Структура нуклеосом и организация 30-нм фибриллы хроматина

Бавыкин, Сергей Георгиевич

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Структура нуклеосом и организация 30-нм фибриллы хроматина
ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Структура нуклеосом и организация 30-нм фибриллы хроматина"

V-- г« .'. ;

из и «■

институт молекулярной биологии в.а.энгелыардта российской академии наук

На правах рукописи

УДК 576.36.3

БАВЫКИН Сергей Георгиевич

СТРУКТУРА НУКЛЕОСОМ И ОРГАНИЗАЦИЯ 30-нм ФИБРИЛЛЫ ХРОМАТИНА

03.00.03-Молекулярная биология

ДИССЕРТАЦИЯ

на соискание ученой степени доктора биологических наук в форме научного доклада

Москва-1992

Г'аОо I л выполнена в Лаборатории молекулярной организации хромосом Института молекулярной биологии имени

В.А.Эигельгардта РАН

(чаи. лабораторией - академик РАН А.Д.Мирзабеков )

0ФИ111:\ЛЫШЕ 011П0НЫ1ГЫ:

академик РАМИ

доктор биожчических наук, профессор, И.Б.Збарский члеи-корреспоидент РАН

доктор химических наук, профессор, А.А.Богданов доктор химических наук, профессор, Э.И.Будовский

ВИЛУИН Я ОРГАНИЗАЦИЯ - Институт общей генетики РАН

Зашша состой гея 1992г. в/^ часов на

заседании Сиашилчзироваиного совета Д.002.79.01 при Институте молекулярной биоюти им. Ii. А. Эн гельгардта РАН по адресу: 11~1>М, Москва Н-334, ул.Вавилова 32.

С лиссертаннеи можно ознакомиться в библиотеке Института молекулярной биологии им. В.А.Экгельгардта РАН.

Автореферат puioслан "l(j -/t&J^/Ji 1992г

Учений секретарь специализированного совета кандидат химических наук

рицын

Актуальность проблемы и общая характеристика работы.

Хроматин, носитель генетической информации всех живых клеток, представляющий собой динамичный комплекс нуклеиновых кислот и белков, с глубокой структурной иерархией, является одним из основных компонентов всех эукариотических ядер. Структурные исследования хроматина значительно продвинулись вперед за последние полтора десятилетия. Открытие в 1973 году нуклеосом -фундаментальных субъединиц хроматина, содержащих ДНК длиной от 160 до 240 пар нуклеотидов (п.н.), одну молекулу гистона HI (или его аналога) и по две молекулы каждого из четырех гистонов Н2А, Н2В, НЗ и Н4, стимулировало лавинообразное количество исследований первых двух уровней упаковки ДНК в ядрах - нуклеосом и 30-нм фибрилл. Используя сведения, полученные методами

рентгеноструктурного анализа, белок-белковых сшивок и определения первичной организации ДНК-белковых комплексов (распределение контактов белков вдоль нити ДНК), были созданы структурная модель нуклеосомного кора (в русской литературе синонимом является термин "минимальная нуклеосома"), представляющего собой комплекс четырех пар гистонов кора и ДНК длиной 145 п.н. (Richmond et al. 1984) и модель его белковой основы - октамера гистонов (Arents et al. 1991). За последние пятнадцать лет было предложено также около двух десятков моделей 30-нм фибриллы - второго уровня упаковки ДНК в ядрах. Однако, в отличие от модели нуклеосомного кора, ни одна из предложенных моделей не может рассматриваться как доказанная. Вместе с тем, даже эти относительно хорошо в структурном отношении изученные компоненты хроматина до настоящего времени в значительной степени продолжают напоминать китайскую головоломку -их внутреннее устройство и способность к пространственным преобразованиям остается для нас скрытой. Кроме того, в последнее время произошла значительная переориентация структурных исследований хроматина на их функциональные аспекты. На первый план вышли такие вопросы как конформационные изменения нуклеосом и 30-нм фибрилл при транскрипции и репликации, наличие и расположение нуклеосом в функционально значимых участках ДНК, их взаимодействие с регуляторными белками и влияние различных уровней организации хроматина на процессы матричного синтеза (Wolffe, 1990; Grunstein, 1990).

Цель и задачи исследования.

Основной целью данной работы было разностороннее изучение сходств и различий структуры, конформационных возможностей и изменений первых двух уровней организации хроматина (нуклеосом и 30-нм фибрилл), находящихся в разных конформационных состояниях в составе модельных систем или в разных функциональных состояниях в ядрах клеток эукариот. Необходимо было выяснить до какой степени структура нуклеосом и 30-нм фибрилл является универсальной для представителей далеких таксономических единиц эукариот и какую роль в их организации играют варианты гистонов. С другой стороны, необходимо было решить вопрос о том, насколько сильно различается структура нуклеосом транскрипционно или репликационно активных и репрессированных ядер. Кроме того, в работе ставилась задача изучения нуклеосом в плане возможных изменений их структуры в процессах матричного синтеза. Необходимо было также разобраться в деталях организации 30-нм фибриллы и постараться объяснить механизмы ее структурно-функциональных изменений.

Научная новизна и практическая ценность работы.

В основу работы положен оригинальный метод изучения ДНК-белковых взаимодействий в составе хроматина с помощью индуцируемых диметилсульфатом (ДМС) ДНК-гистоновых сшивок, приоритет разработки которого принадлежит диссертанту и его соавторам. С помощью этого метода - определения первичной организации ДНК-белковых комплексов - с большой точностью были локализованы контакты всех пяти гистонов с ДНК в составе нуклеосом относительно 5'-конца нуклеосомной ДНК. С помощью этого метода впервые были получены прямые данные, подтвердившие выдвинутую ранее на основе косвенных результатов гипотезу, об универсальности строения нуклеосомного кора всех трех высших царств эукариот (Животные, Растения и Грибы) и была предложена модель автономного расположения контактов тетрамера гистонов (НЗ,Н4)2 и двух димеров (Н2А,Н2В) на ДНК нуклеосомного кора. Кроме того, впервые было показано, что полная инактивация хроматина не сказывается существенным образом на первичной организации нуклеосомного кора.

Применение данного метода позволило изучить тонкие изменения ДНК-гистоновых контактов в модельных экспериментах по исследованию структуры нуклеосом в растворах с различной ионной силой. В

минимальных нуклеосомах был обнаружен ряд конформационных переходов и впервые показано, что взаимодействие отдельных участков гистонов с ДНК может быть нарушено без заметного изменения структуры нуклеосомного кора в других его областях. Важным моментом является то, что ряд структурных изменений, обнаруженных в модельных экспериментах, был зарегестрирован и в составе хроматина, где соответствующие конформационные переходы наблюдались, в частности, при декомпактизации 30-нм фибриллы. Кроме того, был предложен механизм стабилизации частиц, образующихся из нуклеосомного кора в результате диссоциации из него гистонов Н2А и Н2В.

Методом определения первичной организации иуклеосом было выявлено перераспределение гистона Н1 во время процессов конденсации-деконденсации 30-нм фибриллы хроматина. В сочетании с нуклеазными тестами, этот метод позволил показать, что межнуклеосомная ДНК в компактизованном хроматине

суперспирализована. В результате диссертантом была предложена оригинальная модель процессов, происходящих во время конденсации 30-нм фибриллы.

Апробация работы.

Представленные в диссертации результаты были доложены на различных Всесоюзных и Международных симпозиумах и конференциях, в том числе: на 47-ом симпозиуме по структуре хроматина (Колд Спринг Харбор, США, 1982); 14-ом Международном конгрессе по биохимии (Прага, Чехословакия, 1988); конференции "Структура хромосомы и экспрессия" (Колд Спринг Харбор, США, 1985); 4-ом и 5-ом двусторонних симпозиумах СССР-ФРГ "Структура и транскрипция генома" (Ереван 1981; Кельн, ФРГ, 1983); б-м и 8-ом двусторонних симпозиумах СССР-Франция "Структура и функция белков и нуклеиновых кислот" (Цхалтубо, 1982; Москва, 1986); 7-ом Всесоюзном симпозиуме "Структура и функция клеточного ядра" (Пущино, 1984); 16-ой конференции ФЕБО (Москва, 1984); 5-ом симпозиуме "Структура и фукнкция хроматина " (Варна, Болгария, 1984); 5-ом Всесоюзном биохимическом съезде (Киев, 1986).

Структура работы.

Диссертация изложена в настоящей брошюре в форме научного доклада. Основная часть результатов получена диссертантом в

соавторстве с С.И.Усаченко. В ряде экспериментов принимали участие А.В.Белявский, И.М.Гавин, В.В.Заец, А.О.Заленский, И.А.Заленская, В.Л.Карпов, А.И.Лишанская, О.В.Преображенская, А.А.Строков, И.М.Ундрицов, В.В.Шик. Автор приносит благодарность всем коллегам за помощь в проведении экспериментов и обсуждение. Автор также выражает признательность академику А.Д.Мирзабекову за постоянный интерес и обсуждение работы.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. Универсальность структуры минимальных нуклеосом.

1.1.Первичная организация минимальных нуклеосом активных и репрессированных ядер.

Несмотря на постоянный состав нуклеосомного кора и высокую консервативность гистонов во всех исследованных эукариотических клетках, минимальные нуклеосомы представляют собой гетерогенную популяцию частиц, различающихся по содержанию гистоновых вариантов, негистоновых белков, степени и характеру модификации гистонов. Эти различия отражаются в физико-химических свойствах минимальных нуклеосом, выделенных, например, на различных стадиях развития морского ежа из его спермиев и эмбрионов (Simpson к Bergman, 1980; Simpson, 1981). Предполагается, что гетерогенность минимальных нуклеосом зависит от функционального состояния хроматина. Особый интерес в связи с этим представляет изучение влияния транскрипции на структуру хроматина и нуктеосом, а также возможности регуляции транскрипции на этом уровне. Ранее было показано, что нуклеосомы обнаруживаются в неактивных и умеренно транскрибируемых, но отсутствуют в активно транскрибируемых участках хроматина рибосомальных генов. Возможны два разных, но не исключающих друг друга объяснения последнего: при активной транскрипции происходит или удаление гистонов с ДНК, или возникают существенные изменения структуры нуклеосом, например их разворачивание (Cartwright et a i. , 1982). Ряд недавно полученных данных свидетельствует в пользу первого предположения (van Holde et al., 1992; Morse, 1992; Freeman & Garrard, 1992).

С другой стороны, нуклеосомы активного хроматина характеризуются некоторыми особенностями, предполагающими их структурные изменения. В частности, они быстрее расщепляются ДНКазой I, могут содержать повышенное количество белка убихитина,

ковалентно связанного с гистоном Н2А, проявляют повышенное сродство к негистоновым белкам HMG 14/17 и к РНК-полимеразе II, а также содержат гистоны, отличающиеся повышенной степенью ацетилирования (Reevs, 1984; Bradbury, 1991; Baldwin, 1992). Минимальные нуклеосомы в составе активно транскрибируемых рибосомных генов Physaruni polycephalum характеризуются повьшенной доступностью цистеиновых остатков в гистоне НЗ и выглядят на электронных микрофотографиях как развернутые двойные частицы (Prior, et al., 1983; van Holde et al., 1992).

Важную роль играют нуклеосомы и в регуляторных процессах. Высокое сродство нуклеосом к определенным последовательностям ДНК показано в многочисленных исследованиях, проведенных в последние годы (Stepafе1 bach et al., 1992). Показано, что связывание нуклеосом регулирует функционирование (З-глобинового промотора (Benezra et al., 1986), промотора гена РН05 (Grunstein, 1990) и некоторых других генов (Felsenfeld, 1992).

Хорошо известно, что нуклеосомы репрессируют транскрипцию как ¡л vitro так и in vivo. Этот процесс регулируется сложной иерархией взаимодействий между комплексами специфических белков, обеспечивающими инициацию или элонгацию транскрипции, и нуклеосомами, расположенными в регуляторных участках гена или в его кодирующей части (Pederson & Simpson, 1988; Wolffe, 1990; Bradbury, 1991; Kornberg & Lorch, 1991; Wolffe 1991; Felsenfeld, 1992; Freeman к Garrard 1992; Hayes & Wolffe, 1992). В процесс регуляции активности генов могут быть вовлечены не только нуклеосомы как целое, но и отдельные гистоны. Так например, в настоящее время показано, что N-конец гистона Н4 участвует в процессах как активации так и репрессии ряда генов дрожжей путем прямого взаимодействия со специфическими белками (Grunstein 1990; Felsenfeld, 1992), а ингибирующий эффект гистона HI на процесс транскрипции может быть усилен тремя специфическими белками, связывающимися с ДНК рядом с промотором (Croston et al., 1991).

Участие ДНК в процессах транскрипции и репликации требует в первую очередь нарушения ДНК-гистоновых взаимодействий в месте считывания ДНК и, следовательно, может вызывать изменения в первичной организации нуклеосом. Однако, до сих пор степень этих изменений остается неизвестной. В этой связи выяснение различий в первичной организации нуклеосом активного и репрессированного хроматина представляет собой значительный интерес.

Для выяснения влияния уровня активности хроматина на структуру нуклеосом и суперструктуру хроматина проводилось

сравнение первичной организации минимальных нуклеосом полностью репрессированного хроматина спермиев морского ежа и эритроцитов цыпленка с первичной организацией нуклеосомного кора активных в транскрипции и репликации ядер эмбрионов дрозофилы, дрожжей и чашелистиков лилии.

Н2В.

ННЗ тшт -пп

__ ^^ Н2В Рис.1. Электрофоретчческое

Н2А «■■» Н2А разделение гистонов

На —• ^и» и минимальных нуклеосом спермиев

морского ежа (а), эритроцитов цыпленка (Ь) и дрожжей (с) в 15% полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия.

В хроматине спермиев морского ежа, характеризующегося максимальной известной длиной нуклеосомного повтора ( 240 п.н. ) (Romberg et a I., 1977 ), гистон Н2В представлен особыми вариантами. Они содержат удлиненную N-концевую область с дополнительным кластером основных аминокислот, содержащим 4-5 лизиновых и несколько аргининовых остатков (Strickland et al., 1978). Гистон Н2А спермиев морского ежа, в свою очередь, также несколько отличается от гистонов Н2А других организмов (Strickland et al., 1980), в то время как отличия в НЗ и Н4 незначительны (Isenberg, 1979).

В хроматине эритроцитов цыпленка дополнительно присутствует аналог гистона HI - гистон Н5. В то же время в дрожжевом хроматине гистон HI, по крайней мере в значительных количествах, не обнаружен. В хроматине эритроцитов цыпленка, эмбрионов дрозофилы и дрожжей длина нуклеосомного повтора составляет 210, 180 и 165 п.н., соответственно (Romberg, 1977), а первичная структура их гистонов практически не имеет особенностей (Wu et al., 1986).

Нуклеосомный кор растительных клеток, также как и минимальные нуклеосомы выделенные из ядер других эукариот содержат по две молекулы гистонов кора и ДНК длиной около 145 п.н. Гистоны НЗ и Н4 растений по своей первичной структуре и электрофоретической подвижности мало отличаются от соответствующих гистонов из других источников. Напротив, гистоны Н2А и Н2В растений представлены обычно значительным количестом субфракций, которые, как правило, имеют большую молекулярную массу и сниженную электрофоретическую

подвижность в присутствии додецнлсульфата натрия по сравнению с соответствующими гистонами животных (рис. 2), что определяется,

И.» mm Н.

а Ь с

Рис 2. Двумерный электрофорез гистонов ядер лилии (о). Первое направление проводили в кислой системе в присутствии Triton Х-100; второе - в системе Лэмли. В качестве маркера во втором направлении использовали

гистоны нуклеосомного кора лилии (а) и печени крысы (с).

в основном, наличием дополнительных вставок в М-концевых частях молекул (8р1кег, 1985).

Для изучения первичной организации нуклеосом, в условиях близких к нативным, сшивку гистонов с ДНК в составе хроматина спермиев морского ежа, чашелистиков лилии и дрожжей проводили непосредственно в ядрах. После этого хроматин расщепляли микрококковой нуклеазой и выделяли сшитые нуклеосомы либо при помощи электрофореза в полиакриламидном геле (в случае морского ежа) согласно методу, разработанному в лаборатории Георгиева (УагБЬаУвку е1 а I. , 1976), либо центрифугированием в градиенте сахарозы (в случае дрожжей). Параллельно, для выяснения влияния процесса выделения нуклеосом на их структуру, проводили сшивку минимальных нуклеосом, выделенных из ядер эритроцитов цыпленка, содержащих, как известно, высоко репрессированный хроматин, а также частиц, выделенных из активных ядер эмбрионов дрозофилы.

Представленные в настоящей работе данные отличаются высоким разрешением. Это достигнуто в первую очередь благодаря использованию нуклеосом спермиев морского ежа, для которых удалось полностью разделить все четыре диагонали фрагментов ДНК, пришитых к четырем гистонам кора. Кроме того, удаление свободной ДНК из пришитого материала на оксиапатите, подбор оптимальных

Рис.3. Авторадиограмма двумерного электрофоретического разделения в полиакриламидном геле в денатурирующих условиях (в системе Лэмли

с мочевиной) меченых Р фрагментов ДИК, сшитых с гистонами в составе минимальных нуклеосом . Комплексы гистонов с ДНК в первом направлении и ДНК во втором фракционируются в соответствии с их молекулярным весом. Гистоны после первого направления расщепляются проназой прямо в геле. Пунктирные линии - положение в геле, а цифры - размер маркерных фрагментов ДНК в нуклеотидах (нк), для простоты округленный до десятков. Положение меченых фрагментов ДНК, сшивающихся с гистонами Н2А, Н2В, ИЗ, Н4 и образующих отдельные диагонали, умазано сплошными линиями. Крайняя правая диагональ содержит фрагменты свободной, не сшитой с гистонами ДНК, картинка слева - кратковременная экспозиция верхней части геля.

концентраций акриламида для каждого случая, использование длинных гелей, понижение силы тока при электрофорезе и другие методические усовершенствования обеспечили получение высококачественных картин двумерных гелей.

Данные о расположении гистонов на ДНК, суммирующие результаты, полученные при двумерных электрофоретических разделениях (рис.3-6), с указанием относительной интенсивности пятен на гелях, представлены: на рис. 7, А - для минимальных нуклеосом эритроцитов цыпленка, эмбрионов дрозофилы и дрожжей, на рис. 7,В - для нуклеосом морского ежа, а на рис.7,С - для нуклеосом чашелистиков лилии.

В данной работе впервые удалось полностью определить положение близких участков связывания гистонов Н2А и Н2В в области 110-130 нуклеотидов и гистонов Н2А и НЗ в области 130-145 нуклеотидов от 5'-конца нуклеосомной ДНК. Ранее установленные участки сшивки (Shick et al. , 1980) были дополнены новыми, часто очень слабыми контактами гистонов Н2А, Н2В и НЗ. Была обнаружена хорошая корреляция слабой сшивки гистона Н4 с участком

'<3 «а»»

■'МО^'дГ ЛН ^ 25

НН-;-1-1-1Н2В

№\-»-1-1

.1 • г зь

Ц4 1-1—I Н4 н_)—м

НН 65 55 98 80 65 ^ ^

Б ШНЬь. А г

Н4 1-1-1-

/-¿-4---1---ЧЛ-\Н2В

П5 105 95 <935 25

Рис.4. Авторадиограмма двумерного электрофаретического разделения

(подробнее см. рис.3) меченых гистонов сшитых с ДНК в составе

минимальных нуклеосом эмбрионов дрозофилы (А), дрожжей (Б) и эритроцитов цыпленка (В и Г). После первого направления ДНК в геле расщепляется по Картону., цифры указывают длину■ фрагментов ДНК, сшивающихся с соответствующими гистонами. Крайнее положение справа занимают непришитые гистоны. Г - длительная экспозиция геля В.

Н4(45,78), т.е. в области 45-го и 78-го нуклеотидов от 5'-конца нуклеосомной ДНК (рис.7), с загрязнением минимальных нуклеосом субнуклеосомами, содержащими ДНК длиной около 135 нуклеотидов. В высокоочшценных препаратах минимальных нуклеосом, не содержащих таких примесей, пятна Н4(45,78) на двумерных гелях не наблюдаются (рис.4,5). Очевидно, участки сшивки Н4(45,78) в субнуклеосомах соответствуют участкам Н4(55,88) нуклеосомного кора. Очень слабое пятно Н4(145) (рис.3,6,7В,С) может возникать в результате неполного расщепления нуклеосомной ДНК при пришивке гистона или появляться благодаря одновременному взаимодействию этого гистона с участками Н4(145) и Н4(65), расположенными рядом на соседних витке суперспирали ДНК нуклеосомного кора (см. ниже рис.11).

Необходимо отметить особенности хроматина объектов, изученных

\шТ ТУНГ ,

^^-^Н2В 1

* • *

Н2А I—I-1-1

Ю 118 ?Ь -<г'

Рис.5. Авторадиограмма двумерного электрофоретического разделения 32

меченых Р фрагментов ДНК, сшитых с гистонами в составе минимальных нуклеосом эритроцитов цыпленка (А). Условия форе за и обозначения см. рис.3. В - длительная экспозиция нижней части геля.

в настоящей работе. Нами было установлено, что нуклеосомный кор активно делящихся клеток чашелистиков лилии (царство Растения) содержит 5 субфракций гистона Н2В и более десяти вариантов гистона Н2А, в то время как гистоны НЗ и Н4 представлены одной субфракцией каждый (рис.2). Все фракции гистонов Н2А и Н2В, кроме

о.дной ,,, ,(РИС .,2а,,Ь.)„.....имеют значительно большую ■ массу, чем

соответствующие гистоны печени крысы (рис.2с), что вероятно и

Рис.б. Авторадиограмма двумерного электрофоретического разделения

меченых Р фрагментов ДНК, сшитых с гистонами в составе минимальных ну.клеосом чашелистиков лилии. Условия фореза и обозначения см. рис.3.

Рис.7. Первичная организация гистонов на однонитчатой ДНК в минимальной нуклеосоме. Положение участков сшивки показано для нукмеосомного кора, сшитого после выделения из эритроцитов цыплят, эмбрионов дрозофилы или в составе ядер дрожжей (А), ядер спермиев морского ежа (В) или ядер чашелистиков лилии (С). Интенсивность сшивки показана черными и светлыми прямоугольниками, непрерывной и пунктирной линиями в порядке убывания в 3-5 раз при переходе от одного обозначения к другому.. Цифры указывают расстояние от 5'конца ДНК кора нуклеосомы в нк.

определяет сниженную подвижность минимальных нуклеосом этих клеток при элбктрофоретическом фракционировании (Bavykin et al., 1988). Минимальные нуклеосомы спермиев морского ежа характеризуются повышенной эффективностью защиты участков, расположенных на расстоянии 20, 40 и 50 нк от 5'-конца нуклеосомной ДНК от действия ДНКазы I, а также повышенной термостабильностью (Simpson, Bergman, 1980). В то время как минимальные нуклеосомы спермиев морского ежа являются более стабильными, чем частицы эритроцитов цыпленка (Simpson, Bergman, 1980), согласно данньм по плавлению и круговому дихроизму, минимальные нуклеосомы дрожжей обладают относительно более релаксированной структурой (Lee et al., 1982).

Несмотря на указанные особенности, нами не было выявлено никакой существенной разницы в первичной организации нуклеосом, полученных из клеток организмов принадлежащих царствам Животные (спермин морского ежа (рис.7,В), эмбрионы дрозофилы, эритроциты цыпленка (рис.7,А), клетки печени крысы и асцитной карциномы Эрлиха мышей (не показано)), Растения (чашелистики лилии (рис. 7,С)) и Грибы (дрожжи (рис. 7А)), за исключением обнаруженного участка сшивки Н2В(58) в минимальных нуклеосомах спермиев морского ежа, образованного по всей вероятности контактами дополнительного сегмента N-концевой области спермального варианта гистона Н2В, что вероятно и объясняет повышенную стабильность таких нуклеосом.

Полученные данные являются первым прямым доказательством высокой эволюционной консервативности и универсальности структуры

минимальных нуклеосом эукариот, которое было предсказано ранее на основании косвенных данных (Kornberg, 1977).

В ядрах спермиев морского ежа и эритроцитов цыпленка хроматин полностью находится в репрессированном состоянии, не участвуя ни в репликации, ни в транскрипции. С другой стороны, ядра клеток чашелистиков лилии, эмбрионов дрозофилы и, в еще большей степени, дрожжей активно вовлечены в эти процессы, благодаря чему все минимальные нуклеосомы проходят через стадию репликации и часть из них входит в состав транскрибируемого хроматина. Однако трудно количественно оценить долю нуклеосом, участвующих в транскрипции. В дрожжах в логарифмической фазе роста транскрибируется по меньшей мере 40% генома (Hereford & Rosbash, 1977), весь хроматин доступен для дейтсвия ДНКазы 1 и фракционируется как активный хроматин (Lohr & Hereford, 1979). На этом основании можно полагать, что существенная часть выделенных нуклеосом дрожжей представляет собой активную фракцию хроматина. Поэтому отсутствие значительных отличий в первичной организации нуклеосом, выделенных из репрессированных и активных ядер, указывает на то, что полная инактивация хроматина не сказывается заметным образом на последовательности расположения гистонов на нуклеосомной ДНК.

1.2 Сравнение первичной организации реконструированных и выделенных из хроматина минимальных нуклеосом.

Многочисленные способы реконструкции нуклеосом из гистонов Н2А, Н2В, НЗ и Н4 и ДНК (McGhee & Felsenfeld, 1980), синтетических полинуклеотидов (Simpson & Kunzler, 1979; Rhodes, 1979; Kunkel к Martinson, 1981) или специфических последовательностей ДНК (Kornberg, 1981; Zachau & Igo-Kemenes, 1981; Wasylyk et al., 1979; Chao et al., 1979; Wittig к Wittig, 1982; Simpson & Stafford, 1983; Ramsay et al., 1984) дают частицы, соответствующие по своим свойствам минимальным нуклеосомам (McGhee & Felsenfeld, 1980). Реконструкция нуклеосом в растворе непосредственно из ДНК и гистонов происходит с высокой эффективностью как при диализе из растворов с высокой концентрацией соли и мочевины, так и при быстром смешивании компонентов в растворах с физиологической ионной силой (Ruiz-Carri 1 lo et al., 1979), особенно в присутствии полианионов (Stein et al., 1979).

Первичную организацию реконструированных минимальных нулеосом изучали на частицах, полученных реконструкцией предварительно реассоциированного октамера гистонов либо на ДНК нуклеосомного

Рис.8. Авторадиограмма двумерного электрофоретического разделения

меченых фрагментов ДНК, сшитых с гистонами в составе

реконструированных минимальных нуклеосом. Нуклеосомы

реконструировали: на ДНК. длиной 146 - (а) или 2-3 т.п.н. - (Ъ,с) Сшивку проводили до (с) или после (Ъ) гидролиза микрококковой нуклеазой реконструированного хроматина, (за) - гель (а) после длительной экспозиции. Условия форе за и обозначения см. рис.3.

кора, (способ 1), либо на ДНК длиной 2-3 т.п.н. (способы 2 и 3) (рис. 8). При этом одну часть реконструированного комплекса гидролизовали микрококковой нуклеазой для получения нуклеосом до (способ 2), а другую - после (способ 3) сшивки в нем гистонов с ДНК. В качестве источника гистонов и ДНК использовали эритроциты цыплят.

Расположение практически всех участков сшивки гистонов с ДНК оказалось одинаковым у частиц, реконструированных указанными способами (рис.9а,Ь,с), и совпало с первичной организацией минимальных нуклеосом, выделенных из изолированного хроматина или

игл HIB Hl H«

нчд — ь Рис.9. Первичная организация

нзв - - ■ >-■■-- гистонов на одной нити ДНК

нэ ------------m минимальных нуклеосом,

н*. _— — m _____________реконструированных на ДНК

о зо ш ьо во юо 110 МО длиной 146п. н. (а), 2-Зт.п.н.

(Ь. с) или выделенных из ядер

с (d). Сшивку, гистонов с ДНК

Н2А - - - проводили до (с) или после

нзв i=uu_, - (b,d) выделения нуклеосом из

нз J m хроматина. Обозначения см.

Н* ■ ■ - рис Л.

О 30 «О »0 SO ЮО 130 1*0

нал

HIB

H«

_ d

хроматина в составе ядер различных клеток (рис.7,9<1). Однако мы обнаружили изменение относительной интенсивности некоторых пятен. Например, пятна Н4(55) и Н4(65), а также Н2В(105) и Н2В(125) в частицах, реконструированных и сшитых способами 1 и 2 (рис.8а,Ь), имеют сравнимую интенсивность, тогда как в частицах, полученных способом 3 (рис.8с), интенсивность пятен Н4(65) и Н2В(125) существенно ослаблена.

В этих сравнительных экспериментах показано, что положение ДНК-гистоновых контактов относительно 5'-конца ДНК в составе различных минимальных нуклеосом восстанавливается с точностью до 2-4 нуклеотидов - в пределах разрешающей способности данной системы электрофореза. Вероятно и в составе молекул гистонов набор пептидов, участвующих в организации контактов, остается неизменным.

Практически полная идентичность первичной организации минимальных нуклеосом, выделенных из ядер, и частиц, реконструированных из октамера гистонов и ДНК длиной 146 п.н., свидетельствует о том, что для обеспечения правильной реконструкции, вероятно, достаточно той информации, которая содержится в структуре гистонового октамера и ДНК (Simpson,

Stafford, 1983). Расположение участков сшивки и, в большинстве случаев, их интенсивности на двумерных гелях не различались в минимальных нуклеосомах, выделенных из хроматина и в минимальных нуклеосомах, полученных реконструкцией на ДНК длиной 2-3 т.п.н. или 146 п.н. Это говорит о том, что правильность реконструкции не зависит от длины и концевых эффектов ДНК.

1.3 Общие принципы организации минимальных нуклеосом.

Рис.ЮА обобщает все полученные данные о расположении основных участков взаимодействия ДНК с гистонами на одной нити ДНК минимальной нуклеосомы. Рисунки 10В и 11 демонстрируют модели симметричного расположения гистонов на линейной и суперспирализованной в составе нуклеосомы двунитчатой ДНК. Таким

(Ш) Hi HZA Н2А

Hi Hi нз нз нз нгв hzb нз нз

О Ю 20 30 iO 50 60 70 SO 90 700 ПО ПО 110 НО f ' ' t t

® , Hi2 , HZA2 HZA2

hzb1 hzb1 Hi' Hi' нз2 нз2 нзг нгв2нгв2 нз' из'

5 1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1- >'

О 10 W 30 iO 50 60 70 1 SO 90 100 110 120 130 HOUS 146 НО 130 ¡20 110 100 90 вот 10 60 50 iO 30 23 1С 3

нз! нз2 H1A нгв' Н2А1 HZB' НЗ' НЗ' НЗ' Hi1 Hi2 Hi' нгв1 нгв1

-7 -6 I 1 -5 -4 1 . .1 -J ___L. -г о i г 1 1 1 1 г 3 i 5 6 7 _ L J_ _ 1. 1 _ _L„

Рис.10. Первичная организация минимальных нуклеосом. (А) - карта расположения основных контактов гистонов на одной нити ДНК нуклсосомпого кора, суммирующая результаты исследования минимальных нуклеосом из эритроцитов цыпленка, дрожжей, эмбрионов дрозофилы, спермиев морского ежа, печени крысы, асцитной карциномы Эрлиха мышей. Скобками отмечен контакт Н2А(75), обнаруженный только в нуклеосомах, сшитых после выделения. Стрелки показывают

Участки ДнК нуклеосомы наиболее доступные действию ДНКазы I. лина стрелки пропорциональна их относительной доступности (см. текст). (Ъ) - симметричная модель расположения гистонов на двух нитях двойной спирали ДНК. минимальной нуклеосомы, основанная на данных рис.ЮА и данных о наличии в минимальных нуклеосомах оси симметрии второго порядка (Richmond et al.,1984). Расстояние от 5'-конца до места пришивки указанно в ну.клеотидах и в относительных единицах (от -7 до +7), соответствующих количеству витков двухцепочечной ДНК с началом отсчета в центре симметрии нуклеосомы. Индексы 1 и 2 обозначают кажду» из двух гистоновых молекул в октамере гистонов.

Рис.11. Модель расположения гистонов на суперспирализованной ДНК минимальной ну.клеосомы. ДНК образует левую суперспираль (Richmond et al., 1984). Участки взаимодействия гистонов с ДНК указаны: для Н2А - узкая лента, прерывистая линия; для Н2В - широкая лента, прерывистая линия; для ИЗ - широркая лента, сплошная линия; для Н4 - узкая лента, сплошная линия. Цифры в кружках - см. рис.10.

образом, гистоны располагаются на одной нити ДНК в порядке: (5' )Н2В( 25 , 35 )-Н4( 55, 65 )-НЗ( 75, 85 ,95 )/Н4( 88 )-

Н2В( 105,115 )-Н2А( 115,118,145 )-НЗ( 145 )( 3' ) и на двухцепочечной ДНК: Н2А/НЗ-( Н2А-Н2В )-( ИЗ, Н4 )-( Н2В-Н2А )-НЗ/Н2А.

Участки существенно более слабой пришивки гистонов к ДНК, показанные на рис.7, но отсутствующие на рис.10, могут возникать в результате следующих событий: осцилляции доменов гистонов содержащих лизиновые и гистидиновые остатки между

комплементарными нитями двойной спирали ДНК (Shick et al., 1980), одновременного взаимодействия гистонов с соседними витками суперспирали нуклеосомной ДНК, присутствия в препарате небольших примесей субнуклеосом или нуклеосом, находящихся в разных конформационных состояниях и т.д. Окончательный ответ о природе этих слабых контактов можно получить лишь после идентификации участков молекул гистонов, взаимодействующих с ДНК.

Умеренная сшивка с гистонами наблюдается в участке с 20-го по 40-й и с 100-го по 120-й куклеотид от 5'-конца, а наиболее интенсивная пришивка происходит в 3*-концевом участке и в центральном сегменте нуклеосомной ДНК от 50-го по 100-й нуклеотид, с которыми контактирует тетрамер гистонов (НЗ,Н4)2- Положение участков слабой и интенсивной пришивки гистонов к ДНК хорошо совпадает с положением мест на ДНК минимальной нуклеосомы более

доступных ( 10, 20, 40, 50, 130 нуклеотидов от 5'-конца нуклеосомной ДНК) и менее доступных (30, 60, 70, 80, 90, 110 нуклеотидов от 5'-конца нуклеосомной ДНК) для действия ДНКазы I (Simpson к Bergman, 1980; Simpson & Whi tlock, 1976; Noll, 1977; Lutter, 1978). Это соответствие указывает на то, что стерическая защита ДНК гистонами в нуклеосомах может обеспечивать устойчивость некоторых ее участков к дейтевию нуклеаз.

Гистоновый октамер минимальной нуклеосомы состоит из достаточно автономных, но взаимодействующих друг с другом специфических гистоновых комплексов - тетрамера (НЗ, Н4)2 и двух димеров (Н2А.Н2В) (Kornberg, 1977; Isenberg, 1979). Контакты тетрамера и двух димеров гистонов также располагаются достаточно независимо друг от друга: контакты (НЗ,Н4)2 занимают на ДНК центральное положение, в то время как два димера (Н2А.Н2В) контактируют с двух сторон по краям нуклеосомной ДНК (рис.1 ОБ). Это подтверждается также изучением структуры субнуклеосом (Bakayev et al., 1981). Слабая степень перекрывания контактов тетрамера и димеров гистонов на нуклеосомной ДНК согласуется с их независимым поведением при репликации хроматина и с их предполагаемым последовательным удалением с ДНК при транскрипции, начинающимся, вероятно, с одного из димеров (Н2А,Н2В) (Svaren & Chalkley, 1990; Morse, 1992; Gruss & Sogo, 1992; van Holde et al., 1992; Feisenfeid, 1992; Hansen к Ausio, 1992). Одновременное взаимодействие гистона НЗ с центральным сегментом (НЗ(75-95)) и концевой областью (Н3( 135,145 ) ) нуклеосомной ДНК (рис.11), вероятно, стабилизирует суперспираль нуклеосомной ДНК (Shick et al., 1980; Klug et al., 1980).

2. Динамические возможности нуклеосом.

Результаты анализа сшивки гистонов с ДНК в составе нуклеосом, полученных различными способами и выделенных из различных источников, свидетельствуют о возможности конформационных переходов в их структуре.

2.1. Конформационные возможности нуклеосом в модельных экспериментах.

Зависимость ДНК-гистоновых взаимодействий от ионной силы раствора изучалась нами на минимальных нуклеосомах, выделеных из ядер эритроцитов цыплят, при изменении ионной силы среды от 0,4 мМ

It] H 6S ы

Рис.12. Авторадиограммы двумерного электрофоретического разделения

(подробнее см. рис.4) меченых 25I гистонов, сшитых с ДНК в составе минимальных нуклеосом из ядер эритроцитов цыпленка в растворах с низкой ионной силой. Концентрация одновалентных катионов (Na) указана в правом верхнем углу каждого геля. Цифрами обозначены точные (а не приблизительные, как в тексте) расстояния (в нк) от 5'-конца ДНК частицы до контактов с ней соответствующих гистонов. Звездочкой отмечено артефактное пятно - вероятно

ПР91/1ТкТЯТ ПЯГГТЯГТЯ ТУ Li MP П Я ГНСТПНЯ НЗ.

до 2,5 М. При понижении ионной силы раствора до 0,4 мМ (рис.12) в первичной организации нуклеосом не наблюдается ярко выраженных изменении, за исключением контактов гистона 114, который практически полностью перестает сшиваться с ДНК, в то время как при физиологических значениях ионной силы его участки сшивки являются доминирующими.

При изменении ионной силы раствора в пределах от 0,7 до 600 мМ NaCl (рис.12,13) первичная структура минимальных нуклеосом также не претерпевает принципиальных изменений и сводится к изменению или перераспределению интенсивностей пятен в картине уже существующих контактов. Такие конформзционные переходы, по всей видимости, протекают без значительных изменений формы и размеров частицы. Так например, было зарегистрировано изменение в интенсивности взаимодействия гистона Н4 с двумя участками нуклеосомной ДНК, что выражается на авторадиограммах двумерных электрофорезов относительным увеличением интенсивности пятна Н4(65) по сравнению с Н4(55) при изменении ионной силы раствора от 10 до 100 мМ (рис.12,13). Одновременно с этим аналогичные изменения происходят и во взаимодействии с нуклеосомной ДНК гистона Н2В, что выражается возрастанием интенсивности пятна Н2В(125) по отношению к пятну Н2В(105) (рис.12,13). Появление по крайней мере части таких конформационных переходов получило объяснение, причины возникновения других пока не ясны.

На схеме, представляющей один супервиток ДНК минимальной нуклеосомы (рис.14), показано, что контакты гистонов Н4 и Н2В с нуклеосомной ДНК локализуются в областях ее наибольших изгибов -1 и -4, соответственно, обнаруженных при рентгеноструктурном исследовании нуклеосом (Richmond et а 1 . , 1984). Тот факт, что увеличение интенсивности сшивки гистонов с ДНК на участках Н2В (125) и Н4(65) происходит одновременно при возрастании ионной силы раствора от 10 до 100 мМ, позволяет предположить существование единого механизма, обуславливающего этот процесс.

Эксперименты, проведенные нами для исследования влияния двухвалентных ионов на структуру нуклеосомного кора показали, что соответствующее перераспределение интенсивности сшивки для гистонов Н2В и Н4 наблюдается и в этом случае, однако, при значительно более низких концентрациях соответствующих ионов - в диапазоне от 0,1 до 1 мМ Са^+ или рис. 15). Характерно, что

2-й *

добавление 3 мМ Mg к ядерам дрожжей приводит к увеличению интенсивности сшивки гистона Н4 с ДНК в области Н4(65) (не

Рис.13. Авторадиограммы двумерного электрофоретического разделения

(подробнее см. рис.4) меченых гистонов сшитых с ЛИК в составе

минимальных нуклеосом из ядер эритроцитов цыпленка в растворах со средней ионной силой. Концентрация одновалентных катионов (На ) указана в правам верхнем углу, каждого геля.

Рис. 14. Схематическое изображение постоянных и вариабельных контактов (непрерывные и

пунктирные стрелки,

соответственно) гистонов Н2В и Н4 на одной половине ДНК нуклеосомного кора, в котором ДНК симметрично накручена на октамер гистонов. Цифры по наружной и внутренней кривизне спирали обозначают число витков двойной спирали ДНК от центра частицы и расстояние от 5'-конца ДНК, соответственно.

показано) до соответствующего уровня, наблюдаемого для гистон Н1-содержащих ядер (рис.3-6). Кроме того, нами было установлено, что концентрация соли, при которой происходят данные конформационные переходы, зависит не от типа катионов или анионов, а лишь от валентности положительно заряженных ионов (не показано).

В качестве предполагаемого объяснения, наиболее вероятной представляется связь этого феномена с увеличением гибкости ДНК, которая наблюдается при ионной силе раствора выше 10 мМ для одновалентных и выше 0,1 мМ - для двухвалентных катионов (Hagerman, 1988). Согласно полиэлектролитной теории (Manning, 1978), такая разница в концентрациях обусловлена более высокой эффективностью экранирования фосфатных групп ДНК двухвалентными катионами, по сравнению с одновалентными. Увеличение гибкости ДНК возможно позволяет гистонам легче адаптировать двойную спираль ДНК к взаимодйствующей с ней поверхности соответствующего пептида.

Другим примером конформационного перехода без нарушения формы и размеров частицы является резкое ослабление пятна Н2А(75) при ионной силе раствора выше 400 мМ NaCl (рис.13), что объясняется диссоциацией в этих условиях от ДНК С-концевого фрагмента гистона Н2А, пришивающегося, как показано нами в экспериментах на минимальных нуклеосомах с удаленными трипсином концевыми фрагментами гистонов (не опубликованные данные), к центральным участкам нуклеосомной ДНК.

В целом, однако, рассмотренные изменения в структуре нуклеосом достаточно слабы, но демонстрируют способность частицы

H2A U

SJ 31 2S

Ca7* OlmM —i'hjb

Ci 2mM

53 38 28

SS il 4B

ZlT 0.1 mM

31 11

Pue.15. Авторадиограммы двумерного электрофоретического разделения

(подробнее см. рис.4 и 12) меченых I гистонов, сшитых с ДНК в составе минимальных нуклеосом из ядер эритроцитов цыпленка в растворах с низкой ионной силой (5 мМ NaCl) в присутствии двухвалентных катионов (их концентрация указана в правом верхнем углу, каждого геля)

адаптироваться к возможным взаимодействиям с регуляторными белками или ферментами, к включению в свой состав модифицированных гистонов или их вариантов, а также способность к взаимодействию .с -ДНК-, содержащей "участкй с"локальнЪ изменяющейся гибкостью, что, как известно, наиболее часто обусловлено наличием в ней специфических последовательностей (Travers, 1989).

При повышении ионной силы раствора выше 600 мМ структура нуклеосом начинает дестабилизироваться. Уже при 600 мМ пятна на радиоавтограммах становятся менее четкими, хотя основные контакты гистонов гистонов с нуклеосомной ДНК сохраняются (рис. 16). Наиболее выраженные конформационные изменения нуклеосомного кора наблюдаются при ионной силе около 1,0 M NaCl. Контакт Н2А(145) исчезает, вместо него появляется сильное взаимодействие Н4(145). Слабый контакт Н4(145) не является необычным и в ряде случаев наблюдается в норме в ядрах и в выделенном хроматине (см. рис.7, а также Davies & Lindsey, 1991). Рис.17 демонстрирует взаимодействие гистонов Н2А и Н4 с ДНК минимальной нуклеосомы в растворах с высокой ионной силой. Появление пятна Н4(145) вместо исчезнувшего Н2А(145) свидетельствует о том, что после потери связи гистона Н2А

Рис.16. Авторадиограммы двумерного электрофоретического разделения

1 ^^

(подробнее см. рис.4 и 12) меченых I гистонов, сшитых с ДНК в составе минимальных нуклеосом из ядер _ эритроцитов цыпленка в растворах с высокой ионной силой. Концентрация одновалентных катионов (Иа ) указана в правом верхнем углу каждого геля.

Рис.17. Изменения в участках сшивки гистонов Н2А и Н4 с ДНК (не заштрихованная и заштрихованная ленты,

соответственно) в составе нуклеосомного кора при (А) -физиологической и (В,С) -

высокой (около силе раствора.

1М) ионной

с концами нуклеосомной ДНК на освободившийся участок частично перераспределяется гистон Н4. В этом случае, в результате дополнительной стабилизиции гистоном Н4 конца нуклеосомной ДНК (которая в норме, по-видимому, обеспечивается взаимодействием гистона НЗ через супервиток с центральными и концевыми фрагментами нуклеосомной ДНК (см. ниже рис.23)), могут образоваться два типа частиц: с компактной структурой - без освобождения ДНК (1) и частиць, в виде "запятой", наблюдаемые под электронным микроскопом в 1,1 М ИаС1 (Яиявеу ег а!., 1979) - (2) (рис.17).

2.2 Нуклеосомы в составе развернутого и компактизованного хроматина в растворе и в ядрах.

Анализ первичной организации минимальных нуклеосом, сшитых после их выделения, а также в составе развернутого хроматина или ядер, выявил существование в хроматине ряда конформационных переходов, обнаруженных в модельных экспериментах. Так, найденный в выделенных минимальных нуклеосомах контакт Н2А(75) был резко ослаблен или не проявлялся совсем в следующих случаях: в нуклеосомном коре компактизованного содержащего гистон Н1 хроматина, выделенного из ядер (Ве1уаУБку е1 а 1., 1980), или в составе ядер (Вауук1п е1 а 1.,1985), в нуклеосомном коре в составе развернутого хроматина в ядрах дрожжей (где Н1 в значительных количествах не обнаружен) (ВаууЫп е1 а 1 ., 1985 ), а также в минимальных нуклеосомах в составе реконструированного без гистона Н1 хроматина (Бавыкин и др.1988). Вместе с тем, указанный контакт гистона Н2А ярко выражен в минимальных нуклеосомах, в составе

которых гистоны были пришиты к ЛИК после выделения нуклеосомного кора из такого реконструированного хроматина. Этот факт позволяет предположить, что отсутствие данного контакта гистона Н2А обусловлено наличием межнуклеосомной ЛИК.

Кроме того, в составе развернутого и компактизованного хроматина нами также были отмечены количественные различия в степени пришивки к различным участкам ДНК гистонов НЗ, Н2В и Н4, что указывает на существование конформационных переходов в нуклеосомах хроматина с разной степенью компактизации. Так, для частиц, у которых сшивка гистонов с ДНК была проведена в составе целых ядер (рис.3), распределение интенсивностей пятен гистонов Н4 и Н2В на двумерном гель-электрофорезе оказалось таким же как и в выделенном нуклеосомном коре при ионной силе раствора выше 10 мМ (рис.5,8а,8Ь,12е,13,18Аа,18Ва). Однако, после деконденсации хроматина, обусловленной разрушением ядер или удалением гистона Н1, пятна 114(65) и Н2В( 115,125) резко ослабевают. Такая картина характерна для нуклеосом в составе выделенного или реконструированного хроматина не содержащего гистон Н1 (рис.18ВЬ и 8с,9с, соответственно). Аналогичная ситуация наблюдалась и в экспериментах на ядрах, не содержащих гистон Н1( дрожжи )(рис.18АЬ).

yeast

Н4

-4—1

88 ЬЪ 55

5*Э О

-ы

88 65 55

mouse ascites

H4t-

88 65 55

н—I

88 65 55

°ис.18. Различия в сшивке гистона И4 с ДНК минимальных нуклеосом. 1а фрагментах авторадиограмм двумерного электрофоре за показано

разделение меченного гистона И4, сшитого с ДНК минимальных

нуклеосом. Сшивку проводили: А - на минимальных нуклеосомах (а) и хелых ядрах (Ь) дрожжей; В - на хроматине асцитной карциномы мышей 7 осле удаления гистона III (о) и минимальных нуклеосомах, выделенных из того же хроматина (а). Цифры указывают на размеры тришитых к гистону, 114 5'-концевых фрагментов нуклеосомной ДИК в нк.

Уменьшение интенсивности пришивки Н4(65 ) и Н2В(125 ) может быть обусловлено различными факторами, например: локальным изменением условии в участке пришивки, уменьшением подвижности ДНК-связывающего домена гистона, изменением соотношения нуклеосом, находящихся в разных конформационных состояниях или различиями в расположении контактирующих участков гистона и ДНК. В составе хроматина, не содержащего гистон HI, эти эффекты, в свою очередь, по-видимому, вызываются разворачиванием спейсерной ДНК (Бавыкин и др.,1988 ), поскольку отсутствие контактов Н2В(125 ) и Н4(65) в таком развернутом хроматине в растворах с ионной силой 40-60 мМ NaCl, где спейсерная ДНК не упакована регулярно (но не в ядрах, где она спирализована (Bavykin et al., 1990) и не в нуклеосомах, где ее просто нет), уже не может определяться возрастанием жесткости ДНК нуклеосомного кора, которое наблюдается только при ионной силе ниже 10 мМ (см.2.1). Важно отметить, что после выделения нуклеосомного кора из развернутого хроматина контакты Н2В(125 ) и Н4(65 ) появляются снова (см. рис.8 и 18).

2.3.Функциональные аспекты конформационных переходов в нуклеосоме.

Подводя итог экспериментов по выявлению конформационных переходов в нуклеосомах, можно сказать, что взаимодействие отдельных доменов гистонов с ДНК кора может быть нарушено без удаления этих гистонов из нуклеосомы и изменения структуры нуклеосомного кора в других его участках. Важно отметить, что обнаруженные изменения интенсивности связывания гистонов с нуклеосомной ДНК выявлены в участках имеющих важное значение. Так, область в которой располагаются контакты Н4(55,65) и Н2В(105,115,125) характеризуется не только наличием изгибов нуклеосомной ДНК в участках ¿1 и -4, но и расположенной здесь границей между контактами димера (Н2А.Н2В) и тетрамера (НЗ,Н4)2-Кроме того, участок ¿1 взаимодействует с доменом гистона Н4, содержащим гистидин-18 (Ebralidse et al., 1988), наличие которого играет решающую роль в регуляции экспрессии ряда генов (Felsenfeld, 1992). Значение этих участков ДНК особенно важно с точки зрения наиболее распространенных в настоящее время моделей транскрипции и репликации ДНК, входящей в состав нуклеосом (Jackson 1990, van Holde, 1992), которые предусматривают ступенчатое удаление сначала димера гистонов (Н2А.Н2В) и, далее, либо одномоментное, либо поэтапное (van Holde, 1992) отделение ДНК от тетрамера гистонов (НЗ,Н4)2- В развернутом хроматине нарушение

¡заимодеиствия октамера гистонов с ДНК в участке Н2В(125), сличающемся высокой интенсивностью сшивки, означает в первую )чередь уже отмечавшееся ранее ослабление взаимодействия концевых участков нуклеосомной ДНК с димером (Н2А.Н2В) (van Holde et а 1 . , 1992), который, как предполагается, вытесняется РНК-полимеразой на тервмх этапах считывания ДНК нуклеосомного кора (Baer & Rhodes, 1983). Исчезновение контакта 114(65) вероятно дестабилизирует 5заимодействие тетрамера (113,114)2 с ДНК и таким образом может эблегчать дальнейшее продвижение полимеразы внутри частицы (см. /an Holde et а 1., 1992, fig. 1 ).

J.Структура 30-нм фибриллы хроматина и ее конфорыационные вменения.

На следующем уровне компактизации хроматина минимальные чуклеосомы вместе с разделяющей их межнуклеосомной ДНК с участием гистона 111 сворачиваются в 30-нм нить, организация которой остается во многих деталях неясной (Widom, 1989). В настоящей заботе изучали организацию нуклеосом и межнуклеосомной ДНК в {роматине из спермиев морского ежа и других источников.

Ядра из спермиев морского ежа являются удобной моделью для исследования структуры хроматина ввиду ряда его особенностей. Этот юлностью репрессированный и высоко конденсированный хроматин по :равнению с хроматином ядер соматических клеток упакован вероятно 1аиболее регулярным образом. Длина нуклеосомного повтора в этом «роматине наибольшая среди изученных объектов и составляет тримерно 240 п.н. (Spadafora et а 1., 1976), а гистон Н2В тредставлен спермальными вариантами.

3.1. Регулярная организация спейсерной ДНК.

При гидролизе хроматина и ядер микрококковой нуклеазой эбнаруживается серия нуклеосом, характеризующихся одинаковой эрганизацией гистонового октаиера на ДНК, но различающихся длиной спейсерной ДНК (от 10 п.н. в MHj 5 5 до 90 п.н. в МН23 ) на величину 10 л п.н., где п - 0, 1, 2, 3,... . Эта 10-нуклеотидная периодичность распостраняется на значительную, вероятно всю, длину спейсерной ДНК. Так, она наблюдалась в экспериментах по измерению длины ДНК динуклеосом после их тримминга (гидролиз нуклеазами участков ДНК выступающих за пределы частицы) (Karpov et а 1., 1982; Strickland et a I . , 1974 ), а также при гидролизе межнуклеосомной

ДНК выделенного хроматина или хроматина в составе ядер из многих источников, в частности с длиной межнуклеосомной ДНК — 30, 50, 70 и 90 п.н. (хроматин эмбрионов дрозофилы, печени крысы, эритроцитов цыпленка и спермиев морского ежа, соответственно)(рис. 19,20). Эта структурная особенность, хотя и в ограниченной степени, характерна и для не содержащих гистон HI ядер и хроматина (рис.21).

10-нулеотидная периодичность расщепления ДНК минимальной нуклеосомы различными нуклеазами, в том числе микрококковой (McGhee к Felsenfeld, 1980; Kornberg, 1977; Prunell, 1983; Felsenfeld, 1978), является следствием доступности наружной поверхности ДНК, расположенной на поверхности гистонового октамера и латерально экранированной гистонами с внутренней поверхности (Richmond et a I ., 1984; Мирзабеков, Рич, 1978; Mirzabekov & Rich.,1979). Такую же периодичность в расщеплении ДНК нуклеазами наблюдали при латеральной защите ДНК плоской поверхностью, например, кристаллов слюды (Rhodes & Klug., 1980).

Рис.19. Электрофоретическое разделение в денатурирующих условиях однонитчатых фрагментов ДНК, образующихся при гидролизе микрококковой нуклеазой ядер (В) и хроматина (А), выделенных из спермиев морского ежа. Время гидролиза указано в верхней части гелей; (с) - ну.клеосомный кор; Ш - мононуклеосомы; (е) маркерные однонитчатые фрагменты ДНК известной длины (указана справа от гелей); 1-7 - мононуклеосомы с длиной ДНК, кратной около 10 нк.

Рис.20. Сравнение продуктов гидролиза микрококковой нуклеазой хроматина (А) и ядер (В), выделенных из эмбрионов дрозофилы (а,£), печени крысы (с),

эритроцитов цыплят (е,к) и асцитной карциномы мышей (¡). Фрагменты ДНК

разделяли электрофорезом в денатурирующих условиях (см.рис.19). Тидролиз

нуклеазой проводили 20 мин. (с) - нуклеосомный кор; 1-7 мононуклеосомы. ( Ь, с!, Г , Ь, - маркерные

однонитчатые фрагменты ДНК (см.рис.19) .

Рис.21. Электрофоретическое разделение в денатурирующих условиях фрагментов ДНК образующихся при гидролизе микрококковой нуклеазой ядер дрожжей (А) и хроматина эритроцитов цыплят, из которого до гидролиза были удалены гистоны Н1 и ¡15 (%) ■ Фракции 1-3 сответствуют нукдеосомам Ш.Ш и МЯ[В5 , не содержащим гистон

Н1; ОМ - дину.клеосомы. ((1, И) - маркерные фрагменты ДНК(см.рис. 19).

В настоящее время предложены три типа моделей организации межнуклеосомной ДНК в хроматине (Felsenfeld & McGhee., 1986), в которых ДНК: 1) свернута в виде суперспирали подобно ДНК минимальной нуклеосомы (Karpov et al., 1982; Finch & Klug., 1977; Worcel к Benyajati, 1977; McGhee et al., 1980; Lee et al., 1981; McGhee et al., 1983); 2) растянута и соединяет соседние нуклеосомы, организованные в виде зигзага (Worcel et al., 1981; Woodcock et al., 1984; Staynov., 1983; Lesters & Staynov, 1983; Williams et al., 1986); 3) нерегулярно свернута внутри соленоида (Thoma et al., 1979; Butler, 1984; Subirana et al., 1985; Widom & Klug, 1985).

Одинаковая 10-нуклеотидная периодичность фрагментов ДНК, образующихся при расщеплении ДНК минимальной нуклеосомы и спейсера микрококковой и другими нуклеазами, является сильным аргументом в пользу представления о том, что ДНК хроматина свернута в виде непрерывной суперспирали. Вместе с тем, полученные данные трудно совместить с двумя другими моделями организации спейсерной ДНК. Модель с зигзагообразным расположением соседних нуклеосом, соединенных растянутыми отрезками ДНК, также как и модель с неупорядоченным расположением спейсерной ДНК не объясняют регулярную 10-нуклеотидную периодичность расщепления нуклеосомной и межнуклеосомной ДНК ДНКазой 1 (Noll, 1974; Lohr & Van Holde, 1979; Prunell et al., 1979), образование при расщеплении хроматина микрококковой нуклеазой мононуклеосом от MH; 45до МН2 3 5 (рис.19,20) и динуклеосом с длиной межнуклеосомной ДНК кратной 10-ти нуклеотидам (не показано, см. Karpov et al., 1982; Strauss, Prunell, 1983), a также наличие взаимодействия гистонов НЗ и Н2В с межнуклеосомной ДНК на значительном расстоянии от минимальной нуклеосомы.

3.2.Взаимодействие гистонов HI, НЗ и Н2В с межнуклеосомной ДНК.

Гистоны кора сами по себе могут стабильно организовать по 10 п.н. межнуклеосомной ДНК с обеих сторон нуклеосомы. Об этом свидетельствует факт образования, помимо МН( , также частицы МН;55и МН]65 при гидролизе микрококковой нуклеазой не содержащих гистона HI ядер дрожжей (Wintersberger et al . , 1973; Davie, 1982; Cetra et al., 1984) или лишенного Hl и H5 хроматина эритроцитов цыплят (рис.21). Взаимодействие гистонов минимальной нуклеосомы со спейсерной ДНК подтверждается также в ряде других экспериментов (Thoma et al., 1979; Morse â Cantor, 1985; Allan et al., 1982;

Weischet et al., 1979; Marion & Roux, 1980; Pigdomenech et al., 1987). Для организации более длинных участков межнуклеосомной ДНК необходим гистон HI.

Многочисленные эксперименты показали, что гистон 111 взаимодействует со спейсерной ДНК (Varshavsky et al., 1976; Thoma et al., 1979; Noll & Kornberg, 1977; Simpson, 1978). Данные по ДНК-гистоновым сшивкам свидетельствуют о связывании 111 не только с концевыми участками хроматосомы, но и с ДНК минимальной нуклеосомы, хотя и в меньшей степени. Определение первичной организации МП 5 показало, что в ядрах спермиев морского ежа HI интенсивно связывается с центральной частью спейсерной ДНК и более слабо - с остальными участками ДНК нуклеосомы (рис.22) (см. также Belyavsky et al., 1980; Sperling R., 1978).

Методом ДНК-гистоновых сшивок было также обнаружено взаимодейтсвие гистона НЗ со спейсерной ДНК (рис.22,23) (см. также Belyavsky et al., 1980; Karpov et al., 1982). Контакты гистона НЗ локализованы в центральной области суперспирализованной нуклеосомной ДНК (на участке между -2,5 и +2,5), рядом с которой

Рис.22. Авторадиограмма двумерного электрофоретического разделения "32

меченых Р фрагментов ДИК, сшитых с гистонами в составе ну.клеосом МНгъъ в ядрах спермиев морского ежа. (Л-С) - различные

условия фореза. В скобках - димеры гистонов. Обозначения см.рис.3.

Рис.23.Модель расположения гистонов Н1, Н2В и НЗ на нуклеосомной ДНК в ядрах спермиев морского ежа. ДНК минимальной нуклеосомы и спейсера, показанного только с одной стороны нуклеосомы, суперспирализована в виде левой спирали с шагом около 80 п.н. Длинные тонкие стрелки отмечают места дополнительных контактов гистонов кора с ДНК соседнего су--первитка. Короткая стрелка - центр спейсерной ДНК. Буквами "с" и "б обозначены гистоны, взаимодействующие с ДНК нуклеосомного кора и спейсерной ДНК, соответственно. Цифры в кружочках указывают количество витков двойной спирали ДНК от центра ("О") нуклеосомной ДНК.

на соседнем витке суперспирали располагаются участки спейсерной ДНК ( от -5,5 до -10,5 в нижней части нуклеосомы на рис.23). Такое пространственное сближение делает возможным одновременное связывание одной молекулы НЗ с этими двумя сегментами ДНК (рис.23). Это подтверждается данными рентгеноструктурного анализа нуклеосом (Bentley et а 1., 1984). С другой стороны, участок связывания гистона Н2В на ДНК минимальной нуклеосомы от -1 до -5,5 сближен с областью спейсерной ДНК от -9 до -13,5 (рис.23). Таким образом, если спейсер находится в суперспирализованном состоянии, гистон НЗ может участвовать в его организации до 35-го нуклеотида от конца ДНК минимальной нуклеосомы, а гистон Н2В - от 20-го до 65-го нуклеотида (рис.23). Спермальный вариант гистона Н2В морского ежа характеризуется положительно заряженной вставкой длиной около 20 аминокислотных остатков в N-концевой области (Strickland et al. , 1978). Вероятно, эта особеность спермального Н2В обуславливает исключительно большие размеры спейсера в этом хроматине (Zalenskaya et al., 1981), хотя нельзя не учитывать и особенности структуры спермальных вариантов гистонов Н2А и HI (Sures et al., 1978; Allan et al., 1980; Strickland et al., 1980; Wouters et al., 1978). Ковалентное связывание гистонов НЗ и Н2В со спейсерной ДНК, обнаруженное в МНг спермиев морского ежа,

подтверждает это предположение, а модель на рис.23 дает структурное объяснение роли Н2В в организации необычно длинного спейсера. Следует отметить, что взаимодействие гистонов Н2В и НЗ с межнуклеосомной ДНК трудно объяснять в рамках модели с вытянутым спейсером, соединяющим в 30-нм фибрилле зигзагообразно расположенные соседние нуклеосомы. В этом случае молекулы Н2В и НЗ должны взаимодействовать со спейсерной ДНК на расстоянии 30 А и более от гистонового октамера. Вместе с тем, любые воздействия, препятствующие суперспирализации спейсерной ДНК, такие, как удаление гистона HI, возможно удаление ионов Mg2 + или модификация остальных гистонов, будут линеаризовать спейсерную ДНК с появлением зигзагообразного расположения соседних нуклеосом в хроматине.

3.3. Расположение нуклеосом в суперструктуре хроматина.

Отличительной особенностью гидролиза хроматина в ядрах спермиев морского ежа микрококковой нуклеазой является образование ограниченного набора нуклеосом, состоящего из МН2 3 , МН2(5 и частиц, не содержащих гистон HI - MHj д и МН^ (рис.19). Это возможно связано с величиной нуклеосомного повтора, длина которого в этом хроматине составляет примерно 240 п.н. Если ДНК как минимальной нуклеосомы, так и межнуклеосомных участков образует непрерывную суперспираль (Karpov et al., 1982; Finch & Klug, 1977; Worcel à Benyajati, 1977; McGhee et al., 1980; Lee et al., 1981; McGhee et al., 1983), в которой, как и в минимальной нуклеосоме, на один виток приходится около 80 п.н. (Finch et al., 1981; Bentley et al., 1981), то нуклеосомный повтор в 240 п.н. содержит три витка суперспирали. В этом случае расщепление нуклеазой одних и тех же экспонированных наружу и доступных ее действию участков спейсерной ДНК в соленоидной структуре хроматина (Finch 4 Klug,1977), располагающихся на расстоянии кратном 80 п.н. приведет к предпочтительному выщеплению частиц МН2 -МН2 4 5 (рис.19 ).

В пределах нуклеосомного повтора в спермальном хроматине гистоновый октамер, располагаясь предпочтительно в центре, тем не менее занимает, вероятно, несколько дискретных положений, смещенных относительно друг друга на 10 п.н. (рис.22,24). Такое же расположение минимальных нуклеосом в пределах нуклеосомного повтора наблюдается и для хроматина эмбрионов дрозофилы. Это согласуется с вариабельной, но кратной 10 п.н., длиной спейсера в хроматине

SpatP' ! h;'.) Cor« (146 bp) Spocp.

20 -*—3

60 , , , . --

70 н?в H4 и2в н;л H?A-—SI

H?R' M?R' H4' H4' H î1 Hi' H3* М?В'Н?Н' H 3' M j' '

______________■,' l-1—_1_I_1-1-1-i_I_1-1-1-1-1_1_I V Ю

О (0 ?0 W W 50 60 ?OJ 90 90 IOO HO l?U 130 140 M6 I1G 140 IV! 1?0 НО Ю0 90 ВО/70 бО ЗО 40 ЗО 20 10 0

-------------3' -1-1-J-1-J--J-J-1-J-L-1-15 —

____________HV HV H?ft Н?П НЗ H5 НЭ H4 M4 M?H НГИ ____

__!<?л' и?д' нгй'ш нгв' _

MN„ MNlt MNlr

1«N„

_)-1-1-1-1-1-1-1-1-1 —1-1-1 I-1 t I I I-1 I-1-L I-l_l-1-1-1-i i

l'i И -lî -I? Il IO 9 -R -Г Г, S -4 -3 -г -I О I ? 1 4 6 7 8 9 К) Il I? 13 14 15

Рис.24. Первичная организация симметричной минимальной нуклеосомы UN 4 5 , монону.клеосом MN[ 5 5 . 6 5 > 7 5 > 8 511 з 5 ' Основиь1е места взаимодействия гистонов показаны на двух нитях ЛИК нуклеосомного кора. Линчи сбоку, показывают, что, например, MN155

образована удлинением. ДНК минимальной нуклеосомы на 10 п.н. с одного из ее концов. Часто встречающиеся частицы обозначены непрерывными линиями, редкие - пунктирными. Длина ДНК указана в нк от 5'-конца или числом витков двойной спирали.

дрозофилы и печени крысы.

При гидролизе микрококковой нуклеазой хроматина ядер эмбрионов дрозофилы, асцитной карциномы мышей и эритроцитов цыпленка, с величиной нуклеосомного повтора соответственно 185, 195, 215 п.н., было обнаружено, в отличие от ядер спермиев морского ежа, образование всего спектра дискретных нуклеосом от МН145 до МН215ч-(рис. 20). В хроматине из этих источников величина нуклеосомного повтора не кратна 80 п.н., благодаря чему различные участки спейсерной ДНК в соленоидной структуре 30-нм фибриллы экспонированы наружу и доступны гидролизу нуклеазой.

3.4. Различия в структуре выделенного хроматина и хроматина в составе ядер.

Данные о том, что не содержащая гисгон Н1 частица МН155 образуется в заментых количествах при гидролизе ядер или компактизованного в 30-нм фибриллы хроматина и отсутствует в продуктах гидролиза развернутого содержащего гистон Н1 хроматина, образующего структуру "зигзага" (рис.19,20), указывают на некоторые структурные перестройки, происходящие при выделении хроматина и связанные, как мы полагаем, с перераспределением

гистона HI.

Необходимо также отметить практически полное сходство в составе мононуклеосом, получаемых при гидролизе микрококковой нуклеазой хроматина, выделенного из ядер всех исследованных нами объектов: печени крысы, эмбрионов дрозофилы, спермиев морского ежа, эритроцитов цыплят (рис.19,20), а также асцитной карциномы мышей (Bavykin et al.,1990). Напротив, картина гидролиза хроматина в составе ядер зависит от источника их выделения, а количество образующихся фракций мононуклеосом (за исключением спермиев морского ежа) тем больше, чем длиннее нуклеосомный повтор (рис.18,20).

В изолированных нуклеосомах, так же как и в хроматине, одна молекула гистона HI своей гидрофобной центральной частью связывается с участком в 10 п.н. на обоих концах ДНК хроматосомы МН 65 , экранируя их от действия микрококковой нуклеазы (Varshavsky et al., 1976; Thoraa et al., 1979; Noll & Kornberg, 1977; Simpson, 1978; Allan et al., 1980). Появление МН]55 в гидролизате хроматина в составе ядер соответствует, по всей вероятности, нарушению контакта гистона HI с ДНК с одной стороны хроматосомы. Возможно, что в составе ядер гистон HI взаимодействует со спейсерной ДНК не только одной нуклеосомы, но и образует контакты со спейсерными участками других нуклеосом, располагающихся рядом вдоль ДНК или на соседних витках соленоида . Благодаря т а кому взаимодействию, молекул,;} гистона. HI может фиксировать и тем самым стабилизировать соседние ,витки соленоида. При выделении хроматина происходит перераспределение 111 и связывание его глобулярной области со спейсерными участками, прилегающими с двух сторон к одной и той же минимальной нуклеосоме. Это ведет к частичной декомпактизации соленоидной структуры, в результате чего спейсерная ДНК становится доступной для гидролиза нуклеазой вдоль всей ее длины, что, к примеру, приводит к замене ограниченного набора частиц MHj , МП 5 , МЧг35> МН 45 , образующегося при гидролизе спермальных ядер на более широкий спектр нуклеосом в гидролизате хроматина, выделенного из ядер спермиев морского ежа.

3.5.Модель динамичной 30-ни фибриллы хроматина.

Предлагаемая модель структуры 30-нм фибриллы хроматина (Бавыкин, 1988) построена на основании исследований организации нуклеосом и межнуклеосомной ДНК в хроматине из спермиев морского

240 bp

740 bp

C\ Рис.25.Модель динамичной 30-нм

^ / фибриллы хроматина с нуклеосомным

" повтором 240 п.н. (А, В) и 200 п.н.

(С,D). Вид сверху. (А) - в составе супервитка для простоты изображено только три нуклеосомы. Трубками обозначены границы нуклеосомного кора. N-Hl, G-H1 и С-Н1 - соответствующие фрагменты гистона HI

D (см.текст). Штриховкой обозначены

границы взаимодействия гистона ИЗ с минимальной пухлеосоыой, а стрелками от нее - участки спейсерной ДНК, взаимодействующие с этим гистоном. Стрелки на наружной кривизне 30-ни фибриллы указывают фрагменты линкера, наиболее доступные для нуклеазы. Видно, что при таком расположении нуклеосом легко образуются минимальные нуклеосомы и МН^ , но не

частицы ЫН235 и МН}45. (В) - та же модель, но нуклеосомы в 11-ни

фибрилле повернуты вокруг ее оси на 180°. При нуклеазном гидролизе такой фибриллы будут легко образовываться нуклеосомы Ш?35и мЯг45 •

Встречная штриховка - участки взаимодействия с ДНК нуклеосомногс кора гистонов Н2В и НЗ. С-Н2А - расположение С-концевого фрагменте гистона Н2А. Стрелки между супервитками указывают участки взаимодействия гистонов со спейсерной ДНК. (С и D) - фрагменту аналогичных моделей для хроматина с более коротким нуклеосомныг. повтором. Модель D, в отличие от С, легко объясняе-1 предпочтительное выщепление динуклеосом.

700 bp

жа и других источников.

Основной причиной, побудившей нас отдать предпочтение модели о спирализованным спенсером, является показанная нами способность истока ИЗ, а в ядрах спермиев морского ежа также и гистона Н2В, заимодействовать с линкерной ДНК на всем ее протяжении (Belyavsky t al., 1980; Karpov et al., 1982; Bavykin et al., 1990). бнаруженная одинаковая 1О-нуклеотидная периодичность в асщеплении ДНК минимальной нуклеосомы и спейсерной ДНК икрококковой и другими нуклеазами (Lohr & van Holde, 1979; авыкин и др., 1988; Karpov et al., 1982; Noll, 1974; Prunel1 et 1., 1979; Lohr, 1986; Strauss, Prunel1, 1983) также является еским аргументом в пользу представления о том, что ДНК хроматина вернута в 11-нм фибрилле (линейная цепочка нуклеосом) в виде епрерывной суперспирали.

На рис.25А и В представлена модель 30-нм фибриллы хроматина в драх спермиев морского ежа. Основные положения модели следующие:

1. 30-нм фибрилла представляет собой односпиральный соленоид, котором нуклеосомы упакованы по принципу моделей со

пирализованным линкером.

2. Шаг суперспирали 11-нм фибриллы эквивалентен периодичности уперспирали ДНК в нуклеосомном коре и составляет 80 п.н.

3. Один супервиток 30-нм фибриллы содержит 6 нуклеосом.

4. Расположение гистона Н1:

a)G-Hl (глобулярный фрагмент гистона Н1 ) взаимодействует с побулярной областью гистона Н2А (G-H2A) на "плоской" поверхности уклеосомы.

б)С-Н1 (С-концевой фрагмент гистона Н1 ) взаимодействует с 1К своей и соседней нуклеосомы в своем и, возможно, соседнем упервитке 30-нм фибриллы.

b)N-H1 (N-концевой фрагмент гистона Н1 ) взаимодействует с стонами нулеосомного кора и, возможно, слабо с его ДНК.

г)гистон НЗ и гистон Н2В, помимо контактов с ДНК ^клеосомного кора, взаимодействуют с ближайшими участками ('первитка спейсерной ДНК, примыкающими к минимальной нуклеосоме.

5. G-Î11 после лизиса ядер перераспределяется на участок /клеосомной ДНК в районе точки"0".

По данным определения первичной организации минимальных ^клеосом (Bavykin et al., 1985), редуктивного метилирования iCTOHOB в их составе и анализа результатов гистон-гистоновых швок (Lambert & Thomas, 1986) глобулярная часть гистона Н2А в

ядрах прилегает к участкам ДНК величиной двадцать нуклеотидны пар, располагающимся симметрично на концах минимальной нуклеосомм Локализация G-H1 в этой области обоснована возникновением сшиво] между G-H1 и G-H2A в результате обработки карбодиимидом (сшивк "нулевой" длины) ядер и выделенного из них хроматина (Boulikas е al., 1980), а также сшивания гистона 111 с гистоном НЗ (Hardi son е al., 1977; Boulikas et al., 1980; Bonner & Stedman, 1979; Глотов i др., 1978; Бакаева и др., 1978), который располагается в это! участке нуклеосомного кора (Bavykin et al.,1985).

Кроме того, показано, что в ядрах спермиев морского ежа G-H сшивается с 20-30 н.п. центрального фрагмента спейсерной ДНК (см разд. 3.2), располагающегося на схеме рядом с G-H1.

Расположение N-H1 проведено так, чтобы он обесечивал фиксаци гистона HI на нуклеосоме (Allan et al., 1986). Подвижность N-Hl вероятно, ограничена (Ring & Cole, 1983), возможно, за сче гидрофобных взаимодействий его эволюционно консервативног пролин-аланин-богатого сегмента (Böhm к Mitchell, 1985) гидрофобными участками октамера гистонов. На слабое взаимодействи этого участка с ДНК указывает отсутствие сшивания N-концево аминокислоты (треонин-1) с ДНК в составе ядер, в отличие о декондепсированного хроматина (Mirzabekov et al., 1989).

С-111 вместе с гистонами НЗ, Н2А и, возможно, N-концевым фрагментами других гистонов обеспечивает спирализацию спейсерно ДНК. C-N- и С-С- сшивки между соседними молекулами гистона HI обнаруженные в экспериментах с бифункциональными сшивающим реагентами (подробнее см. в обзорах Batler, 1983; Бавыкин, 1988) могут обеспечиваться за счет подвижности С-Н1 как внутри своего так и соседнего супервитка соленоида.

Модели А и В на рис.25 отличаются друг от друга повороте нуклеосом в составе 11-нм фибриллы на 180° . Модель В лучи объясняет состав спектра нуклеосом, образующегося при гидролиз микрококковой нуклеазой ядер спермиев морского ежа и содержащего кроме минимальных нуклеосом и частиц MHj 5 , лишь еще две части!. МНг35 и МН2 4 5 , в которых нуклеосомный кор расположен в центр соответствующих фрагментов ДНК, a G-H1 контактирует с концевыи фрагментами нуклеосомной ДНК.

На рис. 25С, показано, что от модели хроматина с нуклеосомнь повтором 240 п.н. легко перейти к модели с повтором 200 п.н. - oi является суперпозицией моделей А и В. При этом каждая последующ, частица относительно предыдущей повернута на 180° .

Рис. 25D демонстрирует, как необходимо расположить частицы, чтобы обеспечить появление динуклеосомного повтора при гидролизе ДНКазой I хроматина с длиной повтора 200 п.н Оказалось, что такое положение можно выбрать и для хроматина с нуклеосомным повтором 180 п.н. (не показано), а также, вероятно, для хроматина со всеми другими значениями повтора.

Поскольку взаимодействие G-H1 и G-H2A вероятно эволюционно консервативно, переход от нуклеосомного повтора 240 п.н. к более коротким должен сопровождаться сближением G-H1 с G-H2A соседней нуклеосомы (см.рис.25), возникновение взаимодействия с которой может дополнительно стабилизировать суперспираль 11-нм нити.

Следует также отметить, что возникновение суперспирализации 30-нм фибриллы и ее параметры могут модулироваться сложным комплексом как гистон-гистоновых, так и ДНК-гистоновых взаимодействий в межнуклеосомном пространстве. Не исключено, что определенную роль в них играет появление вращательного момента 11-нм нити в результате взаимодействия гистона HI одновременно с гистонами кора и с супервитком спейсерной ДНК. Аналогичный механизм был предложен ранее (Worcel к Benyajati, 1977), с той лишь разницей, что гистон HI располагался снаружи 11-нм нити.

При разрушении ядер осмотическим шоком или добавлением ЭДТА в растворах с низкой ионной силой (например, при остановке нуклеазного гидролиза) происходит разрушение 30-нм фибриллы (возможно, в первую очередь из-за потери двухвалентных ионов). При этом глобулярная часть гистона 111 подтягивается к нуклеосомному кору (вероятно своим N-концом, служащим своеобразным "якорем" (Allan et а 1 . , 1986 )) и занимает прилегающие 10 п.н. ДНК с обоих его концов, блокируя образование частиц MHj 5 , что приводит к вьпцеплению при нуклеазном гидролизе "хроматосом" (Bavykyn et al.,1990), пришивке гистона HI к З'-концам ДНК нуклеосом MHjgs и MHj ? (Karpov et al., 1982) и образованию структуры "зиг-заг" (Thoma et al., 1979). При этом N-H1 и С-Н1 могут взаимодействовать со спейсерной ДНК.

Такое перемещение G-H1 также может быть связано с перераспределением G-H2A в центральную часть нуклеосомы, в район точни "0", на что указывает появление сильного участка связывания Н2А (75) в этой области в выделенном из ядер хроматине, в отличие от хроматина в составе ядер, где этот контакт отсутствует или выражен значительно слабее (Belyavsky et al., 1980).

Важно отметить, что по данным нуклеазного гидролиза такое

положение гистона Hl в изолированном хроматине характерно дл хроматина всех без исключения исследованных нами источнико клеток, содержащих гистон HI. В то же время, спектр мононуклеосом образующийся при гидролизе ядер, проведенном в одинаковых условия для изученных нами типов клеток, различен. Предполагается, что эт связано с разным углом поворота нуклеосом друг относительно друг в 11-нм нити, упакованной в 30-нм соленоид, который зависит о длины нуклеосомного повтора. При этом различные участк нуклеосомной ДНК становятся доступными для гидролиза нуклеазо (Bavykin et al.,1990).

В заключение следует сказать, что упаковка ДНК в регулярь организованный соленоид, скорее всего, является идеализацие реально существующей ситуации. Айзенберг на основе недавни исследований компактизации хроматина в растворе методе малоуглового рассеяния рентгеновских лучей (Greulich et al., 1987 высказал предположение о том, что компактная фибрилла може представлять собой "worm-like coil" - спираль с непостоянным параметрами. На существование нерегулярности в упаковке фибрил указывают также Бордас и др. (Bordas et al., 1986), хотя автор рассматривают данные Айзенбега о существовании "worm-like coil как ошибочные (Koch et al., 1987). Кроме того, вариации длин линкера, наличие свободных от нуклеосом областей и возможно влияние на структуру фибриллы следующего уровня компактизаци хроматина должны значительно усложнять картину.

ВЫВОДЫ

1. В результате углубленной разработки оригинального метох определения первичной организации ДНК-белковых комплексо! созданного диссертантом ранее в коллективе соавторов, с высок! разрешением установлена первичная организация нуклеосомного кор (минимальной нуклеосомы) и предложена модель автономно расположения контактов тетрамера гистонов (НЗ,Н4)г и двух димерс (Н2А.Н2В) на нуклеосомной ДНК.

2. Показано, что первичная организация нуклеосомного кора клетках организмов всех трех высших царств эукариот - Животные Растения и Грибы - не имеет существенных отличий. Таким образой

впервые прямыми данмми доказана универсальность структуры нуклеосомного кора как фундаментального структурного элемента хроматина.

3. Исследование первичной организации нуклеосом, выделенных из полностью репрессированных ядер и ядер высоко активных в транскрипции и репликации, показало, что полная инактивация хроматина не сказывается заметным образом на последовательности расположения контактов гнетонов вдоль ДНК у основной массы нуклеосом.

4. В модельных экспериментах по изучению конформационных возможностей нуклеосом в растворах с различной ионной силой был выявлен ряд конформационных переходов в нуклеосомах и впервые показано, что взаимодействие отдельных доменов гистонов с ДНК может быть нарушено без значительных изменений структуры нуклеосомного кора в других его участках.

5. Ряд таких конформационных переходов, связанных с изменением контактов гистонов Н2А, Н2В и Н4 с нуклеосомной ДНК, обнаружен в составе хроматина и установлена их связь с компактизацией 30-нм фибриллы и диссоциацией концевых фрагментов гистонов от ДНК в нуклеосоме.

6. В результате исследования диссоциации нуклеосом в растворах с высокой ионной силой был предложен механизм стабилизации частиц, образующихся из нуклеосомного кора в результате диссоциации из него гистонов Н2А и Н2В.

7. В результате изучения структуры нуклеосом и их организации в

суперструктуре хроматина показано, что межнуклеосомная ДНК в

составе 30-нм фибриллы суперспирализована с участием гистона Н1 и гистонов кора.

8. На основании результатов исследования хроматина, компактизованного в составе ядер или развернутого после их разрушения, предложена модель динамичной 30-нм фибриллы хроматина, характеризующаяся перераспределением гистона Н1 во время ее декомпактизации.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1.А.Д.Мирзабеков, А.В.Белявский, С.Г.Бавыкин, В.В.Шик. Первичн; организация нуклеосомы: порядок расположения гистонов на ДН1 Докл. АН СССР, 242, 715-718, 1978.

2.A.D.Mirzabekov, V.V.Shick, А.V.Be 1yavsky, S.G.Bavykin. Prinai organization of nucleosome core particle of chromatin: sequeni of histone arrangement along DNA. Proc. Natl. Acad. Sci. US/ 75, 4184-4188, 1978.

3.A.D.Mirzabekov, V.V.Shick, A.V.Belyavsky, V.L.Karpo1 S.G.Bavykin. The structure of nucleosomes: the arrangement ( histories in the DNA grooves and along the DNA chain. Cold Sprij Harbor Symp. Quant. Biol. 47, 149-155, 1978.

4.A.Mirzabekov, V.Shick, A.Belyavsky, S.Bavykij R.Beabealashvi1 у, A.Kolchinsky, A.Melnikova. Topography of interaction of lac repressor, RNA polymerase and hi stones wi DNA. Gene Functions, 51, 13-21, 1979.

5.Е.С.Левина, С.Г.Бавыкин, В.В.Шик, А.Д.Мирзабеко: Взаимодействие гистонов с ДНК в хроматине. Новый мет< ковалентного связывания гистонов с ДНК, удобный для ] локализации на ДНК. Биохимия, 45, 1133-1145, 1980.

6.A.D.Mirzabekov, A.V.Belyavsky, S.G.Bavykin, V.V.Shick. Prima organization of nucleosomes and its functional implication BioSystems, 12, 265-271, 1980.

7.A.D.Mirzabekov, V.V.Shick, A.V.Belyavsky, S.G.Bavykin, A.Ric Primary organization and functioning of the nucleosome со particle of chromatin. Frontiers of Bioorganic Chemistry a Molecular Biology, 361-367, Ed. S.N.Anarichenko, Pergamon Pres Oxford к New York, 1980.

8.V.V.Shick, A.V.Belyavsky, S.G.Bavykin, A.D.Mirzabekov. Prima organization of the nucleosome core particles. J. Mol. Bio 139, 491-517, 1980.

9.A.V.Belyavsky, S.G.Bavykin, T.G.Goguadze, A.D.Mirzabeko Primary organization of nucleosome containing all five histon and DNA 175 and 165 base-pairs long. J. Mol. Biol. 139, 519-53 1980.

10.V.L.Karpov, V.N.Zayetz, S.G.Bavykin, A.D.Mirzabekov. Stabili of the primary organization of nucleosome core particles upon so conformational transitions. Abstracts of the Second Soviet-Itali

symposium "Mac r 0:110 i ecu 1 e s in the functioning cell", Pushchino, 1980, 88-94.

11.V.W.Zayets, S.G.Bavykin, V.L.Karpov, A.D.Mirzabekov. Stability of the primary organization of micleosome core particles upon some conformational transitions. Nucl. Acids Res. 9, 1063-1068, 1981.

12.E.S.Levina, S.G.Bavykin, V.V.Shick, A.D.Mirzabekov. The Method of crosslinking hi.stone s to DMA partly depurinated at neutral pll. Analyt. Biochem. 110, 93-101, 1981.

13.V.L.Karpov, S.G.Uavykin, 0.V.Preobrazhenskaya, A.D.Mirzabekov. Alignment of nncIeosomcs along DNA and organization of spacer DNA in Drosoph i1 a chroma;n. Nucl. Acids Res. 10, 4321-4337, 1982.

14.A.D.Mirzabekov, S.G.Bavykin, V.L.Karpov, O.V.Preobrazhenskaya, К.К.Ebra1idze, V.M.Tuneev, A.F.Me 1nikova, E.G.Goguadze. A.A.Chenchick, R. S . Beabea1 ashvi1i. Structure of nue 1eosoraes, chromatin, and RNA polymerase-promoter complex as revealed by DNA-protein cross-1inking. Cold Spring Harbor Symp. Quant.Biol., 47, 503-510, 1983.

15.A.D.Mirzabekov, V.L.Karpov, O.V.Preobrazhenskaya, S.G.Bavykin A.R.Dzherbashayan, V.V.Shick, A.V.Belyavsky. The structure of nucleosomes and chromatin. Current Trends in Life Sciences, 12, 1-7, 1984.

16.A.D.Mirzabekov, V.L.Karpov, О.V.Preobrazhenskaya, S.G.Bavykin, S.1.Usachenko, A.1.Lyshanskaya, I.M.Undritsov, V.V.Shick, A.V.Belyavsky. Dynamic structural changes in chromatin upon transcription. Proceedings in the 16th FEBS congress, Moscow 1985, Part B, 142-145.

17.С.Г.Бавыкин, С.И.Усаченко, В.В.Шик, А.В.Белявский, А.И.Лишанская, И.М.Ундрицов, И.А.Зеленская, А.Д.Мирзабеков. Первичная организация минимальных нуклеосом активных и репрессированных ядер. Молек. Биол.,19, 144-161, 1985.

18.S.G.Bavykin, S.1.Usachenko, A.1.Lishanskaya, V.V.Shick,

A.V.Belyavsky, I,M.Undritsov, A.A.Strokov, I .A.Za1enskaya, A.D.Mirzabekov. Primary organization of core particles is invariable in repressed and active nuclei from animal plant and yeast cells. Nucl. Acids Res. 13, 3439-3459, 1985. 19.S.G.Bavykin, I.M.Undritsov, S.1.Usachenko, A.A.Strokov, Y. F.Bogdanov, A.D.Mirzabekov. The primary organization of nucleosomal core particles from actively dividing cells of lily. FEBS Lett. 228, 149-152, 1988.

20.А.И.Лишанская, С.Г,Бавыкин, Т.Шустер, М.Грюнстайн,

А.Л.Мирзабеков. Структура нуклеосом, содержащих, мутантный гистс Н2В. Док. АН СССР, 300, 482-486, 1988.

21.С.Г.Бавыкин, С.И.Усачеко, А.Д.Мирзабеков. Сравнение первичнс организации реконструированных и выделенных из хроматш минимальных нуклеосом. Молек. биол. 22, 531-538, 1988.

22.С.Г.Бавыкин, С.И.Усаченко, А.О.Заленский, А.Д.Мирзабеков Структура нуклеосом и организация межнуклеосомной ДНК в хроматине Молек. Биол. 22, 517-530, 1988.

23.С.Г.Бавыкин. Динамика структуры хроматина. В сборнике "Итог науки и техники", серия Молекулярная биология, Москва 1988 5-121.

24.S.G.Bavykin, К.К.Ebralidse, S.A.Grachev, I.M.Gavin

S.1.Usachenko, D.V.Pruss, A.D.Mirzabekov. Nucleosomes' structur and their organization in chromatin. In: Highlights of Moder Biochemistry, ed. by A.Kotyk, J.Skoda, V.Pacer, V.Kostka, VS Intern. Sci. Publish., Zeist, 1989, 115-127.

25.A.D.Mirzabekov, S.G.Bavykin, A.V.Belyavsky, V.L.Karpov 0.V.Preobrazhenskaya, V.V.Shick, K.K.Ebralidse. Mappin DNA-Protein interactions by cross-linking. Methods in Enzymolog 170, 386-408, 1989.

26.S.G.Bavykin, S.I.Usachenko, A.0.Zalensky, A.D.Mirzabekov Structure of nucleosomes and organization of internucleosomal DN in chromatin. J. Mol. Biol. 212, 495-511, 1990.

Информация о работе

Бавыкин, Сергей Георгиевич
доктора биологических наук
Москва, 1992
ВАК 03.00.03

Автореферат

Похожие работы

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему Структура нуклеосом и организация 30-нм фибриллы хроматина ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Структура нуклеосом и организация 30-нм фибриллы хроматина"

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Структура нуклеосом и организация 30-нм фибриллы хроматина
ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология