Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Структурно-функциональное изучение белковых продуктов генной экспрессии в поперечнополосатой мышечной ткани человека

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Структурно-функциональное изучение белковых продуктов генной экспрессии в поперечнополосатой мышечной ткани человека"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХ НАУК . МЕДИКО-ГЕНЕТИЧЕСКИЙ НАУЧНЫЙ ЦЕНТР

Ь ЦП/ и

На правах рукописи

УДК 577.122+611.12+616.12

ЕРШОВА ЕЛИЗАВЕТА СЕРГЕЕВНА

СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНОЕ ИЗУЧЕНИЕ БЕЛКОВЫХ ПРОДУКТОВ ГЕННОЙ ЭКСПРЕССИИ В ПОПЕРЕЧНОПОЛОСАТОЙ МЫШЕЧНОЙ ТКАНИ ЧЕЛОВЕКА.

03.00.15 "генетика" 03.00.04 "биохимия"

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 1998

Работа выполнена в лаборатории биохимической генетики Медико-генетического научного центра РАМН

Научные руководители:

доктор биологических, наук, профессор

доктор биологических наук

С.С. Шишкин Л.И. Ковалев

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор

доктор биологических наук

Л.А. Певницкий С.А. Силаева

Ведущее учреждение: Институт молекулярной генетики РАН

заседании Диссертационного Совета Д.001.16.01 при Медико-Генетическом научном центре РАМН по адресу: г.Москва, 115478, ул. Москворечье, д.1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Медико-генетического научного центра РАМН.

Защита состоится ". 1998 г. в

к

ч. на

Автореферат разослан " _¿__ 1998 г.

Ученый секретарь Диссертационного Совета, доктор биологических наук профессор

Л.Ф. Курило

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. В современной генетике человека одной из наиболее интенсивно разрабатываемых областей является изучение информационного садержагаи генома человека. Уже около 10 лет развернут прямой анализ геномной ДНК человека в рамках международной научной программы '"Геном человека" (Celis, 1991). Параллельно, в целях выяснения информационного содержания генома человека, достаточно активно ведутся комплексные исследования белковых продуктов генной экспрессии (ЕПГЭ), которые в последние годы все больше приобретают черты международной кооперации, получившей специальное название - "Протеом" ("From genome to proteoine"; 2nd Sienna 2D Electrophoresis Meeting Abstract-, 1996). Методологической основой протеомных исследований стали наделено установленные закономерности в- реализации генетической информации и так называемый системный подход, дающий возможность параллельного изучения сотен и тысяч БПГЭ. содержащихся в каком-либо биологическом объекте, благодаря очень высокой разрешающей способности метода двумерного электрофореза по О'Фаррехту (Celis J, 1991, Klose ,Т, 1989).

Исследования БПГЭ отдельных тканей и органов человека образуют важную составляющую в создаваемой программе «Протеом человека» (Sanchez J, 1995). Они, фактически, дают возможность охарактеризовать особенности функционирования генома в конкретном виде клеток или тканей, например, в поперечнополосатой мышечной ткани. Именно БПГЭ этой ткани стали объектом исследования в данной работе. Исхода из представлений о генетическом контроле за клеточной дифференцировкой, задача описания специфических наборов БПГЭ, имеющихся в определенных клеточных линиях или образцах тканей и органов, рассматривается как способ прямого анализа той части генома, функционирование которой обеспечивает конк]зетный тип дифференцировки. Постепенно углубляя знания об этой части генома и накапливая данные о выявляемых БПГЭ, последователи

получают реальную возможность искать новые гены человека и расширять представления об информационном содержании генома.

Другой аспект актуальности протеомной стратегии связан с тем, что она, в конечном счете, предполагает построение полного каталога БПГЭ человека с идентификацией кавдого БПГЭ в каждой ткани, сопоставление БПГЭ, экспрессирующихся в различных тканях и выявление тканеспецифичных БПГЭ (Sanchez J, 1995, Celis J, 1996). Подобные каталоги БПГЭ позволят наиболее эффективно проводить поиски молекулярных маркеров наследственных и ненаследственных заболеваний, а также изучать онтогенетические, патогенетические и фенотипические особенности функционирования геномов.

К настоящему времени уже создан ряд баз данных, которые содержат сведения о БПГЭ печени, почки, сердца, плазмы, красных кровяных клеток, спинномозговой жидкости человека, экспрессирущихся как в норме, так и при некоторых патологических состояниях, а также сведения о максимальных фенотипических отклонениях по некоторым белкам (Golaz О., 1996, Jungblut Р., 1994)..

Вместе с тем, продолжение исследований БПГЭ поперечнополосатой мышечной ткани человека представляет значительный интерес как в связи с необходимостью углубления представлений о особенностях функционирования генома в этих тканях, а также о структурно-функциональных свойствах мышечных белков в связи с возможностью выявления изменений на молекулярном уровне, ассоциированных с протеканием различных заболеваний ( Dunn M.J., 1996, Jungblut P., 1994). Особый интерес при этом вызывает разработка подходов к анализу тех БПГЭ, которые непосредственно связаны с функционированием генома, например ДНК-метилаз, которым приписывается ключевая роль в обеспечении стойкой репрессии генов при дифференцировке (Альберте Б., Брей Д., 1994). Этим ферментам поперечно-полосатой мышечной ткани посвящен специальный раздел представляемой работы.

Кроме того, данные о БПГЭ могли бы послужить основой для создания патогенетически обоснованных методов точной диагностики наследственных, генетических обусловленных и ненаследственных болезней, затрагивающих мышечные ткани. Например, высокая частота заболеваний миокарда человека при сравнительно малой информированности о молекулярных основах организации этой ткани делают актуальными исследования БПГЭ именно сердечной мышцы в норме и патологии. Очевидно, что банки данных о мышечных БПГЭ могли бы стать удобным инструментом исследованиях молекулярных изменений при протекании соответствующих патологических процессов.

Цель и задачи исследования

Целью настоящей работы являлось изучение особенностей генной экспрессии в поперечнополосатой мышечной ткани человека в норме и при некоторых патологических состояниях с помощью анализа структурно-функциональноых свойств БПГЭ на основе применения системного подхода, а также сравнение БПГЭ в зрелой мышечной ткани и в культивированных миоцитах человека.

В соответствии с целью исследования в работе решались следующие задачи:

1. Провести сравнительное изучение 2-ЭФ белковых паттернов поперечнополостых мышц человека при использовании амфолинового и иммобшшнового градиентов рН.

2. Охарактеризовать особенности функционирования генома человека в поперечнополосатой мышечной ткани как комплекс наиболее представленных белковых продуктов генной экспрессии (БПГЭ) и по обобщенным результатам нескольких видов двумерного элекгрофоретического анализа построить новую, расширенную версию каталога мышечных БПГЭ человека, дополнив ранее полученные данные результатами анализа БПГЭ в системе двумерного электрофореза ПЧЗ-ПАЬТ.

б

3. На основе особенностей генетически детерминируемой первичной структуры БПГЭ идентифицировать ряд новых фракций на двумерных картах сердечной и скелетной мышцы, осуществить поиск новых БПГЭ, а также тканеспецифичных БПГЭ.

4. Показать, что свойства ДНК-метилаз - ферментов, участвующих в регуляции генной экспрессии, могут исследоваться в поперечнополосатой мышечной ткани человека прямым анализом в рамках системного подхода.

5. Изучить изменения спектра БПГЭ при наследственных и ненаследственных заболеваниях миокарда.

6. Исследовать особенности генной экспрессии в культивируемых миобластов человека по БПГЭ в сравнении с мышечной тканью и оценить возможные изменения генной экспрессии при влиянии различных факторов роста.

Научная новизна работы.

Получены новые данные об особенностях функционирования генома человека в поперечнополосатой мышечной ткани - построена новая расширенная версия каталога БПГЭ поперечнополосатой мышцы человека, в которую включены дополнительные сведения о 34 БПГЭ, обладающих р1 в зонах кислых и щелочных значений рН. Эти БПГЭ удалось выявить благодаря использованию новой модификации 2-ЭФ с применением иммобилизованного градиента рН. Построенная версия каталога содержит также новые результаты идентификации БПГЭ, установлено, что: №4328724 является фосфатидилэтаноламинсвязующим белком, №4462716 скелетномышечной карбоангидразой III, №4950704 - аконитазой, №4715547, №4701540, №4665531, №4645527, - 4 фракции десмина, №4394875 и № 4380895 - сердечная и скелетномышечная изоформы тропонина I. Обнаружен БПГЭ №4276623, в первичной структуре которого есть участок, соответствующий фрагменту последовательности цитокератина, и два других участка, которые не присутствуют в каких-либо секвенированных

БПГЭ человека (по банку данных 5\У155-Р1ЮТ). Таким образом, по-видимому, эта полипептидная цепь является новым БПГЭ.

Впервые показано, что в белковых фракциях, полученных 2-ЭФ, можно определять ДНК-метилазнуго активность, и, в частности, обнаружена ДНК-(цитозин-5) метилазная активность во фракции актина. Изучение спектра БПГЭ миокарда человека при некоторых наследственных и

Н£наследгтиентп.ту члпгпрвянняу пьтяшпп пяч нетппргттлау пянее. изменений.

при ДКМП и реакции отторжения трансплантата моикарда.

Научно-практическая значимость.

Комплекс БПГЭ, выявленных в образцах поперечнополосатой мышцы человека, представляет собой интегральную характеристику функционирования генома человека, прошедшего процесс дифференцировки по мышечному типу, и получение такой характеристики, очевидно, является важным и значимым научным результатом. Вместе с тем, значимость полученных данных в немалой степени будет определяться и возможностями дальнейшего использования их в разработке различных генетических проблем, связанных с реализацией генетической информации при физиологических процессах и патологии. Представленная в работе новая версия каталога БПГЭ открывает дополнительные перспективы для исследований генной экспрессии в мышечной и других тканях человека, она позволит также улучшить направленность и повысить эффективность сравнительного анализа БПГЭ при различных видах наследственной патологии миокарда.

Дальнейшее изучение выявленного нового члена семейства цитокератинов (БПГЭ №4276623) возможно позволит или обнаружить новый ген, кодирующий данный продукт, или приведет к новому варианту альтернативного сплайсинга какого-либо из известных цитокератиновых генов. Кроме того, этот результат демонстрирует значение исследований первичной структуры у БПГЭ, полученных 2-ЭФ, для поисков новых генов

Результаты анализа ДНК-метилаз, который, как показано в работе, успешно можно сочетать с 2-ЭФ и системными исследованиями БПГЭ, могут сыграть важное значение в изучении клеточной дифференцировки и ряда других генетически детерминируемых процессов.

Данные о влиянии фактора роста фибробластов и фактора роста эпителия на генную экспрессию в культивируемых миобластах человека представляют интерес для установления молекулярных механизмов контроля за клеточной пролиферацией и могут иметь определенное биотехнологическое значение.

Выявленное уменьшение альфа-В-кристаллина в сердечной мышце и увеличение содержания этого БПГЭ, а также продукта его деградации в тканях почки при реакции хронического отторжения трансплантата сердца позволяет приблизиться к выяснению молекулярных механизмов патогенеза этого грозного осложнения, возникающего после пересадок сердца. При подтверждении выдвинутого предположения о том, что кристаллин миокарда может из поврежденных мышечных клеток попадать в кровь, а затем в почки, можно рассчитывать на использование этого БПГЭ в качестве молекулярного маркера данного патологического процесса. Таким образом, возникнет возможность создания диагностикума на реакцию отторжения трансплантатов сердца. Следует отметить, что на настоящий момент реакция отторжения трансплантата сердца диагностируется только функционально (по развитию сердечной недостаточности) или морфологически, с использованием биопсии миокарда. Соответственно, можно думать, что тест на присутствие альфа-В-кристаллина в крови позволит осуществлять более раннюю и быструю диагностику данного осложнения.

Модифицированный полупрепаративный метод выделения белков из двумерных гелей позволяет получить высокоочшценные препараты индивидуальных белков, в количествах, достаточных для приготовления в

последующем антител и создания иммунологического диагностикума.

Основные положения, выносимые на защиту.

1). Охарактеризованы особенности функционирования генома человека в поперечнополосатой мышечной ткани, выражающиеся в виде формирования определенного комплекса из наиболее представленных БПГЭ и по обобщенным результатам нескольких видов двумерного элекгрофоретического анализа построена новая (третья) расширенная версия каталога этих БПГЭ, дополненная сведениями о 34 БПГЭ и результатами идентификации 10 БПГЭ.

2). Свойства ДНК-метилаз - ферментов, участвующих в регуляции генной экспрессии, могут исследоваться в поперечнополосатой мышечной ткани человека прямым анализом в рамках системного подхода, который показал, что во фракции актина присутствует ДНК-(цитозин-5) метилазная активность.

3) В аутопсийных образцах пациентов с дилятационной кардиопатией ччй^таг-Ц-Ч'^шш а лпу У£ЖЩЦ.Г ХПОНИЧРСКПГа

отторжения трансплантата сердца происходит уменьшение содержания альфа В кристаллина, сочетающееся с накоплением альфа В кристаллита и продукта его деградации (или модификации) в тканях почки. 4). Фактор роста фибробластов и фактор роста эпителия оказывают влияние генную экспрессию в культивируемых миобластах человека.

Объем и структура диссертации. Диссертация содержит следующие разделы: введение, обзор литературы, материалы и методы исследований, результаты и обсуждение, выводы, заключение, список литературы. Работа изложена на 143 страницах машинописного текста и иллюстрирована 8 таблицами и 25 рисунками. Список литературы содержит 258 источников, включая 208 работ зарубежных авторов.

Апробация работы. Материалы диссертации представлялись и

genomes"(Siena, Italy, 1994), 1 (3) Рос. съезде люд. генетиков (Москва, 1994), 5-ой конф. "Геном человека-96", (г.Черноголовка, 1996); Intern.Meeting "From genome to proteom"; (Siena, Italy, 1996); 9. Jahrestagung der Geselleschaft fur humangenetic. (Innsburk, Austria 1997); 2-ом биохимическом съезде (Москва, 1997), на Ученом Совете МГНЦ РАМН (1997). По теме диссертации опубликовано 12 печатных работ.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Основную часть исследования составили различные виды анализа аутоптатов сердечной и скелетной мышц человека со сроками аутолиза до 6 часов от лиц, погибших в результате несчастного случая. Аутопсийные материалы были получены из бюро судебно-медицинской экспертизы 2 морга Мосгорздравотдела.

В исследованиях изменений белков при различных видах патологии образцы миокарда и почки человека (операционные (1-2 часа) или аутопсийные (до 1 суток с момента смерти) от лиц, страдавших соответствующими заболеваниями) были любезно предоставлены лабораторией типирования и консервирования органов НИИ трансплантологии и искусственных органов МЗ РФ.

Для изучения белков в миоцитах человека проводился соответствующий анализ клеточных культур, выведенных из биопсий скелетных мышц сотрудниками МГНЦ РАМН к.б.н. Г.Б.Раевской и к.б.н. Т.Б.Крохиной.

Проведение двумерного электрофореза выполняли по методу О'Фаррелла (1975) с определенными модификациями (Ковалев Л.И. и др., 1986; Tsvetkova M.N. et al., 1991) и с применением иммобилизованного градиента pH (Gorg A. et al., 1988,1994,1995).

Детекцию белков после проведения электрофореза осуществляли окрашиванием кумасси голубым R-250 (Fairbanks G. Et al., 1971), азотнокислым серебром (Blum H. ,1984) и 4M раствором ацетата калия

(Higgins R, 1973). Электроблоттинг белков на ншроцеллюлозные мембраны и иммунохимическую детекцию иероксидазным методом проводили по Towbin Н. (1979, 1984). Пептидные фрагменты белков получали трипсинолизом (Celis J., 1990) и фракционировали обращенно-фазовой хроматографией (Лаптев A.B. и др., 1994). Определение N-концевой последовательности пептидов проводилось на базе Института молекулярной биологии им. В.АЭнгельгардта Российской Академии наук на газожидкостном секвенаторе модели 816 фирмы "Knauer" (ФРГ) по методике и программе секвенирования фирмы-поставщика. Поиск аминокислотных последовательностей, гомологичных найденным, проводили с помощью пакета программ GENEBEE (автор Л.И.Бродский, МГУ, Москва) по банку последовательностей SWISSPROT (версия 21).Концентрацию белка определяли по методу Бредфорд (Bredford М., 1976).Измерение ДНК-метилазной активности проводилось на базе Института биомедицинской химии РАМН старшим научным сотрудником Н.Г.Лопатиной.

Денситометрирование двумерных электрофореграмм проводили на лазерном денситометре фирмы "LKB Pharmacia" (Швеция) "UltraScan XL" в комплексе с IBM-совмсстимым компьютером, используя пакет программного обеспечения "GelScan XL" версия 2.1 и пакет программ "GelView" (Ефимочкин A.C., Россия).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Построение новой (третьей) расширенной версии банка данных о БПГЭ поперечнополосатой мышцы человека.

Несколько лет назад с помощью специально модифицированного

варианта 2 ЭФ группа отечественных исследователей (среди которых

была и автор этой работы) получили результаты анализа белков

сердечной мышцы человека, позволившие сформировать и

оригинальную двумерную карту, и, на её основе, каталог мышечных

белков. Однако, недавно начавшееся быстрое распространение в

протеомных исследованиях модификаций 2ЭФ анализа, использующих

ИЭФ в иммобплиновом градиенте рН (IPG-систему), определило в качестве первоочередной задачи проведение изучения мышечных белков с помощью IPG-системы, а также, проверки возможности прямого анализа функциональных свойств белков после двумерного электрофореза. При общем сходстве распределения картин белковых фракций оказалось, что применение иммобилизованного градиента рН позволяет выявить дополнительно значительное количество белков с pi меньше 5,5 и больше 7,75, вплоть до 9,0-10,0. В связи с этим, было принято решение о построении обобщенной двумерной карты (Рис. 1) суммирующей результаты использования IPG- и амфолиновой систем. Результаты фракционирования в иммобилиновой системе позволили включить в карту дополнительно 34 БПГЭ и уточнить координаты для ряда фракций, детектируемых в обеих системах фракционирования. Систему нумерации фракций оставили прежней: первые четыре цифры номера представляют собой десятичный логарифм молекулярной массы, о следующие три -изоэлектрическая точка.

В целях повышения информативности двумерной карты сведущей стадией работы стали эксперименты по идентификации отдельных полипептидных фракций на двумерных электрофореграммах, которую мы проводили методами микросеквенирования и иммуноблотганга. Результаты представлены в таблице 1.

Приведенные выше результаты были обобщены в форме 3-ей версии банка данных о БПГЭ поперечно-полосатой мышцы человека. В целом, комплекс полученных результатов о 347 наиболее представленных БПГЭ этих тканей, часть из которых удалось идентифицировать, можно рассматривать как обобщенную характеристик} основных особенностей функционирования генома человека в поперечно-полосатых мышечных тканях. Однако, естественно, данная характеристика далека ог завершения и нуждается в дальнейшем пополнении и уточнении.

о

•<p

' 'Ъс

о< а «во . . •

«О

а _

. .а в V

О

. <5 QO О' *

S «• *? в «с» во в •

в. ■ ^ •• о. * °о

л ° ®

„ Ь' v о - ° О «, » -о ' в " а

о

.с - вг о- -

pi

vjt ' i,g ътг. ts

us tr

7,0 7.&S

m

Рис. 1. Комплексная двумерная карта БПГЭ миокарда человека.

Добавленные фракции выделены. Таблица 1. Дополнения к каталогу БПГЭ поперечнополосатой мышцы _человека: дополнительно идентифицированные фракции.

Идентификация БПГЭ микросеквенированием

Номер по каталогу Mm, kDa Pi Секвенирован-ная последовательность Позиция Е идентифиц ированном белке Наименование

4328724 21,3 7,24 APVAGT(C)YQ 161-169 Фосфатидилэтанол-амин связывающий белок

LY(C)LVLTDPD 63-72

4950704 89,1 7,04 PA(D)QE(D)E 9-15 Аконитаза человека

4276623 18.9 6.23 LDNLQQE(I)(D)(F) 304-313 Кератин фрагмент не найден

ENQYE

NYKR

4462716 29.0 7.16 SVSYDGGQA 65-73 Скелетномышечная карбоангидраза III

Идентификация БПГЭ иммуноблоттингом

Номер по каталогу Mm, kDa Pi Наименование

4715547 51,9 5,47 Десмин

4701540 50,2 5,40

4665531 46,2 5,31

4645527 44,2 5,27

4394875 24,8 8,75 Тропонин 1 сердечная изоформа

4380895 Тропонин 1 скелетномышечная изоформа г

На основе материалов созданного банка данных нами был проанализирован белковый состав культивируемых миобластов человека и показаны изменения в 5 группах белков под действием факторов роста фибробластов и эпителия, что свидетельствует о влиянии этих факторов на генную экспрессию. Также это показывает, что метод годится для контроля качества растущих культур.

2. Изучение функциональной активности белковых фракций, полученных при 2-ЭФ исследовании (на примере ДНК-метилазной активности).

Проблема прямого определения функциональной активности белков, полученных после двумерного фракционирования, считается одной из самых сложных со времени первых этапов применения метода О'Фаррелла, что связано с денатурирующими условиями метода. К счастью, некоторые белки даже после воздействия таких денатурирующих агентов, как мочевина и БОБ, сохраняют способность к ренатурации и восстановлению (по крайней мере, частично) функциональной активности. Предварительно проведенное исследование ДНК-метилазной активности белков ядерных экстрактов из препаратов сердечной мышцы человека (совместное с Н.Г. Лопатиной, Институт биомедицинской химии РАМН) позволили поставить задачу поиска возможностей для определения ДНК-метилазной активности у БПГЭ сердечной мышцы человека после 2-ЭФ анализа.

Сначала (в ходе предварительного исследования) было проанализировано распределение ДНК-метилазной активности экстрактов ядерных белков в широком диапазоне рН и, при колоночном изоэлектрофокусировании, удалось обнаружить 5 пиков ферментативной активности в диапазоне рН от 3.5 до 8.2. Фракции, соответствующие одному из пиков активности, были собраны и проанализированы двумерным электрофорезом. В результате, на электрофореграмме было

выявлено 6 белковых фракций с молекулярными массами 10, 25, 35,43, 67 и 120 кДа, и для каждой из этих фракций был проведен замер ДНК-метилазной активности. Максимальные значения проявили фракции с Мм 120 и 43 кДа, причем последняя фракция привлекла особый интерес в связи с тем, что она проявляла элекгрофоретические свойства, близкие к свойствам сс-акгина миокарда. Далее было предпринято определение метилазной активности в ряде отдельных белковых фракциях, полученных из полных лизатов сердечной мышцы человека после разделения двумерным электрофорезом, в том числе во фракции актина. Практически только фракция актиновых белков оказалась способна переносить метильные группы с S-аденозилметионина на ДНК. Включение метки характеризовалось выраженной зависимостью от температуры инкубации. При анализе гидролизата ДНК, в этих экспериментах, метка была обнаружена в составе 5-метилцитозина. Эти данные позволяют заключить, что фракция № 4635537 (актин) из сердечной мышцы человека содержит БПГЭ, обладающий ДНК-метилазной активностью, и обнаруженный фермент по субстратной специфичности является цитозиновой ДНК-метилазой.

С помощью программы GENEBEE был проведен поиск гомологий между аминокислотными последовательностями некоторых типичных цитозиновых ДНК-метилаз и актинов, в результате в С-концевых последовательностях ос-акгина сердечной мышцы человека и некоторых типичных бактериальных метилаз - ДНК-(5-цитозин)-метилтрансфераз обнаружены протяженные области гомологии, охватывающие несколько десятков аминокислотных остатков и характеризующиеся высокими коэффициентами сходства (Рис.2).

Более того, последовательность YSF{V}TTAEREIV, содержащая аналог консервативной последовательности этих

АТСТ 190

ЬАбЬФЬТОУЬ

*1 II I**

МЕКНСАИБУЯ МТИС, 270

МТБ 9

МТ01

220

АСТС БиНКЕКЬСУУ

II I I II ** МТЫС С^ЕРБ^КИ

300 | |

МТБ9 СБЕРБЕМЕЕ

390 | | ***|* *

МТБ1 <23ЕРПТУ1Е 330 250

АСТС УЕЬРБССУТТ

**1 I И

ЖвИ УЕ1ААА1ККТ 330

200

МКИЛЕИСУЗ * | * * |

РААСКЕТЬУК 280

I

И

К

230 АЬОЕЕИЕМАТ

I III УОЫШОАУКМ 310

УБУ2

350

210 ЕУГТАЕКЕ1У

1*1 * I * РМТУЛЕУАКГ

290 ||||+* ***

РЕБШЕУЛЮ:

380 ||*|** * * *

НЕТАКЕСАИ1 320 240

ААЗЭЗЗЬЕКЗ

III III I IGNAVPVNLA

320

****|*|***

1СЫАУР\тЬА

410 ****!* * * ЮЫАУРРЬЬА 360

Ь

340

Рис.2. Аминокислотные последовательности гомологичных участков ос-актина сердечной мышцы человека (183-253) и бактериальных ДНК-метилтрансфераз (К=3,76). Все обозначения гомологичности аминокислотных остатков даны по отношению к МТ>ГС; АСТС - ос-актин сердечной мышцы человека; МТЫв - ДНК-(5-цитозин)-метшпрансфераза ШОРН, (М-ИШП), (К.Ф. 2.1.1.73); МШ - ДНК-(5-цитозин)-метшпрансфераза БАи961, (М.8Аи961), (К.Ф. 2.1.1.73); МТО1 - ДНК-(5-цитозин)-метшпрансфераза БОЕ!, (К.Ф. 2.1.1.73). Все обозначения гомологичности аминокислотных остатков даны по отношению к МТЬЮ; (|) - гомология, ( * ) - совпадение или близкая гомология.

бактериальных метилаз (Bcstor, 1988), была обнаружена в 49 актинах разного происхождения.

Таким образом, наличие определенных гомологии в первичной структуре актинов и ряда бактериальных ДНК-метилаз согласуется с обнаружением нами метилазной активности во фракции актиновых белков.

3. Использование двумерного электрофоретического анализа для изучения изменений БПГЭ при некоторых болезнях сердечнососудистой системы.

Одним из важных приложений к исследованиям, проводимым в рамках протеомных программ, считают развертывание работ по изучению молекулярных основ различных физиологических и патологических процессов (Lemkin, 1995). В частности, уже первые результаты по построению двумерных карт и банков данных о белках сердечной мышцы человека начали использоваться для поиска молекулярных (диагностических) маркеров и для изучения патогенетических механизмов различных болезней сердечнососудистой системы (Dunn, 1996, Knecht, 1994, Jungblud, 1991). Доводом в пользу целесообразности таких поисков служили имеющиеся данные об обнаружении качественных и количественных изменений на уровне белков миокарда при многих сердечнососудистых заболеваниях (Feldman, 1988, Ladensen, 1992, Mercadier, 1983, Schwartz, 1992). Очевидно, что эти изменения могут отражать как первичные, так и вторичные нарушения метаболизма сердечной мышцы.

В данной работе построенные двумерные карты и третья версия компьютерного банка данных были использованы для сравнительного изучения белков аутопсий миокарда, полученных от лиц, страдавших дилятационной (ДКМП) и гипертрофической (ГКМП)

кардиомиопатиямия, циклической болезнью сердца (ИБС), миокардитами и некоторыми другими заболеваниями. Таким образом, исследовались как болезни с доказанной генетической природой, болезни, характеризующиеся семейным накоплением, так и ненаследственные болезни сердечно-сосудистой системы.

При миокардите, клапанной патологии и ГКМП среда анализируемого спектра белков различий выявлено не было. Изучение белковых продуктов генной экспрессии в аутопсийных образцах пациентов с ДКМП показало изменения в 10 белковых фракциях, наиболее яркими из которых являются: увеличение количеств трансферрина (4900660) и белка (4262593), идентифицированного как гомолог цитокератина (Рис. 3).

Рис.3. Изменения в количественной представленности белковых фракций при дилятационной кардиопатии и ишемической болезни сердца: А - увеличение фракции трансферрина;В - увеличение фракции белка, гомологичного цитикератинам.

В группе больных с ИБС было обнаружено, также как и при ДКМП, усиление экспрессии белка N 4900660 (трансферрина) у 9 из 16 пациентов, и фракции белка, гомологичного цитокератину (7 из 16 пациентов), хотя степень усиления была менее выраженной, чем при ДКМП. По-видимому, отмеченные изменения являются вторичными,

хотя, возможно, они и играют определенную роль в патогенезе изученных заболеваний.

В настоящее время в лечении ряда болезней сердечно-сосудистой системы все более широкое применение находят пересадки сердца. При этом оказалось, что исходы операций по пересадкам сердца часто связаны с возникновением хронической реакции отторжения трансплантированного объекта.

Обычно диагностика хронического отторжения осуществляется преимущественно по клиническим проявлениям, например, по развитию сердечной недостаточности, нарушениям ритма, либо на морфологическом уровне (Хубутия, 1995, Рябоштанова, 1995). Изменения, происходящие на молекулярном уровне, остаются пока мало изученными, хотя именно молекулярные маркеры тех или иных патологических процессов, как правило, позволяют обеспечивать раннюю и точную диагностику этих процессов.

Системные исследования изменений БПГЭ открывают хорошие возможности как для изучения молекулярных механизмов осложнений трансплантаций, так и для поиска белков-маркеров реакций хронического отторжения. В перспективе такие белки могли бы быть использованы для разработки чувствительных и дешевых иммуноферментных методов диагностики. С этой целью в отдельной серии исследований мы было проведено изучение БПГЭ и поиск признаков отторжения в образцах трансплантатов сердца (п=3) *.

Общим изменением для всех проанализированных образцов трансплантата явилось (Рис.4) выраженное увеличение количества белкового материала в полипептидных пятнах 4312685 (20.60 кДа/р1 6.85), 4262672 (18.30 кДа/р! 6.72) и уменьшение фракции 4318709 (20.80

* Этот раздел работы выполнялся совместно с Л.И.Обельчук.

кДа/р1 7.09). Белок 4318709 на двумерных электрофореграммах белков миокарда человека был ранее идентифицирован нами как сс-В-кристаллин.

Можно предположить (учитывая уменьшение количества белкового материала в исходном пятне кристаллина), что две яркие фракции (4312685 и 4262672) с молекулярными массами несколько меньшими, чем у кристаллина представляют собой продукты его модификации и/или деградации. В пользу этого предположения косвенно свидетельствует и наличие определенной корреляции между относительным увеличением пятен 4312685 и 4262672, с одной стороны, и сроком функционирования трансплантата, с другой.

контроль При отторжении трансплантата сердца

Желудочек миокарда человека

Почка человека

Рис.4. Изменения в «зоне кристаллина» на двумерных электрофореграммах белков желудочка миокарда и почки человека при хроническом отторжении трансплантата сердца по сравнению с контролем. Стрелками отмечены фракции ^-В-кристаллина и продукта его деградации.

При параллельном исследовании белков почки у пациентов с реакцией хронического отторжения трансплантированного сердца (п=3) неожиданно также были обнаружены изменения белков,

располагающихся в "зоне кристаллита" на двумерных

электрофореграммах (Рис. 4.). Для фракции, по нашим предположениям, являющейся продуктом деградации oc-B-кристаллина, ЛИ. Обельчук был определен фрагмент аминокислотной последовательности, который соответствует последовательности ос-В-кристаллина, что подтверждает наше предположение.

Анализ почечных БПГЭ у других пациентов - с хроническим отторжением трансплантата почки (п=3) - изменений в уровне представленности cc-В-кристаллина в ткани трансплантата не выявил. Это позволяет думать, что именно реакция хронического отторжения трансплантата сердца обуславливает накопление сс-В-кристаллита и продукта его деградации в ткани почки. Можно предположить, что ос-В-кристаллин при хроническом отторжении трансплантата и связанной с этим ишемией миокарда играет какую-то роль в выведении миокардиальных белков из мышечных клеток и сам попадает в кровоток. В конечном счете, это приводит молекулы кристаллита в почки и обеспечивает накопление их там. Экспериментальная проверка данного предположения позволит, (в случае успеха), использовать тест на выброс oc-B-кристаллина в кровь качестве молекулярного маркера для диагностики реакций отторжения при пересадках сердца.

4. Использование двумерного электрофорегического анализа для получения высокоочищенных препаратов белков.

Установлено, что белковые фракции на двумерных

электрофореграммах имеют высокую степень гомогенности (Anderson, 1982), а при выполнение многих биохимических и биотехнологических работ требуется выделить препарат индивидуального белка. Такие белковые препараты часто могут быть необходимы для иммунизации лабораторных животных с целью получения моно- или поликлональных

антител.

В этой работе разработан модификация метода выделения на примнре тропонина I. Тропонин I в силу своих свойств и тканевой специфичности находит применение как маркер дистрофических процессов в мышечных клетках. В частности, некоторые авторы предлагают определять уровень тропонина I в крови для ранней диагностики инфаркта миокарда (ТакаЪаБЫ, 1996, Мая, 1997). Тропонин ] имеет щелочную изоэлектрическую точку, и в связи с этим не детектируется на двумерных электрофореграммах в обычном (равновесном) режиме. Подобрав режим неравновесногс изоэлектрофокусирования, при котором белки с »елочными изоэлектрическими точками детектируются на геле, мы идентифицировали фракцию иммуноблотгангом, а затем выделяли её, используя электроэлюцию. Подобный подход позволил достичь выхода 80-100%, чтс в течении месяца может обеспечить наработку белка в количествах, достаточных для начала работ по получению МКАТ.

ВЫВОДЫ

1)Особенности функционирования генома человека в поперечнополосато! мышечной ткани охарактеризованы как комплекс наиболее представленных белковых продуктов генной экспрессии (БПГЭ) и пс обобщенным результатам нескольких видов двумерного эдектрофоретического анализа построена новая (третья) расширенная версия каталога этих БПГЭ, в которой благодаря использовании иммобилизованного градиента рН:

а)увеличено общее количество БПГЭ до 347 за счет улучшенщ разделения компонентов с «кислыми» и «щелочными» значениями рН.

б) уточнены координаты для ряда БПГЭ.

в) с помощью микросеквенирования и иммуноблоттингс

идентифицированы БПГЭ № 4328724 (фосфатидилэтанол-аминсвязукмций белок), № 4462716 (скелетномышечная карбоангидраза III), № 4950704 (аконитаза), № 4715547, № 4701540, № 4665531 , № 4645527, (4 фракции десмина), № 4394875, № 4380895, (сердечная и скелетномышечная изоформы тропонина I, соответственно), г) БПГЭ № 4276623, по особенностям первичной структуры охарактеризован как новый член семейства цитокератинов.

2) Показано, что свойства ДНК-метилаз - ферментов, участвующих в регуляции генной экспрессии, могут исследоваться в поперечнополосатой мышечной ткани человека прямым анализом в рамках системного подхода. Обнаружено присутствие ДНК-(цитозин-5) метилазной активности во фракции актина сердечной мышцы человека.

3) Изучение спектра БПГЭ при наследстенных и ненаследственных заболеваниях миокарда показало изменения в аутопсийных образцах пациентов с дилятационной кардиопатией по 10 белковым фракциям, в том числе, увеличение количества БПГЭ № 4900660 (трансферрин) и № 4276623 (новый член семейства цитокератинов).

4) При реакции хронического отторжения трансплантата сердца выявлено специфическое изменение в спектре БПГЭ - уменьшение альфа В кристаллина, сочетающееся с накоплением альфа В кристаллита и продукта его деградации или модификации в тканях почки.

5) Обнаружено, что на генную экспрессию в культивируемых миобластах человека оказывают влияние фактор роста фибробластов и фактор роста эпителия, результатом чего становятся изменения БПГЭ в 5 зонах на двумерных электрофореграммах.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Shislikin S.S., Kovalyov L.I., Lucashova I.V., Chudaidatov A.I., Ershova E.S., Musolyamov A.Kli.. Egorov Ts.A, Shilov A.G., Kucharenko V.l. Two-

dimensional electrophoresis and microseqeunce analysis of proteins in Russian genom project. // Abstract. "2D Electrophoresis: from protein maps to genomes". Sienna, Sept. 16-18, 1994, p. 65.

2. Ковалев Л.И., Ершова E.C., Ковалева M.A, Худайдатов АН, Егоров Ц.А., Мусалямов А.К., Шишкин С.С. Изучение продуктов генной экспрессии в разных видах мышечной ткани у человека. // Тез. докладов 1 (3) Рос. съезда мед. генетиков., М, 1994, 30-31.

3. Шишкин С.С., Ковалев Л.И., Ковалева М.А, Ершова Е.С., Худайдатов А.И.. Волгина В.В. Теоретические и прикладные аспекты изучения тканевой специфичности генной экспрессии у человека. Тез. докл. 1(3) Рос съезда медгенет., М, 1994, ч.1, 68.

4. Ершова Е.С., Ковалев Л.И., Шишкин С.С. Быстрый метод полупрепаративного выделение высокоочшценных белков из миокарда человека на основе фракционирования экстрактов двумерным электрофорезом. // Биотехнология, 1994, N 6, с. 17-19.

5. Kovalyov L.I., Shishkin S.S., Efimochkin AS., Kovaleva M.A., Ershova E.S., Egorov T.A, Musalyamov A.K. The major protein expression profile and two-dimensional protein database of human heart. // Electrophoresis, 1995, v. 16, N7, p. 1160-1169.

6. Лопатина Н.Г., Никольская И.И., Ковалев Л.И., Ершова Е.С., Шаркова Е.В., Киркель А.З., Шишкин С.С. ДНК-метилазная активность в сердечной мышце человека Ассоциация ДНК-метилазной активности с фракцией акпшовых белков. // Молекул.биология, 1995,т.29, N 4, с.884-892.

7. Шишкин С.С., Крохина Т.Б., Раевская Г.Б., Ковалев Л.И., Волгина В.В., Педченко А.В., Ершова Е.С., Крахмалева И.Н. Изучение условий получения стабильных и чистых культур миобластов человека. Контроль чистоты с помощью детекции специфических для. мышечных клеток продуктов генной экспрессии. // Тез. докл. 5-ой конф. "Геном человека-96", с. 73.

8. Kovalyov L.I., Ershova E.S., Lucashova I.V., Severin V.V., Musolyamov A.Kh., Egorov T.A. Shislikin S.S Application of Two-Dimensional Protein Database of Human Heart for the Study of alteration in Protein Patterns by Some Cardiovascular Diseases.// Abstract "From genome to proteom"; 2nd Sienna 2D Electrophoresis Meeting., Sept. 16-18, 1996, p.101

9. Крохнна Т.Б, Шишкин C.C., Раевская Г.Б., Ковалев Л.И., Ершова Е.С., Черников В.Г., Мирочник В.В., Бубнова Е.Н., Кухаренко В.И. Особенности генной экпрессии в человеческих миобластах при анализе клеток первичных и клонированных культур. // "Бюлл эксп. биологии и медицины", 1996, № 9, с. 314-317.

10.Ershova E.S., Kovalyov L.I., Shislikin S.S. Particularities of anomalous human embryonic myocardial samples protein composition. // in: 9. Jahrestagung der Geselleschaft fur humangenetic. Congress Innsburk, 16-19 April 1997, p. 87.

П.Ковалев Л.И., Северин B.B., Ершова E.C., Обельчук Л.И., Цомартова Д.А, Хасигов П.З., Шишкин С.С. Двумерный электрофоретический анализ белков в трансплантатах сердца человека. Изменения В-кристаллииа. // Тез. 2 биохим. съезда, Москва, 1997, ч. II, с. 438-439.

12.Ершова Е.С., Ковалев Л.И., Шишкин С.С., Лукашова И.В., Егоров С.А, Мусалямов А.К. Исследование комплекса главных (наиболее представленных) белков, экспрессирующихся в различных мышечных клетках человека. Новая расширенная версия 2Д-каталога. // Тез. 2 биохим. съезда, Москва, 1997, ч. П, с. 495-496.