Структурно-функциональные характеристики модельной популяции scenedesmus quadricauda при интоксикации

Прохоцкая, Валерия Юрьевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Структурно-функциональные характеристики модельной популяции scenedesmus quadricauda при интоксикации
ВАК РФ 03.00.18, Гидробиология

Автореферат диссертации по теме "Структурно-функциональные характеристики модельной популяции scenedesmus quadricauda при интоксикации"

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ им. М. В. ЛОМОНОСОВА

Биологический факультет

2 я щ ?ппп

На правах рукописи

ПРОХОЦКАЯ Валерия Юрьевна

структурно-функциональные характеристики

модельной популяции scenedesмvs пилошслиол при интоксикации

03.00.18 — Гидробиология

автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва —2000

Работа выполнена на кафедре гидробиологии Биологического факультета Московского Государственного университета им. М. В. Ломоносова

Научный руководитель:

кандидат биологических наук, ведущий научный сотрудник А. Г. Дмитриева Научный консультант:

доктор биологических наук, профессор В. А. Веселовский Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Ю. Г. Симаков кандидат биологических наук Л. А. Ганьшина

Ведущее учреждение - Институт микробиологии РАН

Защита состоится 9 июня 2000 г. в 1530 часов на Заседании специализированног совета Д 053.05.71 в Московском Государственном университете им. М. В. Ломоносова п адресу: Москва, Ленинские горы, МГУ, Биологический факультет, ауд. 557

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического ф-та МГУ

Отзыв в двух экземплярах просим направлять по адресу:

119899, Москва, МГУ, Биологический ф-т, специализированный Ученый Совет Д.053. 05.71

Автореферат разослан ¿Ь'мая 2000 г. Ученый секретарь совета,

кандидат биологических наук

А. Г. Дмитриев.

I. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. В условиях современного постоянно возрастающего антропогенного воздействия на водные экосистемы остается актуальной проблема совершенствования методов биоиндикации и биотестирования состояния окружающей среды (Строганов, 1970; Филенко, 1988, 1990).

Для оценки токсических свойств веществ широко используют культуры микроводорослей (Bringmann, Kuhn, 1978; Boyle, 1984; Trainor, 1984; Calaraari et al., 1985; Брагинский и др., 1987; Кожанова, Дмитриева, 1989; Schafer et al., 1994). Уровень воздействия токсикантов определяют по изменению численности водорослей в культуре. Проводят прямой подсчет клеток или используют интегральные оптические методы, основанные на поглощении и флуоресценции клеточных пигментов (Методики биологических исследований..., 1971; РД 118-02-90, 1991; Методические указания..., 1998). Считают, что варьирование количества клеток в популяции водоросли адекватно отражает ее состояние (van Leeuwen et al., 1985).

Однако, часто число клеток водорослей в популяции сложным образом изменяется в присутствии токсиканта в среде (Строганов, 1941, 1973; Филенко, Исакова, 1983; Александров, 1985; Филенко, 1990). Это связано с тем, что токсикант изменяет клеточный состав популяции, воздействуя на скорость размножения и гибели клеток, длительность клеточного цикла и функциональное состояние клеток. Очевидно, что для полноты характеристики состояния культуры микроводорослей в условиях токсического воздействия было бы полезным контролировать ее клеточный состав, то есть определять гетерогенность популяции. Но поскольку это достаточно трудоемкий процесс, в настоящее время анализ структуры популяции микроводорослей проводят редко.

Поэтому целью настоящей работы стало исследование закономерностей изменения размерно-возрастной структуры и функциональных характеристик клеток водоросли Scenedesmus quadricauda (Тигр.) Breb. под влиянием бихромата калия и фунгицида сульфата имазалила. В задачи работы входило:

1. Исследовать динамику численности клеток водорослей при длительном воздействии различных концентраций бихромата калия и фунгицида сульфата имазалила;

2. Проследить за формированием размерно-возрастной структуры лабораторной популяции Sc. quadricauda в норме и при токсическом воздействии;

3. Выявить закономерности восстановления популяции 5с. циад.г1саи<1а, подвергнутой интоксикации разной степени, по размерно-возрастному составу и функциональным характеристикам клеток. Научная новизна. На основании наблюдения за изменением общего числа и доли мертвых клеток в культуре 5с. диас1г1саис1а, а также размерного спектра клеток и их функциональных характеристик в присутствии бихромата калия и сульфата имазалила в среде предложено новое объяснение трехфазной (бимодальной) зависимости ответа популяции водоросли на возрастающее количество токсикантов. Снижение относительной численности клеток при малых концентрациях токсикантов связано не с гибелью, а с торможением деления клеток. При средних концентрациях отсутствие эффекта ("мертвая" зона на дозовой кривой) или стимуляция роста культуры вызваны возобновлением деления клеток после временной задержки. Адаптация культуры водорослей обусловлена переходом клеток на новый режим функционирования, в котором их чувствительность к токсическим воздействиям понижена. Установлено, что культура 5с. диа&каис1а состоит из двух субпопуляций: "крупных" зрелых и "мелких" молодых клеток, отличающихся по функциональной активности. Анализ изменения размерно-возрастной структуры популяции в присутствии сульфата имазалила показал, что торможение деления клеток происходит на фазе клеточного цикла, а гибель — в зависимости от возраста клеток либо в конце стадии Сг и при митозе, либо накануне фазы 8. В популяции 8сепес1е5ти5 определен размер пула "сверхрезистентных" клеток. Практическое значение работы. Результаты работы могут быть использованы для оценки состояния популяций микроводорослей в условиях токсического воздействия и прогнозирования опасности токсикантов для водных экосистем. Снижение относительной численности клеток в культуре, сопровождаемое появлением крупных клеток (и клеток-гигантов), указывает на то, что оно не связано с гибелью клеток, а вызвано задержкой клеточного деления. Появление в популяции клеток, размер которых меньше контрольных, в первые часы после интоксикации свидетельствует о присутствии в среде летальных количеств токсиканта. Визуальный контроль клеточного состава популяции можно использовать для качественной характеристики изменения ее состояния.

Апробация работы. Материалы диссертационной работы были представлены на Международных конференциях студентов и аспирантов по фундаментальным наукам "Ломоносов-96", "Ломоносов-97" (Москва, 1996, 1997); Всероссийской конференции "Эколого-физиологические исследования водорослей и их значение для оценки состояния природных вод" (Борок, 1996); I Съезде токсикологов России (Москва, 1998);

II Международной конференции "Актуальные проблемы современной альгологии" (Киев, 1999); II съезде биофизиков России (Москва, 1999); IV Съезде физиологов растений России (Москва, 1999); Международной конференции «Микология и криптогамная ботаника в России: традиции и современность» (Санкт-Петербург, 2000), Результаты работы докладывались и обсуждались на семинарах лаборатории водной токсикологии кафедры Гидробиологии.

Объем и структура работы. Диссертация изложена на'/Страницах машинописного текста и состоит из следующих разделов: введение, материалы и методы исследования, результаты и обсуждение, заключение, выводы, список литературы, включающий 243 источника, и приложение. Работа иллюстрированаЗ^рисунками и -/^таблицами. Публикации. По теме диссертации опубликовано 10 работ, 5 находятся в печати.

И. СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объектом исследования являлась лабораторная альгологически чистая культура зеленой протококковой водоросли Scenedesmus quadricauda (Turp.) Breb., полученная из коллекции культур водорослей кафедры микробиологии Биологического факультета МГУ им. М. В. Ломоносова (DMMSli, штамм S-3). Для опыта отбирали нормально развивающуюся культуру водорослей, частично синхронизированную чередованием "дня" и "ночи" (Успенская, 1966), находящуюся в фазе логарифмического роста и содержащую не менее 90 % живых клеток. Исходная плотность культуры составляла 100-200 тыс кл/мл (Хоботьев, 1969; Брагинский, Сиренко, 1971).

Водоросли выращивали на среде Успенского № 1 (Успенская, 1966) при интенсивности света до 5 тыс. люкс со сменой дня и ночи. Температура выращивания 20-24° С.

В качестве токсикантов были использованы универсальный эталонный токсикант бихромаг калия К2СГ2О7 (Международный стандарт..., 1987; Wang, 1987) и фунгицид сульфат имазалила 1-[2-(2,4-дихлорфенил)-2(2-пропенилокси)этил]-1Н-имидазол-сульфат. Концентрации токсикантов варьировали путем разведения дистиллированной водой исходного раствора, содержащего 1 мг/мл вещества. Токсиканты в объеме 1 мл однократно вносили в культуры водорослей в начале логарифмической фазы роста. Действие веществ изучали в хронических экспериментах длительностью до 35 суток. Опыты проводили в трех повторностях для каждой концентрации.

Численность клеток (в дес. тыс. кл/мл) определяли при помощи светового микроскопа АУ-12 "Ломо", Россия. Просчет клеток проводили в камере Горяева в 25 больших квадратах. Численность рассчитывали по формуле: N = п ' 104, где N — численность клеток в 1 мл суспензии, п — в 25 больших квадратах.

Соотношение живых, мертвых и отмирающих клеток (в % от общей численности) определяли при помощи люминесцентного микроскопа. Мертвыми считали клетки, имеющие зеленое свечение, отмирающими - оранжевое, живыми -красное (Горюнова, 1952; Дмитриева, 1988).

Линейные размеры клеток водорослей (длину и ширину, мкм) определяли калиброванным винтовым окулярным микрометром АМ-9-2. Измеряли не менее 80 клеток в каждой повторноста. Клетки группировали в классы с интервалом 0.5 мкм и строили распределения встречаемости клеток каждого размера (в %).

Функииональное состояние фотосинтетического аппарата клеток исследовали методом замедленной люминесценции (ЗЛ) (Веселовский, Веселова, 1990, 1992). ЗЛ регистрировали на установке с двухдисковым фосфороскопом Беккереля от 0.5 мл суспензии плотностью 100-300 тыс. кл/мл. Объект освещали периодически вспышками красного света (^>610 нм) длительностью 6 мс. В промежутках между вспышками возбуждающего света в течение 3—18 мс регистрировали свечение. Максимальная освещенность объекта составляла 30 клк. Ее можно было изменять набором нейтральных светофильтров.

Зависимость уровня свечения от интенсивности возбуждающего света (световые кривые ЗЛ) позволяла определить освещенность, необходимую для светового насыщения фотосинтеза. По положению максимума на температурной кривой ЗЛ судили о теплоустойчивости тилакоидных мембран (рис. 1а). Для этого суспензию клеток водорослей нагревали со скоростью 2° С в минуту от 20° до 60° С и одновременно регистрировали ЗЛ. Интенсивность возбуждающего красного света составляла 0.6 клк. Температуру суспензии контролировали микротермистором конструкции Карманова (АФИ, Санкт-Петербург). Точность определения положения максимума ЗЛ — 0.3° С.

Величину затухания ЗЛ водорослей во время индукционной фазы фотосинтеза после темновой преадаптации использовали для характеристики активности функционирования фотосинтетического аппарата (т)): т|= (1тах-1стац)/1тах> где 1тах — уровень свечения сразу после включения света, когда фотосинтез равен нулю ("темновое" состояние хлоропластов), I стад — стационарным уровень свечения, когдя фотосинтез максимален ("световое" состояние хлоропластов) (рис. 16).

20 30 40 50 60 Температура, град. С

-20 0 20 40 60 Время, с

Рис. 1. Характеристики фотосинтетического аппарата клеток Sc. quadricauda.

А — температурная зависимость ЗЛ; Б — индукционная кривая 3JI.

По изменению ЗЛ в ответ на действие диурона — ингибитора нециклического электронного транспорта (ЭТ) — судили об уровне последнего: ЭТ = Ь.ли>рон/1_яиурон, где I+диурон и I-диурон — уровни ЗЛ в присутствии и отсутствие диурона, соответственно.

Уровнем ЗЛ в присутствии диурона, когда реакционные центры закрыты, характеризовали количество фотохимически активного хлорофилла в клетке.

Микрофотографии клеток были сделаны на микроскопе Axioplane Carl Zeiss, Германия, с объективом ЮОх при помощи компьютеризированной системы анализа изображения на основе камеры АТ200 с охлаждаемой ПЗС-матрицей (прибор с зарядовой связью, Photometries).

Статистическую обработку результатов проводили согласно "Методическому руководству по биотестированию воды" (РД 118-02-90).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

1. РОСТ И РАЗМЕРНЫЙ СОСТАВ ПОПУЛЯЦИИ 5с. quadricauda. 1.1. Клеточный цикл .Ус. quadricauda в стандартных условиях культивирования. При выращивании на питательной среде Успенского № 1 культура quadricauda была, в основном, представлена 2- и 4-клеточными ценобиями. Удвоение численности популяции в среднем происходило за 3—4 суток. Анализ распределения клеток по размерам показал, что в культуре постоянно присутствуют

две группы клеток: "мелкие" и "крупные". Этот факт согласуется с двухвозрастной моделью, предложенной для описания структуры популяции одноклеточной водоросли хлореллы (Тагшуа ег а1., 1953).

Рисунки 2а и 26 демонстрируют изменение размерного спектра клеток во время роста контрольной культуры водорослей. Перед увеличением численности популяции в распределении клеток по ширине преобладали "крупные" клетки (4.5 мкм; отношение дайны к ширине 1:0.5) преимущественно в 2-клеточных ценобиях. "Мелкие" клетки (3.0 мкм; отношение длины к ширине 1:0.33) образовывали меньший максимум и были объединены в 4-клеточные ценобии. Возрастание численности популяции зеркально изменяло бимодальное распределение: клетки со средним размером 3.0 мкм формировали больший максимум, а "крупные" (4.5 мкм) — меньший.

□ 4-клеточные ценобии

В 2-клеточные ценобии

1 2 3 4 5 6 7 8 Ширина клетки, мкм

Рис. 2. Размерно-возрастной и ценобиальный состав популяции qmdricauda в контроле. А — перед увеличением численности клеток; Б — после увеличения численности клеток.

Длина "крупных" и "мелких" клеток была достаточно постоянной (9.5-10.5 мкм), и, следовательно, объем клетки зависел в основном от ее ширины. Средняя ширина "мелких" клеток была в 1.4—1.5 раза меньше, чем "крупных", то есть их объемы отличались вдвое. Поэтому, можно считать, что пул "крупных" клеток — это готовые к делению клетки, а пул "мелких" возникает в результате деления.

Исходя из полученных результатов, клеточный цикл &. циайг'юаиЛа в наших условиях культивирования можно представить следующим образом (рис.3):

4-клеточный ценобии с клетками, готовыми к делению (4.0—4.5 мкм, фаза клеточного цикла), распадается на два 2-клеточных ценобия (без изменения числа клеток в культуре);

затем каждая материнская клетка (4.5 мкм) в составе 2-клеточлого ценобия образует две автоспоры, и появляется молодой 4-клеточный ценобий, состоящий из "мелких" клеток шириной около 3.0 мкм. Общее число клеток при этом удваивается;

"мелкие" молодые клетки увеличиваются в размере и превращаются в "крупные" зрелые клетки шириной около 4.5 мкм, способные к делению. После этого цикл повторяется

Рис. 3. Клеточный цикл 5с. диас1псаи(1а в норме и при интоксикации. Показаны средние размеры клеток. М — митоз; 8 — синтетический период; в, и — пре- и постсинтетический периоды. Стрелками обозначены изменения клеточного цикла в присутствии токсикантов. 1 — торможение деления клеток в присутствии 0.001 и 1.0 мг/л сульфата имазалила и 0.001 мг/л бихромата калия. 2 — преждевременное деление и гибель клеток в присутствии летальных концентраций токсикантов.

Последовательность описанных событий была прослежена на фракции выделенных седиментационным методом "мелких" клеток. Их распределение по ширине было унимодальным с максимумом в области 3.0 мкм. Клетки входили в 4-клеточные ценобии. Через два дня, когда размер клеток достиг 4.5 мкм, они образовывали 2-клеточные ценобии. На третьи сутки клетки поделились, их число возросло, и в распределении опять появлялся большой максимум из "мелких" клеток в 4-клеточных ценобиях.

1.2. Варьирование длительности клеточного цикла. Эксперименты с лабораторными культурами водорослей проводят круглогодично. Поэтому важно знать параметры роста культуры в разные сезоны года. Мы выяснили, что среднее время удвоения числа клеток водорослей в весенний период составляло 2—3 суток, тогда как в зимний — 4—5 суток. Независимо от сезона количество мертвых клеток в пробах не превышало 5—7% от общей численности.

Сопоставление размерно-возрастной структуры популяции в разные сезоны показало, что в состав 4-клеточных ценобиев в зимний период входят более крупные клетки (ширина 3.5—4.0 мкм), чем в весенний (3.0—3.5 мкм). Это позволяет считать, что удлинение клеточного цикла в зимний период идет в основном за счет фазы Оь Это предположение согласуется с мнением (8сЫеИз, 1977; Гродзинский, 1983) о том, что варьирование продолжительности клеточного цикла в наибольшей степени зависит от длительности фазы С].

13. Функциональные характеристики "крупных" и "мелких" клеток. При помощи измерения ЗЛ культур водоросли, в которых преобладали "крупные" или "мелкие" клетки, были выявлены их некоторые функциональные различия. При высокой освещенности (30 клк, преобладает миллисекундный компонент ЗЛ) больший уровень ЗЛ у "крупных" клеток по сравнению с "мелкими" свидетельствовал о более раннем световом насыщении у них фотосинтеза. Теплоустойчивость тилакоидных мембран "мелких" клеток была выше, чем у "крупных", как это следовало из положения максимумов на температурной зависимости ЗЛ — 49.5° С и 47.5° С, соответственно. Эффективность фотосинтеза у "мелких" клеток (т)=0,86±0,02 отн.ед.) была также несколько выше по сравнению с "крупными" (т|=0,80 ± 0.02 отн.ед.).

При помощи регистрации ЗЛ мы проследили за изменением функциональных характеристик клеток в процессе клеточного цикла. При созревании мелких клеток уровень ЗЛ (при закрытых ингибитором диуроном реакционных центрах) в расчете на клетку сначала двукратно увеличивался, а после деления снижался до исходного уровня. То есть, количество фотохимически активного хлорофилла при удвоении

объема клетки тоже возрастает вдвое. Исходно высокая теплоустойчивость у "мелких" клеток снижалась перед делением, а затем вновь возрастала. Последнее наблюдение согласуется с известным фактом снижения устойчивости клеток в конце фазы Сг клеточного цикла (Гродзинский, 1983).

2. ВЛИЯНИЕ БИХРОМАТА КАЛИЯ И СУЛЬФАТА ИМАЗАЛИЛА НА ЧИСЛЕННОСТЬ И СТРУКТУРУ ПОПУЛЯЦИИ 5с. чиа(1гкаи(1а.

2.1. Динамика роста культуры водорослей в присутствии различных количеств токсикантов была разной.

У контрольной культуры логарифмическая фаза роста продолжалась до 15 дней, после чего наблюдали переход в стационарную фазу.

Малые количества сульфата имазалила и бихромата калия (0.001 мг/л) стимулировали деление части клеток, и в первые двое суток их численность превышала контрольную на 10—15 %. Но, начиная с 4-х суток и до конца эксперимента, число клеток было в среднем на 20 % меньше, чем в контроле.

При "средних" концентрациях токсикантов (0.01 и 0.1 мг/л), в первые двое суток численность клеток не менялась, но в последующие дни быстро возрастала, достигала контрольного уровня или даже превышала его.

При концентрации сульфата имазалила 1.0—2.0 мг/л, а бихромата калия.3.0 мг/л число клеток в течение эксперимента было близко к их исходному количеству.

Большие количества токсикантов (10.0 мг/л и более) после некоторой лаг-фазы постепенно уменьшали количество клеток в культурах практически до нуля.

2.2. Кривые "концентрация — эффект". На основании кинетики роста водорослей в присутствии токсикантов были построены зависимости относительной численности клеток от концентрации токсикантов. Как показано на рисунках 4а и 46, экспонирование культур водоросли в течение 4—7 суток с токсикантом сложным образом изменяет число клеток по сравнению с контролем (кривые I). При низких и высоких концентрациях токсикантов количество клеток было меньше, чем в контроле. При средних — эффект отсутствовал. Наблюдаемая трехфазная (бимодальная, парадоксальная) концентрационная зависимость мало изменялась в течение хронического эксперимента (до 30 суток).

Число мертвых клеток в культуре возрастало только при высокой концентрации токсикантов (кривые 2 на этих же рисунках). Следовательно, колебания относительной численности водорослей в культурах при меньших концентрациях токсикантов, по-видимому, нельзя объяснить простым суммированием процсссов'размножения и гибели

клеток. Такой эффект неоднократно описан в литературе (Строганов, 1941, 1973, Александров, 1985, Филенко, 1990) и называется «парадоксальным», поскольку токсикант в меньшей концентрации оказывает больший биологический эффект, чем в средних. Чтобы разобраться, как реагируют клетки на разные количества токсиканта, мы проанализировали изменение размерно-возрастной структуры популяции в характерных точках кривых "концентрация—эффект".

8 i

1 ь

2 1 I 2

ё*

¡!> а

Це

Е ® о 5

120 120 о с 120

о "к

100 \ 1 Г Л 100 ь ф и с о 100

V V 1 5 У а

80 80 X О О Ь" X 80

60 > 60 л ^ о Ь? а ж л с <0 о а« £ 60

40 г 40 о ь X и х Р 40

20 - 20 К с; о о X н и Ф § 20

0 0 СЕ о 0

0 0.01 1 10 Бихромат калия, мг/л

0 0.01 1 10 Сульфат имазап ила, мг/л

Рис. 4. Изменение относительной численности (кривая 1) и доли мертвых клеток (кривая 2) Бс. quadricauda в присутствии бихромата калия (А) и сульфата имазалила (Б) на 4—8 сутки эксперимента.

2.3. Размерно-возрастная структура популяции в присутствии токсикантов.

Эффект токсикантов в концентрации 0.001 мг/л. Результатом действия токсикантов в низких концентрациях, начиная с 4 суток интоксикации, было отставание роста культуры. В пробах появлялись "крупные" клетки (4.5—5.5 мкм) в составе 2-клеточных ценобиев. Позже размер этих клеток увеличивался до 6.0—6.5 мкм, они становились одиночными и составляли приблизительно половину от общего числа клеток в пробах. Размерный спектр клеток имел два максимума в областях 4.0 и 6.0—6.5 мкм. Первый (широкий) объединял пролиферирующие клетки в составе 2- и 4-клеточных ценобиев, второй составляли крупные одиночные клетки (рис. 5). К 25 суткам эксперимента крупные клетки превращались в круглых одиночных "гигантов".

Таким образом, причиной отставания в росте культуры водоросли при низких концентрациях токсиканта было не замедление клеточного цикла у всех клеток популяции, а прекращение пролиферации у некоторых. Другие клетки в популяции, по-видимому, не реагировали на присутствие токсикантов и продолжали делиться. Иными словами, реакция культуры водоросли на токсиканты в низкой концентрации

определяется клеточной гетерогенностью, которая проявляется уже на начальном этапе действия токсикантов. Последние стимулировали деление одних клеток (через сутки число клеток по сравнению с контролем возросло на 15 %), не оказывали влияние на другие и на длительный срок остановили пролиферацию третьих.

о о г о «в X

а а.

I-

о Ш

2 3 4 5 6 7 8 Ширина клетки, мкм

о %

ф «в 30) а. ь о Ш

□ 4-клеточные ценобии

Э 2-клеточные

ценобии 0 одиночные клетки

1 2 3 4 5 6 7 8

Ширина клетки, мкм

Рис. 5. Размерно-возрастной и ценоЬиальный состав популяции ¿'с. циас1псаис1а в присутствии 0.001 мг/л бихромата калия и сульфата имазалила. А — 4 сутки; Б — 30 сутки.

Низкие концентрации сульфата имазалила, приостановив деление у части клеток в популяции, существенно не нарушали активность функционирования фотосинтетического аппарата (т1=0.68 ± 0.03 отн. ед., в контроле т}=0.82± 0.02 отн.ед.), а также не препятствовали накоплению клетками биомассы — наблюдали увеличение размеров клеток. Теплоустойчивость фотосинтетических мембран к концу третьей недели, когда прекратившие деление крупные клетки составляли половину популяции, была на 1.5° С выше, чем у контрольной культуры.

Средние "недействующие" концентрации (0.01 и 0.1 мг/л), Реакция клеток

¿>с. quadricauda на токсикант в концентрации на два порядка более высокой (0.01-0.1

мг/л), чем в предыдущем опыте, резко изменялась. Во время двухдневной задержки деления размер как "крупных", так и "мелких" клеток увеличивался. В пробах возрастала доля "крупных" клеток (4.5—5.0 мкм) в 2-клеточных ценобиях. На 3—4 сутки, когда деление клеток синхронно возобновилось, а численность клеток достигла контрольного уровня, в популяции стачи преобладать "мелкие" клетки в 4-клеточных ценобиях. В размерном спектре клеток восстановился максимум при 3.0—3.5 мкм, характерный для контрольной культуры.

В присутствии сульфата имазалила во время задержки клеточного деления эффективность фотосинтеза незначительно снижалась до т)=0.70±0.02 отн. ед. по сравнению с контролем т)=0.82± 0.03 отн. ед., но через двое суток вновь восстанавливалась до нормы. Возросшая на 1.5° С во время остановки деления теплоустойчивость фотосинтетических мембран после возобновления клеточной пролиферации сохранялась. Таким образом, за время одного клеточного цикла произошло адаптивное повышение устойчивости клеток, в результате которого культура водоросли могла расти в присутствии токсиканта.

При концентрации сульфата имазалила 1.0—2.0 мг/л и 3.0 мг/л бихромата калия число клеток на протяжении эксперимента было близко к исходному. Однако анализ размерно-возрастной культуры и количества мертвых клеток показывает, что причины снижения относительной численности, по крайней мере, две: это задержка деления одних клеток и размножение и гибель других.

В случае действия сульфата имазалила в течение первого клеточного цикла после введения токсиканта относительное количество клеток падает вдвое. Размер всех клеток достигал 4.5—5.0 мкм, и в дальнейшем их ширина продолжала увеличиваться. К 30 суткам клетки приобретали шарообразную форму, ценобии распадались на одиночные гигантские клетки диаметром 11.0—12.0 мкм (рис. 6). В то же время доля мертвых клеток возрастала до 15 %. Это могло означать, что в культуре, наряду с гибелью клеток, происходит их размножение.

£ 30 л

1 20

т о о.

£ 10

4 сутки

30 сутки

□ 4-клеточные

ценобии О 2-клеточные

ценобии в одиночные клетки

2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 1213 14 Ширина клетки, мкм

Рис. 6. Размерно-возрастной и ценобиальньш состав популяции циасЬ-'юаийа в присутствии 1.0 мг/л сульфата имазалила на 4 и 30 сутки эксперимента.

Это предположение подтверждают опыты с бихроматом калия, в которых тоже имело место торможение клеточного цикла у части клеток, сопровождаемое возрастанием их размеров. Но доля мертвых клеток была выше, чем в присутствии имазалила и составляла 30 %. На наличие в культуре пула пролиферирующих клеток в этих условиях указывает присутствие в пробах "мелких" клеток в составе 4-клеточных ценобиев. Появление 2-клеточных ценобиев с клетками меньшего размера (3.5—4.0 мкм), чем в контроле, свидетельствует о том, что бихромат калия нарушает оболочку ценобия, способствуя его преждевременному распаду.

Имазалил в сублетальной концентрации существенно не нарушал фотосинтеза (т|=0.72 ± 0.03 отн. ед. по сравнению с т1=0.8±0.02 отн. ед. в контроле). Рост объема клеток сопровождался увеличением количества фотохимически активного хлорофилла. Теплоустойчивость тилакоидных мембран у гигантских клеток превышала исходную на 1.5° С.

Пролиферация у одиночных гигантских клеток возобновлялась после их отмывания и перенесения в чистую питательную среду. В популяции водорослей снова появились 2- и 4-клеточные ценобии с клетками нормального размера. Таким образом, наблюдаемое явление гигантизма клеток можно рассматривать как защитную реакцию па токсикант. В этот период клетка находится в состоянии покоя, не делится, но продолжает активно накапливать биомассу, о чем свидетельствует нормальный уровень фотосинтетических процессов.

Под влиянием токсикантов в высоких концентрациях (5.0 мг/л и выше сульфата имазалила и 10.0 мг/л и выше бихромата калия) водоросли погибали фактически в течение двух клеточных циклов. Однако, в первые сутки численность клеток в двухвозрастной культуре практически не изменялась. В размерном спектре появлялись очень мелкие водоросли диаметром 2—2.5 мкм в 4-клеточных ценобиях (рис. 7). Это означало, что сульфат имазалила и бихромат калия первоначально инициировали деление водорослей, причем даже тех из них, которые еще не достигли необходимого размера. Если в норме делились преимущественно клетки размером около 4.5 мкм, то в присутствии летальных количеств токсикантов — клетки размером 3.5 мкм. Поскольку общее количество клеток при этом не изменялось, то, очевидно, что часть из них уже погибла.

Таким образом, анализ структуры популяции раньше, чем подсчет числа клеток, может информировать о летальном эффекте токсиканта.

Ширина клетки, мкм

Рис. 7. Размерно-возрастной и ценобиальный состав популяции 5с. диас1псаис1а в присутствии 10.0 мг/л бихромата калия и сульфата имазалила на 1 сутки эксперимента.

Наблюдение функциональных характеристик клеток позволяло выявить необратимые изменения в жизнедеятельности клеток прежде, чем их численность начинала уменьшаться. Наиболее характерным было падение теплоустойчивости тилакоидных мембран, которое через 1 сутки составляло уже 10° С (с 48° до 38° С). Фотохимическая активность хлоропластов в это же время уменьшалась в 1.5 раза (с г| г0.8±.0.02 отн. ед. до т|=0.5±0.05 отн. ед.). Если у клеток контрольной культуры остановка фотосинтетического электронного транспорта гербицидом диуроном увеличивала уровень ЗЛ вдвое, то у отравленных клеток, напротив, уровень свечения уменьшался вдвое. Последнее означает, что сульфат имазалила нарушает электронный транспорт на донорной стороне фотосистемы II (ФСII).

Описанные нарушения в фотосинтетическом аппарате водоросли увеличивались с ростом количества токсиканта в среде Чем выше была концентрация токсиканта (10.0—20.0—40.0 мг/л), тем быстрее развивались нарушения.

Однако, к 20—30 суткам эксперимента с летальным количеством токсиканта (например, 5.0 мг/л сульфата имазалила) в пробах оставались функционально активные живые клетки, и можно было построить их размерный спектр. Размерно-возрастная структура популяции была очень похожа на таковую у контрольной культуры. Характеристики фотосинтетического аппарата этих клеток, хотя и отличались от контрольных, но не столь значительно, чтобы говорить о необратимости изменений. Интересно было оценить величину пула таких резистентных клеток в исходной популяции водорослей.

2.4. Определение размера пула устойчивых клеток в популяции £с. диа^каиЛа при действий бихромата калия.

Число резистентных клеток в культуре Зс. диас1гкаис1а определяли после длительной трехразовой интоксикации бихроматом калия в летальной концентрации 10.0 мг/л.

Культуры были лредадаптированы путем выращивания с 0.1; 1.0; 3.0 и 10.0 мг/л бихромата калия, а затем пересажены в среду с 10.0 мг/л соли. Предадаптация привела к тому, что в зависимости от указанных концентраций к концу эксперимента на среде с 10.0 мг/л бихромата калия выросло разное количество клеток. Наибольшее количество живых клеток (73 тыс кл/мл) содержала культура, предадаптированная с 0.1 мг/л ("недействующая" концентрация на дозовой кривой). Иными словами, предварительная экспозиция клеток в этой концентрации токсиканта повысила устойчивость всей популяции.

Затем культуры вновь пересадили в среду с 10.0 мг/л бихромата калия. Через месяц численность живых клеток во всех культурах составила 6—8 тыс кл/мл, за исключением культуры, лредадаптированой при 10.0 мг/л токсиканта, где живых клеток не обнаружено. Интересно, что если такой же эксперимент проводили не в зимний, а в весенний период, то выживало 5 тыс кл/мл. Это означает, что в течение года резистентность культуры к токсикантам меняется, причем в весенний период популяция является более устойчивой к действию токсиканта. Это наблюдение согласуется с данными других авторов (Чжао Ицзюнь, 1994; Арттохова и др., 1997а, б).

Таким образом, несмотря на длительную экспозицию водорослей с летальными количествами бихромата калия, в культурах сохраняются жизнеспособные клетки. Подсчет показывает, что их количество составляет 5—6 % от исходного числа клеток в культурах. Эта величина близка к приводимым в литературе данным по частоте спонтанных мутаций у одноклеточных водорослей, низших грибов и бактерий в естественных условиях (Эрлих, Холм, 1966; Яблоков, Юсуфов, 1976; Тимофеев-Ресовский и др., 1977; Кайгер, Айала, 1988).

За счет пула резистентных клеток происходит быстрое восстановление численности популяции после снижения токсической нагрузки. Так, клетки, первоначально предадаптированные с 3.0 мг/л и дважды пересеянные в среду с 10.0 мг/л бихромата калия росли в 10 раз быстрее, чем контрольные.

Наличие в популяции Кс. диас!псаис!а устойчивых к бихромату калия клеток может быть связано с их постоянным присутствием в культуре или является

результатом образования резистентных мутантов во время процедуры отбора. Но для прояснения этой ситуации необходимы специальные исследования.

2.5. Влияние токсикантов на клеточный цикл диш!псаи4а.

Наблюдение за изменением размерного спектра клеток водорослей под влиянием токсикантов позволило тестировать не только присутствие в ростовой среде его сублетальных или летальных концентраций, но и предположить, на какой фазе клеточного цикла реализуется их действие (рис. 3).

Добавление в культуру водоросли, состоящей преимущественно из "мелких" клеток (фаза клеточного цикла), сублетальной концентрации сульфата имазалила (1.0 мг/л) останавливало ее рост на длительный срок (рис. 8, кривая У). Клетки увеличивались в размере и не делились, оставаясь одноядерными. На 7—8 сутки их ширина достигала 6.0—7.0 мкм, а к 30 суткам — 11.0—12.0 мкм. Оболочка ценобиев лопалась, и в пробах были видны исключительно одиночные шарообразные клеточные "гиганты" (рис. 6).

Если в культуре преобладали "крупные", готовые к делению клетки (фаза Ог; в контроле они поделились на следующие сутки), то присутствие тех же количеств имазалила не мешало удвоению численности популяции. Однако клетки поделились только едипожды, и позже их численность в культуре практически не изменялась (рис. 8, кривая 2). Отсюда следует, что сублетальные количества имазалила тормозят клеточный цикл на фазе в) и препятствуют репликации ДНК.

1 с 2 2

»- 3 о *

¡1

щ 2 Ц

0,8 0,6 0,4 0,2 0

0 1 2 3 4 5 6 7 Время, сутки

Рис. 8. Влияние сульфата имазалила на популяции диас1псаис1а с разным клеточным составом. Кривая 1 — популяция с преобладанием "мелких" клеток; кривая 2 — популяция с преобладанием "крупных" клеток.

В летальных концентрациях имазалила (10.0 мг/л и больше) водоросли погибали в течение А—5 суток, то есть практически за время одного клеточного цикла. В первые

сутки в пробах двухвозрастпой культуры число клеток было близко к контрольному уровню, но появлялись очень мелкие водоросли диаметром 2—2.5 мкм в 4-клеточных ценобиях (рис. 7). Последнее означает, что имазалил инициировал деление не достигших необходимого размера водорослей шириной 3.5 мкм (в норме делятся преимущественно клетки с диаметром около 4.5 мкм). Но поскольку общее количество клеток при этом не юменялось.-то ясно, что уже в первые сутки клетки гибли.

Численность одновозрастной культуры, состоящей из молодых не готовых к делению клеток размером около 3.0 мкм в 4-клеточных ценобиях, в присутствии летального количества токсиканта в течение первых суток тоже не изменялась. Токсикант не препятствовал увеличению размера клеток до 3.5—4.0 мкм. Однако, спустя еще сутки, численность клеток резко упала, что указывало на их гибель.

Сопоставляя динамику гибели клеток в одно- и двухвозрастной культурах, следует предположить, что молодые "мелкие" клетки и зрелые "крупные" в присутствии летального количества токсиканта отмирают на разных фазах клеточного цикла. По-видимому, "мелкие" клетки гибнут в конце фазы 0|, а "крупные" — в конце фазы С<2 или во время митоза. Как известно (Гродзинский, 1983), именно в эти фазы клеточного цикла клетки наиболее чувствительны к различным воздействиям.

Таким образом, наблюдения за размерным спектром популяции в присутствии токсикантов позволяют не только определить наличие в ростовой среде сублетальных либо летальных концентраций, но и установить этап клеточного цикла, на который действует токсикант.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ.

С целью определить биологическую опасность химических продуктов, то есть найти минимально действующие и максимально допустимые количества вредного вещества, а также другие количественные характеристики, принятые в токсикологии, используют тест-организмы, в частности, лабораторные культуры пресноводных зеленых микроводорослей. Высокая чувствительность этих организмов к токсикантам обусловлена "открытостью" их обмена, постоянным поглощением и выделением во внешнюю среду различных веществ.

фаз клеточного цикла, нарушить продвижение клетки по циклу и тем самым изменить скорость роста популяции и ее чувствительность к окружающим факторам. Отсюда следует, что рутинный подсчет числа клеток без учета клеточного состава популяции значительно обедняет токсикологический эксперимент.

Проведенные нами исследования позволили установить разницу в реакции популяции на токсикант в зависимости от ее клеточного состава. Так оказалось, что сублетальная концентрация сульфата имазалила (1.0 мг/л) быстро и на длительный срок останавливает рост популяции, состоящей преимущественно из "мелких" клеток (фаза в] клеточного цикла), но не препятствует делению "крупных" (фаза йг). После деления, когда "крупные" клетки стали "мелкими", численность популяции оставалась на одном уровне.

Анализ изменения размерно-возрастной структуры популяции в присутствии летальных концентраций имазалила (10.0 мг/л и больше) позволил выяснить, на какой стадии клеточного цикла происходит преимущественная гибель клеток. В одновозрастной культуре высокие концентрации имазалила не тормозили рост "мелких" клеток. Гибель клеток, по-видимому, наступала в конце фазы 0[, во время которой чувствительность клеток к внешним воздействиям резко возрастает (Гродзинский, 1983; Гудков, 1985). Из анализа кинетики гибели клеток в двухвозрастной культуре следовало, что "крупные" клетки, скорее всего, гибнут в конце фазы Ог и при делении. Кроме того, анализ структуры популяции в это время показал, что летальные концентрации стимулируют деление "крупных" и даже незрелых клеток, уже прошедших синтетическую фазу (Э).

Наблюдения за клеточным составом популяции позволили показать разницу в ее состоянии при одном и том же уровне снижения относительной численности клеток под: влиянием токсиканта. На дозовой кривой (рис. 4) видно, что одинаковое отклонение численности от контроля происходит в двух областях, при концентрациях токсикантов, отличающихся на несколько порядков. В области низких концентраций снижение относительной численности популяции было обусловлено торможением деления только у части клеток, что вызывало постепенное накопление в культуре клеток-гигантов. Остальные клетки нормально пролиферировали. В этом проявляется гетерогенность реакции клеток на токсиканты. В отличие от малых, сублетальные концентрации токсиканта вызывали длительное торможение деления всех клеток.

' Анализ размерной структуры популяции позволяет решить, вызвано ли 50 %-ное снижение относительной численности клеток задержкой их деления (эффективная концентрация, ЭК5Э) или гибелью (летальная концентрация, ЛК5о), Если снижение

относительной численности вызвано задержкой деления, то в популяции преобладают "крупные" клетки.

С помощью наблюдения за структурой популяции можно провести предварительный качественный анализ реакции популяции на токсиканты. Так, появление крупных и гигантских клеток указывает на вероятное присутствие в среде сублетальных концентраций токсиканта, а появление "мелких" клеток свидетельствует о летальном эффекте токсиканта.

В данной работе использовали ЗЛ (метод исследования фотосинтетической функции клеток), исходя из того, что ассимиляция световой энергии — главнейшая функция автотрофных организмов. Наиболее информативной оказалась регистрация люминесценции культуры водорослей на терминальной стадии жизнедеятельности клеток. Изменения в характеристиках люминесценции наблюдались прежде, чем можно было обнаружить гибель клеток. Выяснилось, что сопровождающее гибель клеток прекращение фотосинтетического электронного транспорта , начинается на донорной стороне ФСП, то есть в том месте электрон-транспортной цепи, которое в первую очередь нарушается при самых различных воздействиях (Веселовский, Веселова, 1990).

В случае частично синхронизированной культуры водорослей возможности метода ЗЛ ограничены, поскольку сигнал регистрируется от совокупности клеток, которые находятся в разных состояниях. Например, при малых концентрациях токсиканта, когда структура популяции изменяется, достоверных изменений в характеристиках свечения не удалось зарегистрировать. Если такие изменения и имели место, то, скорее всего, они были следствием перемены клеточного состава популяции, а не результатом прямого действия токсиканта на фотосинтетический аппарат.

Наблюдение за уровнем свечения культуры водорослей после остановки электронного транспорта диуроном можно было использовать как показатель изменения численности клеток в популяции.

ВЫВОДЫ.

1. Структура модельной популяции £с. диас1г1саш1а (Тигр.) ВгеЬ. при выбранных условиях культивирования представлена двумя размерно-возрастными группами клеток: "крупными" зрелыми клетками шириной 4.5—5.0 мкм в составе 2-клеточных ценобиев, преобладающими перед делением, и "мелкими" молодыми шириной около 3.0 мкм в составе 4-клеточных ценобиев, преобладающими после деления.

2. Размерно-возрастная структура популяции ¡¡с. диа(1псаш1а при интоксикации изменяется, что можно использовать как диагностический признак состояния популяции: наличие гигантских клеток свидетельствует о торможении процесса деления клеток, а преобладание мелких — об ускоренном делении клеток и значительном токсическом эффекте.

3. Обнаружен эффект действия токсикантов в сверхмалых концентрациях (0.001 мг/л), выраженный в торможении деления примерно половины клеток в популяции. При этом структура популяции представляет собой совокупность одиночных клеток-гигантов и обычных клеток в составе 2- и 4-клеточных ценобиев.

4. Причиной образования крупных и гигантских одиночных клеток шириной до 12.0 мкм при интоксикации культуры является длительная обратимая задержка их деления. После пересева на среду без токсиканта эти клетки начинают делиться, и размерно-возрастная структура популяции восстанавливается.

5. Различные концентрации токсикантов неодинаково влияют на стадии клеточного цикла: сублетальные концентрации ингибируют деление клеток на фазе 0|; при летальных концентрациях "крупные" зрелые клетки отмирают в конце фазы или при митозе; молодые "мелкие" клетки гибнут накануне Б-фазы.

6. Измерение фотосинтетической активности по характеристикам ЗЛ наиболее информативно при действии высоких концентраций токсикантов; необратимые изменения в клетках водорослей по ЗЛ фиксируются раньше, чем снижается численность клеток.

7. Опыты по ступенчатой интоксикации культуры водорослей бихроматом калия показали, что в популяции присутствует 5—6 % "сверхустойчивых" клеток, за счет которых происходит восстановление численности популяции.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Прохоцкая В. Ю., Веселова Т. В., Веселовский В. А., Дмитриева А. Г., Артюхова В. И. (1996). Комплексный анализ действия фунгицида сульфата имазалила на культуру Бсепес1е5тш диас1псаис1а11 Всероссийская конференция "Эколого-физиологические исследования водорослей и их значение для оценки состояния природных вод", Борок, 3—5 декабря. Тез. докл. С. 163.

2. Филенко О. Ф., Дмитриева А. Г., Арпохова В. И., Прохоцкая В. Ю. (1998). Количественная взаимосвязь биологических параметров водорослей при токсических воздействиях//1 съезд токсикологов России. Тез. докл. С. 325.

3. Артюхова В. И., Прохоцкая В. Ю., Дмитриева А. Г., Коломенская Е. Е. (1999). Адаптация Scenedesmus диаЛпсаиЛа (Тигр.) ВгеЬ. к бихромату калия// Альгология. 9, № 2. С. 9.

4. Веселовский В. А., Веселова Т. В., Прохоцкая В. Ю. (1999). О причине парадоксальной концентрационной зависимости ответа клеточной популяции на токсические агенты// II съезд биофизиков России, Москва, МГУ, 23—27 августа. Тез. докл. С. 187.

5. Дмитриева А. Г., Артюхова В. И., Прохоцкая В. Ю. (1999). Контроль качества воды с использованием одноклеточных зеленых водорослей // Экологические системы и приборы. N1.0. 41—44.

6. Прохоцкая В. Ю. (1999). Методы биотестирования воды: проблемы и перспективы// Информационно-аналитический сборник «Инновации-98». Материалы I Международной выставки-ярмарки и конференции, Москва, 4—9 сентября, 1998. С. 77—81.

7. Прохоцкая В. Ю., Веселова Т. В., Веселовский В. А. (1999). Изменение размерно-возрастной структуры лабораторной популяции водоросли Scenedesmus quadr¡cauda (Тиф.) ВгеЬ. (СМогоркусеае) в присутствии фунгицида сульфата имазалила// Альгология. 9,№ 2. С. 121—122.

8. Прохоцкая В. Ю., Веселова Т.В., Веселовский В. А. (1999). Уменьшение вероятности ошибки в определении токсических концентраций химического продукта // Экологические системы и приборы. N 2. С. 54—57.

9. Прохоцкая В. Ю., Веселовский В. А., Веселова Т. В. (1999). Рост, структура популяции и характеристики фотосинтетического аппарата водоросли Scenedesmus quadrií■auda в присутствии имазалила (1-[2-(2,4-дихлорфенил)-2-(2-пропенилокси)-этил]-1Н-имидазол)// IV съезд Общества физиологов растений России, Москва, ИФР РАН, 4—9 октября. Тез. докл. С. 447.

10. Прохоцкая В. Ю., Артюхова В. И. (2000). Вариабельность морфологических параметров Бсепейезтш циайг1саийа (Тшр.) ВгеЬ. в норме и при интоксикации// Всероссийская конференция "Проблемы экологии и биоразнообразия водных и прибрежноводных экосистем", Борок, 14—16 сентября.

11. Прохоцкая В. Ю., Веселова Т. В., Веселовский В. А., Дмитриева А. Г., Артюхова В. И. (2000). Размерно-возрастная структура лабораторной популяции 8сепе<1евтш диа(1псаш1а в присутствии сульфата имазалила // Альгология, (в печати).

12. Прохоцкая В. Ю., Веселовский В. А., Веселова Т. В., Дмитриева А. Г., Артюхова , В. И. (2000). О причине трехфазного ответа популяции водоросли Ъсепейешиь

quadricauda на действие сульфата имазалила// Физиология растений. 47, N 5. (в печати).

13. Прохоцкая В. Ю., Дмитриева А. Г., Артюхова В. И. (2000). Размерный состав лабораторной популяции микроводорослей при интоксикации// Международная

. конференция "Микология и криптогамная ботаника в России: традиции и современность", Санкт-Петербург, 24—28 апреля. Тез. докл. (в печати).

14. Артюхова В. И, Прохоцкая В. Ю., Дмитриева А. Г. Роль водорослей в оценке качества водной среды// Международная конференция "Микология и криптогамная ботаника в России: традиции и современность", Санкт-Петербург, 24—28 апреля. Тез. докл. (в печати).

15. Прохоцкая В. Ю., Артюхова В. И., Дмитриева А. Г., Филенко О. Ф. (2001). Оценка степени адаптации лабораторной популяции микроводоросли Scenedesmus диаёпса^а (Тшр.) ВгеЬ. к действию бихромата калия// Вестник МГУ, сер. биол. № 1. (в печати).

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Прохоцкая, Валерия Юрьевна

I. Введение.

II. Обзор литературы.

1. Определение понятий "популяция" и "структура популяции".

2. Особенности организации клеточных популяций.

2.1. Культуры клеток.В

2.2. Культуры одноклеточных микроводорослей.

2.3. Природные популяции и сообщества фитопланктона.

3. Жизненные циклы пресноводных хлорококковых водорослей.

3.1. Жизненный цикл Chlorella.

3.2. Жизненный цикл Scenedesmus.

3.3. Изменения физиологических характеристик клеток водорослей в течение жизненного цикла.

4. Полиморфизм природных и лабораторных популяций видов рода Scenedesmus.

5. Реакция клеток и популяций гидробионтов на внешнее неблагоприятное воздействие.

5.1. Фазность реакции клеток и культур гидробионтов на токсиканты.

5.2. Общие представления о возможных механизмах популяционного ответа.

5.3. Адаптивные реакции водорослей.

5.4. Экспериментальные исследования действия некоторых основных групп токсикантов на микроводоросли.

5.4.1. Действие тяжелых металлов.

5.4.2. Действие пестицидов.

III. Материалы и методы исследования.

1. Объект исследования.

2. Техника культивирования.

3. Токсиканты.

4. Схема проведения экспериментов.

5. Исследуемые показатели.

Результаты и обсуждение.

1. Рост и размерный состав популяции диас1пссшс1а.

1.1. Клеточный цикл диа&юаиЛа в стандартных условиях культивирования.

1.2. Варьирование длительности клеточного цикла.

1.3. Функциональные характеристики "крупных" и "мелких" клеток.55 2. Изменения численности, структуры популяции и функциональных характеристик клеток Бс. диас1г1саис1а в присутствии токсикантов.

2.1. Динамика роста культуры водорослей в присутствии токсикантов.

2.2. Кривые "концентрация — эффект".

2.3. Размерно-возрастная структура популяции в присутствии бихромата калия.

2.4. Размерно-возрастная структура популяции Se. quadricauda в присутствии сульфата имазалила.

2.5. Определение размера пула устойчивых клеток в популяции Se. quadricauda при действии бихромата калия.

2.6. Влияние токсикантов на клеточный цикл Se. quadricauda.

2.7. Контроль состояния популяции водоросли в присутствии токсиканта методом замедленной люминесценции.

2.8. Механизм ингибирования фотосинтеза клеток водорослей сульфатом имазалила.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Структурно-функциональные характеристики модельной популяции scenedesmus quadricauda при интоксикации"

В условиях современного постоянно возрастающего антропогенного воздействия на водные экосистемы остается актуальной проблема совершенствования методов биоиндикации и биотестирования состояния окружающей среды (Строганов, 1970; Vighi, Calamari, 1985; Priant, Henry, 1985, Hermes et al., 1985; Филенко, 1990). Обычно при проведении экспериментов токсикологи в качестве тест-объектов используют разнообразные организмы: бактерии, простейшие, микроводоросли, низшие ракообразные, моллюски, рыбы и др. (van der Shalie et al., 1979; Cairns, Cruber, 1980; Шаланки, 1985; Методы биотестирования вод, 1988; Biomonitoring., 1995).

Очень удобным объектом для исследований действия токсикантов как на клеточном, так и на популяционном уровнях являются микроводоросли (Методики биологических исследований., 1971; Bringmann, Kuhn, 1978; Boyle, 1984; Trainor, 1984; Whitton, 1984; Calamari et al., 1985; Брагинский и др., 1987; Кожанова, Дмитриева, 1989; Schafer et al., 1994). Использование лабораторных культур водорослей в экологических исследованиях дает возможность, во-первых, исследовать действие токсиканта на функциональные и морфологические показатели растительной клетки (клеточный уровень); во-вторых, оценить действие токсиканта на модельную популяцию микроводорослей (популяционный уровень), а, кроме того, изучить некоторые экологические особенности той или иной группы водорослей (Happey-Wood, 1978; Paasche, 1978).

Уровень воздействия токсикантов определяют по изменению численности водорослей в культуре. Проводят прямой подсчет клеток или используют интегральные оптические методы, основанные на поглощение и флуоресценции клеточных пигментов (Методики биологических исследований., 1971; РД 11802-90, 1991). Считают, что варьирование количества клеток в популяции водоросли адекватно отражает ее состояние (van Leeuwen et al., 1985).

Использование интегральных оптических методов для оценки токсического действия веществ дает исследователю ряд преимуществ, поскольку, во-первых, с их помощью можно исследовать реакцию живых неповрежденных клеток; во-вторых, такие методы являются достаточно оперативными и позволяют получить ответную реакцию уже через 10-15 минут после внесения токсиканта в среду (Lorenzen, 1966; Samuelsson et al., 1978; Schmidt, 1983). Однако, при интерпретации полученных данных возможен ряд ошибок, связанных с присутствием в пробе посторонних частиц (Iturriaga, Siegel,

1989), изменения спектра поглощения света в процессе роста культуры (Yentsch, Phinney, 1989), изменения размеров клеток и их пигментного состава (Perry, Porter, 1989; Yentsch, Phinney, 1985). На результаты определения также влияют условия выращивания культуры водорослей. На слабом свету клетки синтезируют больше хлорофилла и в пересчете на их площадь поглощают больше света, чем клетки, выращенные при высокой освещенности и содержащие меньше пигмента.

Из сказанного выше следует, что, несмотря на очевидную оперативность оптических методов, при их использовании необходимо критически относиться к полученным результатам. Кроме этого, исследователи нередко не учитывают того факта, что экспериментальные результаты являются суммарным откликом гетерогенной совокупности клеток. Поэтому корректно поставленный эксперимент по измерению физиологических параметров должен проводиться на синхронной культуре микроводорослей, реакцию которой на внешнее воздействие можно рассматривать как ответ одной гигантской клетки (Tamiya et al., 1953; Tamiya, 1957, 1966; Sorokin, 1957).

Основной характеристикой состояния культур микроводорослей, подвергающихся токсическому воздействию, на популяционном уровне является общее число клеток (Методики биологических исследований., 1971; Т 90-304, 1980; ISO 8692, 1989; РД 118-02-90, 1991). Однако, часто число водорослей в популяции сложным образом изменяется в присутствии токсиканта в среде (Строганов, 1941, 1973; Филенко, Исакова, 1983; Александров, 1985; Филенко,

1990). Это связано с тем, что токсикант изменяет клеточный состав популяции, воздействуя на скорость размножения и гибели клеток, длительность клеточного цикла и функциональное состояние клеток. Очевидно, что для полноты характеристики состояния культуры микроводорослей было бы полезным контролировать ее клеточный состав, то есть определять гетерогенность популяции. Но поскольку это достаточно трудоемкий процесс, в настоящее время анализ структуры популяции микроводорослей проводят редко. Поэтому целью настоящей работы стало исследование закономерностей изменения размерно-возрастной структуры и функциональных характеристик клеток водоросли 5с. диа&1саис1а под влиянием бихромата калия и фунгицида сульфата имазалила.

В задачи работы входило:

2. Проследить за формированием размерно-возрастной структуры лабораторной популяции 5с. циаФюаиёа в норме и при токсическом воздействии;

3. Выявить закономерности восстановления популяции Бс. диа(}псаш1а, подвергнутой разной степени интоксикации, по размерно-возрастному составу и функциональным характеристикам клеток.

Заключение Диссертация по теме "Гидробиология", Прохоцкая, Валерия Юрьевна

ВЫВОДЫ.

1. Структура модельной популяции 5с. циас1Нсаис1а при выбранных условиях культивирования представлена двумя размерно-возрастными группами клеток: "крупными" зрелыми клетками шириной 4.5—5.0 мкм в составе 2-клеточных ценобиев, преобладающими перед делением, и "мелкими" молодыми шириной около 3.0 мкм в составе 4-клеточных ценобиев, преобладающими после деления.

2. Размерно-возрастная структура популяции 5с. диас!псаис1а при интоксикации изменяется, что можно использовать как диагностический признак состояния популяции при действии токсикантов: наличие гигантских клеток свидетельствует о торможении процесса деления клеток, а преобладание мелких — об ускоренном делении клеток и значительном токсическом эффекте.

3. Обнаружен эффект действия токсикантов в сверхмалых концентрациях (0.001 мг/л), выраженный в торможении деления примерно половины клеток в популяции. При этом структура популяции представляет собой совокупность крупных одиночных и "мелких" клеток в составе 2- и 4-клеточных ценобиев.

5. Различные концентрации токсикантов неодинаково влияют на стадии клеточного цикла: сублетальные концентрации ингибируют деление клеток на фазе при летальных концентрациях крупные зрелые клетки отмирают в конце фазы С2 или при митозе; молодые мелкие клетки гибнут накануне фазы.

103

ЗАКЛЮЧЕНИЕ.

С целью определить биологическую опасность химических продуктов, то есть найти минимально недействующие и максимально допустимые количества вредного вещества, а также другие количественные характеристики, принятые в токсикологии, используют тест-организмы, в частности, лабораторные культуры пресноводных зеленых микроводорослей. Высокая чувствительность этих организмов к токсикантам обусловлена "открытостью" их обмена, постоянным поглощением и выделением во внешнюю среду различных веществ.

Реакция популяции на токсикант в целом определяется гетерогенностью индивидуальной чувствительности клеток. В ходе клеточного цикла чувствительность клетки к повреждающим агентам изменяется. Поэтому устойчивость популяции зависит от количества клеток, находящихся на разных фазах клеточного цикла, и продолжительности этих фаз. В общем случае токсикант может повлиять на любую из фаз клеточного цикла, нарушить продвижение клетки по циклу, и тем самым изменить скорость роста популяции и ее чувствительности к окружающим факторам. Отсюда следует, что рутинный подсчет числа клеток без учета клеточного состава популяции значительно обедняет токсикологический эксперимент.

Проведенные нами эксперименты позволили установить разницу в реакции популяций на токсикант в зависимости от ее клеточного состава. Так оказалось, что сублетальная концентрация сульфата имазалила (1.0 мг/л) быстро и на длительный срок останавливает рост популяции, состоящей преимущественно из "мелких" клеток (фаза в! клеточного цикла), но не препятствует делению "крупных" (фаза 02). Но после деления, когда "крупные" клетки стали "мелкими", численность популяции оставалась на одном уровне.

Анализ изменения размерно-возрастной структуры популяции в присутствии летальных концентраций имазалила (10.0 мг/л и больше) позволил выяснить, на какой стадии клеточного цикла происходит преимущественная гибель клеток. В одновозрастной культуре высокие концентрации имазалила не тормозили рост "мелких" клеток и они, не поделившись, погибали. Это, по-видимому, означает, что эти клетки погибают в конце фазы Сь во время которой чувствительность клеток к внешним воздействиям резко возрастает (Гудков, 1980; Гродзинский, 1983). Из анализа кинетики гибели клеток в двухвозрастной культуре следовало, что "крупные" клетки, скорее всего, гибнут в конце фазы С2 и при делении. Кроме того, анализ структуры популяции в это время показал, что летальные концентрации стимулируют деление "крупных" и даже незрелых клеток, уже прошедших синтетическую фазу (8).

Наблюдения за клеточным составом популяции позволили показать разницу в состоянии клеточной популяции при одном и том же уровне снижения относительной численности клеток под влиянием токсиканта. На дозовой кривой (рис. 6) видно, что 20%- ое отклонение численности от контроля происходит при двух концентрациях токсиканта, отличающихся на несколько порядков. В области низких концентраций снижение относительной численности популяции было обусловлено торможением деления только у части клеток, что вызывало постепенное накопление в культуре "клеток-гигантов". Остальные клетки нормально пролиферировали. В этом проявляется гетерогенность реакции клеток на токсиканты. В отличие от малых, сублетальные концентрации токсиканта вызывали длительное торможение деления всех клеток.

Анализ размерной структуры популяции позволяет решить, вызвано ли 50%-ное снижение относительной численности клеток задержкой их деления (ЭК50) или гибелью (ЛК50). Если снижение относительной численности вызвано задержкой деления, то в популяции преобладают "крупные" клетки.

Наблюдение за структурой популяции позволяет провести предварительный качественный анализ реакции популяции на токсиканты. Так, появление крупных и гигантских клеток указывает на вероятное присутствие в среде сублетальных концентраций токсиканта, а появление "мелких" клеток вследствие их преждевременного деления под влиянием токсиканта — о летальном эффекте токсиканта.

В данной работе использовали ЗЛ (метод исследования фотосинтетической функции клеток), исходя из того, что ассимиляция световой энергии — главнейшая функция автотрофных организмов. Наиболее информативной оказалась регистрация люминесценции культуры водорослей на терминальной стадии жизнедеятельности клеток. Изменения в характеристиках люминесценции наблюдались прежде, чем можно было обнаружить гибель клеток. Выяснилось, что сопровождающее гибель клеток прекращение фотосинтетического электронного транспорта начинается на донорной стороне ФС II. То есть, в том месте электрон-транспортной цепи, которое в первую очередь нарушается при самых различных воздействиях (Веселовский, Веселова, 1990).

Сравнительное исследование действия сульфата имазалила и бихромата калия на культуру водорослей показало общий характер изменения численности и структуры популяции при нарастании концентрации токсикантов. Зависимость поведения популяции при возрастании степени ее интоксикации демонстрирует иерархический характер ответных реакций клеток на токсикант. Ответ популяции водорослей на токсикант аналогичен последовательности событий, которые имеют место в любых клеточных популяциях при нарастании альтерирующего воздействия, и выглядит следующим образом: стимуляция пролиферации при низких количествах токсиканта; обратимая задержка деления и выход клеток из цикла (появление в популяции пула устойчивых покоящихся клеток) при сублетальных факторах и, наконец, гибель клеток.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Прохоцкая, Валерия Юрьевна, Москва

1. Александров В. Я. (1985). Реактивность клеток и белки. JI.: Наука. 318 с.

2. Арутюнян Н. П. (1966). Культивирование одноклеточных зеленых водорослей. Ереван:Изд-во АН Армянской ССР. 75 с.

3. Брагинский Л. П., Величко И. М., Щербанъ Э. П. (1987). Пресноводный планктон в токсической среде. Киев: Наук. Думка. 180 с.

4. Багоцкий С. В., Санин М. В., Эйнор Л. О. (1992). Пестициды и их воздействие на водные экосистемы: Обзорная информация. М.: ВНИИТЭИагропром. 48 с.

5. Брагинский Л. П., Сиренко Л. А. (1971). Методика токсикологического эксперимента на синезеленых водорослях/ Методики биологических исследований по водной токсикологии. М.: Наука. С. 191—205.

6. Брагинский Л. П., Комаровский Ф. Я., Мережко А. И. (1979). Персистентные пестициды в экологии пресных вод. Киев: Наук. Думка. 141 с.

7. Веселовский В. А., Веселова Т. В. (1990). Люминесценция растений: теоретические и практические аспекты. М.: Наука. 200 с.

8. Веселовский В. А., Веселова Т. В. (1992). Индукция флуоресценции. Теория и практика использования для диагностики/ Физиолого-биохимические и биофизические методы диагностики степени устойчивости растений к патогенам и другим факторам. М.: МГУ. 96 с.

9. Владимирова М. Г., Семененко В. Е. (1962). Интенсивная культура одноклеточных водорослей. (Инструкция по первичным испытаниям выделяемых из природы и селекционируемых форм фотоавтотрофных одноклеточных водорослей). М.: АН СССР. 59 с.

10. Водоросли. Справочник (1989)/ Вассер С. П., Кондратьева Н. В., Масюк Н. П. и др. Киев: Наук. Думка. 608 с.

11. Горбунова Н. П. (1992). Альгология: Учебное пособие для ВУЗов по специальности «Ботаника». М.: Высш. школа. 256 с.

12. Горюнова С. В. (1952). Применение метода флуоресцентной микроскопии для определения живых и мертвых клеток водорослей// Труды ин-та микробиологии АН СССР. М. вып. 2. С. 64—78.

13. Горюнова С. В., Максимов В. Н., Плеханов С. Е. (1984). Поглощение и выведение тяжелых металлов микроводорослями в зависимости от их физиологического состояния// Науч. докл. высш. шк. Биол. Науки. N 2. С. 6972.

14. Гродзинский Д. М. (1989). Радиобиология растений. Киев: Наук. Думка. 384 с.

15. Гудков И. Н. (1980). Резервирование в меристемах растений// Надежность клеток и тканей. Киев: Наук. Думка. 212 с.

16. Дмитриева А. Г., Веселова Т. В., Веселовский В. А. (1989) Биотестирование сточных вод и их компонентов и биоиндикация природных вод сиспользованием люминесцентных методов/ Методы биотестирования качества водной среды. М.: МГУ. С. 21—34.

17. Методики биологических исследований по водной токсикологии (1971). М.: Наука. 299 с.

18. Методическое руководство по биотестированию воды РД 118-02-90 (1991). М.

19. ЪА.Методы физиолого-биохимического исследования водорослей в гидробиологической практике (1971). Киев: наук. Думка. 247 с.

20. Мочалкин А. И., Мочалкина А. К, Соколов М. С. (1972). Фотоиндуцированное послесвечение растений под влиянием гербицидов// Физиология и биохимия культурных растений. 5, вып. 5.

21. Мур Д. В., Рамамурти С. (1987). Тяжелые металлы в природных водах. М.: Мир. 286 с.

22. Ъ1.Погосян С. И., Лебедева Г. В., Ризниченко Г. Ю. (1991). Связь функциональной структуры популяции одноклеточных водорослей с ее динамикой// Проблемы экологического мониторинга и моделирования экосистем. Л.: Гидрометеоиздат. XIII. С. 280—297.

23. Посудин Ю. И., Масюк Н. П., Лилицкая Г. Г. (1996). Векторный метод биотестирования водных сред// Альгология. 6, N 1. С. 15—25.

24. Ъ9.Саноцкий И. В., Уланова И. П. (1976). Критерий вредности в гигиене и токсикологии при оценке опасности химических соединений. М.: Медицина

25. Седова Т. В. (1996). Кариология водорослей. Санкт-Петербург: Наука. 386 с.41 .Селъе Г. (1960). Очерки адаптационного синдрома. М.: Медицина.

26. А2.Строганов Н. С. (1941). Новые пути решения проблемы действия сточных промышленных вод на водные организмы. М.: МГУ.

27. Строганов Н. С. (1973). Теоретические аспекты действия пестицидов на водные организмы// Экспериментальная водная токсикология. Рига: Зинатне. 5. С. 11—38.

28. Тимофеев-Ресовский Н. В., ЯблоковА. В., Глотов Н. В. (1973). Очерк учения о популяции. М.: Наука. 275 с.

29. Тимофеев-Ресовский Н. В., Воронцов Н. Н., Яблоков А. В. (1977). Краткий очерк теории эволюции. М.: Наука. 297 с.

30. Упитис В. В. (1983). Макро- и микроэлементы в оптимизации минерального питания микроводорослей. Рига: Зинатне. 240 с.

31. Успенская В. И. (1966). Экология и физиология питания пресноводных водорослей. М.: МГУ. 124 с.

32. Федоров В. Д. (1975). Концепция устойчивости экологических систем// Всесторонний анализ окружающей природной среды. Труды Сов.-амер. симп., Тблилиси, 25—29 марта 1974. Л.: Гидрометеоиздат. С. 207—217.

33. Филенко О. Ф. (1988). Водная токсикология. М.: МГУ. 154 с.

34. Филенко О. Ф., Исакова Е. Ф. (1983). Компенсаторные изменения в ответе дафний на летальные воздействия// Реакции гидробионтов на загрязнение. М.: Наука. С. 135—140.

35. Хоботьев В. Г. (1969). Стандартизация условий при экспериментальном изучении действия токсических веществ на водоросли// Тез. симп. по водной токсикологии. Л. С. 111—112.

36. Berman T. and Chava S. (1999). Algal growth on organic compounds as nitrogen sources// J. Plank. Res. 21, N 8. P. 1423—1437.61 .Biomonitoring of coastal waters and estuaries (1995. CRC Press. 552 p.

37. Bisalputra T. and Weier T. E. (1963). The cell wall of Scenedesmus quadricaudaU Amer. J. Bot. 50, N 10. P. 101—1019.

38. Borisova E. V., Tsarenko P. M. (1999). The effect of accompanying bacteria on the freguency of unicells in cultures of some Scenedesmus species// Arch. Hydrobiol. Suppl. 127. P. 47—56.

39. Bringmann G. and Kuhn R. (1978). Testing of substances for their toxicity threshold: model organizms Microcystis(Diplocystis) aeruginosa and Scenedesmus quadricaudaU Mitt. Internat. Verein. Limnol. 21. P. 275—284.

40. Cain J. R., Paschal D. C. and Hayden C. M. (1980). Toxicity and bioaccumulation of cadmium in the colonial green alga Scenedesmus obliquusll Arch. Environ. Contam. Toxicol. 9, N 1. P. 9—16.

41. Cairns J. and Cruber D. (1980). A comparison of methods and instrumentation of biological early warning systems// Water. Res. Bull. 16, N 2. P. 261—266.

42. Calamari D., Chiaudani G. and VighiM. (1985). Methods for measuring the effects of chemicals on aquatic plants// Methods for estimating risk of chemical injury: human and non-human ecosystems.

43. Chen Z. D., Coan C., Fielding L. and Cassafer G. (1991). Interaction of CrATP with the phosphorylation site of the sarcoplasmic reticulum ATPase// J. Biol. Chem. 266, N 19. P. 12386—12394.

44. Clowes F. A. L. (1954). The promeristem and minimal constructional centrein grass root apices// New Phytol. 53, N 1/3. P. 108—116.

45. Corradi M. G., Gorbi J. and Bassi M. (1995a). Hexavalent chromium induces gametogenesis in the freshwater alga Scenedesmus acutusll Ecotoxicol. Environ. Saf. 30, N2. P. 106—110.

46. Davies A. G. and Sleep J. A. (1980). Cooper inhibition of carbon fixation in coastal phytoplankton assemblages// J. Mar. Biol. Assoc. UK. 60, N 4. P. 841-850.

47. Dehning I., Tilzer M. M. (1989). Survival of Scenedesmus acuminatus (Chloophyceae) in darkness// J. Phycol. 25, N 4. P. 271—283.

48. Donachie W. D. (1968). Relationship between cell size and time of initiatic on of DNA replication//Nature. 219. P. 1077—1079.

49. Dom P. B., Rodgers J. H., Jop K. M., Raia J. S., Dickson K. L. (1987). Hexavalent chromiun as a reference toxicant in effluent toxicity test// Environ. Toxicol, and Chem. 6, N 6. P. 435-^144.

50. Engelberg J. (1961). A method of measuring the degree of synchronization of cell populations// Exp. Cell Res. 23. P. 218—227.

51. Fargasova A. (1994). Comparative study of plant growth hormone (herbicide) toxicity in various biological subjects// Ecotoxicol. Environ. Saf. 29, N 3. P. 359— 364.

52. Food and Agriculture Organization of the United Nations (1986). Pesticide Residues in Food. FAO Plant Production and Protection Paper 77.

53. Frenette J.-J., Vincent W. F., Legendre L. and Nagata T. (1996a). Size-dependent phytoplankton responses to atmospheric forcing in lake Biwa// J. Plank. Res. 18. P. 371—391.

54. Frenette J.-J., Demers S., Legendre L. and Boule M. (1996b). Size-related photosynthetic characteristics of phytoplankton during periods of seasonal mixing and stratification in an oligotrophic multibasin lake system// J. Plank. Res. 18. P. 45—61.

55. Gavis J. (1983). Toxic binding of cupric ion by marine phytoplankton// Mar. Res. 41, N 1. P. 53-63.

56. Hase E., Mihara S. and Tamiya H. (1960). Role of sulfur in the cell division of Chlorella with special reference to the sulfur compounds appearing during the process of cell division. I. Plant and Cell Physiol. 2. P.9.

57. Hase E., Mihara S. and Tamiya H. (1961). Role of sulfur in the cell division of Chlorella with special reference to the sulfur compounds appearing during the process of cell division.// Plant and Cell Physiol. 1. P. 131.

58. Hase E., Morimura Y. and Tamiya H. (1957). Some data on the growth physiology of Chlorella studied by the technique of synchronous culture// Arch. Biochem. Biophys. 69. P. 149—165.

59. Hegewald E., An S. S. and Tsarenko P. (1998). Revision of Scenedesmus intermedius Chod. (Chlorophyta, Chlorococcales). Arch. Hydrobiol./ Suppl. 127, Algolog. stud. 92. P. 47—56.

60. Herczeg T., Lehoczky E., Rojik I., Vass I., Farkas T. and Szalay L. (1980). Stimulatory effects of pyridazinone herbicides on Chlorellall Plant Sci. Lett. 19. P. 285—294.

61. Hermes J., Konemann H., Leeuwangh P. and Musch A. (1985). Quantitative structure-activity relationships in aquatic toxicity studies of chemicals and complex mixtures of chemicals// Environ. Toxicol, and Chem. 4, N 3. P. 273—279.

62. Hindak F. (1974). The morphological variabilityof Scenedesmus pannonicus Hortob. in culture// Arch. Hydrobiol. Suppl. 11, N 2. P. 130—139.

63. Hindak F. (1978). The genus Lagerheimia Chod. and Lagerheimia-like unicells in the genus Scenedesmus Meyen (Chlorophyceae)// Biologia. 33, N 10. P. 795—808.

64. Hindak F. (1979). Some problems in the taxonomy of the genus Scenedsmus Meyen (Chlorococcales, Chlorophyceae)!'/ Biologia. 34, N 10. P. 811—822.

65. Hindak F. (1990). Studies on the Chlorococcal algae (Chlorophyceae). V. Biol. Prace, Bratislava. 225 p.

66. Jardim W. F. and Pearson H. W. (1984). A study of the cooper complexing compounds released by some species of cyanobacteria// Water Res. 18. P. 985-989.

67. Kaftan D., Meszaros T., Whitmarsh J. and Nedbal L. (1999). Characterization of photosystem II activity and heterogeneity during the cell cycle of the green alga Scenedesmus quadricauda!1 Plant. Physiol. 120, N 2. P. 433—442.

68. Kalmaz E. V. and Kalmaz G. D. (1979). Transport, distribution and toxic effects of polychlorinated biphenils in ecosystems: review// Ecological Modelling. 6. P. 223251.

69. Kanazawa T. and Kanazawa K. (1969). Specific inhibitoiy effect of cooper on cellular division in Chlorellall Plant Cell. Physiol. 10. P. 495-502.

70. Kazumi J., Zorkin N and Lewes A. J. (1987). The effect of manganese-cooper interactions of growth of a diatom in water from a manganese-rich British Columbia fjord// Estuarine, Coast. Shels Sci. 25, N 3. P. 337-346.

71. Kessler E. (1991). Scenedesmus: problems of highly variable genus of green algae//Bot. Acta. 104. P. 169—171.

72. Knoechel R. and Quinn E. M. (1989). Carbon dinamics of logarithmetic and stationary phase phytoplankton as determined by track autoradiography// Cytometry. 10, N5. P. 612—621.

73. Kobayashi M. (1974). Control of cell division in a green alga Ankistrodesmus gracilis// Plant. Ctll Physiol. 15, N 6. P. 1017—1026.

74. Kobrael M. E. and White D. S. (1996). Effects of 2,4-dichlorophenoxyacetic acd on Kentucky algae: simultaneous laboratory and field toxicity testings// Arch. Environ. Contam. Toxicol. 31, N 4. P. 571—580.

75. Komarek J. and Ludvik J. (1972). Die zellwandstruktur als taxonomisches Merkmal in der gattung Scenedesmus. 2. Taxonomische auswertung der untersuchten Arten// Arch. Hydrobiol. Suppl. 41. P. 11—47.

76. Komarek J. and Ruzicka J. (1969). Effect of temperature on the growth and variability of Scenedesmus quadricauda (Turp.) Breb.// Studies in phycology. Stuttgart: E. Schweizerbart'ache. P. 262—292.

77. Kotzabasis K. and Senger H. (1994). Free, conjugated and bound polyanims during the cell cycle in synchronized cultures of Scenedesmus obliuqusll Z. Naturforsch. 49, N 3-4. P. 181—185.

78. Kuiper J. (1981). Fate and effects of mercury in marine plankton communities in experimental enclosures// Ecotoxicol. Environ. Saf. 5, N 1. P. 106-134.

79. Kylin A., Das E. (1967). Calcium and strontium as micronutrients and morphogenetic factors for Scenedesmus!/ Phycologia. 6. P. 201—210.

80. Laamanen M. J. (1997). Environmental factors affecting the occurence of different morphological forms of cyanocaryotes in the northern Baltic Sea// J. Plank. Res. 19, N 10. P. 1385—1403.

81. Lazinsky D. and Sicko-Goad L. (1990). Morphometric analysis of phosphate and chromium interactions in Cyclotella meneghiniana!7 Aquat. Toxicol. 16, N 2. P. 127-139.

82. Les A., Walker R. W. (1984). Toxicity and binding of cooper, zink and cadmium by the blue-green alga Chroococcusparisll Water Air Soil Pollut. 23, N 2. P. 129-139.

83. Lorenzen C. J. (1966). A method for the continuous measurement of in vivo chlorophyll concentration// Deep-Sea Res. 13. P. 223—227.

84. Lorenzen H. (1957). Synchrone Zeelteilungen von Chlorella bei verschiedenen Licht Dunkel - Wechseln// Flora. 144, N 4. S. 473.

85. Lorenzen H. and Hesse M. (1974). Synchronous cultures// Algal physiology and biochemistry. Bot. Monographs. 10. P. 894—908.

86. Lorenzen H. and Ruppel H. G. (1960). Versuche zur gliederung des entwicklungsverlaufsdes Chlorella zelle// Planta. 54. P. 394.

87. Lustigman B., Korky J., Labady A. and McCormick J. M. (1985). Absorbtion of Cu by long-term cultures of Dunaliella salina, D. tertolecta and D. viridisll Bull. Environ. Contam. Toxicol. 35, N 3. P. 362-367.

88. Malis-Arad S. and McGowan R. E. (1982). ). Alkalinity-induced aggregation in Chlorella vulgaris. II. Canges in the cell wall during the cell cycle// Plant. Cell Physiol. 23, N1. P. 11—17.

89. S5.Nagy-Toth F. (1987). Notes on the pleomorphism of Scenedesmus intermedius Chod.// Arch. Hydrobiol. Suppl. 68. P. 325—342.

90. Neumann W., LaaschH. and Urbach W. (1987). Mechanisms of herbicide sorption in microalgae and the influence of environmental factors// Pesticide Biochem. Physiol. 27. P. 189—200.

91. Ober K. (1974). Effect of diasepam on cell division rates and productivity of Scenedesmus obliquus in synchronous cultures// Arch. Microbiol. 99. P. 369—378.

92. Ovsiannikova M. N. and Oseytrova A. (1982). Use of a synchronous Chlorella population for studying the effect of low-dose stimulation of N-Nitroso-N-methilurea// Genetika. 18, N 6. P. 924—928.

93. Paas che E. (1978). Growth experiments with marine plankton algae: the role of "water quality" in species succession// Mitt. Internat. Verein. Limnol. 21. P.521— 526.

94. Pelicaric S. (1971). Verschiedene typen der ultrastruktur der zellwand bei drei arten der gattung Scenedesmus Meyen// Arch. Hydrobiol. Suppl. 39. P. 137—145.

95. Pelicaric S., Sulek J. and Ludvik J. (1970). Ultrastructure of the cell wall of Scenedesmus quadricauda (Turp.) Breb. strain Greifswald/15// Arch. Hydrobiol. Suppl. 39. P. 1—6.

96. Perry M. J. and Porter S. M. ("1989). Detemination of the cross-section absorbtion coefficient of the individual phytoplankton cells by analitical flow cytometry// Limnol. Oceanogr. 34, N 8. P. 1727—1738.

97. Peterson H. G., Boutin C„ Freemark K. E. and Martin P. A. (1998). Toxicity of hexazinone and diquat to green algae, diatoms, cyanobacteria and duckweed// Aquatic Toxicology. 39, N 2. P. 111—134.

98. Peterson H. G., Boutin C,, Martin P. A., Freemark K. E., Ruecker N. J. and Moody M. J. (1994). Aquatic phyto-toxicity of 23 pesticides applied at Expected Environmental Concentrations// Aquatic Toxicology. 28, N 3—4. P. 275—292.

99. P//// A., Carle D. O., Kline E., Pickering Q. and Lazorchak J. (1988). Effects of pollution on freshwater organisms// J. Wat. Pollut. Contr. Fed. 60, N 6. P. 994-1065.

100. Pirson A. and Lorenzen H. (1958). Photosyntetische sauerstoffentwicklung von Chlorella nach synchronization durch licht-dunkel-wechsel// Naturwissenschaften. 58. S. 497.

101. Pirson A. and Lorenzen H. (1966). Synchronized dividing algae// Ann. Rev. Plant Physiol. 17. P. 439—458.

102. MA.Pirson A., Lorenzen H. and Koepper A. (1959). A sensitive stage in synchronized cultures of Chlorellall Plant. Physiology. 34. P. 353—355.

103. Rebhum S. and Ben-Amotz A. (1984). The distribution of cadmiun between the marine alga Chlorella stigmatophora and sea water medium. Effect on algal growth// Water Res. 18, N 2. P. 173-178.

104. Rinne I. and Tarkiainen E. (1978). Algal tests used to study the chemical factors regulating the growth of planktonic algae in the Helsinki sea area// Mitt. Internat. Verein. Limnol. 21. P. 527—546.

105. Russell G. and Morris O. P. (1972). Ship-fouling as an evolutionary process// Marine corrosion and fouling: materials in the sea. Third International Congress. Evanston, III. Northwestern University Press.

106. Schafer H., Hettler H„ Fritsche U., Pitzen G., Rodeger G. and Wenzel A. (1994). Biotests using unicellular algae and ciliates for predicting long-term effects of toxicants// Ecotoxicol. Environ. Saf. 27, N 1. P. 64—81.

107. SetlikJ., Berkova E., Doucha J., Kubin S., Vendlova J. And Zachleder J. (1972). The coupling of synthetic and reproduction processes in Scenedesmus quadricaudall Algol. Stud. 7. P. 172—213.

108. Shields R. (1977). Transition probability and the origin of variation in the cell cycle// Nature. 267, N 5613. P. 704—707.

109. Shubert L. E., Trainor F. R. (1974). Scenedesmus morphogenesis control of the unicell stage with phosphrus// Brit. Phycol. J. 9. P. 7—14.

110. Siver P. and Trainor F. (1981). Morphological control and physiology of Scenedesmus strain 170// Phycologia. 20. P. 1—11.

111. Smith E. A., Mayfield C. /., Wong P. T. and Silverberg B. A. (1977). Effect of naturally occuring apatites on growth and morphology of algae// Can. J. Microbiol. 23, N9. P. 1188—1196.

112. Swale E. M. F. (1967). A clone of Scenedesmus with Chodatella-stages// Brit.

113. Phycol. Bull. 3, N 2. P. 281—293. 210.T 90-304 (1980). Essais des eaux. Determination de l'inhibition de croissance de

114. Towill L. E., Shriner C. R., DruryJ. S., Hammins A. S. andHolleman J. W. (1978). Reviews of environmental effects of pollutants: III. Chromium EPA-600/ 1-78-023. Environmental Protection Agency, Health Effects Research Laboratory, Cincinnati, OH.

115. Trainor F. R. (1964a). The effect of composition of the medium on morphology in Scenedesmusll Can. J. Bot. 42. P. 515—518.

116. Trainor F. R. (1964b). Spine distribution in several Scenedesmus cultures// Amer. J. Bot. 51. P. 995—1001.

117. Trainor F. R. (1965a). Scenedsmus obliquus sexuality// Science. 148. P. 1094— 1095.

118. Trainor F. R. (1965b). A studiy of unialgal cultures of Scenedesrnus incubated in nature in the laboratory// Can. J. Bot. 43. P. 701—705.

119. Trainor F. R. (1966). A study of wall ornamentation in cultures of Scendesmusll Amer. J. Bot. 53. P. 995—1000.

120. Trainor F. R. (1969). Scenedesrnus morphogenesis. Trace elements and spine formation. J. Phycol. 5. P. 185—190.

121. Trainor F. R. (1971). Development of form in Scenedesrnus / Parker B. and Brown R.// Contributions in Phycology. Lawrence, Cansas: Alen Press. P. 81—92.

122. Trainor F. R. and Hilton R. L. (1963a). Identification of species of ScenedesrnusII Nature. 200. P. 800.

123. Trainor F. R. and Hilton R. L. (1963b). Culture of Scenedesrnus longusll Bull. Torrey Bot. Club. 90. P. 407—412.

124. Trainor F. R and Roskosky F. G. (1967). Control unicell formation in soil Scenedesrnus!I Can. J. Bot. 45. P. 1657—1664.

125. Trainor F. R. and Rowland H. L. (1968). Control of colony and unicell formation in synchronized Scenedesrnus!I Phycology. 4, N 4. P. 310—317.

126. Trainor F. R., Rowland H. L., Lylis J. C., Winter P. A. and Bonanomi P. L. (1971). Some examples of polymorphism in algae// Phycologia. 10. P. 113—119.

127. Velthuys B. R. (1981). Electron-dependent competition between plastoquinone and inhibitors for binding to photosystem II// FEBS Lett. 126. P. 277.

128. Vighi M. and Calamari D. (1985). QSARs for organotin compounds on Daphnia magna!! Chemosphere. 14, N 11-12. P. 1925—1932.

129. Walker J. D. (1988). Efects of chemicals on microorganisms// J. Wat. Pollut. Contr. Fed. 60, N6. P. 1106-1121.

130. Walsh C. E., Bahner L. H. and Horhing W. B. (1980). Toxicity of textile mill effluents to freshwater estuarine algae, Crustaceans and fishes// Environ. Pollut., ser. A. 21. P. 169-179.

131. Whitton B. A. (1984). Algae as monitors of heavy metals of freshwaters// Algae as ecological indicators. Academic Press. Ink. London Ltd. 434 p.

132. Yentsch C. S. andPhinney D. A. (1985). Spectral fluorescence: an ataxonomic tool for studying the structure of phytoplankton populations// J. Plankt. Res. 7. P. 617— 632.126

Информация о работе

Прохоцкая, Валерия Юрьевна
кандидата биологических наук
Москва, 2000
ВАК 03.00.18

Диссертация

Структурно-функциональные характеристики модельной популяции scenedesmus quadricauda при интоксикации - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы