Как уже упоминалось выке, наименьшей стабильностью обладают препараты изолированных тяжелых цепей.

На основании приведенных результатов мы пришли к заключению, что АТФааньш центр миозина формируется тяжелыми цепями без непосредственного участия легких цепей. Однако, последние играют существенную роль в стабилизации 'структуры активного центра.

В последнее время появились работы, в которых показано, что ДТНБ-ЛЦ способны влиять на взаимодействие актина с миозином и тем самым в некоторой степени участвовать в регуляторных процессах, имеющих место при мышечном сокращении' (Moos et al., 1982; Wagner, 1984)При этом на взаимодействие актина с миозином могут влиять как связывание Са2+ с ДТНБ-ЛЦ (Wagner & Stone,1983), так и их фосфорилирование (Pemrlck,1980).

С другой стороны, известно, что к моменту запуска сокращения всего лишь несколько процентов от общего количества головок миозина в мышечном волокне могут связать Ca2* (Robertson et al.,1981), и что, в отличие от гладких мьшц, в скелетных мышцах позвоночных фосфоркдирование ДТНБ-ЛЦ не является необходимым условием . для активации АТФагы миозина ахтином, поскольку скорость одиночного сокращения мышечных волокон в этих мышцах.выше, чем скорость фосфорилировакия ДТНБ-ЛЦ (Левицкий, 1986). На этом основании принято считать, что связывание Са2+ с головками миозина и фосфорилирование ДТНБ-легких цепей не принимают непосредственного участия в запуске сокращения мышечных волокон, а ДТНБ-ЛЦ не являются истинно регуля-торными.

Для получения дополнительной информации о роли ДТНБ-ЛЦ ми-

озина скелетных мышц в регуляторных механизмах мышечного сокращения мы провели сер;тю экспериментов по изучению влияния связывания Са2+ с ДТНБ-ЛЦ и их фосфорилирования на конформацшо тяжелых цепей миозина (ТММ), используя метод ограниченного трипсинолиза. Во всех экспериментах использовали растворы Бол-ка, содержавшие МгС1о в концентрации 1 ммоль/л, что в определенной степени соответствует физиологическим условиям. Ограниченный протеолиз проводили в присутствии либо 0.5 ммоль/л ЭГТА либо 0.1 ммоль/л СаС1г- В последнем случае, несмотря на наличие 1 ммоль/л МгС1г, миозиновые головки были насыщены ионами Са2+ из-за различий в связывании и Са2+ миозином

Полученные данные (рис.2) позволяют говорить о взаимосвязанном влиянии Са2+ и фосфорилирования ДТНБ-ЛЦ на конформацию тяжелых цепей миозина в присутствии актина. Так мы не наблюдали значительных различий между фосфоршшрованным и дефосфори-лированным миозинами, ДТНБ-легкие цепи которых били насыщены ионами Са2+, и в то же время мы не обнаружили различий в кон-формации тяжелых цепей фосфоршшрованного миозина, ДТНБ-легкие

Рис.2.Изменение во времени относительной интенсивности Потн. (%)] окраски полос гелей, соответствующих фрагменту 50К дефос-фсрилированного (А) и фосфоршшрованного (Б) миозина, подвергнутого ограниченному трипсинолизу в присутствии актина. Условия опыта: препараты миозина (2мг/мл) инкубировали при комнатной температуре в присутствии актина (0.5 мг/мл) в течение 15 мин.в среде, содержавшей (в ммоль/л):имидазол-НС1-10 (рН 7.0); КС1-100; М2012-Зпи ЭГТА-0.5 (А) или С'аС12-0.1 (О). Трипсинолиз проводили при 20 С и весовом соотношении миозин/трипсан~100.1.

цепи которого балл кзэт^еу nxfo либо Сй" • •

Знач;;толы:и: ксл^ор. пллслклс- у.а.'у.нения тетзлых цепей инозина при его зггч::'.о;',-;,Ътг,п:1 с акхимк« «ги набхэдаги только у дсфзсфсркг::?ою&ьг;ого ДТИБ-ЛП ксторого бшш насыщены •

ионами Мз2\ Kmdhso тжез состояние реакизуется в покоящейся мышце. Scü3i:a на С:г+ фэз^срилиротаже ДТНБ-ЛЦ, имеюадае место в арсцсссэ аримзрно в одинаковой степени из-

меняет ксп^ор:»'2щ-х тл:-.?лих цепей инозина. Нам удалось показать, что •гькь.з 1к:.'гко5зы га£.-эдз-~ясь тогько в присутствии актина и что сии вягрзгяаэлк структуру фраг!.'.9пта тяжелых цепей головки икогака с ;ол. массой БОкДа, который непосредственно взаимодействует с алтлно:*.

йсходч из получерезультатов могло заключить, что конформ^лпокпые ¡BKsißi« допей миозина, вызываемые'

фосфорилироЕззкем ЩИЗ-лепях цепей ■ или связыванием Са*"+ могут, по-в;:днмо;:у, •> некоторой степени учагтвозать в регуляции актил-киозииового вза:а:оде:".стпня, а следовательно и в сокращении мыац.

Способность миозина гидролизовать АТФ была обнаружена более 50 лет иааад отечесгБСит/л 6::эх1!>.глко 51 3. А.Енгельгардтом и М.Н.Любимовой. С тех пор пол ".лось большое количество работ, в которых ¿-ердоитатизлю свойства миозина изучали в различных условиях с использованием различные субстратов и модифицирующих АТ&зу веществ. Однако до си:; пор неясны ыеханигьы действия одно- и двухвалентных встиовоа и некоторых органических, веществ на АТ&азную ияивкооя» миозина, а также вопросы, связанные с объяснением субстратной специфичности миозииовой . АТ-.С>азьг и характерной для нее двухфазной зависимости от pH среды. Эти проблемы тесно переплетаются с вопросами организации АТ-Оазпого центра миозина и с изменением его конформации при воздействии различных факторов.

Подойти к изученко этих вопросов нам позволили.накопившиеся к настоящему времени литературные данные, свидетельствующие о том, что протеолитические фрагменты тяжелой цепи головки миозгла с молекулярными массами 2?кДа (27К), 50кДа '(50К) И 20 кДа (20К) представляет собой отдельные структурные домены, причем в формировании АТС-азного центра непосредственно участ-г вуют домены 27К и БОК (Mornet et al.,1984, Vlbert . & Cohen, 1983).

•.iTi.'n'ji"^.' Gl обладает

'?f:ct3v:y nor:l";:v::kk:í температур.

!:!:л?р'.пнкого при тсм-дгградйрэ58»> Сист-

;?:í'Tcm ско.;сг:ть дегрсдьцлп ф?аг-с с тис, умЕнсв&тя АКазной ак-

Нй-ми покясаго, что прзто-различной чугсгоя&эдсгтмэ к Так при трипсинолизо С1, г.р^, пературах 35-40сС, 4'P-ri:o;rr & рее, чем фрагменты '2?К и ХК, мента БОК коррел;фова.:з со ск тивности С1 (Бабикчук и др., 1239). Стсяокь г-'гр"л?.ц::и Фрагмента 50К под воздействием дензтурирукщих йактсров в вгачительной степени умоньшалаеь е присутствии аг.тина, ATO и ддо (Setton & Muhlrad, 1984; БыЗийчук и С:и:еккэ,1£С1), на осксьанки чего ыы предлолалш*, что таксе л:.б'/ль::ссти структуры Gl в

присутствии специфически взаидолсйствуд^-ж с нхм ьгзэетз иие-ет, по-видимому, функциональный характер.

Используя метод сграниченчого трппскнолнза, mi; изучали влияние различных НТО и НД2 - природных аналогов субстрата ми-озиновой АТФазы и продукта АТС-азной реакции, соответственно, на температурную стабильность препаратов С1 (рис.3).

Aseo

1.СИ

X г7*

л

XI X

V К

V V

л •Г !»

л r^i 1 л X V i

X V X -. X

>: X i- ч /\ у

X X X X X

X X X JJ V

'т т — т — 5

1 2 3 4

V

X

:;¡ > Ц

h

х

X X

¡I !х

10

X

X V

V

л л

у X

X X

0 7 8 9 10 11 12 13 Рис.3.Оптическое поглощение при 590 нм ЕАзосО красителя, экстрагированного из полос гелл, ссответству^сщн:: фрагменту БОК, образующемуся в регультате проведения ограниченного трипенно-ляза препаратов С1 з течение 20 мил. при комнатной температуре. Препараты С1 предварительно кшубнроваги при 39-С в течение 30 мин. в.присутствии различных добагок: 1-АТФ:2-ГТФ;3-УТФ;4-ЦТ<5; 5-АДФ; 6-ГДФ;7-УДО:8-ЦЩ>; 9-ДДФ+ ванадат: 10-ГД&* ванадат; 11-УДЗЯ-ванацат;12-ЦДСЯ- ванадат; 13-контроль (добавки отсутствовали).

О

- л о _

Влияние воздействия различных НТФ на температурную стабильность С1 можно объяснить, исходя из схемы гидролиза АТФ, предложенной (Taylor,1977):

М '+ НТФ # М -НТФ М*НТФ - М**НДФ -Фн * М*НДф. -Фн ^

* Ы*НДФ + Фн * М -НДФ * М + НДФ (2), .

где М**АДФ "Фн - так называемый "долгоживущий комплекс" , распад которого лгаитирует скорость ферментативного процесса. Известно, что скорость гидролиза миозином (С1) различных субстратов увеличивается в ряду АТФ < ЦТФ < УТФ < ГТФ (Seidel, 1975). Прирост собственной флуоресценции миозина (С1), связанный с образованием комплекса .М**1ЩФ -Фн, уменьшается е ряду АТФ > ЦТФ > УТФ > ГТФ. В то же время мы обнаружили (рис.3,ст. 1-4), что различные НТФ в значительной степени стабилизируют структуру С1 и по своему протектирукщему воздействию на температурную стабильность препаратов С1 различные НТФ образуют ряд (1): АТФ > ЦТФ > УТФ > ГТФ. Как видно из рис 3.(ст.5-8) нукле-озиддифосфаты также стабилизируют структуру С1, но в отличие от НТФ, по своему протектирукщему воздействию они располагаются в ряд (2): АДФ > ГДФ > ЦДФ УДФ. При отсутствии же в раст- . воре НТФ и НДФ,денатурация С1 при действии повышенной температуры идет значительно быстрее, так что при последующем трипси-нолизе полоса геля, соответствующая фрагменту 50К, на злектро-фореграмме практически полностью'исчезает (рис.3,ст. 13).

Эти результаты находят естественное объяснение, если, исходить из того, что при гидролизе НТФ на стадии образования "долгоживущего комплекса" структура субфрагменга-1 становится более плотной я жесткой. Триптофаиили, ответственные за собственную флуоресценцию, в такой структуре должны иметь больший квантовый выход, что проявляется в приросте флуоресценции С1 после добавлений НТФ. Такая структура должна быть также более устойчива к действию денатурирующих факторов, в том числе и к действию повышенной температуры. Эти структурные изменения относятся' в основном к наиболее лабильному участку С1 - фрагменту БОК. Мы предполагаем, что при образовании "долгот, /щего комплекса" особое значение имеет взаимодействие .азотистого основания НТФ с "гидрофобным карманом" АТФазного центра. Решающую роль в таком взаимодействии играет, по-видимому, группа -NH2 (донор протона) в положении 6 пуринового кольца АТФ и соответствующем ему положении 4 пиримидинового

Iry

О ~

кольца ЦТФ, а также группа =N (акцептор протона) в положениях 1 и 3, соответственно, чем и обусловлено размещение АТФ и ЦТФ в начале ряда (1) (азотистые основания ГТФ и УТФ в соответствующих положениях содержат группы противоположной полярности).

В случае взаимодействия с АТФазным центром нуклеозидди-фосфатов с образованием комплекса и*ЩФ полярные группы не играют существенной роли и на первый план выходят гидрофобные взаимодействия. В таком комплексе активный центр с наибольшей силой связывает АДФ и ГДФ, т.е. соединения, содержащие основания с объёмным пуриновым кольцом, обладающем сильно выраженными гидрофобными свойствами (0стерман,1985).

В пользу такого представления свидетельствуют результаты, полученные нами при проведении ограниченного трипсинолиза препаратов С1, предварительно проинкубированных в присутствии различных НДФ и ионов ванадата (рис.3,ст.9-12). Поданным (Goodno & Taylor,1982) АДФ в присутствии ионов ванадата способна взаимодействовать с АТФазным центром миоаина с образованием комплекса, аналогичного комплексу М^АДФ -Фн, образующемуся при гидролизе АТФ. То же, по-видимому, должно происходить и при наличии в растворе других НДО. Следует ожидать, что в присутствии ванадата протектиру-ощее действие НДФ на препараты С1, будет совпадать с действием НТФ. Действительно, как следует из'результатов, приведенных на рис.3 (ст.9-12) в этом случае для НДФ наблюдается ряд (3) АДФ > ЦДФ > УДФ > ГДФ, который совпадает с рядом (1), т.е. в присутствии ванадата НДФ взаимодействуют с АТФазным центром за счет полярных групп в положениях 1 и 6 кольца аденина (или соответствующих им групп других нуклеотидов).

На основании полученных результатов и литературных данных мы сделали вывод о том, что имеются, по крайней мере, два кон-формационных состояния "гидрофобного кармана" АТФазного центра миозина. Одно из них реализуется на стадиях, предшэствующих гидролизу АТФ и следующих за стадией распада "долгоживущего комплекса", когда АТФазный центр связывает нуклеотид аа счет слабых гидрофобных взаимодействий. Другое, по-видимому, ответственно за замедление АТФааной реакции на стадии образования "дсш-оживущего комплекса". При этом имеют место полярные взаимодействия между комплементарными группами кольца аденина и "гидрофобного кармана" АТФазного центра. При взаимодействии

миозина с актином структура "гидрофобного кармана" претерпевает обратные изменения - полярные взаимодействия с "карманом" по комплементарным группам разрушаются, вследствие чего связь азотистого основания с ним ослабляется и энергия макроэрга, аккумулированная в структуре С1, используется для элементарного акта сокращения.

" • Опираясь на эту гипотезу, можно объяснить двухфазный характер АТФазной активности миозина (С1) при изменении рН среды, а также модифицирующее действие некоторых органических веществ и SH-реагентов. Так, мы предполагаем,' что активирующее действие этих реагентов объясняется их непосредственным взаимодействием с "гидрофобным карманом" АТФазного центра, что препятствует образованию."долгоживущего комплекса". Это предположение подтверждает гипотезу Е.В. Петушковой о механизме действия ПХМБ на АТФазную активность миозина (Петушкова,1973).

Исходя из представления о двух состояниях "гидрофобного кармана" АТФазного центра, можно объяснить двухфазный характер рН-зависимости АТФазной активности миозина (С1). Известно, что для ИТФ в качестве субстрата рИ-зависимость имеет простую сиг-моидальную форму с максимумом при щелочных рН (Петушкова и -Семина, 1980). По нашему представлению гидролиз . ИТФ происходит без образования "долгоживущего комплекса" и связь между нукле-отидным кольцом и АТФазным центром осуществляется только за счет слабых гидрофобных взаимодействии аналогично ГТФ. Связывание жэ миозином АТФ сопровождается образованием "долгоживу-щего комплекса" за счет полярных взаимодействий между группами в положениях 6 и 1 кольца аденина и комплементарными группами АТФазного центра. При этом наблюдается широкое плато (или не® большой минимум) при нейтральных рН. Защелачивание среды сопровождается увеличением скорости АТФазной реакции, достигая таковой при гидролизе ИТФ. При рН ниже 6.0 скорости гидролиза АТФ и ИТФ различаются также незначительно (Ralnford et al.1964), Известно также, что гидролиз АТФ при температурах ниже 5°С не сопровождается образованием "долгоживущего комплекса и при таких температурах рН-зависимости гидролиза ИТФ и АТФ миозином практически не различаются и имеют сигмовдальную форму. Исходя из этих данных, мы полагаем, что "долгоживущий .комплекс" М**АДФ -Он стабилен только при нейтральных рН и температуре ваае 5°С, чем и можно объяснить различия, наблюдаемые

при гидролизе АТФ и ИТФ, и двухфазный характер АТФазной активности при этих условиях.

Исходя из наших результатов и литературных даннвх (Вагапу1, 1960) о том, что при связывании актина с головкой миозина АТФазная реакция ускоряется более чем на порядок, а гидролиз ГТФ миозином активируется актином только в незначи-. тельной степени, можно предположить, что именно образование, "долгоживущего комплекса" М**АДФ -Фн позволяет актину регулировать АТФазу миозина и такая регуляция может иметь место только при нейтральных значениях рН.

ВЫВОДЫ.

1. Налажены методики Еыделения препаратов полностью фосфорилированного и полностью дефосфорилированного миозина.

2. С помощью метода ограниченного протеолиза с последующим разделением на ионообменных колонках получены препараты С1, содержащие различные наборы легких цепей и препараты изолированных тяжелых цепей 01.

3. Установлено, что препараты изолированных тяжелых цепей обладают АТФазной активностью, сравнимой с активностью препаратов исходного С1.

4. Показано, что легкие цепи миозина, хотя и не принимают ' непосредственного участия в формировании АТФазного центра миозина, играют важную роль в поддержании его конформации. •

5. Установлено, что фосфоршшрование ДГНБ-ЛЦ миозина и замена связанного с такими цепями М§-2+ на Са2+ способны вызывать конформационные изменения тяжелых цепей миозина в присутствии актина.

6. Показано, что протеолитические фрагменты тяжелой цепи С1 с молекулярными массами 27кДа, БОкДа, 20кДа обладают различной чувствительностью к воздействию повышенных температур.• Наиболее чувствительным является фрагмент 50К, деградация которого коррелирует о уменьшением. АТФазной активности, что позволяет отнести его к структурам,, принимающим участие в формировании АТФазного центра миозина.

V. На основании полученных-результатов сформулирована гипотеза о двух состояниях "гидрофобного кармана" АТФазного центра миозина, реализующихся, по-видимому, на различных стадиях гидролиза- АТ$' миозином¡. На стадии образования долгоживущего- комплекса» Й^ДДФ' • Фн взаимодействие осуществляется между

группой -NH2 в положении -6 и группой =N в положении 1 ■ кольца аденина и комплементарными группами АТФазного центра. На стадиях, предшествующих гидролизу ATO и следующих за стадией распада долгоживущего комплекса, АТФазный центр связывает нуклео-тид за счет слабых гидрофобных взаимодействий.

Список основных работ, опубликованных по темо диссертации.

1.Филенко a.m.Омельянюк B.C., Бабийчук Э.Е. Доменная организация тяжелой цепи субфрагмента 1 миозина//8-ой Бсесоюэ. симп. "Биофизика и биохимия биологической подвижности": Тез. докл. - Тбилиси,1987. - С.37.

2.-Бабийчук Э.Б., ФиленкоА.М., Смельянюк B.C. .Данилова Е.М. Терыгтческая лабильность структуры домена 50кДа субфраг-мента-1 миозина//Докл.АН УССР,сер.Б. - 1989. - N1. - С.53-55.

3.Бабийчук Э.Б., Гарбаренко Л.И. Выделение и свойства тяжелых цепей субфрагмента-1 миозина скелетных мышц кролика//Молекулярная генетика и биофизика. Киев:Еища школа-. - 1989. -Вып.14. - С.33-36.

4.Бабийчук Э.Б., Филенко A.M. Влияние различных нукдео-зидфосфатов на трипсинолиз субфрагмента-1 миозина// 6-я Всесоюз. конф. по биохимии мышц: Тез.докл. - Тбилиси,1989. -С. 17.

5.Бабийчук Э.Е., Гарбаренко Л.И., Данилова В.М. 'Быстрый метод выделения субфрагмента-1 миозина и изучение его структурной организации путем ограниченного трипсинолиза//Молекулярная генетика и биофизика. Киев:Вида школа.-1990.- Вып.15.-С.74-77.

6.Филенко A.M., ЗимаВ.Л., Данилова В. М., Омельянюк B.C., Бабийчук Э.Б., Трегубов B.C. Структурная организация субфрагмента 1 миозина скелетных мышц//Биополимеры и клетка.-1990.-Т.6, N3.- С.39-45.

7.Filenko A.M., Zyma V.L., Danllova V.M., Omelyanlyk V.S., Bablyckuk E.B. Osobltosti strukturnlh znacajkl subfragmenta-1 miozina skeletnlh mlslca//In: Blodlnamlka mlslca. Zagreb. - 1990. - p.l-17.

L Бабийчук Э.Б., Филенко A.M. Функционально-различные состояния "гидрофобного кармана" АТФазного центра миозина//Мо-декулярная биология. - 1991. - Т.25,Вып.2. - С.381-387."

9.Бабийчук Э.Б., Филенко A.M., Омельянюк B.C., Данилова В.Ы., Гарбаренко Л.И. Некоторые особенности организации АТФаз-

ного центра миозина//Модекулярная генетика и биофизика. Киев: "Льйидь". - 1891. - Вып. 16. - С.79-83

lO.Oanllova V.M., Fllenko A.M., Bablychuk E.B. Functionally distinct states of myosin ATPase site "hydrophobia pocket'V/Proo. XX Europ.conf."Muscle contraction and cell motility. - Oxford.UK. 1991. - P.22

11.Bablychuk E.B., Stepkowskl D.S., Danllova V.M., Kakol I. Regulatory light chain Influences alterations of myosin head Induced by aotln//FEBS Lett.-1991.-V.293,Ml,2.3.-P.55-58.

Подписано в почать 21.03,02. формат 00*84/18. Бум.офс. Офс.печ. Усл.печ.л. 0,8.Уч,-изд.л. 1.0.Тираж 100 ясэ. Зак, № Юб.БосплатнОа

Т

Полиграфический участок Ин-та экономики АН Украины, 252011,Киев-И, -л.Панаса Мирного.26.