Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Структура тРНК1Ser из печени быка и ее взаимодействие с аминоацил-тРНК-синтетазой

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Структура тРНК1Ser из печени быка и ее взаимодействие с аминоацил-тРНК-синтетазой"

ОРДЕНА ЛЕНИНА И ОРДЕНА ДРУЖБЫ НАРОДОВ

АКАДЕМИЯ НАУК УКРАИНСКОЙ ССР ИНСТИТУТ МОЛЕКУЛЯРНОЙ БИОЛОГИИ И ГЕНЕТИКИ

На правах рукописи УДК 577.113.5 КАЛАЧНИК Лилия Григорьевна

СТРУКТУРА тРН1^вг ИЗ ПЕЧЕНИ" БЫКА И ЕЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ С АМИНОАЦИЛ-тРНК-СШТЕТАЗОЙ

03.00.03 - молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Киев - 1988

Работа выполнена в Киевском институте молекулярной биологии и генетики АН УССР

Научные руководители: академик АН УвСР, доктор биологических наук,, профессор Г.Х.Маиука^ кандидат биологических наук М.А.Тукало

Официальные оппоненты: член-корреспондент АН УССР, доктор биологических наук, профессор А.В.Ельская; кандидат химических наук Т.Д.Машкова

Ведущая организация - Институт биоорганической химии СО АН СССР

Защита состоится " S " 1988 г.

в 4О часов на заседании Специализированного совета Д-016.П.01 Института молекулярной биологии и генетики АН УССР по адресу: 252627, г.Киев-143, ул.Заболотного, 150.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института молекулярной биологии и генетики АН УССР.

Автореферат разослан " Y " 1988 г.

Ученый секретарь Специализированного совета канд. биол. наук

Л.Л.Лукаш

. Актуальность проблемы. 3 изучении процесса биосинтеза белка одно из центральных мест принадлежит проблеме узнавания тРНК соответствующей аминоацил-тРНК-синтетаэой ( АРСазой ). Несмотря на ^огромное количество исследований, посвященных взаимодействию тРНК и АРСаз, остается ряд проблем, требующих дальнейшего изучения. В настоящее время складывается представление, что не существует каких-либо общих правил узнавания тРНК соответствующей АРСазой. Каждая изученная тРНК первого класса имеет свои особенности взаимодействия с гомологичной АРСазой. В то же время характер взаимодействия между тРНК второго класса и гомологичными АРСазами до сих пор не выяснен. Не известно, например, какой вклад в узнавание вносит длинная вариабельная петля, заметным образом влияющая на пространственную структуру тРНК второго класса. Функциональное значение длинной вариабельной петли тРНК до настоящего времени вообще остается непонятным. Если учесть, что у эукариот только две тРНК с длинной дополнительной петлей ( тРНКЗег и тРНКЬеи ), а у прокариот - три ( тРНК8ег , тРНК1,ви, тРНКТуг ), то можно предположить, что функция этой петли имеет какое-то особое значение в процессе биосинтеза белка, либо вообще не имеет отношения к акцепторной и адапторной роли тРНК.

Цель и задачи работы. Целью настоящей работы было определение первичной структуры и изучение взаимодействия с серил-тРНК-синтетазой тРНК^ ег из печени быка, относящейся к классу тРНК с длинной вариабельной петлей.

В соответствии с целью работы были "поставлены следующие задачи:

1. Разработать схему получения индивидуального препарата тРНК]Р0Г из печени быка и выделить в препаративном количестве.

2. Установить первичную структуру тРНК^ег .

3. Определить элементы пространственной структуры тРНК^9Г и участки взаимодействия ее с серил-тРНК-синтетаэой с использованием метода химической модификации.

Научная новизна. Впервые получена в индивидуальном состоянии ?РШ-рог из печени быка и определена ее первичная структура. Обнаружена низкая реакционная способность остатков фосфорной кислоты В, 9, II, 21, 47 6, 47 I, 49, 56, 58, 59 в условиях

стабилизирующих нативную структуру молекулы, что свидетельствует об общности укладки рибозофосфатного остова тРНК первого и второго класса, за исключением вариабельной ветви, экспонированной в раствор.

Исследования взаимодействия тРНК с гомологичной синте-тазой показало, что серил-тРНК-синтетаза защищает от модификации алкилирутацим реагентом участки X) -стебля (положения 12, 13) и вариабельной ветви ( положения 45 - 47, 47 в, 47 Н ) тРНК^вг, что указывает на возможное участие вариабельного стебля тРН?^ег в специфическом взаимодействии с гомологичной АРСазой.

Теоретическая и практическая значимость работы. Данная диссертационная работа посвящена фундаментальной проблеме и вносит вклад в понимание особенностей узнавания тРНК с длинной дополнительной петлей гомологичными синтетазами. В отличие от других известных типов взаимодействий тРНК с гомологичными синтетазами антикодон сериновой тРНК не контактирует с гомологичной АРСазой. С ферментом взаимодействует участок и -стебля в положениях 12, 13, а также вариабельная ветвь в положениях 45-47, 47 б, 47 Н тРНК|вг .

Практическая значимость работы состоит в том, что разработан доступный в практической лабораторной работе метод получения индивидуальной тРНКт0Г из печени быка. Метод может быть использован для наработки препарата тРНК^ег в больших количествах, как в лабораториях, так и на специализированных предприятиях.

Из работы по расшифровке первичной структуры тРНК| следует, что "Милихром" имеет широкие возможности в изучении структуры нуклеиновых кислот, особенно при идентификации минорных компонентов.

Данные полученные в диссертационной работе используются в лекционном курсе по молекулярной биологии для студентов Киевского государственного университета им. Т.Г.Шевченко.

Апробация работы. Гезультаты исследований обсуждены на У-ом Украинском биохимическом съезде ( Ивано-Франковск, 1987 ), 12-ом международном собрании "тРНК" ( Умеа, 1987 ), французско-советской конференции "Физико-химические основы жизни" ( Перигод, 1968 ), У1-ом советско-итальянском симпозиуме "Макромолекулы в

функционирующей клетке" ( Ленинград, 1988 ), 14-ом международном биохимическом съезде ( Прага, 1988 ), 5-ой конференции молодых ученых социалистических стран по биоорганической химии ( Пущино, 1988 ).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 10 работ.

Объем и структура работы. Диссертация изложена на 126 страницах машинописного текста и включает введение, обзор литературы, описание методов исследования, результаты работы и их обсуждение, заключение, выводы и список литературы, содержался 215 источников.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Работу по определению первичной структуры тРНК^вг печени быка и изучению ее взаимодействия с серил-тРНК-синтетазой проводили на препарате 99%-ой чистоты. Исходный материал суммарной т?НК получали по методу описанному Брунграбер (Brungraber Е.А., 1962 ). Для выделения препарата индивидуальной тРНК^вг из суммарного препарата тРНК из печени быка мы использовали хроматографии на ВД-целлплозе. На первой стадии очистки применяли хроматографию суммарной тРНК на БД-целлюлозе по ( Diamond A. et al., 1981 ). Из трех полученных пиков в результате фракционирования на БД-целлюлозе акцепторной активности по серину в дальнейшей работе использовали первый ( тРНК^ег ), Для дальнейшей очистки материала первого пика ( тРНК^ег ) после хроматографии тРНК на БД-целлюлозе была использована рехроматография на БД-целлюлозе в отсутствие ионов магния. Степень очистки полученного препарата определяли по уровню образования ^^С-серил-тРШ, а также по оли-гонуклеотидным картам Tj-РНКазных1гидролизатов.

Первичную структуру тРНК^ег печени быка определяли с помощью сочетания методов микроспектрофотометрии и гель-секвенирования. Для идентификации минорных компонентов был использован микроспек-трофотометрический метод, разработанный в отделе структуры и функции нуклеиновых кислот ( Тукало М.А. и др., 1981 ), Нуклеотид-ную последовательность определяли методом быстрого гель-секвенирования (Peatti« D.A. , 1979 ). Для секвенирования также исполь-

эовали гидролиз Tj, U2, Phy м- РНКазами,специфичных к гуанозину, аденозину, аденозину + уридину (Donia-Keiler н. et al., 1977 ). Введение радиоактивного фосфата в 3'- и 5'- конец молекулы тРНК|ег проводили в соответствии с работами (Bruce Q.C. et al., 1978; Szekely М.. Sanger У. , 1969; Silberklang M. et al., 1977 ),

Определение остатков фосфорной кислоты, участвующих в образовании пространственной структуры тРШ|вг, а также участков контакта tPHKj01 и серил-тРНК-синтетазы проводили согласно ( Власов В.В., 1982 ).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ ВЫДЕЛЕНИЕ, ОЧИСТКА И ХАРАКТЕРИСТИКА ПРЕПАРАТА тРНй|в1"

Получение достаточного количества препарата индивидуальной тРНК из тканей животных для исследования ее взаимодействия с АРСазой, а также определения нуклеотидной последовательности . представляет собой достаточно сложную задачу, так как тРНК разных специфичностей часто имеют очень сходную структуру. В настоящей работе выделение индивидуальной тРНК|ег из печени быка проводилось с использованием комбинации двух колоночных хроматографий н£ БД-целлюлозе. Хроматография суммарной тРНК на БД-целлюлозе в присутствии ионов магния была первым этапом очистки. Использование хроматографии на БД-целлюлозе привлекало нас, прежде всего, возможностью фракционирования больших количеств препарата суммарной тРНК и удовлетворительным разделением тРНК на иэоакцепторные формы.

При хроматографии суммарного препарата тРНК печени быка на БД-целлюлозе при pF 4,5 в присутствии ионов Mg2+ было получено три пика серин-акцепторной активности: два из них элюировались в градиенте концентрации хлористого натрия, а третиЦ - в спиртовом градиенте. Основная серин-акцепторная активность ( 80% ) сосредо точена в пиках I и 2, содержащих тРНК^ег 15% чистоты. Фракции, содержащие первый пик серин-акцепторной активности, объединяли и осаждали спиртом ( тРНК|ег ). тРНН^0Г рехроматографировали вто рично на колонке с ВД-целлюлозой в отсутствие ионов Mg при 4°С При хроыатографичесном разделении обогащенной , соответ-

ствующей пику I в первой системе, в пределах солевого градиента происходила элюция большей части тРНК, не обладающей серин-акцег

торной активностью, а в спиртовом градиенте элюировали тРНК^ег ( рис. I ). После второй стадии очистки был получен препарат 99%-ой чистоты.

Чистоту выделенного препарата тРНК|ег проверяли по акцеп-тоной активности, а также по олигонуклвотидным картам Tj-РНКаз-ных гидролизатов.

Таким образом, использованная схема очистки тРНК|е:г является эффективной для ее препаративного выделения: из I г суммарной тРНК выделяется 4 мг тРНК^ег 99% чистоты.

Сдм

ОПРЕДЕЛЕНИЕ ПЕРВИЧНОЙ СТРУКТУРЫ tPHKj Ser

Первичная структура tPHKj печени быка была расшифрована с помощью метода быстрого гель-секвенирования и микроспектрофо-тометрического метода. С целью идентификации минорных компонентов нами определен нуклеозидный состав олигонуклеотидов Tj-РНКаз-ного гидролизата тРНК^вг . Для этого использовали микроколоночный жидкостный хроматограф "Милихром". На первом этапе работы проводили фрагментацию тРНК^ег Tj-РНКазой и хроматографическое разделение олигонуклеотидов, полученных в результате гидролиза тРНК|5ег . Первичную хроматографию осуществляли на ДЭАЭ-целлюло-зе в системе Томлинсона-Тенера (Tomlinson R.V., Thener G.M., 1963 ) при pH 7,5 в 7М мочевине. Хроматографией достигалось разделение олигонуклеотидов, в основном, по их длине ( рис. 2 ). Затем изоплиты подвергали фракционированию по нуклеотидному составу в системе Томлинсона-Тенера при pH 3,7 в 7М мочевине. Ди-нуклеотиды хроматографировали на дауэксе I х 8 в градиенте соляной кислоты и хлорида натрия по ( Тукало М.А. и др., 1979 ). Ре-хроматогрфию в обращеннофазовой системе ЕРС-8 использовали для разделения самых длинных олигонуклеотидов, которые имеют близкие свойства. О гомогенности олигонуклеотидов судили по спектральным отношениям, а также относительном их количестве.

Олигонуклеотиды обессоливали, а затем для определения нук-леозидного состава проводили гидролиз олигонуклеотидов фосфоди-эстеразой змеиного яда в присутствии щелочной фосфатазы из б. coli. Нукдеозиды разделяли хроматографией на колонке с катионооб-менником А-6 в 0,02М бикарбонате аммония pH 9,8 (singhal R.P., 1972, 1974 ). Таким образом мы определили нуклеозидный состав

Рис. I. Хроматография тРНК^6*" на бензолированной ДЭАЭ-целлю-лозе в отсутствие Сорбировано 40 мг тРНК^0Г

Колонка 2 х 30 см. Смеситель: 375 мл 0,2Ы Nad, 0,01М ацетата натрия, 1мМ 2-меркаптоэтанола. Резервуар: 375 мл I,3M NaCl,' 0.0IM ацетата натрия, Ш 2-меркаптоэтанола. Спуятовый градиент - смеситель: 225 мл I,3M KaCl, 0,0IU ацетата натрия, 1мМ 2-ыеркап-тоэтанола; резервуар: 225 ил 2,ОМ HaCl, 0,01М ацетата натрия, 1мМ 2-меркаптоэтанола, 10% этанола. Скорость ЭЛК1ЦИИ 55 ил/час.

Рис. 2. Хроматография Т^-РНКазного гидролизата

на микроколонке с ДЭАЭ-целлюлозой в градиенте хлористого натрия при рН 7,5 в 7М мочевине. Сорбировано 0,4 о.е. гидролизата тРНЙ. Колонка 0,5x70 им. Скорость элщии 150 мкл/час.

олигонуклеотидов Tj-РНКазного гидролизата tPHKj ег и идентифицировали большинство минорных нуклеозидов. В составе тРНК®ег обнаружено 17 минорных компонентов, один из которых ( А*р ) еще не удалось идентифицировать. Для более полного представления о структуре олигонуклеотидов были определены их 5'-концевые нуклеозиды ( табл. I.).

Параллельно микроспектрофотометрическим исследованиям проводили секвенирование по методу Д.Питти (Peattie D.A. , 1979 ). Также для секвенирования использовали гидролиз специфическими РНКазами - Tr, U2, Phy м. Реконструкция полной первичной структуры тРНК®6 печени быка осуществлялась на основании данных по гель-секвенированию и результатов, полученных при использовании микроспектрофотометрического варианта блочного метода. При реконструкции использовали также знание обобщенной первичной

структуры тРНК (Grosjean Н. et al. , 1982 ). Длина полинуклео-Sop

тидной цепи tPHKj составляет 85 нуклеотидов. Сериновая тРНК относится ко второму классу тРНК, имеющих длинную вариабельную петлю. В составе тРНК ®ег обнаружено 17 модифицированных нуклеотидов ( рис. 3 ).

Первичная структура тРНК®ег печени быка оказалась иденден-тичной первичной структуре тРНК®ег печени крысы (Rogg н. et al., 1975 ), отличаясь в положениях 27, 43, 46 от первичной структуры тРНК|ьГ melanogaster { Cribbs D.L. et al. , 1987 ). Это свидетельствует о высокой консервативности гена данной тРНК8ег в процессе эволюции. Обнаружен ряд общих нуклеотидов при сравнении первичной структуры тРНК®ег печени быка с известными последовательностями нуклеотидов тРНКВвг эукариот (sprinzl Н. et al. , 1987 ) ( рис 3 ). Исключая нуклеотиды, участвующие в формировании третичной структуры всех тРНК, можно предположить, что остальные общие нуклеотиды для этих тРНК вовлекаются в специфическое узнавание серил-тРНК-синтетазой.

ОПРЕДЕЛЕНИЕ ОСТАТКОВ ФОСФОРНОЙ КИСЛОТЫ, УЧАСТВУЮЩИХ В ОБРАЗОВАНИИ ПРОСТРАНСТВЕННОЙ СТРУКТУРЫ тРНК®вг

При изучении взаимодействия тРНК и АРСазы необходима информация не только о первичной структуре, но и пространственной. Наиболее широкие сведения при сравнении пространственных струк-

Таблица I

Определение последовательности оснований в олигонуклеотидах полного Т^-РНКазного гидролизата тРНК^вг

Продукты гидролиза, Фракция:Олигонуклеотид:Метод расщепления:соотношения(моль/моль)

Т-1

т-г

Т-3 Т-4 Т-5

Т-б

Ст^Ор 5р

ОСхр} Юр {а^Свр

¿ар

А(Х»р

А

СаоСйр

вдэ, мэ

то яе

ВДЭ, МЭ Концевой анализ

ФДЭ. ФМЭ Т£-РНКаза Концевой анализ

А,о(1,3:1,0)

А,с,о (1,0:1,0:1,0) С,о (2,0:1,0)

Т-7 А(ш3С,0)Ср то же о (1,0:0,4:1,0:

Т-8 ШИр вдэ, шъ Концевой анализ и, с, о (1,0:1,0:1,0)

Т-9 ГОпйр

Т-Ю рор

Т-11 АЭЮр ВДЭ, ©1Э Концевой анализ А, г, о (1,0:0,8:1,0)

Т-12 С(и,ш5С,и)Ор то же и, с, о (2,0:2,0:1,0)

Т-13 т(г,с)ор то же

Т-14 С(А,С)6р то же с, А, о (2,0:0,96:1,0)

Т-15 В(В,А,А)Ор ВДЭ, Шд А, й (2,0:1,0)

Т-16 С(0,А*А,г,С, 0,А,0,ип)вр ш А,А,и,С,С, С, А,и,С,С,и, С.бр ВДЭ, змэ Концевой анализ

Т-17 ВДЭ, ФМЭ

15

Ч^о А

20

[»ом

С

С

с

Бс- с

А -и

е-С

А-и

с-с

с

асе С б'

50

^ т

С и

с

35

б-с

зоЮ'С^о

Рис. 3. Первичная структура тРНК^ег печени быка в виде клеверного листа. Обведены нуклеотиды, общие для всех известных ци-топлазматических тРНк эукариот.

тур молекул тРНК можно полуить, используя химические соединения, модифицирующие фосфаты. Кроме того, метод модификации тРНК этил-нитрозомочевиной очень прост в исполнении, высокочувствителен при использовании в варианте быстрого гель-секвенирования и позволяет получать количественные характеристики уровня модификации фосфата.

Доступность фосфатов для алкилирования этилнитро-

зомочевиной исследовал^ в условиях, обеспечивающих нативную структуру молекул, и в денатурирующих условиях. Полученные фрагменты анализировали гель-электрофорезом. В процессе обработки тРНК после модификации используется осаждение этанолом. Это приводит к неполному выделению коротких фрагментов полинуклеотидов. Поэтому получить данные о модификации фосфатов вблизи концов нуклеотидной цепи тРНК не представляется возможным ( обычно первые 7-8 фосфатов ). В положениях 17, 44 тРНК^эг содержатся остатки 2" -О-метилрибозы, которые препятствуют расщеплению соответствующих фосфотриэфиров. Это не дает возможности получить информацию о степени модификации в этих участках молекулы. Поскольку, степень модификации тРНК этилнитрозомочевиной в использованных условиях была низкой, то уровень модификации фосфатов тРНК и интенсивность соответствующих электрофоретических полос должны быть прямо связаны с реакционными способностями фосфатов в неповрежденной модификацией структуре тРНК, существующей в условиях алкилирования. Количественная обработка результатов заключалась в определении интенсивности полос с помощью сканирующего денситометра, что позволяло оценить степень расщепления по каждому из фосфатов тРНК, а следовательно и уровень модификации этих фосфатов. При алкилировании тРН^вг в денатурирующих условиях все фосфаты в ее составе реагируют с близкими скоростями, а слабые отличия в реакционных способностях различных фосфатов, наблюдаемые при этом, возможно, отражают влияние соседних оснований.

Отношение интенсивностей электрофоретических полос, соответствующих расщеплению по одноименным фосфатам тРНК ®вг, алки-лированной в условиях, стабилизирующих пространственную структуру тРНК, а также в денатурирующих условиях представлены на рис. 4. Данные величины показывают отличия в реакционной способности фосфатов в нативной тРНК и в денатурированной молекуле.

Аом С

с с

рС-С А-и

1СЧ5'0

с-с А-и С-С

С ОАССС

60

с с

л Ч 4 « чг • • • • «

Ст асС^9 е г СиССС с" ¿С С, п^С'» Т

Чисс

'»А

20

А-и С"Ак

&С <7СС" )о С-С« . А*-•Л А О А*

и

о1^

с

с

14

№ 1

Рис. 4. (А) Структура тРНК? в виде клеверного листа. Треугольникам*.! обозначены фосфаты с низким уровнем модификации в условиях, стабилизирующих нативную структуру молекулы. (Б) Относительные реакционные способности фосфатов тРНК^,Р/И- отношение ин-тенсивностей соответствующих электрофрретических полос электрофоре грамм опытов по алкилированию тРЙК в условиях, стабилизирующих нативную структуру молекулы и в денатурирующих условиях. Ры - номера фосфатов.

Известно, что основной причиной снижения реакционной способности фосфатов в составе тРНК является их пространственное экранирование от реагента, которое происходит за счет их участия во взаимодействиях, формирующих третичную структуру тРНК. Проанализировав кривую расчета денситограмм, было определено, что при алкилировании тРНК®61' этилнитрозомочевиной в условиях, когда полимер имеет натизную структуру, низкий уровень модификации имеют следующие фосфаты: 8, 9, II, 21, 47 й, 47 I, 49, 56, 58, 59. На рис. 4 представлено расположение этих фосфатов в структуре тРНК|вг . Из результатов исследования алкилирования различных тРНК с помощью этилнитрозомочевины ( Власов В.В., 1982; Пет-рушенхо З.М. и др., 1986 ) и наших данных видно, что во всех тРНК низкий уровень модификации имеют фосфаты 8, 9, 18, 58, 59. А это свидетельствует о возможной их общей роли в организации макроструктуры молекулы. Полученные нами результаты в сравнении с литературными данными об участии фосфатов в формировании пространственной структуры тРНК (1П.азаотг У.У. et а1. , 1981 ) показывают, что фосфаты 8, 9, 18, 21, 58, 59 взаимодействуют с ионами Мв2+, стабилизирующими третичную структуру тРНК.

Об универсальном месте связывания иона магния в антикодоно-вой петле тРНК свидетельствует наблюдавшееся уменьшение реакционной способности фосфата в положении 36 тРНК^ег . А фосфаты в положениях 47 3, 47 I и 49 являются, по-видимому, основными структурными элементами молекулы тРНК®ег , поддерживающими определенное положение длинной вариабельной ветви.

Таким образом, наши и данные литературы ( Петрушенко З.М. и др., 1986; УХавдот У.тг. et а1., 1981 ) указывают на общность укладки рибозофосфатного остова тРНК®ег и тРНК^^ с длинной дополнительной петлей и остова тРНК, имеющих короткую вариабельную петлю. Различия же касаются структуры вариабельной ветви, экспонированной в раствор и образующей дополнительные третичные взаимодействия.

УЧАСТКИ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ тРНК®ег С СЕРИЛ-тРНК-ШГГЕТАЗОЙ

Участки контакта тРНК®61" печени быка и серил-тРНК-синтета-зы изучали методом химической модификации этилнитрозомочевиной, как описано в предыдущем разделе. На р'*с. 5 представлены результаты эксперимента по алкилированию 3'-меченой тРНК®вг в присут-

*

он

С С С

рСС А<1 1СЧ» С-С А-О С-С ■ С-С

о илссс с ,сисйй

____ тс » Т

°ОдА тС

10 А-№СГ А/

«Ь А/Ч^б-

«« ! )оС'С*о уОК

тС А и А* С и

С

и

V

.вес.

алл

'А

С

с

ю 20 ^ ц т ?1 р.

Рис. 5. (А) Структура тРНК^"г в виде клеверного листа. Стрелками обозначены фосфаты, которые защищаются серил-тРНК-синтетазой от алкилирования этилнитрозомочевиной. (Б) Относительные реакционные способности фосфатов свободной тРИК^"" и в присутствии серил^тРНК-синтетазы. Н - отношение интенсивностей соответствующих злектрофоретических полос электрофореграмм опытов по алкили-рованию тРИК в присутствии серил-тРНК-синтетазы и свободной тРНК в условиях, стабилизирующих нативную структуру молекулы. Рм -номера фосфатов.

ствии серил-тРНК-синтетазы. Полученные данные показывают, что серил-тРНК-синтетаза наиболее эффективно защищает от алкилирова-ния фосфаты о-стебля в 12, 13 положениях, а также V -ветви в 45 - 47, 47 6^47 Н позициях тРНК^ . В то же время область ан~ тикодона тРНК^ не защищается гомологичной АРСазой от алкили-рования этилнитрозомочевиной. Расположение фосфатов тРНК®вг , защищенных серил-тРНК-синтетазой от модификации этилнитрозомочевиной, представлено на рис. 5.

В отделе структуры и функции нуклеиновых кислот ИМБиГ АН УССР параллельно изучались участки контакта тРНК®ег и серил-тРНК-синтетазы с помощью гидролиза нуклеазами Тр РЬу М, СЬ-З, Р| ( Тика1о М.Х. вt а1. , 1988 ). Экспериментальные данные гидролиза нуклеазами тРН^вг в присутствии серил-тРНК-синтетазы подтверждают наши результаты, свидетельствующие, что одним из участков контакта тРНК^ с синтетазой является вариабельная ветвь, а также то, что антикодон тРНК^ег не контактирует с АРСазой.

вывода

1. Разработан метод получения индивидуальной тРН$[0Г печени быка с использованием двухстадийной хроматографии на БД-целлюлозе и проведена характеристика препарата тРНК^ег .

2. Установлена первичная структура тРНК^вг печени быка

а/ определен нуклеозидный состав олигонуклеотидов Т|-РНКаэ-ного гидролизата тРКК^ег и идентифицированы минорные компоненты с помощью микроспектрофотометрического варианта блочного метода;

б/ определена нуклеотидная последовательность тРНК|вг методом гель-секвенирования;

в/ проведена полная реконструкция первичной структуры тРНК^вг

на основании данных по гель-секвенированию и микроспектрофото-метрии.

3. С помощью алкилирования этилнитрозомочевиной определены фосфаты, участвующие в поддержании третичной структуры тРНК®0Г , в положениях: 8, 9, II, 21, 47 й, 47 I, 49, 56, 58, 59.

4. Методом химической модификации тРНК®ег этилнитрозомочевиной с предварительной защитой тРНК®ег гомологичной синтетазой установлено, что фермент защищает от модификации елкилирующим

реагентом участки d -стебля в положениях 12, 13 и вариабельной ветви в позициях 45 - 47, 47 <3, 47 Н тРНК|ег . Полученные результаты с высокой степенью вероятности свидетельствуют о том, что указанные последовательности могут быть участками контакта тРНК^ег и гомологичной синтетазы.

СПИСОК

основных работ, опубликованных по теме диссертации

1. тРНК з довгою вар1абельною петлею: структура та взаемод1я з ам1ноацил-тРНК-синтетазою/ М.А.Тукало, З.М.Петрушенко, I.A. Крикливий, Л.Г.Калачнюк I 1н.// У Укра1нськ. Б1ох1м.з'1зд (1вано-Франк1вськ, вересень, 1987р.):Тез.доп.-Ки1в,1987.-C.I60.

2. tKNA with long variable loop. Structure and interaction with aminoacyl-tENA synthetase/ M.A.Tukalo, Z.M.Petrushenko,

I.A.Krikliviy, L.G.Kalachnyuk et al.// 12th International tEHA Work-shop: Abstracts.-Umea-Sweeden,1987.-Ill-B-29.

3. Калачнюк Л.Г., Козак Л.А., Тукало М.А., Мацука Г.Х. Выделение и характеристика препарата индивидуальной изоакцептор-ной tPHKj р из печени быка// Биополимеры и клетка.-1987.-3,№5.-С.£74-276.

A*. Interaction between tBNA with 1опк.variable loop and amino-acyl-tHNA synthetase/ G.Kh.Matsuka, M.A.Tukalo, Z.M.Petrushenko. I.A.Krikliviv. L.G.ZIc.iachr7'.3!: et al.// ^crocolcculea la the iuaiiicaiaii call/ by С.£.itсi.-i;о, 19.-P..

5. The different styles of interaction long extra loop fiNAs wi^h aminoacyl-tENA synthetase/ G.Kh.Matsuka, M.A.Tukalo, Z.M.Petrushenko, I.A.Krikliviy, O.T.Rozchko, L.G.Kalachnyuk et al.// Base Physico-Chimique de la vie "Colloque Franco-Bovietique en Perigord"»France: Abstracts.-,Perigord,1988.-P.13.

6. Structure and interaction of tRNASer and seryl-tHMA synthetase from bovine liver/ M.A.Tukalo, L.G.Kalachnyuk, O.I.Gud-aera et al.// Base Physico-Chimique de la vie "Colloque Sranco-Sovietique en Perigord",Frances Abstracts.-Perigord, 1988.-P.12.

7. Pecularities of interaction between tHNAs with long variable loop and aminoacyl-tRNA synthetases/ G.Kh.Matsuka, M.A.Tuka-

lo, Z.M.Petrushenko, I.A.Krikliviy, O.T.Rozchlco, L.G.Kalach-nyuk et al.// 14th International Congr. of Biochemistry: Abstracts.- Prague,Czechoslovakia,1988..157.

8. Serine transfer HHA and seryl-tHNA synthetase from bovine liver: purification, structure and interaction/ M.A.Iukalo, L.G.Kalachnyuk, O.I.Gudzera et el.// 14th International Congr. of Biochemistry: Abstracts.-Prague,Czechoslovakia,1988.

455.-P.157.

9. Study on interaction of tHNA with aminoacyl-tRNA synthetase. Peculiarities of tHNA with long variabllable loop/ G.Kh.Ma-tsuka, M.A.Tukalo, Z.M.Petrushenko, I.A.Krikliviy, O.T.Hoz-chko, L.G.Kalachnyuk et al.// VI Symp. OBSH-Italy."Macromo-lecules in the functioning cell"(Leningrad,USSR,June,1988):* Book of Abstracts.-Leningrad,1988.-P.96.

10. Калачник Л.Г., Гришок А.А., Гудэера О.И., Тукало M.A. Серино-вая тРНК печени быка. Структура и взаимодействие с серил-тРНК-синтетазой// 5-ая Конференция молодых ученых социалист, стран по биоорганической химии (Пущино,август,1988): Тез.

ДОКЛ.-ПуЩИ"« TQRfi _Л CK-QA

БФ - 23031 Зак.970 Формат 60x84/16. Уч.-изд.л. 1,0

Подписано к печати 26.10.1988 г. Тираж 100_ •

Полиграфический участок Института теоретической физики АН УССР