Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Структурно-функциональная характеристика гена ро-кристаллина лягушки Rana temporaria

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Структурно-функциональная характеристика гена ро-кристаллина лягушки Rana temporaria"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ИНСТИТУТ БИОЛОГИИ РАЗВИТИЯ им. Н. К. КОЛЬЦОВА

на правах рукописи УДК 577.1

РГВ ОД I ДЬН 1998

МИКАЕЛЯН АРСЕН СУРЕНОВИЧ

СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ГЕНА РО-КРИСТАЛЛИНА ЛЯГУШКИ RANA TEMPORARIA.

03.00.15 -генетика.

АВТОРЕФЕРАТ

диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва, 1998

Работа выполнена в лаборатории молекулярно-генетических основ онтогенеза Института биологии развития им. Н. К. Кольцова РАН

Директор Института академик РАН Н.Г. Хрущов

Научные руководители:

ка1щидат биологических наук С.М. Долгилевич кандидат биологических наук Р.Д. Зиновьева

Офицальные оппоненты:

доктор биологических наук Б.А. Кузин доктор биологических наук С.И. Городецкий

Ведущая организация:

Биологический факультет Московского Государственного Университета им. М.В. Ломоносова.

" г. в "¿Л

Защита диссертации состоится г. в часов

на заседании Диссертационного совета Д 002.85.01 при Институте биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН по адресу: г. Москва, ул. Вавилова, 26

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Инстшуга биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН (г. Москва, ул. Вавилова, 26)

Афтореферат разослан 1998 года

Ученый секретарь Диссертационногсмювета кандидат биологических наук Е.В. Волина

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы. Изучение молекулярных механизмов диф-•еренциальной экспрессии генов, лежащих в основе клеточной диффе-енцировки и органогенеза, находится на стыке генетики, молекулярной иологии и биологии развития и представляет собой одно из центральных аправлений в современной биологии.

Кристаллины, структурные белки хрусталика глаза позвоночных и гспозвоночных животных, являются удобными маркерами для исследова-ия таких проблем как: дифференцировка, эмбриональная индукция, ре-:нерация, старение, молекулярная эволюция.

В результате усилий рада исследовательских групп в США, Канаде, понии и др. выделены и структурно охарактеризованы гены, кодирую-ие основные классы белков хрусталика высших позвоночных: а-, 0-, у- и кристаллинов (\Vistow е1 а1 1994, Р1а^огеку е1 а!., 1988, КопсЬИ е1 а1. '83).

Наши исследования посвящены изучению уникального белка •кристаллина, специфического для лягушек рода Капа.

р-кристаллин принадлежит к суперсемейству НАДФ-Н-зависимых дуктаз - ферментов углеводного обмена (\yatanabe К., с( а1., 1988). Сравне-[е аминокислотных последовательностей р-кристаллина и белков семей-ва альдо-кеторедуктаз различных видов животных и человека показало ачительную гомологию между ними (50-70%). Во всех белках вышеука-ного семейства были обнаружены высококонсервативные области, в стности сайты связывания кофермента НАДФ-Н. Такого рода сайты оке были обнаружены в аминокислотной последовательности р-исталлина (с 45 по 53 и с 268 по 274), полностью совпадающие с сайтом «ывания НАДФ-Н для альдозоредуктазы из печени человека и простаг-адин-Р-синтазы из легких быка. Однако, ферментативная активность у фисталлина не обнаружена (Сагрег е1 а1., 1987). Особый интерес пред-[вляют структурные исследования регуляторных областей эволюцион-

но-родственных генов р-кристаллина и ферментов альдо-кето-редуктаз. что является предметом наших исследований.

В последние годы структурно-функциональные исследования регу ляторных областей генов кристаллинов приобретают особое значение ] связи с установлением участия ряда гомеобоксных белков в регуляцш экспрессии кристаллинов (Dorn et al., 1994, Cvekl et al., 1994,1995).

Выяснение молекулярных механизмов тканеспецифической экспрес сии, идентификация факторов, отвечающих за активацию генов кристал линов имеет не только теоретическое значение, но возможно, будет ис пользовано в медицинской практике, в частности при разработке методо лечения некоторых заболеваний глаза связаных с нарушением функци! хрусталика, например, диабетической катаракты (Kinoshita et al.,1990). Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы является структур но-функциональная характеристика гена р-кристаллина лягушк R.temporaria.

Задачи исследования сформулированы следующим образом:

1. Получение и определение первичной структуры полноразмерной кДН] р-кристаллина, которая необходима для поиска соответствующего гена.

2. Анализ тканевой специфичности экспрессии гена р-кристаллина.

3. Создание представительного банка геномных клонов и выделение клс нов, содержащих фр агменты гена р-кристаллина.

4. Построение рестрикционных карт полученных клонов.

5. Структурно-функциональная характеристика гена р-кристаллина. Уст: новление экзон-интронной структуры исследуемого гена.

6. Идентификация и структурная характеристика промоторного учасп гена р-кристаллина.

Научная новизна. В диссертационной работе впервые представлена детал: ная структурно-функциональная характеристика гена р-кристаллина л:

дики. Идентифицирован и структурно охарактеризован 5'-ланкирующий участок гена р-кристаллина.

Основные положения, отражающие новизну работы:

Впервые выделена и отсеквенирована полноразмерная кДНК -кристаллина.

Впервые получены доказательства тканеспецифической экспрессии на р-кристаллина в хрусталике глаза лягушки Rana temporaria.

Из геномного банка выделены и проанализированы клоны, содержа-ие информацию о полной структуре гена р-кристаллина.

Впервые построена полная экзон-интронная карта гена р-кристаллина. олучена информация о сходстве экзон-интроннон композиции генов ->исталлина лягушки и альдозоредуктазы крысы.

Идентифицирован и структурно охарактеризован участок гена кристаллина, имеющий гомологию с промоторным участком эволюци-[но-родственного гена карбамил фосфат синтетазы-1 (CPS-1) Rana tesbeiana. В полученной структуре идентифицирован ряд регуляторных ементов, характерных для промоторов генов некоторых кристаллинов. ¡актнческая значимость. Полученные нами данные могут использоваться заботе ряда лабораторий, занимающихся исследованием пространствен-й структуры кристаллинов (Институг белка РАН), исследованием моле-пярных механизмов развития и регенерации (Институт биологии разви-ч), а также могут быть использованы исследователями-генетиками и цицинскими генетиками (Институты общей генетики и биологии гена Н, Институт генетики человека РАН).

бликации и апробация результатов. Основные научные результаты, пред-вленные к защите, опубликованы в 12 печатных работах. Материалы ;сертации докладывались на 4 международных и 2 Всесоюзных научных 1ференциях. Апробация диссертации проведена на объединенном семи->е лабораторий генетики, молекулярно-генетических основ онтогенеза, >химической эмбриологии, проблем регенерации Института биологии вития им. Н.К.Кольцова РАН.

Структура н объем работы . Диссертация состоит из введения, обзора л! тературы, описания материалов и методов, изложения полученых результ: тов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой научной литератур . Работа изложена на/^^страницах машинописного текста, иллк стрирована рисунками и Л таблицами.

Материалы и методы.

Объектом исследования являлась травяная лягушка Rana temporari Следует отметить, что лягушка, эмбриональное развитие которой происх< дит вне организма, а получение зародышей в массовых количествах во: можно большую часть года, является удобным объектом для изученр активации генов кристаллинов в ходе развития.

Выделение РНК проводилось гуанидиновым методом (Feramisco et а 1982). из замороженных в жидком азоте тканей предварительно растерть в ступке.

Получение ро1у(АУ*~-РНК проводилось по методу Эдмонса с пом< щью хромотографии на о^о(<Л>целлюлозе (Edmonds et al. 1971) или И( пользовался метод сорбции на oligo(dT)^KnbTp разработаный и поставля! мый фирмой Amersham.

Дот-гибридизапия РНК, нанесенной на нитроцеллюлозную мембра! точечным методом в денатурирующем растворе, проводилась по стандар ной протоколу, используя в качестве зонда меченую 32Р ДНК (Маниати и др., 1984).

Блот-гибрндизация ДНК проводилась после переноса фракционир' ванной гель-электрофарезом ДНК на нитроцеллюлозную мембрану с m следующей гибридизацией с меченым 32Р зондом (Southern, 1975).

Меченне ДНК проводилось с помошью методов: Ник-трансляш или Кленовским-фрагментом ДНК-полимеразы I и "рассеяной затравк] (Маниатис, и др., 1984).

Гидролиз ДНК рсстрикнионпыми эндонуклеазами проводился обш принятым методом (Roberts, 1981) в условиях, предлагаемых поставщика»

этих ферментов. Разделение рестрикционных фрагментов ДНК проводили в агарозных и полиакриламидных гелях как описано в литературе (Маниатис, и др., 1984).

Выделение плазмидной ДНК осуществляли щелочным методом (Birn-boim and Doly, 1979)

Определение первичной структуры ДНК проводилось методом терминирующих аналогов (Sanger, 1977), используя набор Sequenas Version 2.0 [U.S. Biohimical Corp.) в соответствии с инструкцией к набору.

Результаты и обсуждение.

Тканеспецифическая экспрессия р-кристаллина.

Ранее было установлено, что р-кристаллин относится к группе кри-

;таллинов, имеющих эволюционное родство с ферментами, в частности с :емейством альдо-кеторедуктаз (Carper et al., 1987).

Для установления тканеспецифичности экспресии гена, кодирую-цего р-кристваллин, нами были выделены препараты тотальной РНК из >азличных органов лягушки, а именно: печени, почек, сердца, селезенки, ;егких, мозга и ооцитов с помощью гуанидинциацанатного метода. Выбор каней определялся высокой функциональной активностью в них вышена-ванных ферментов.

Тотальная РНК была иммобилизована на нитроцеллюлозную мем-рану дот-методом по 10 мкг на точку и проведена дот-гибридизация ме-енной Р32 кДНК кодирующей р-кристаллин Rana temporaria. Удельная ктивность меченого зонда составляла 5.0Х104 Бк\мкг.

а)

б)

II

б)

1 2 3 4 5 6 7

Рис. 1 Радиоавтограф дот-гибридизации тотальной РНК, выделеной следующих тканей лягушки Rana temporaria:

а) - хрусталик глаза. Концентрация нанесенной РНК: 10 мкг, мкг, 0.1 мкг, 0.01 мкг, 0.001 мкг.

б) - сердце (1), почки (2), печень (3), легкие (4), селезенка (; ооциты (6), мозг (7). -Концентрация тотальной РНК из вьн перечисленных органов по 10 мкг на точку. Гибридизация проводилась с меченной 32Р кДНК р-кристалли (I) и меченной 32Р кДНК рибосомальной РНК (II)

Оценку результатов гибридизации проводили по данным радиоав-ографии. Положительным контролем служила тотальная РНК з хрусталика глаза лягушки Rana temporaria, иммобилизованная на мем-рану в убывающей концентрации (Шмкг, 1мкг, ОЛмкг, 0.001мкг, .0001мкг).

В качестве неспецифического контроля анализируемые пробы гиб-идизовались также с меченной Р32 кДНК рибосомальной РНК.

Результаты проведенных экспериментов приведены на рис. 1

Полученные результаты свидетельствуют о наличии гиперэкспрес-ии р-кристаллина в хрусталике глаза и отсутствии значимой экспрессии в ругих органах лягушки Rana temporaria. Наши данные согласуются с дан-ыми, имеющимися в литературе, об отсутствии в хрусталике лягушки тьдозо/альдегидредуктазной активности (Carpet et al. 1987), несмотря на то го р-кристаллин составляет около 10% водорастворимых белков хруста-г1ка.

Следует отметить, что сходные результаты получены при исследова-ии экспрессии некоторых других генов, кодирующих таксоноспецифиче-íne кристаллины, в частности 5-кристаллин птиц и рептилий (Wistow, )94 г.). Особенный интерес вызывает различие в характере экспрессии 1ИЗК0 родственных генов, кодирующих две субъединицы белка. Только 5-является хрусталикоспецифическим белком и не обладает ферментатив-эй активностью, в то время как экспрессия 6-2 детектируется и в других :анях (Barbosa et al. 1991).

олучение и скрининг геномного банка травяной лягушки Rana temporaria.

Основной задачей настоящих исследований являлась структурно-/нкциональная характеристика гена, кодирующего р-кристаллин, ма-эрный белок хрусталика глаза лягушки Rana temporaria. Для проведения кого рода исследований нами была получена полноразмерная кДНК кристаплина, знание первичной структуры которой было необходимо я установления экзон-интронной структуры исследуемого гена.

Длина кДНК р-кристаллина хрусталика глаза лягушки Rana temporaria составляет 1230 и.о.. 5' -нетранслируемый регион (5'-НТР) составляет 40 п.о., З'-НТР - 211 п.о. З'-НТР содержит сигнал полиадени-лирования на расстоянии 15 п.о. от poly (А) тракта.

Для выделения функционального гена р-кристаллина был создан геномный банк лягушки Rana temporaria.

Получение геномного банка лягушки R. temporaria.

Нами была выделена хромосомная ДНК из семянников лягушки R. temporaria. 100 мкг данной ДНК были подвергнуты частичной рестрикции ферментом EcoRl. Рестрикцированная геномная ДНК фракционировалась гель-электрофорезом в 0,5% легкоплавкой агарозе. После экстракции фракция молекул размером около 20 т.п.о. лигировалась с плечами фагового вектора EMBL4. Полученные таким образом рекомбинантные молекулы упаковывались в головки фага. Клетки E.coli инфицировались фаговыми частицами, несущими фрагменты геномной ДНК лягушки. Инкубацию проводили до появления зон лизиса. Титр полученного банка клонов геномной ДНК составлял около 2 млн. независимых рекомбинантных клонов на 1 мкг. хромосомной ДНК.

Скрининг геномного банка травяной лягушки.

Скрининг банка проводился путем гибридизации ДНК геномных клонов с меченной Р32 кДНК р-кристаллина. Фаговые частицы со встроенными фрагментами геномной ДНК лягушки высевались на чашки Петри, инфицированные предворительно клетками E.coli из расчета 5х105 фаговых частиц на чашку размером 20X20 см. После инкубации фаговые бляшки переносились на нитроцеллюлозные фильтры. Фильтры с иммо-билизированной на них ДНК гибридизовались с меченной Р32 вставкой клона р513, несущей последовательность кДНК р-кристаллина. Удельная активность зонда составляла 8х105 Бк\мкг ДНК.

Нами было индентифицированно десять гибридизационных сигна-ов. Зоны лизиса, соответветствующие сигналам гибридизации, были ырезаны, а фаговые частицы экстрагированы и подвергнуты скринингу горично.

В результате вторичного скрининга геномного банка нами были поручены 3 клона, которые дали положительный сигнал с меченым зондбм. ти клоны были названы gro5, gro7 и gro9 ( от genomic го- ). После ä$i-лификации клонов из них была выделена ДНК, которая использовалась чя дальнейшего структурного анализа.

В этих экспериментах, для сравнения мы использовали также ДНК иона gro-I2, частичная структурная характеристика которого была провеяна ранее (Долгилевич и др. 1988).

естрикционпый анализ.

Размер вставок, полученных клонов составляет около 18 т.п.о., что пределялось условиями клонирования. Первичный структурный анализ роводили с помощью одиночных и двойных гидролизов редкощепящими ;стриктазами: EcoRl, Pstl, Hind III, Bglll, с последующим фракциониро-шием в 0,5% агарозном геле и блот гибридизацией с меченной Р32 кДНК -кристаллина. Фрагменты, дающие гибридизационный сигнал с меченой кДНК р-кристалина, содержат экзоны или участки экзонов исследуе-ого гена. Также в качестве зондов при гибридизации мы использовали 5' 3' половины кДНК р-кристаллина для идентификации соответствующих шстков гена р-кристаллина.

В результате анализа структурных данных было установлено, что юны gro-5, gro-9, gro-7 являются перекрывающимися. Причем клоны о-5 и gro-9 содержат структурную информацию о 5' фланкирующем тетке, а клон gro-7 - о 3' фланкирующем участке гена р-кристаллина.

Отличия в наборе рестрикционных фрагментов в клонах gro-5 и gro-свидетельствуют о различиях в первичной структуре.

Следует отмстить , что на данном этапе исследований геномны клон gro9 казался полностью идентичным ранее охарактеризованном клону бго12.

На основании полученных результатов рестрикционного анализа блот гибридизации были построены детальные рестрикционные карт клонов его-5, бго-9 и ¿то-7. (Рис.2)

В результате построения рестрикционных карт подтвердились наш предположения о том, что клоны, выделенные нами, имеют не тольк топографические, но и структурные отличия. Это указывает на то чтс ДНК изучаемых клонов несет информацию о различных копиях ген р-кристаллина.

Особый интерес для наших исследований представляли фланкирук щие области гена р-кристаллина. Для детального структурного анализ были выбраны два фрагмента. Первый , как мы предполагали, содержи 5' фланкирующую область гена р-кристаллина. Это фрагмент 8,7 т.п.о получающийся при ЕсоШ-гидролизе ДНК клонов бго-9 и яго-5. Второ{ включает всю 3' фланкирующую область гена р-кристаллина. Это фра1 мент 6.0 т.п.о., получающийся только при ЕсоШ-гидролизе ДНК клон

Таким образом, нами были подобраны и субклонированы фрагмег ты геномных клонов, дальнейший структурный анализ которых, как м надеялись, позволил бы нам дать полную структурную характеристик гена р-кристаллина лягушки.

L-+Ü-J-у.-Гт „ 2.3 0.V 1.5 . L. Г 1Г J.

ГР «¡чм I'm 0.7 1.2 3.0 IP If ^ 0.2 I

С >1 Uc )1 2.3 0.5 1.5 з С-ä> «-> «=->

CD

0.7 1.2 2.7 0.6

Е Ijl Е Р If ] 1 1 1 E

<-5 <-> 'г 5 i->

<---- 43 ..... 1Л

CD

».7 1.2

Рис. 2 Рестрикционные карты ориентирование относительно друг друга рекомбинантных клонов gro-9, gro-5 и gro-7. Е - сайты расщепления рестриктазой EcoRl, Н - сайты расщепления рестриктазой Hind III, В - сайты расщепления рестриктазой Bgl II, Р - сайты расщепления рестриктазой Pst 1.

Экзон-интронная структура гена р-кристаллина.

Одной из основных характеристик гена является его экзо! интронная композиция. Это очень консервативное свойство гена, поэток оно сохраняется у большинства изученных родственных генов.

Стратегия этих исследований такова: прямым секвенированием ДН мы определяли нуклеотидную последовательность субклонов, содержащ! фрагменты изучаемого гена, и сравнивали со структурой кДН р-кристаллина. Совпадающие участки последовательности соответствуй экзонам, то есть транскрибируемой части гена, а участки последовательш сти, содержащиеся только в геномной ДНК - соответствуют интронам, i есть части гена, которая выбрасывается (сплайсируется) в ходе постграш ляционной модификации мРНК.

На основании сравнительного анализа полученной информации структуре геномных клонов со структурой кДНК ро-кристаллина нам была построена полная экзон-интронная карта гена р-кристаллш (Рис.3).

На рисунке приведена также экзон-интронная структура эволюц* онно родственного гена, кодирующего фермент альдозо-редуктазу крыс (Graham et al., 1991).

Гены АР и ро- содержат 10 и 11 экзонов соответственно, причем в случаях размеры экзонов совпадают, а в 3 - сумма двух экзонов одног гена равна длине экзона другого гена.

Следует отметить также, что проанализированные границы экзонс соответствуют каноническим для большинства изученных генов. Вероятш множественная дупликация общего гена-предшественника и последующи мутационные изменения, происходившие в ходе эволюции, привели существованию целого семейства генов ферментов и хрусталикоспецифк ческого гена р-кристаллина, утратившего ферментативную активность.

55 72 168 117 78 123 110 166 83 81 140

I_I

1 T.RQ

Рис. 3 Сравнение экзон-интронных структур гена р-кристалина лягушки (р-кр.) и гена альдозы редуктазы крысы (АР) (Graham et al., 1991).

Структурный анализ геномных клонов gro-9, gro-5 и gro-7 выявил различия в первичной структуре интронов, что свидетельствует о многоко-пийности гена р-кристаллина.

Сравнение структуры экзонов содержащихся в исследуемых клонах с полноразмерной кДНК р-кристаллина показало их полное совпадение, в отличие от описанного ранее фрагмента псевдогена р-кристаллина (gro-12), имеющего делецию в 9 нуклеотидов (Автореферат диссертации, Князева М.В., 1990).

Таким образом, в геноме лягушки Rana temporaria, ген, кодирующий р-кристаллин представлен по крайней мере в 4 копиях, одна из которых, вероятно, является псевдогеном.

Идентификации промоториого участка гена р-кристаллина лягушки Rana temporaria.

Кроме структурной характеристики гена р-кристаллина, наш интерес был направлен на поиск промоторной области и возможных регуля-торных элементов гена р-кристаллина.

Для решения этой задачи мы использовали прямое секвенирование субклона 8.7, так как он является самым крайним 5' фрагментом в клонах gro-5 и gro-9.

В результате поэтапного секвенирования нами была получена информация о первичной структуре 5* фрагмента длиной 1033 п.о. которая приведена на рис. 4

Анализ полученной нами 5'концевой последовательности субклона 8.7 длинной 1033 нуклеотида показал, что это АТ-богатая последовательность содержит некоторые регуляторные элементы, характерные для промоторов всех изученных генов кристаллинов. Это в первую очередь ТАТА-бокс и API-подобные сайт связывания транскрипционных факторов (Meakin et al, 1985, 1987; Murer-Orlando et al., 1987). Известно, что API сайт в генах кристаллинов позвоночных и беспозвоночных отвечает за хрусталикоспецифическую экспрессию. Другие регуляторные элементы, такие как ARE-, XRE-, реагируют на окислительный стресс н на ксенобиотики (Tomarev et al, 1992; Piatigorsky and Zelenka. 1992).

АР-1-под.

GAATTCGGAT CTGAACCGTC AAAATGTAGT GGTTGTTGGC CAACACAGAC 50

TGCATTTACT GTAAGTCACA CTTATAAACA TAGTCAACTG TATTTAATTT 100

АР-1-под.

TGTAACAGAG AAAAAAAAAA GTACAAATGA GAATATAAAT ATATTCTTGT 150

AGATGAATGA TAACATTTTT GTAAAACATA AAATCAATTT TTTGAAAAAC 200

GATGTCACTT AAAATATAAA CTTTTATTTG TTGAGTAGTG AGGTTAAAAA 250

CAGAACATTA AAGAATACGT CTGTTAAATA TATACGTCAG TTGGAGAATG 300

TTGATGTTGC TTCAGTAAAA TATATTTGGA ATTGTAGATG CAATGTTGTC 350

AATGCATCTT GTAACAAATG TTAATTTTTG TGATATCACC CCATCAACAG 400

GTAGCATGCA CAGCGGATAT GCCCTGTCTC TGAAATATAG CGTATATTTT 450

GAGAGCACTG ATGTTACCTA TTTAAAGTAT CGTGCAATGC TTTTGAAGGG 500

TAGGGATTAC TGCAAAATTA TTATATATTG GGAAATACTG ACATCAAGGA 550

GAAAGATTTG CTAAAACTGG GGCACTTAGA ATATGGTGTA GCTGTGCATA 600

GTCTAATGCC CTGTACАСAC GATCGGTCCA TCCGATGAGA ACCGTCTGAT 650

АР-1-под.

GGACCGTTTT CATCGGTTAA CCGATGAAGC TGACTGATGG TCAGTCGTGC 700

XRE-под. ARE-под.

CTACACACCA TCGGTTCGAA AAAAATGATC GCGTGAGAAC CTGACGTAAA 750

ACAGAACGAC GTGCTGAAAA AAACCAAGTT CAATCCTTCC AAGCATGCGT 800

CGAGCATCGG TGGATTTTTA ACCTATGGTT GTGCCTACTA AAGATCGTTT 850

TTTTTTCTAT CTGCTTTTTT TTAACCTATG GATAAATAAC TGATGGCGCC 900

CACACACGAT CGGTTTGGTC CGATGAAAAC GGTCCATCAG ACCGTTCTCA 950

TCGGTTTGAC CGATCGTGTG TATGCGGCAT TAGACTGCAT AGTCTTCTAA 1000

TATA-box

ATTCAGCTTG CTTAATTAAG CTTTGACAAT AAA ...1033

Рис. 4. Нуклеотидная последовательность 5' фланкирующей области гена р-кристаллина. Жирным шрифтом с подчеркиванием выделены TATA бокс и сайты связывания транскрипционных факторов.

Сравнительный анализ полученной последовательности с базой данных нуклеотидных последовательностей СЕМВАИК показал наличие высокогомологичного участка (54 п.о. - 79%) с промоторной областью гена карбомил фосфат синтетазы-1 (КФС-1) Яапа сШеьЬе'мпа (неопубликованые данные), который представлен на рисунке 5.

576 AGGAAGGTTTAATAAAACTGCTGCACACAGAATCTGTTACAGCTGTCCATAGT 602

II III III I I I I I I I I I I I I I I I I И II I I I I I I I I I I I I I I

550 AGAAAGATTTGCTAAAACTGGGGCACTTAGAATATGGTGTAGCTGTGCATAGT 626

Рис. 5. Сравнение высокогомологичных участков нуклеотидных последовательностей промоторных областей генов карбомил фосфат синтетазы-1 (КФС) и р-кристаллина (РК).

Наличие протяженного участка со столь высокой гомологией в промоторах двух генов в геноме лягушек рода Rana может свидетельствовать о функциональной значимости этого участка.

Выявление регуляторных факторов, обеспечивающих хрусталикоспе-цифическую экспрессию кристаллиновых генов и, в частности р-кристаллина, представляет собой одну из актуальных задач дальнейших исследований. Наличие охарактеризованных промоторных участков кристаллиновых генов позволяет осуществить такого рода исследования, а также использовать их при изучении классических проблем биологии, как трансдифференцировка, регенерация, эмбриональная индукция. Особый интерес представляет эволюционный аспект сравнения структур регуляторных участков гена р-кристаллина и генов гомологичных ему белков. Результаты такого сравнения могут выявить конкретные этапы эволюционного процесса, приведшего к появлению в белковом ансамбле хрусталика лягушки нового белкового компонента, р-кристаллина.

КФС РК

Выводы.

1. Впервые получены доказательства хрусталикоспецифической экспрессии гена ро-кристаллина лягушки R. temporaria.

2. Сконструирована представительная кДНК библиотека на матрице мРНК из хрусталика лягушки R. temporaria. Идентифицирован клон, несущий полноразмерную последовательность кДНК р-кристаллина, и определена его первичная структура.

3. Создан геномный банк лягушки R.temporaria, из которого с помощью кДНК-зонда выделены клоны, содержащие участки гена р-кристаллина.

4. Построена детальная рестрикционная карта полученных геномных клонов.

5. Проведена структурная характеристика геномных клонов. Доказано наличие в геноме лягушки по крайней мере четырех копий гена р-кристаллина, один из которых вероятно является псевдогеном.

6. Впервые идентифицирован и структурно охарактеризован геномный клон, содержащий 5'концевой участок гена р-кристаллина, который по совокупности данных может содержать промотор гена р-кристаллина.

7. Компьютерный анализ структуры 5'-участка гена р-кристаллина выявил гомологию с первичной структурой промоторного участка гена кар-бомил фосфат синтетазы-1 Rana catesbeiana, а также наличие ряда регуля-торных элементов, характерных для промоторов других кристаллиновых генов.

Список работ, опубликованных по теме диссертации.

1. Долгилевич С.М., Князева М.В., Микаелян А. С., Гаузе Г.Г. Выделение и некоторые характеристики хромосомного гена, кодирующего ро-кристаллин лягушки. ДАН СССР, т.302, с. 449-451 (1988).

2. Долгилевич С.М., Микаелян А.С., Князева М.В., Снеговая И.Ю.,. Симир-ский В.Н., Аленикова К.С., Гаузе Г.Г. Ро-кристаллин хрусталика глаза лягушки: структура и экспрессия., ДАН, 1994, т. 335, N 3, с. 373-377.

3. Долгилевич С.М., Снеговая И.Ю., Микаелян А.С.. Таксонспецифиче-ский белок хрусталика глаза лягушки: филогенетическое родство с белками семейства NADP-зависимых редуктаз, Известия Академии Наук, Серия Биология, 1994, N 4, с. 577-587.

4. Гаузе Г.Г., Долгилевич С.М., Князева М.В., Микаелян А. С., Выделение и некоторые характеристики хромососного гена ро-кристаллина лягушки. Материалы Всесоюзн. конф. Структура генома, М. 1987, с.7

5. Гаузе Г.Г., Долгилевич С.М., Князева М.В., Микаелян А.С. Выделение и некоторые характеристики хромосомного гена ро-кристаллина лягушки: Тез. докл. и стендовых сообщений, представленных на сов,-фин. симпозиуме по биологии развития, Ташкент, 26 сент.-1 окт. 1988 г., Онтогенез, 1988, т. 19, N 4, с. 448

6. Долгилевич С.М., Князева М.В., Микаелян А. С., Снеговая И.Ю., Гаузе Г.Г., Хромосомные гены/псевдогены хрусталика ля-гушки Rana temporaria. Структура и функции клеточного ядра: 10-й Всесоюзн. симп., 10-14 окт. 1990г, Гродоно, тез. докл., М., 1990, с. 44.

7. G.G.Gause, M.V.Knyaseva, S.M.Dolgilevich, A.S.Mikaelyan. Way to search for ligands binding to a taxon-specific lens crystallin. In: Recombinant Systems

in Protein Expression. Eds.: K.K.Alitalo, M.L.Hyhtala, N.Y.: Elsevier Science Publ., 1990, p. 13-18.

8. G.G.Gause, M.V.Knyaseva, S.M.Dolgilevich, A.S.Mikaelyan. Isolation and several characheristics of the chromosomal genecoding fro the rho-crystallin of the frog. Abstr. of the 8th Intern. Congr. of Eye Research, San-Francisco, USA, 1988, p. 107.

9. G.G.Gause, M.V.Knyaseva, S.M.Dogilevich, A.S.Mikaelyan. Structure and developmental expression of the gene coding for the rho-crystallin of the frog. In: From DNA to Developmental Biologist. Abstr. of Conf., Utrecht, The Netherlands, 20-25 Aug. 1989. Cell Differ, and Develop., 1989, v. 27, Suppl., p. 5163.

10. M.V.Knyazeva, S.M.Dolgilevich, A.S.Mikaelyan, G.G.Gause. Structural charachterization of a taxon specific gene coding for rho-crystallin of the frog Rana Temporaria. Proc. of the Nuclear workshop, 11th Sept., 18-23, 1989, Suzdal, USSR, Eds: I.B.Zbarsky and T.V.Buldyaeva, Chernogolovka, 1989, p. 111.

11 .G.G.Gause, M.V.Knyazeva, I.Yu.Snegovaya, S.M.Dolgilevich A.S.Mikaelyan. Way to search for ligands binding to a taxon-specific lens crystallin. Abstr. of the 9th Intern. Congr. of Eye Research, Helsinki, Finland, July, 29-Aug., 4, 1990, eds. Y. Uusitalo, A.Palkama, Helsinki, 1990, p.261.

12. Dolgilevich S.M., Snegovaya I.Yu., Mikaelyan A.S. Evolutionary origin of the gene family coding for taxon-specific protein in the frog lens. Abstract of International symposium "Mechanisms of Developmental: ontogenetic and evolutionary aspects". Онтогенез, 1994, тот 25, N4, стр.58-59.

/

/