Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Сравнительный анализ структурно-функциональной организации матричных РНК проопиомеланокортина и пролактина человека и других млекопитающих

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Сравнительный анализ структурно-функциональной организации матричных РНК проопиомеланокортина и пролактина человека и других млекопитающих"

Р Г Б ОД 2 1 АВГ 1995

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК СИБИРСКОЕ ОТДЕЛЕНИЕ

НОВОСИБИРСКИЙ ИНСТИТУТ БИООРГАНИЧЕСКОЙ ХИМИИ

на правах рукописи УДК 577.113.5: 577.175.328

БОНДАРЬ АЛЕКСАНДР АНАТОЛЬЕВИЧ

СРАВНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ ОРГАНИЗАЦИИ МАТРИЧНЫХ РНК ПРООПИОМЕЛАНОКОРТИНА И ПРОЛАКТИНА ЧЕЛОВЕКА И ДРУГИХ МЛЕКОПИТАЮЩИХ

03.00.04 - биохимия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

г. Новосибирск, 1995 г.

Российская Академия Наук Сибирское Отделение НОВОСИБИРСКИЙ ИНСТИТУТ БИООРГАНИЧЕСКОЙ ХИМИИ

на правах рукописи УДК 577.113.5:577.175.328

БОНДАРЬ АЛЕКСАНДР АНАТОЛЬЕВИЧ

СРАВНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ ОРГАНИЗАЦИИ МАТРИЧНЫХ РНК ПРООПИОМЕЛАНОКОРТИНА И ПРОЛАКТИНА ЧЕЛОВЕКА И ДРУГИХ МЛЕКОПИТАЮЩИХ

03.00.04 - биохимия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

■-.Новосибирск, 1995г.

Работа выполнена в Новосибирском институте биоорганической химии СО РАН.

Научные руководители: Член-корреспондент РАЕН,

доктор биологических наук, профессор Мертвецов Николай Павлович

кандидат химических паук Каргииов Владимир Андреевич

Официальные оппоненты: доктор химических наук, профессор кандидат биологических наук

Лаврик Ольга Ивановна Меркулова Татьяна Ивановна

Ведущая организация:

Институт экспериментальной медицины РАМН (г.Сашсг-Петербург).

Защита состоится

_1995 г. часов иа заседании Диссертационного Совета К 003.52.01 в Новосибирском институте биоорганической химии СО РАН по адресу: 630090, Новосибирск-90, проспект академика Лаврентьева 8.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Новосибирского института биоорганической химии СО РАН.

3- оР

Автореферат разослан О_1995 г.

Ученый секретарь Диссертационного Совета, кандидат химических наук О.С.Федорова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность темы. Ряд пептидных гормонов и нейропептидоз гипофиза, таких как АКТГ, альфа-, бета- и гамма МСГ, бета-липотропин (ЛПГ) и ß-эндорфин происходят из общего белка-предшественника, называемого проопиомеланокортином (ПОМК). Под контролем пептидных гормонов-производных ПОМК, находятся процессы нормального развития, поведения, памяти, эмоционального и физиологического ответа на стресс (Smith A.I. and Funder J.W. 1988, Мертвецов H.П. 1990). Известно, что огагоидные пептиды, и в особенности продукт процессинга ПОМК - ß-эндорфин, входят в число факторов, стимулирующих синтез препролактина - предшественника другого, не менее важного полифункционального гормона гипофиза - пролактина (Tong Y. and Pelletier G 1992). Большинство биологических эффектов пролактина связано с репродуктивной функцией (M.Wallis и соавт. 1985). Знание первичной структуры и особенностей организации мРНК, кодирующих ПОМК и пролактин, является принципиальным шагом, огкрывающим путь к выяснению регуляторных механизмов их экспрессии, механизмов их действия, возможности их микробиологического синтеза для нужд медицины. Сравнительный анализ выведенных из мРНК последовательностей белков дает представление о функциональной значимости отдельных районов гормонов.

Пели и задачи. Целью настоящей работы являлось исследование структурно - функциональной организации гипофизарных матричных РНК, кодирующих проопиомеланокортин и пролактин, на примере мРНК ПОМК человека, быка, норки и мРНК пролактина человека и норки и их сравнительный анализ с другими видами млекопитающих. Для выполнения этой цели было необходимо решить следующие задачи: 1) клонировать кДНК ПОМК из гипофиза человека, быка и норки и кДНК пролактина из гипофиза человека и норки; 2) определить нуклеотидную последовательность клонированных кДНК ПОМК и пролактина; 3) провести сравнительный анализ полученных последовательностей кДНК и кодируемых ими прегормонов с известными для других млекопитающих и выявить закономерности и особенности их структурно - функциональной организации.

Научная новизна работы: Впервые определена нуклсотидная последовательность кДНК ПОМК из гипофиза человека. Впервые определена нуклеотидная последовательность кДНК ПОМК из гипофиза норки. На основании сравнительного анализа первичных и вторичных структур ДНК, кодирующих ПОМК человека и других млекопитающих, предложен механизм возникновения мутаций и вариабельных районов в ДНК генов ПОМК. Впервые ген проопиоме-ланокортина локализован на 11 хромосоме норки и показана его уникальность. Впервые определена нуклеотидная последовательность кДНК пролактина норки.

Научно - практическая значимость работы: На основе ДНК полученной в настоящей работе рекомбинантной плазмиды pHPRL24, несущей вставку кДНК пролактина человека с определенной нами нуклеотидной последовательностью, с добавлением химически синтезированного

участка нуклеотидной последовательности, кодирующего 16 недостающих N-концевых аминокислотных остатков, сотрудниками НИБХ СО РАН Морозовой Т.В. и Муравлевым А.И. был сконструирован генно - инженерный продуцент пролактина человека , необходимого в медицинской практике (Морозова Т.В. и сотр., 1993). На основе ДНК полученной в настоящей работе рекомбинантной плаэмиды рВРОМСв, несущей вставку кДНК ПОМК быка с определенной нами нуклеотидной последовательностью, Беклемишевым А.Б., Головиным С.Я. и сотрудниками (НИКТИ БАВ "НПО" ВЕКТОР) сконструирован генно инженерный продуцент бета-липотропного гормона быка и разработана схема трипсинового высвобождения из генно-инженерного белка биологически активного опиоидного пептида - ß- эндорфина, необходимого в медицинской практике (Беклемишев А.Б. и сотр., 1988). Рекомбинантные плазмиды, полученные в настоящей работе, представляют существенный интерес как специфические молекулярные зонды для определения содержания мРНК ПОМК или пролактина в различных тканях организма человека, быка, норки при исследованиях механизмов гормональной регуляции экспрессии соответствующих генов и как материал для конструирования генно-инженерных продуцентов важнейших пептидных гормонов человека, быка и норки для биомедицинских исследований или нужд практической медицины. Проведенный сравнительный анализ всех известных аминокислотных последовательностей как биоактивных доменов ПОМК, так и пролактина разных видов млекопитающих, дает представление о функциональной значимости тех или иных групп аминокислотных остатков белков и открывает возможность детально исследовать влияние конкретных участков этих важных гормонов гипофиза на их функциональную активность.

Публикации и апробация работы. По материалам диссертации опубликовано 10 статей, из них 3 в зарубежных изданиях. Результаты работы были представлены: в виде стендового доклада на 10-м двустороннем Советско-французском симпозиуме "Физико-химические основы жизни" (Киев, 4-8 июня 1990 г.); в виде доклада на 7-м международном конгрессе по изоферментам (Новосибирск, 7-12 сентября 1992 г.).

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 170 страницах, включающих 33 рисунка, 9 таблиц и 143 ссылки списка литературы. Диссертационная работа состоит из введения, трех частей и выводов. Часть I - обзор литературы по теме: "Структурно- функциональная организация генов и мРНК, кодирующих важнейшие гормоны гипофиза - ПОМК и пролактин, у человека и других млекопитающих". Часть II - экспериментальная, содержит описание материалов и методов, использованных в работе. Часть III - результаты и обсуждение, содержит изложение основных результатов работы, их обсуждение и анализ.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ. Стадии настоящей работы, связанные с клонированием кДНК ПОМК и пролактина проводились совместно с сотрудником НПО "ВЕКТОР" Головиным С.Я.. Используя в качестве источника специфической мРНК ткань гипофиза человека, быка и норки, в которой концентрация мРНК ПОМК и пролактина максимальнаШес С.Е. и сотр., 1983, Sasavage N.L. и сотр., 1982), в основном при помощи стандартных методов, мы клонировали кДНК ПОМК человека, быка и норки, а также кДНК пролактина человека и норки. Нуклео-тидные последовательности клонированных кДНК определяли секвенированием обеих цепей ДНК в основном по методу Максама-Гилберта. Реакции химической модификации проводили в растворе (Maxam A.M. and Gilbert W. 1980), либо с ДНК фрагментами, иммобилизованными на твердофазном носителе DE-81 целлюлоза (Чувпило С.А., Кравченко В.В. 1983) с собственными и разработанными сотрудником НИБХ Морозовым И.В. модификациями. Первичную структуру нескольких фрагментов кДНК пролактина норки устанавливали также и по методу Сэнгера, используя модифицированную ДНК полимеразу фага Т7 и двуцепочечную ДНК клона pMVPÍÍL на основе pUC18 или субклоны вставки данной кДНК в составе бактериофага М13шр18-19.

Нуклеотидная последовательность кДНК проопиомеланокортнна из гипофиза человека.

Определенная нами впервые нуклеотидная последовательность кДНК ПОМК из гипофиза человека (рис.1) имеет размер 909 пар оснований. Она кодирует полную аминокислотную последовательность ПОМК человека, включая важнейшие биоактивные пептиды - АКТГ, р- липотропин и p-эндорфин. Она также содержит почти всю З'-нетранслируемую область мРНК и 60 оснований из 75, кодирующих сигнальный пептид ПОМК. Определенная нами первичная структура кДНК ПОМК человека полностью совпадает с известной нуклеотидной последовательностью экзонов 2 и 3 гена ПОМК человека (Takahashi Н. и сотр., 1983) и подтверждает его экзон- ин-тронную структуру, расчитанную ранее теоретически. Как и в ПОМК других млекопитающих пары аминокислотных остатков аргинина и лизина, выполняющие роль сайтов протеолитическо-го расщепления при его процессинге, фланкируют биоактивные домены ПОМК человека. Биологическая активность АКТГ, p-эндорфина и других пептидов проявляется только после вы-щепления их из состава ПОМК и последующих модификаций, таких как экзо/эндопептидазное расщепление, гликозилирование, амидирование или ацилирование (Smith A.I. и сотр., 1988). В ПОМК человека мы локализовали один потенциальный сигнал N-гликозилирования на 15-ом аминокислотном остатке уз-МСГ, три потенциальных сайта амидирования и три потенциальных сайта фосфорилирования пептидных производных ПОМК (рис.1). Определенная нами впервые нуклеотидная последовательность кДНК ПОМК человека зарегистрирована в базе данных EMBL nucleotide sequence database (Англия) и в банке данных GenBank (CUIA) под номером М38297.

Сигнальный пептид--к- N-концевой пептид

1 Cya?erArgSerGlyMaL«uLeuLeuAlaLeuLeuI.euGlnAlaSerMetGluValArgGlÍTrpCysLeuGluSerSer

5 '-CTGCAGCCGCTCGGGGGCCCTGTTGCTGGCCTTGCTGCTTCAGGCCTCCATGGAAGTGCGTGGCTGGTGCCTGGAGAGCAGC 10 20 30 40 50 60 70 80

GlnCysGlnAapLeuThrThrGluSerAsnLeuLeuGluCysIleArgAlaCysLysProAspLeuSerMaGluThrPreMet cagtgtcaggacctcaccacggaaagcaacctgctcígagtgcatccgggcctgca^ggccgacctctcggccgagactcccatc 90 loo 110 120 130 140 150 160

Зим i пм ЛОМХ I Эюм 3 гаи ЛОМК

PheProGlyAanGlyAspGluGlnProLeuThrGluAsnPrdAjgLydTyrValMetGlyHisPheArgTrpAspArgHbeGly TTCCCGGGAAATGGCGACGAGCAGCCTCTGACCGAGAACCCUCGG^ÁqTACGTCATGGGCCACTTCCGCTGGGACCGATTCGGC 170 180 190 200 Д10 ••••' 220 230 240 250

Г1ДЗ-МСГ

ц-МСГ

nScrSerSerSerGlySerSerGlyAlaGlyGli .CAI 260

9

isIia:

Соединительный пептид

LyäArgGluAspValSftrAlaGlyGluAspCysGlyProLäu ■GCAGCAGCGGCAGCAGCGGCGCAGGGCAjAAGCGqGAGGACGTCTCAGCGGGCGAACT.CTGCGGCCCGCTG 270 280 290 300 310 320 330

__ АКТГ

-а-МСГ

N-концевой пептид (Соед. пептид) 112 ProGluGlyGlyProGluProAzgSerAspGlyAlaLysProGlyProAxgGÍuGly: CCTGAGGGCGGCCCCGAGCCCCGCAGCGATGGTGCCAAGCCGGGCCCGCGCI 340 360 370 380

JH2

а,-МСГ

НО ArgTrpGlylysProVíiGly CGCTGGGGCAAGCCGGTGGGC

■yaLye ArgAr з

iagaagcggcgc

.ysAjrg îerTyrSerMetGluHisPhe .GGGCjíASCgCTCCTACTCCATGGAGCACTTC

__390 400 410

Кортикотропинподобный пептид (КПП) 'roValLysValTyrProAanGlyAlaGluAspGluSerAlaGluAlaPhe :CAGTGAAGGTGTACCCTAACGGCGCCGAGGACGAGTCGGCCGAGGCCTTC 460 470 480 490 500

АКГ1ХКПЮ

168 ProLeuGluPhi

CCCCTGGAGTTÍ fol®® 510

4-ЛПГ

Ï^GluLeuThrGlyGlnAcgLeuAzgGluGlyAspGlyProA^pGlyProAlaAspAspGlyAlaGly ' ¡GAGCTGACTGGCCAGCGACTCCGGGAGGGAGATGGCCCCGACGGCCCTGCCGATGACGGCGCÄGGG 530 540 550 560 570 580

196 AlaGlnAlaAapLeuGluHlaSerLeuLeuValAlaAlaGldtysijy;

590

600

610

620

gcccaggccgacctggagcacagcctgctggtggcggccgac am3uö gacgagggêccctacaggatggagcacttccgctgg

№

ß-МСГ

AspGluGlyProTyrArgMetoluHisPheArgTrp

ß-МСГ

224 GlySerProProLysAaï

ggcagcccgcccaaggac wsö^jtacggcggtttcatgaci

680 Ш

4-ЛПГ 4-Эндорфин

640

650

660

670

4-Эндорфин

TyrGlyGlyPheMetThrderGluLysSerGInThrProLeuValThrLeuPheLysAsn CCGAGAAGAGCCAGACGCCCCTGGTGACGCTGTTCAAAAAC 700 710 720 730 740 750

252 AlallelleLyaAir-AlaTyr GCCATCATCAAGAACGCCTAt 760 770

IlyGlu '•*

GAGTGAGGGCACAGCGGGCCCCAGGGCTACCCTCCCCCAGGAGGTCGACCCCAA 790 800 810 820 830

agccccttsctctcccctgccctgctgccgcctcccagcctggggggtcgtggcagataatcagcctctta -3' 840 850 860 870 880 890 900 909

Рис.1 Нуклеотидная последовательность секвенированной кДИК ПОМК человека и кодируемая ею аминокислотная последовательность проопиомеланокортина. Затененными прямоугольниками выделены сочетания пар основных аминокислотных остатков лизина (Lys) и аргинина (Arg), выполняющих роль потенциальных сайтов процессинга белка предшественника. Над аминокислотной последовательностью стрелками указаны границы биоактивных доменов проопиомеланокортина. Границы вкзонов 2иЗ гена ПОМК человека, расчитанные теоретически ТакакагЫ И. и сотрудниками (1983), указаны под нуклеотидной последовательностью кДНК. Потенциальные сайты гликозилирования - Гл, амидирования - M¿u фосфорили-рования - f, показаны над аминокислотной последовательностью ПОМК. Терминирующий кодом трансляции обозначен как

. N-концееой пептид

1 AlaGluThrPrcValPhe 5'- GCCGAGACGCCGGTGTTCI 10

ъ,1-мсг

29 TrpAspArgPÏéGlyX TGGGACCGCTTCGGCfc 90 100

y,.i.,-ЯГСГ

lyAsnGlyAspGluGlnProLeuThrGluAsnPro .xytiyï tyrValMetGlyHisP'neArg GCAACGGCGM'GAGCAGCCGCTGACTGAGAACCCCpSCT^GyACGTCATGGGCCATTTCCGC 30 40 50 60 70

Ta)

80

ri-Mer

nGlySerSerSerSerGlyValGlyGlyAlaAlaGli ■TGGTAGCAGCAGCAGCGGAGTTGGGGGCGCGGCCCAI 110 120 130 140

Xy*Ari i .фвА®5& i "Ш

Соединит, пептид GluGluGluValAlaVal IGAGGAGGAAGTGGCGGTG 160

N-концевой пептид Соединительный пептид

АКТГ m-МСГ

Ii##*raSerTyrSerMetGluHisPheArg

57 GlyGluGlyProGlyProArgGlyAspAspAlaGluThrGlyProArgGJ ЦАзт I

GGCGAAGGCCCCGGGCCCCGCGGCGATGACGCCGAGACGGGTCCGCGCGAGGAC MjSgffi rCTTACTCCATGGAACACTTCCGC 170 190 200 210 220 ' ""О 240 250

Коргликотропинподобный пептид (КПП)

мсг

85 TrpGlyLysProValGlj

TGGGGCAAGCCGGTGGGI 260 270"

LysLyaAxgArï ProValLysValTyrProAsnGlyAlaGluAspGluSerAlaGlrAlaPhePro 4AAGAACCCSCG( CCGGTGAAGGTGTACCCCAACGGCGCCGAGGACGAGTCGGCCCAGGCCTTTCCC

280

290

300

310

320

330

актг (кпп)

113 LeuGluPhe ,ysArg

CTCGAATTC lAÈAGG

340

А-ЛПГ

ïluLeuThrGlyGluArgLeuGluGlnAlaArgGlyProGluAlaGlnAlaGluSerAlaAlaAlaArg ïAGCTGACCGGGGAGAGGCTCGAGCAGGCGCGCGGCCCCGAGGCCCAGGCTGAGAGTGCGGCCGCCCGG 360 370 380 390 400 410 420

Jj А-МСГ

141 AlaGluLeuGluTyrGlyLeuValAlaGluAlaGluAlaGluAlaAlaGlujjyiïya IspqêrGlyProTyrLysMetGluIIis GCTGAGCTGGAGTATGGCCT®TGGCGGAGGCGGAGGC^GGCGGCCGAG{ffijGÂftBpCTCGGGGCCCTATAAGATGGAACAC

470

480

490

500

A - МСГ

169 PheArgTrpGlySerProProLysAsp:

TTCCGCTGGGGCAGCCCGCCCAAGGAC 510 520 530

.узЛгд IfAGCGC

(D<

/ - Эндорфин

yrGlvGlyPheMetThrSÎrGluLysSerGlnThrProLeuValThrLeu ■ACGGOTGGTTCATGACCTècGAGAAGAGCCAAACGCCCCTTGTCÀcGCTG Î40 И 550 560 570 580

А-ЛПГ A- Эндорфин

590

600

610

197 PheLysAsnAlallelleLysAsnAlaHiaLysLyiGlyGli

TTCAAAAACGCCATCATCAAGAACGCCCAQAAGAAÎ GGCCAGTGAGGGCGCAGCGGGCAGGGGCCTCTCTCCGCGGAAAGTTGA

630

640

650

660

670

3' - нешрвнелируемая область CCCTGAAGGCCTCTCTTCTGCCCTCCTACCGCCTCGCAGCCTGGGTGAGGATTCGCCCAG - 3' 680 690 700 710 720 730

Рис.2 Нуклеотидная последовательность секвенированной кДНК ПОМК быка и кодируемая ею аминокислотная последовательность ПОМК. Затененными прямоугольниками выделены сочетания пар основных аминокислотных остатков лизина (Lys) и аргинина (Arg), выполняющих роль потенциальных сайтов процессинга белка предшественника. Над аминокислотной последовательностью стрелками указаны границы биоактивных доменов ПОМК. АКТГ - ад-ренокортикотропчый гормон. МСГ - меланоцитстимулирующий горнон. ЛИГ - лыяопфошшй гормон. Отличия от нуклеотидной последовательности кДНК ПОМК быка, определенной группой Nakamihi и сотр.,(1979), указаны под последовательностью в позициях 19-21, 441, 459, 543 и заключены в рамки. Терминирующий кодон трансляции показан как Потенциальные » сайты гликозилирования - Га, амидарования - A'&ju фосфорилирования - Р, показаны над аминокислотной последовательностью ПОМК.

Нуклеотидная последовательность кДНК ПОМК из гипофиза быка.

Секвенированная нами кДНК ПОМК быка имеет размер 732 н.п.. Она кодирует все биоактивные пептиды ПОМК быка - у-,а-,(3-МСГ, АКТГ, Р-ЛПГ и p-эндорфин. От известной последовательности мРНК ПОМК быка, определенной ранее (Nakanishi S. и сотр., 1979), секвенированная нами кДНК ПОМК отличается шестью нуклеотидными заменами (рис.2). Три замены н меняют аминокислотный состав продукта трансляции. Оставшиеся три отличия представляют собой полную замену кодона ССС21 (Pro) на кодон 11 l2i(Phe-7) в области мРНК, кодирующей участок N-концевого пептида. Эта замена аминокислотного остатка скорее всего обусловлена мутацией, возникшей при клонировании кДНК, поскольку у всех известных аминокислотных последовательностей ПОМК млекопитающих, и даже земноводных и рыб эта позиция идентична с Pro. На рис.2 показаны определенные нами при помощи пакета программ PCGENE v.6.0 (фирма IntelliGenetics Inc., США) потенциальные сайты N- гликозилирования, амидирования и фосфорилирования ПОМК быка. Определенная нами нуклеотидная последовательность кДНК ПОМК быка зарегистрирована в базе данных EMBL nucleotide sequence database (Англия) и в банке данных GenBank (США) под номером М38606. Нуклеотидная последовательность кДНК ПОМК из гипофиза норки. Секвенированная нами впервые кДНК ПОМК норки имеет размер 585 н.п., кодирует все биоактивные пептиды ПОМК кроме у-МСГ и содержит большую часть З'-нетранслируемой области мРНК (рис.3). Анализ аминокислотной последовательности проопиомеланокортина норки выявил потенциальные сайты амидирования и фосфорилирования ПОМК (рис.3). Интересно отметить, что кДНК ПОМК норки кодирует среди нескольких а.к. остатков N-концевого пептида дополнительный сайт протеолитического процессинга ПОМК Argj-Argg. При этом несколько укорачивается соединительный пептид ПОМК норки, не несущий функционального значения. Однако возможно, что, например, в негипофизарных тканях, этот сайт может играть роль альтернативного при процессинге ПОМК в сравнении с классическим сайтом Lysg-Argio около АКТГ (рис.3). Вовлеченность данного сайта в процессинг ПОМК будет зависеть далее уже от специфичности конкретного типа прогормонконвертаз, присутствующих в данной ткани, а при определенной ситуации сайт Args-Arge может оказаться более предпочтительным, чем Lysg-Argio- При сравнении аминокислотных последовательностей ПОМК млекопитающих видно (рис.4), что этот альтернативный сайт процессинга, скорее всего, образовался в результате де-леции соответствующего района гена ПОМК норки.

Из-за различий и сложности механизмов регуляции экспрессии гена ПОМК, наблюдаемых в гипофизе, особо важно определить, существуют ли в геноме множественные копии гена ПОМК, или уникальный ген ПОМК. В геноме мыши, например, обнаружен (Motake М. и сотр., 1983, Uhler М. и сотр., 1983) функционально неактивный, расположенный на другой

-б -

N-концевой nenn

1 SerGluProGly irgArg îluGly

5'- GAGCGAGCCCGGCÇGCCGçjiAGGGC 10 20

узЛгд

lASCGC

зтг

ЛКТГ

-*ъ-мсг

¡erTycSerMetGluHisPheArgTrpGlyLysProVAlGly 'CCTATTCCATGGAGCACTTCCGCTGGGGCAAGCCTGTGGGC 40 50 60 70

ЛКТГ

Кортикотропин подобный пептид

ArgÁTí ProValLysValTyrProAsnGlyAlaGluAspGluSerAlaGluAlaPheProLeuGluPhe CGGCGqCCGGTGAAGGTGTACCCCAACGGCGCCGAGGACGAGTCGGCCGAGGCCTTCCCGCTCGAGTTC lAGÍA!

100 110 120 130 140 loü ~

90

4-лпг

SluLeu .GCTG 160

54 AlaGlyGluArgProGluProAlaLeuGlyProGluGlyAlaAlaGluGlyMetAlaAlaLeuAlaAspLeuGluTyrGly GCCGGGGAGCGGCCTGAGCCGGCGCTCGGCCCCGAGGGCGCGGCCGAGGGCATGGCGGCCCTGGCCGACCTGGAGTACGGC 170 180 190 200 210 220 230 240

81 LeuValAlaLysAlaGluValAlaGlu ,ysLys CTGGTGGCGAAGGCCGAGGTGGCGGAG lÄSAAG

250 260 2»

ß-MCT

\spAspGlyProTyrLysMetGluHis PheArgTrpGiySerPrcGly

ïACGACGGGCCCTACAAGATGGAGCACTTCCGCTGGGGCAGCCCGGGC 280 290 300 310 320

ß-МСГ _I ß-Эндорфин

108 LysAsp lysAr'gpyrGlyGlyPheMetThrsKrGluLysSerGlnThrProLeuValThrLeuPheLysAsnAlallelle

AAGGAC. lAGCG

зке

Itacggcggcttcatgacctccgagaagagccagacccccctggtgacgctgttcaaaaacgccatcatc 340 350 360 370 380 390 400

Í-ЛПГ

ß-Эндорфин 135 LysAsnAlaHii

1/ysLy

GlyGli

AAGAACGCCCACtAAGAAjGGCCAGTGAGGGCACCGCGGGGCCAGAGGCTTCTCTCCCCCCAGGAAGTCGACCCTAAGGCCC

410 420 430 440 450 460 470 480

CCCCTCTCCTCGCCTGCCCTCCCGCCGCCTCCCGGCCTGGGTGTGCTCCTCGCTCAGGCCGTGACGGCCCGATAGTCAGCC

490 500 510 520 530 540 550 560

TCTTCAAGCTGACTGTAGTT - 3' 570 580

Рис. 3. Нуклеотидная последовательность секвенированной ДНК копии мРНК ПОМК норки. Над последовательностью указаны потенциальные сайты амидирования^Мщ и фосфорили-poeaHUjf РА Блоками показаны пары основных а.к. остатков hys. Arg. Дополнительный сайт протеолЗтического процессинга ПОМК норки ÍArffj-Ar^) заключен в рамку.

хромосоме псевдоген ПОМК. В геноме же амфибии Xenopus laevis найдено два функционально-активных гена, с которых транскрибируются две гомологичные, но разные матричные РНК ПОМК (Deen P.M. и сотр., 1992; Martens O.J.M. и сотр., 1986). Локализация же гена ПОМК известна только у человека - в хромосоме 2 (Owerbach D. и сотр., 1981) и у мыши - в хромосоме 12 (Uhler М. и сотр., 1983). Используя вставку кДНК ПОМК норки в качестве специфического зонда для гибридизации и панели гибридных клеток норка-хомячок, содержащих на фоне хромосом хомяка разные хромосомы норки, в совместной работе с лабораторией д.б.н. Серова О.Л. нам удалось локализовать ген ПОМК норки в виде единственной копии на 11 хромосоме. Определенная нами нуклеотидная последовательность кДНК ПОМК норки зарегистрирована в базе данных EMBL nucleotide sequence database (Англия) и в банке данных GenBank США) под номером J03039.

СНГМЯВНЫЙ пептыд

Л_1А_2Л_

1-Ш.

И-СОМЦеВОЙ ПепТЖД

__ш__ао_

70

Человех

Обезьяна

Внк

Сввнья

Овца

Крыса

Ннжь

Норка

Слон

Человек

обезьяна

Внк

Свинья Овца Крыса Мннь

Норка Слон

Человек

Обезьяна

Бнк

свннья

Овца

Хрн сл

Нннь

Норка

Слон

КР1(БСС81»баАЬЫАЬЬЬвАЕМЕ7КС,-КСЬЕВ60С0БЬТТЕ5КЬ1ЕС1КАСКРШ,8АЕ1РМГРСЫаОЕ0РЬ НРЯВССвеЕШиЫЛаДЗДАВНЕУИОНСЪЕВбОСОВЬТТБбтЛСГМСКРЭЬбАЕТРУРРСКаПЕаРЬ НРЫ|С8еаВ(»Т.Т|ЬКТТ.ТДАВМЕУ»ОТСЬЕ8БСС0РЬТТЕе11ЦДС1ЯДСКРР13ЛЕТгУГГСМСРЕ0РЬ Ш>КЬССЗКЕ0Д1ХЬТ1^Х<!АЕН(^вНСЬЕ£Е(у;90ЬЕТСВ1<ЬШС1ЯАСКР0ЬЕАгТР77РС1(а0АЗРЬ

РОЬЕАЕТРУ^РаЫСОЕОРЬ

МРЯгСМВК8аДТ.Т,Т,»ТД.Т.СТВХРУН8К(ХЕВВ0СаРЬТТЕ511ЫАС11и1гИДЬеДЕТРУГРСМСРЕаР1.

ЕШДуц ОН2 I

ЭКЭОН2 Т ЭКЗОНЗ

Т.Л-МСГ |-»в-

-90

Т1-МСГ 100

110

Соэдннтальщй пестяд

120 130

1«0

ТЕНРРХТУМСНГНУЛЖГСККМВВВВС----БваАООККЕО—УВАОЕРССР1.РЕ<ЗОРЕР118[Х>АХРСРНЕ

ТЕ1ИЖТУМВНП1М11!101ии16ЕВО-----Е—АНбККЕР—УААаЕРМЬЬРЕаарЕРНСРаАаРСРКЕ

ТЕМРККТУНСЗНГННРКРСККМСВЕвВОТСв---ААдкНЕЕЕ-УАУСЕ-------С-РСРКСООДЕТСРКЕ

Тга<РККТУ№НГН1П)К7СЯКНаЕВ800С«ЗаСаАСдКХЕЕЕЕУААСЕ-------С-РСРЯСОЗУАРСРКО

тжярнктунзнгниры'СИяквЕзвгоАса—ААОКНЕЕЕ-УАТСЕ-------С-РСРРСОСАЕТСРКЕ

ТЕКРШ[1У110НГЯИ)ИРОРКИ88ВА------«ЗВАОККАЕЕЕТЛвОР-------йЯРЕР-------ВРЯЕ

ТЕИРКПУНВНРЯИЖГСРЯИВВЕА------СВААЙЮ!АЕЕЕАУЖ5Р-------аВРЕР-------ВРНЕ

ЕЕРСЯ--------ЧЕ

а-МСГ -110-1

КПП

. 1(0

170

ПП

Веряабехвшй район

_2Ш1_?1П

.*********************»***** ** » ••

СККЕТВМЕН?ЯКСКРУСКККНРУКУТРМСАЕРЕ8АЕАРР1|ЕРККЕЬТС031ЛЕСРСРРСРАРРСАСАСАО аККВТВНЕНРКЯСКРУСККККРУХУХРНОАЕРЕВАЕА^РЬЕРККЕЬТСОКРКАСРСРРСРАРРСАСРЯАС РККЕТЕМЕВРЯНСХРУаХККЯРУКУХРМаАЕОЕВАВАРРЬЕРЖЕЬТСЕКЬЕдАЯаРЕАдА^-ЕАААКАЕ О^ВТВКБШРВКаКРУаККЯКРУКУТРЫаА20Е1Л£АРРЬЕР1)КЕ1АаА?РЕРАВ0РЕАРАЕ-аААА.«А1; РХХвТВНЕНРЯНСХРУаТЖКЯРУКУТРМОАЕРЕЕАвАРРЬЕРХХЕЬТСЕКЬЕдАХгРЕАСАЕ-ВА^АКАЕ

ОХКВТЕМЕНРКТОХРУОХКМРУХУУРМУАЕКЕВАЕАРРЬЕРКЯЕЬЕОЕСР-----------------РС

СХЖЕТВМЕНРКИОХРУОККККРУКУТРНУАЕМЕВАЕАГРЬЕГККЕЬЕОЕКР-----------------ЬО

С1ХЕ;ЕКЕН7ЯИСКРУСХКККРУКУТР1<САЕРЕВАЕАРРЬЕРККЕЬАСЕКРЕРА1ЛРЕСААЕ-(:МААЬА0 ЕТВМЕНГКИБКРУаККНКРУКУТРНСАЕаЕгАЕАРРЬЕРХХЕЬАКЕКРЕРАКаРЕаРРЕ-вААТбАО

Вармбиимй район

_220

р-мсг

240

уо

-Эндорфяи

260_

270

27.8

Человек

Обезьяна

Внк

Свинья

Овца

Крыса

Шшь

Норка

Слон

ЬЕНВЫ.-----УААЕХКРЕСР1КНЕа?ЯЯС8РРКРККТ0СРНТВЕКВдТРЬУТЫКНА11ККАТХХСЕ

ЬЕНЕЫ.-----УААЕКК0ЕаРТ1ШЕНРКНСВРРК0ККТСаРИТ8ЕК8дТР1.УТЬРКНА11КМАГКК0д

иТСЬУАЕАЕА£ААЕХХРЕСР1ХМЕНГКИОВРРКРКЯТСаРМТВЕК8дТРЬУТЬРККА11К1<АНХКСд ЬЕТСЬУАЕЛЕА—АЕКК0ЕаРТХМЕНЕКНСЕРРКРКНТгаРМТВЕК8дТРЬУТЬГК1)А1УКМАНККСд ЬЕТСЬУАЕАЕА—АЕХ1ШВаРУКМЕНРКЯС8РРКРККТгСРНТВЕКВдТРЬУТ1.ГККА11К11;АККСд

ЬЕд-УЬ-----ЕРРТЕКАРСР7КУЕН?КМСКРРКРКК7ССРМТ8ЕК8дТРЬУТЬРКНА11КЫУНККСд

1.Ев-У1/—---гвРАЕКРРСРтаУЕНРЯНВЯРРКЕКВЮОРМТВЕКВдТРЬУТЬРКНАИКНАНКХСд

ХЕТСЬУАХАЕ—УАЕККРРСРТКНЕН7КМаВРаКРКИ70СРНТЕЕХ8дТРЬУТЬ7К|!А11К!1АНХКСд ХЛНСЬУАЕУЕАТВАЕХКОЕОРТКМЕНРКЯСЕРАКРКИТССРИТВЕКЕдТРЬУТЪККНАИКЫАТККОН

Рис. 4 Выравненные аминокислотные последовательности проопиомеланокортинов человека и других млекопитающих. Пять первых а.к. остатков сигнального пептида ПОМК человека выведены из последовательности мезона 2 гена ПОМК человека (ТакакагЫ И. и сотр., 1983), остальные - собственные данные. Последовательность ПОМК норки - собственные данные. Стрелками над последовательностью показаны границы пептидов - производных ПОМК. Звездочками над последовательностью обозначены полностью идентичные позиции ПОМК. Точки над последовательностью означают позиции, в которых произошла замена аминокислотного остатка на аналог, т.е. аминокислоту той же группы. Делеции в последовательностях про-ояиомеланокортина показаны при помощи тире. Заполненным блоком под последовательностью отмечен район делеции в вене ПОМК норки, приведшей к образованию альтернативного сайта протеолитического процессинга ПОМК норки - ЙК (АгдАгд).

Сравнительный анализ первичных структур проопиомеланокортина человека н других млекопитающих, а также мРНК их кодирующих.

Сравнительное выравнивание аминокислотных последовательностей ПОМК показало, что у всех видов млекопитающих биологически активные домены в белке-предшественнике расположены сходным образом и фланкированы с обоих концов парами Lys и Arg. Исключение составляют проопиомеланокортин мыши и крысы, у которых пара аминокислотных остатков Argeg-Arggo заменена на пару Projg.Argoo и пара Lys226-Lys227 н<* G'u226-Lys227 (рис. 4 ), поэтому у^-МСГ и ß-МСГ не могут появиться в результате протеолитического процессинга ПОМК. Степень консервативности ПОМК неравномерна по всей длине белка - предшественника и резко отличается на разных участках, причем границы консервативных и вариабельных районов четко совпадают с границами биологически активных доменов ПОМК. Высоко консервативны сигнальный пептид, у^-МСГа-МСГ, ß-МСГ и ß-эндорфин. Соединительный пептид и участок ПОМК между КПП и ß-МСГ, напротив, очень вариабельны и содержат многочисленные делеции, составившие у крысы и мыши почти половину длины этих районов (рис.4). В белок-кодирующей части нуклеотидных последовательностей мРНК ПОМК млекопитающих, наблюдаются те же закономерности в распределении консервативных и вариабельных участков, что и на уровне сравнения аминокислотных последовательностей ПОМК (рис.5). Также степень консервативности последовательностей неравномерна по длине, а границы консервативных и вариабельных участков мРНК четко совпадают с границами биологически активных доменов ПОМК, т.е. коррелируют с ее функциональной топографией. В 5'-нетранслируемом районе консервативны только участки, примыкающие к старту транскрипции гена и в большей степени к инициирующему ко-дону трансляции. 3'- нетранслируемые области мРНК ПОМК млекопитающих отличаются друг от друга делециями и вставками в большей степени, чем заменами одних нуклеотидных оснований на другие.

1 10 20 30 49 50 60 70

Человек

Обезьяна ATGCCGAGATCGTGCTGCAGCCGCTCGGGGGCCCTGTTGCTGGCCTTGCTGCTTCAGGCCTCCATGGAAG

Бык ATGCCGAGACTGTGCAGCAGTCGTTCGGGCGCCCTGCTGCTGGCCTTGCTGCTTCAGGCCTCCATGGAAG

Свинья ATGCCGAGATTGTGCAGCAGTCGCTCGGGGGCCCTGCTGCTGGCCTTGCTGCTTCAGGCCTCCATGGAAG

Крыса ATOCCGAaATTCTGCTACAGTCGCTCAGGGGCCCTGCTGCTGGCCCTCCTGCTTCAGACCTCCATAGACG

ATGCCGAGATTCTGCTACAGTCGCÎCAGGGGCCCTGTTGCTGGCCCTCCTGCTTCAGACCTCCATAGATG ********* *** *** ** ** »* ****** ******** * ********* ******* ** *

__Сигнальный пептид_

Яоо»2 ЗаенЗ

№шь

80 90 100 110 120 130 140

Человек TGCGTGGCTGGTGCCTGGAGAGCAGCCAGTGTCAGGACCTCACCACGGAAAGCAACCTGCTG 3AGTGCAT

Обезьяна TGCGTGGCTGCT'SCCTGGAGAGCAGCCAGTGTCAGGACCTCACCACGGAAAGCAACCTGCTG SAGTGCAT

Бык TGCGTGGTTGGTGCCTGGAGAGCAGCCA3TGTCAGGACCTCACCACGGAAAGTAACCTGCTG 3CGTGCAT

Сьанья TGCGTGGCTGGTGCTTGGAAAGCAGCCAGTGTCAGGACCTCTCCACGGAAAGTAACTTGCTG ÎCGTGCAT

Крыса TGTGGAGCTGGTGCCTGGAGAGCAGCCAGTGCCAGGACCTCACCACGGAAAGCAACCTGCTG 3CTTGCAT

Мышь TGTGGAGClrGGTGCCTGGAGAGCAGCCACTGCCAGGACCTCACCACGGAGAGCAACCTGCTGCCTTGCAT

** * • н***** **** *********** ********* ******* ** *** *****|» *****

Сигнальный пептид |_N-концевой çenmud

ISO 160 170 ISO 190 200 210

Человек CCGGGCCTGCAAGCCCGACCTCTCGGCCGAGACTCCCATGTTCCCGSGAAATGGCGACGAGCAGCCTCTG Обезьяна CCGGGCCTGCAAGCCCGACCTTTCGGCCGAGACTCCGCTGTTTCCGGGCAATGGCGACGAGCAGCCTCTG

ShK ccgggcctgcaagcccgacctctccgccgagacgccggtgttccccggcaacggcgatgagcagccgctg

Свинья CCGGGCCTGCAAACCAGATCTCTCCGCGGAGACGCCCGTGTTTCCCGGCAACGGCGACGCGCAACCGCTG Крыса CCGGGCCTGCAGACTCGACCTCTCGGCGGAGACGCCCGTGTTTCCAGGCAACGGAGATGAACAGCCCTTG

Мышь CCGGGCTTGCAAACTCGACCTCTCGCTGGAGACGCCCGTGTTTCCTGGCAACGGAGATGAACAGCCCCTG

****** *•** * •• •* t* ***** ** •*** ** ** *• 4* ** * ** ** **

Человек

Обезьяна

Бык

Свннья

Крыса

Нывь

Человек Обезьяна

Б UK

свинья

Крыса

Мывь

220 230 240 250 260 270 280

ACCGAGAACCCCCGGAAGTACGTCATGGGCCACTTCCGCTGGGACCGATTCGGCCGCCGCAACAGCAGCA ACCGAGAACCCCCGGAAGTACGTCATGGGCCACTTCCGCTGGGACCGATTCGGCCGCCGCAACAGTAGCA ACTGAGAACCCCCGGAAGTACGTCATGGGCCATTTCCGCTGGGACCGCTTCGGCCGTCGGAATGGTAGCA ACCGAGAACCCCCGGAAGTACGTCATGGGCCACTTCCGCTGGGACCGCTTCGGCCGCCGGAATGGCAGCA ACTGAAAATCCCCGGAAGTACGTCATGGGTCACTTCCGCTGGGACCGCTTCGGCCCGAGAAACAGCAGCA ACTGAAAACCCCCGGAAGTACGTCATGGGTCACTTCCGCTGGGACCGCTTCGÍCCCCAGGAACAGCAGCA

ПуМСГ

Tif-M'

er

290 300 310 320 330 340 350

GCAGCGGCAGCAGCGGCGCAGGGCAGAAGCGCGAGGACGTCTCAGCGGGCGAAGACTGCGGCCCGCTGCC

GCGGCAGC-------GCGCAC—CAGAAGCGCGAGGACGTCGCGGCTGGCGAAGACCGCGGCCTGCTACC

GCAGCAGCGGAGTTGGGGGCGCGGCCCAGAAGCGCGAGGAGaAAG-TGGCGGT-----------------

GCAOCGGCGGCGGTGGCG-GTGGCGGCGGCGCG-----GGCCAGAAGCGCGAGGAGGAGGAGGTGGCGGC

GTGCTGGCGGC-TCAGCGCA-----GAGGCGTGCGGA-------------GGAAGAGACGGCGGG-----

OTGCTGGCAGC-GCGGCGCA-----G IGGCGT 3CGGA-------------GGAAGAGGCGGTGTG-----

ГгМСГ

Соединительный пептид

3(0 370 380 390 400 410 420

Человек TGAGGGCGGCCCCGAGCCCCGCAGCGATGGTGCCAAGCCGGGCCCGCGCGAGGGCAAGCGCTCCTACTCC

Обезьяна TGAGGGTGGCCCCGAGCCCCGTGGCGATGGCGCCGGGCCGCGCCCGCGCGAGGGCAAGCGCTCCTACTCC

Бык GGGCGAAGGCCCCGGGCCCCGCGGCGATGACGCCGAGACGGGTCCGCGCGAGGACAAGCGTTCTTACTCC

Сввнья GGGCGAAGGCCCCGGGCCCCGCGGAGATGGCGTCGCGCCGGGCCCGCGCCAGGACAAGCGCTCCTACTCC

Крыса GGGAGATGGC----CGTCCGG--------------AGCCAAGTCCACGGGAGGGCAAGCGCTCCTACTCC

Нывь GGGAGATGGC----AGTCCAG--------------AGCCGAGTCCACGCGAGGGCAAGCGCTCCTACTCC

Норка QAGCGAGCCCGG---CCGC------------------------CGCGAGGGtjaAGCGqrCCTATTCC

Соединительный пептид

* ** ***

ЛКГГ(а-ЦСГ)

«30 440 450 460 470 480 490

Человек ATGGAGCACTTCCGCTGGGGCAAGCCGGTGGGCAAGAAGCGGCGCCCAGTGAAGGTGTACCCTAACGGCG

Обезьяна ATGGAGCACTTCCGCKKGGCAAGCCGGTGGGCAAGAAGCGGCGCCCGGTGAAGGTGTACCCCAATGGCG

Бык ATGGAACACTTCCGCTGGGGCAAGCCGGTGGGCAAGAAGCGGCGCCCGGTGAAGGTGTACCCCAACGGCG

Сввнья ATGGAGCACTTCCGCTGGGGCAAGCCCGTGGGCAAGAAGCGGCGCCCGGTGAAGGTGTATCCCAACGGCG

Крыса ATGGAGCACTTCCGCTGGGGCAAGCCGGTGGGCAAGAAGCGGCGCCCTGTGAAGGTGTACCCCAATGTCG

Мывь ATGGAGCACTTCCGCTGGGGCAAGCCGGTGGGCAAGAAACGGCGCCCGGTGAAGGTGTACCCCAACGTTG

Норка ATGGAGCACTTCCGCTGGGGCAAGCCTGTGGGCjUWïAAGCGGCGCpCGGTGAAGGTGTACCCCAACGGCG

а-МСГ

C^AGAAGCGGCGC^C

КПП

500 510 520 530 540 550 560

Человек CCGAGGACGAGTCGGCCGÁGGCCTTCCCCCTGGAGTTCAAGAGGGAGCTGACTGGCCAGCGACTCCGGGA

Обезьяна CCGAGGACGAGTCGGCCGAGGCCTTCCCCCTGGAGTTCAAGAGGGAGCTGACCGGCCAGCGGCCCCGGGC

Вых CCGAGGACGAGTCGGCCCAGGCCTTTCCCCTCGAATTCAAGAGGGAGCTGACCGGGGAGAGGCTCGAGCA

Сввнья CCGAGGACGAGTTGGCCGAGGCCTTCCCCCTCGAGTTCAGGAGGGAGCTGGCCGGGGCGCCCCCCGAGCC

Крыса CCGAGAACGAGTCGGCCGAGGCCTTTCCCCTAGAGTTCAAGAGGGAGCTGGAAGGCGAGCAGCCTGAT—

Мывь CTGAGAACGAGTCGGCGGAGGCCTTTCCCCTAGAGTTCAAGAGGpAGCTGGAAGGCGAGCGGCCATTA—

Норка CCGAGGACGAGTCGGCCGAGGCCTTCCCGCTCGAGTTC \AGAGApAGCTGGCCGGGGAGCGGCCTGAGCC * *** ****** *** ******* ** ** ** •**» **

ЛКТГ {КПП)

ß-ЛПГ (BP)

570 590 590 600 610 620 630

Человек gggagatggccccgacggccctgccgatgacggcgcaggggcccaggccgacctggagcacagcctgctg

Обезьяна gggggatggccccgatggccctgccgacgacggcgcggggccccgggccgacctggagcacagcctgctg

Бык ggcgcgcggccccga-ggcccaggc—tgagagtgcggccgcccgggctcagctggagtatggcctagtg

Свинья ggcacgggaccccga-ggccccggc—cgagggcgcggccgcccgggccgagctggagtacgggctggtg

Криса GGC—TTGG-----A-G-----------------------------------------CAAGTCCTGGAG

Мышь GGC—TTGG-----A-G-----------------------------------------CAGGTCCTGGAG

Норка GGCGCTCGGCCCCGA-GGGCGCGGC—CGAGGGCATGGCGOCCCTGGCCGACCTGGAGTACGGCCTGGTG

640 650 660 670 680 690 700

GT---------------GGCGGCCGAGAAGAAGGACGAGGCCCCCTACAGGATGGAGCACTTCCGCTGGG

GT---------------GGCGGCCGAGAAGAAGGATGAGGGCCCCTACAGGATGGAGCACTTCCGCTGGG

GCGGAGGCGGAGGCCGAGGCGGCCGAGAAGAAGGACTCGGGGCCCTATAAGATGGAACACTTCCGCTGGG

GCCGAGGC------CGAGGCGGCGGAGAAGAAGGACGAAGGGCCCTATAAGATGGAGCACTTCCGCTGGG

CCGGATA---------------CCGAG---AAGGCCGACGGGCCCTATCGGGTGGAGCACTTCCGCTCGG

TCCGACG---------------CGGAG---AAGGACGACGGGCCCTACCGGGTGGAGCACTTCCGCTGGA

G------CGAAGGCCGAGGTGGCGGAGAAGAAGCACGACGGGCCCTACAAGATGGAGCACTTCCGCTGGG

* **L ***r ** ***** * **** ************

Вариабельный район (BP) -1 I-ß-МСГ

Человек

Обезьяна

Бык

Свинья

Крыса

Мышь

Норка

710 720 730 740 750 760 770

Человех GCAGCCCGCCCAAGGACAAGCGCTACGGCGGTTTCATGACCTCCGAGAAGAGCCAGACGCCCCTGGTGAC

Обезьяна GCAGCCCGCCCAAGGACAAGCGCTACGGCGGCTTCATGACCTCCGAGAAGAGCCAGACTCCCCTGGTGAC

Бык GCAGCCCGCCCAAGGACAAGCGCTACGGTGGGTTCATGACCTCCGAGAAGAGCCAAACGCCCCTTGTCAC

Свинья GCAGCCCGCCCAAGGACAAGCGCTACGGCGGCTTCATGACCTCCGAGAAGAGCCAGACGCCCCTGGTCAC

Г.рыса GCAACCCGCCCAAGGACAAGCGCTACGGCGGCTTCATGACCTCCGAGAAGAGCCAGACGCCCCTGGTGAC

Мышь GCAACCCGCCCAAGGACAAGCGTTACGGTGGCTTCATGACCTCCGAGAAGAGCCAGACGCCCCTGGTGAC

Норка GCAGCCCGGGCAAGGAIAAGCGlfTACGGCGGCTTCATGACCTCCGAGAAGAGCCAGACCCCCCTGGTGAC

ß-МСГ

ß-Эндорфин

780 790 800 810 819

Человек GCTGTTCAAAAACGCCATCATCAAGAACGCCTACAAGAAGC-GCGAGTGA

Обезьяна ACTGTTCAAAAACGCCATCATCAAGAACGCCTACAAGAAGGGCCAGTGA

Бык GCTGTTCAAAAACGCCATCATCAAGAACGCCCACAAGAAGGGCCAGTGA

Свинья GCTGTTCAAAAACGCCATCGTCAAGAACGCCCACAAGAAGGGCCAGTGA

Крыса GCTCTTCAAGAACGCCATCATCAAGAACGTGCACAAGAAGGGCCAGTGA

Мышь GCTCTTCAAGAACGCCATCATCAAGAACGCGCACAAGAAGGGCCAGTGA

Норка GCTGTTCAAAAACGCCATCATCAAGAACGCCCACAAGAAGGGCCAGTGA »* ***** •**•****« ********* *********** *****

ß-ЛПГ (ß-Эндорфин) —-1

Рис. 5 Сравнение нуклеотидных последовательностей кодирующей области матричных РНК ПОМК человек а и других млекопитающих. Звездочками обозначены позиции идентичных нуклеотидов. Стрелками под последовательностью показано расположение районов мРНК, кодирующих биоактивные домены ПОМК. Граница ЭкЗФНв 2/ЗкЗОМ 3 генов ПОМК обозначена над последовательностью. Первые 14 нуклеотидов последовательности кодирующей области мРНК ПОМК человека, недостающие в секвенированной нами кДНК, выведены из последовательности зкзона 2 гена ПОМК человека (Takakaski Н. и сотр., 19S3). Нуклеотидные последовательности мРНК ПОМК обезьяны, быка, свиньи и мыши опубликованы в работах Patel P.D. и сотр. (1988), Nakaniski S. и сотр. (1979), Boileau G. и сотр. (1983), Harigaya Т. и сотр. (1986). Первичная структура мРНК ПОМК крысы выведена нами из нуклеотидной последовательности гена ПОМК крысы, опубликованной в работе Drouin J. и сотр. (1985).

Различия в консервативности районов белка ПОМК могут бьггь вызваны не только их отличающейся функциональной значимостью и влиянием естественного отбора, но и зависимостью частоты возникновения мутаций от структурных особенностей ДНК, кодирующей эти районы. В мРНК ПОМК все участки, кодирующие биоактивные пептидные домены ПОМК, определяются одним экзоном 3 (рис.5). Соответственно анализ первичной структуры мРНК данного района выявляет особенности и экзона 3 гена ПОМК.

Ripley L.S. и Glickman B.W. (1983) показали, что во многих случаях возникновение одиночных и множественных нуклеотидных замен может быть объяснено на основе предположения о формировании в ДНК гетеродуллексных вторичных структур, соответствующих несовершенным инвертированным повторам. Колчанов и соавторы (1985) - не только инвертированным, но и прямым и тандемным повторам. Репарационная коррекция таких несовершенных самокомплементарных последовательностей, образующих шпилечные структуры, приводит по мнению Ripley L.S. и Glickman B.W. (1983) к образованию кластеров предопределенных точ-ковых мутаций. Определенные нами нуклеотидные последовательности кДНК ПОМК человека (909 н.п.), быка (732 н.п.) и норки (585 н.п.) насыщены совершенными прямыми и инвертированными повторами размером 6, 7 и более пар нуклеотидных оснований (таблица 1).

Таблица 1. Содержание повторов минимальной длины 6/7 н.п. в нуклеотидных последовательностях кДНК ПОМК человека, быка и норки и кДНК пролактина человека и норки.

Число |фтыгтмг

, ^ ^ хДИК кД ПК к ДИК

' помк ПОМК * ' ПОМК

' человека ■ быка 4 норки

' ь 206/68 115/44 90/37

3 ' 1

«дяккдик

'пролактина пролактина ¿человека * . ' норки

?0Щ 196/58 *60/17.дй->1| 91/29 мм

емой ' 909 н.п. 732 н.п. ' ' 585 н.п.

53/14 58/23

;58^15^:,.дЙ 9/2

|704'Н.п." V .ч Ч 682 н.п.

0.227/0.075 0 157/0.06 0.153/0.063 ;а075/0.(Н9 • 0.085/0.033

послёдаштешосга ДНК • Чксл» п^«^йо»торош < ИИН1МалвоЙдаявйВ в/7 tt.li.,'

норияро»«шЬе н»1 луклеотад f-^/ X-^'Sl

WadmMHtam- 0.215/0.063 0.081/0.023 ! 0.155 /0.049 |0.082^Ь^21 0.013/0.003 ров иининжлмта жилой С/7 н.в. иорннромняое в»*1

■уыеогад

Рис. 6 График распределения нуклеотидных оснований СС в нуклеотидной последовательности секвенированных нами кДНК ПОМК человека (верхний) и норки (нижний), полученный анализом последовательности при помощи программы РОСНЫЕ. Интервал расчета 30 н.п.. На графике указаны районы кДНК, кодирующие пептидные домены проопиомеланокортина.

%ос

□■даспсмк&ю

■^КГЕМОцм

Сигнал. Остат. -ги-МСГ узс-МСГ СП а-МСГ КПП пептид К-КП

К-копаевой пептид

А К Т Г

р - Л П Г

Рис. 7 Сравнительная диаграмма процентного содержания нуклеотидных пар СС в определенных нами последовательностях кДНК ПОМК человека, быка и норки по районам, кодирующим пептидные домены ПОМК. Обозначения районов кДНК, кодирующих: сигнальный пептид - Сиг-вал. петнд; N-концевую часть Ы-копцевого пептида ПОМК - Остат. К-КП; гамма/,МСГ - 71,2-МСГ; С-концевая часть гаммауМСГ - у]с-МСГ; соединительный пептид - СП; альфа-МСГ - а-МСГ; кортикотропинподобный пептид - КПП; вариабельный район ПОМК - ВР; бета-МСГ - р-МСГ; бета-эндорфин - р-ЭФ; З'-нетранслируемый район мРНК ПОМК - З'НТР.

Распределение вС пар в последовательности мРНК ПОМК человека, быка и норки четко коррелирует со степенью консервативности или вариабельности рассматриваемого участка. Чем консервативнее район мРНК ПОМК, тем ниже в нем содержание вС пар. И наоборот, в районах с наибольшим числом отличий, содержание йС пар заметно выше (рис. 6,7).При секвени-ровании кДНК ПОМК норки мы обратили внимание на значительное количество

"компрессий" на радиоавтографах секвенирующих гелей в участках, соответствующих вариабельному району (с 155 по 268 на рис.3). Появление компрессий при секвенировании обычно объясняют наличием шпилечных структур в анализируемой ДНК. Мы построили возможные вторичные структуры для участков цепи ДНК из области экзона 3 гена ПОМК, идентичных и комплементарных секвенированным нами кДНК ПОМК человека, быка и норки (рис. 8,9). Отметили на них наиболее вариабельные основания, отличающиеся более чем у двух мРНК ПОМК. Видно, что вариабельный участок располагается в высокоструктурированном районе, а наибольшее число отличий приходится на правую часть крестообразной структуры (рис. 8). Мы полагаем, что механизм возникновения мутаций в ДНК, кодирующей ПОМК может быть сходным с идеями, предложенными Ripley L.S. и Glickman B.W. (1983). А именно, в процессе репликации геномной ДНК, в области репликативной вилки, новосинтезированный на геномной ДНК матрице фрагмент, согласно идеям Ripley L.S. и Glickman B.W. (1983), может образовывать вторичные структуры (рис. 96), например, подобные изображенным на рис. 8 и 9а. Стабильность таких структур значительно повышается при наличии в данном районе повторов и палиндромов и высокого содержания GC пар (табл.1, рис.6,7). Ферменты репарации, работая в районе репликативной вилки "проверяют" комплементарность новосинтезированной цепи с материнской, репарируя любые несоответствия участков ДНК. В районе А (рис.96) эти ферменты могут ошибиться, т.е. могут узнавать неполностью комплементарные участки шпилечной структуры, например, пары G'.T или петлевые неспаренные участки размером в несколько пар оснований, и провести коррекцию района А цепи ДПК, приведя ее в соответствие с " псевдородительской" частично комплементарной цепью (районом В). В шпилечной структуре неспаренные основания могут подвергаться эксцизии в одной из нитей ДНК, при этом вторая нить ДНК будет служить матрицей для последующей застройки корректируемого участка. Некоторые фрагменты таких шпилечных структур могут и вовсе быть вырезаны (рис.8). Сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей кДНК ПОМК млекопитающих, наложенный на расчитанны вторичные структуры ДНК из области экзона 3 гена ПОМК человека и норки, показал, что здег} как бы произошла замена пар 0:Т5<й и G:T6so на С;С565 и G:Cg5Q (рис. 8), пар G6i9:T и T5m:G на AgigiT и (рис. 9а). В ДНК ПОМК крысы и мыши делегирован район, совпа-

дающий со стеблем шпильки для ДНК ПОМК норки (рис. 8). Интересно отметить, что в большинстве полученных нами вариантов вторичных структур консервативные и вариабельные районы ДНК располагаются по противоположные стороны от оси вероятной шпилечной структуры, как на рис. 8 и 9а. Мутации в районах гена ПОМК, соответствующих важным биоактивным доменам, которые у ПОМК высоко консервативны, могут приводить к нарушению функции соответствующих гормонов и, следовательно, отсекаться естественным отбором.

5'-

у человека, обезьяны, быка и свиньи.

Делеция € н.п. е последовательности мРНК ПОМК норки? рис. 5)

Примерный (рис.5), район делеции в мРНК ПОМК мыши и крысы.

в Т

С С

\ ©

© (5©

©30 ©О©©© ©©©©¡а) © ______> ®

Примерный, по данным выравнивания нуклеотидных последовательностей мРНК ПОМК млекопитающих (рис.5), район делеции в гене ПОМК мыши и крысы, совпадающий со стеблем шпилечной структуры ДНК ПОМК норки.

ад^ у человека,обезьяны,быка и свиньи.

Рис. 8 Возможная вторичная структура ДНК ( нумерация нуклеотидной последовательности от 500 до 659 по рис.5),.иодирующей вариабельный участок ПОМК норки (АО- •96.4 ккал/Моль). Кружочками отмечены наиболее вариабельные нуклеотидные основания, отличающиеся более, чем у двух мРНК ПОМК (рис.5 )• Показаны примерные участки делеции в

мРНК ПОМК мыши и крысы. В закрашенные рамки заключены некоторые замены в мРНК ПОМК других млекопитающих.

А)

Б)

, С С

С 6 5 « С

5 ' Vе "У 5 с

вр\с:( ш.

'¡и У обеэмны, быка ■ зорки

I с

5' с660

т

I

■Л.

ВР I ■ г » «-МСГ

« с -'461

6 с

С 6 КПП с с « 5/*—Гл с

^ е ^ • I

с 51 с •:

А А

с «"•

5 ® С с ц с

1 с ст с е 6 с « б в

Vе 1

у саккьи с 5

Л«. 1'5г5 й

« * «

С 6 ® I 11(11

1 » с

С 1 < 5

5 С С С « С

/ с I 5 'ИТУ

Т«7 у быка

Ал» у быка, «нам ■ вора

Рис. 9 Л) возможная вторичная структура (АС - -69.6 ккал/Молъ) фрагмента ДВХ, комплементарного мРНК ПОМК человека (нумерация нуклеотидной последовательности от 660 до 461 по рис 5), построенная при помощи программы PCFOLD.EXE. Б) Гипотетические структуры, с высокой вероятностью возникающие в процессе репликации ДИК. Новосинтезирован-ная цепь ДНК комплементарна матричной РНК

С другой стороны, если участок гена ПОМК не подвержен сильному давлению естественного отбора, мутации, возникшие вследствие предложенной нами репарационной коррекции района А по "матрице" В района (рис.96) шпилечной структуры, в принципе могут фиксироваться. В пользу предложенного механизма повышенной частоты возникновения мутаций, особенно в вариабельных районах гена проопиомеланокортина свидетельствуют:

♦ насыщенность всего кодирующего района экзона 3 гена ПОМК разного рода совершенными повторами, которые создают предпосылки для формирования вторичных структур ДНК.

♦ повышенное содержание вС пар в нуклеотидной последовательности экзона 3 гена ПОМК, особенно в вариабельных районах, что должно увеличивать стабильность образующихся вторичных структур.

♦ наличие в экзоне 3 гена ПОМК протяженных (самые длинные - до 22 н.п., кодируют высококонсервативные домены меланотропинов) прямых повторов, которые фланкируют вариабельные районы мРНК ПОМК. Вторичные структуры, с высокой вероятностью образующиеся в соответствующих им районах ДНК экзона 3 гена ПОМК, могут стабилизироваться фланкирующими их повторами.

Можно предположить, что отмеченные нами структурные особенности ДНК и предложенный механизм могут реализоваться и в других случаях, когда наблюдается относительно высокая вариабельность определенных участков генома.

Нуклеотидная последовательность кДНК пролактина из гипофиза человека.

Определенная нами нуклеотидная последовательность кДНК пролактина из гипофиза человека имеет размер 704 н.п. (рис.10). Она содержит всю З'-нетранслируемую область мРНК и кодирует пролактин человека, за исключением шестнадцати Ы-концепых аминокислотных остатков гормона и сигнального пептида входящего в состав препролактина. Два отличия этой последовательности из гипофиза от последовательности кДНК пролактина из пролактиномы человека не меняют состав продукта трансляции. Ранее было показано, что в гипофизе млекопитающих присутствует гликозилированная форма пролактина, в которой единственная в молекуле углеводная цепь присоединена к Азп-31 остатку, и установлено, что гликозилированный свиной пролактин обладает повышенной лактогенной активностью (Бутнев В.Ю. и сотр., 1987). В последовательности пролактина человека мы локализовали один вероятный сайт Ы- гликозилирования гормона также по Азп-31. Семь сайтов фосфорилирования, удовлетворяющих консенсусным последовательностям широкоизвестной базы данных РКОЭ1ТЕ (США), показаны на рис 10. Гомология определенной нами нуклеотидной последовательности кДНК пролактина из гипофиза человека составляет при сравнении:

10

20

30

40

50

60

70

90

САССТОТТТОАССССССССТССТССТСТСССАСТАСАТССАТААССТСТССТСАСАААТСТТСАОССААТТССАТАААСО(ЗТАТАСС АзрХ.еиРЬеА.ярАгдА]. л''/а 1'/■а! Т.оиЭс гН1 зТу г! 1 еН: 5; Аяп1.еиЗегЯег 01 uMETPhe.SerGluFheA.ipLy.*; АгдТугТЬ г

17 20 37 л j_ «о

ГО Ср)

\и)

90 100 110 120 ^^^ 130 140 150 160 170

САТбСССССбССТТСАТТАССААСбССАТСААСАС^ТСС^АСАСТТСТТСССТТСССАССССССААСАСААССАССААССССААСАб Н1з01уАгдС1уРпе11еТЬгЬузА1а11еА5пЗе^СузУ1зТКгЗегЗегЪеиА1аТЬгРгоС1иАзрЬузС1иС1пА1аС1пС1п 50 60 Г 70

Ф

180 190 200 210 220 230 240 250 260

АТСААТСАААААСАСТТТСТСАСССТОАТАбТСАССАТАТТАССАТССТССААТСАСССТСТбТАТСАТСТССТСАСССААСТАССТ МЕТАзпС1пЬузА5рРЬеЬеиЗегЪеи11еУа13ег11еЬеиАгд9егТгрАзпС1иРгоЬеиТ]угН1вЬеиУа1ТЬгС1иУа1Агд 80 100

оо со

270 280 290 300 310 320 330 340

ОСТАТОСААСААОССССССАЕССТАТССТАТССАААЕСТСТАСАОАТТаАСЕАССАААССАААССОСТТСТАСАСЕССАТОСАОСТС С1уМЕТб1пС1иА1аРгоС1иА1а11еЬеи5егЬузА1аУа1С1и11еС1иС1иС1пТ]ЬгЬузАгдЬеиЬеиС1и51уМЕТС1и1.еи 110 120 130

350 360 370 380 390 400 410 420 430

АТАСТСАВССАСеТТСАТССТеАААССАААСААААТеАСАТСТАСССТеТСТОЗТСССаАСТТССАТСССТССАСАТСесТеАТаАА 11 е'^'а1 Яе гС1гЛ'а 1Н1Б р гоС1 иТЬ гЬуя С1иА.=пС1и 11еТуг Рго'/а 1 Тг р5е гС1 уЬеиргоЯе г ЬеиС! :;Мг:ТА1аЛ5р31и

140 150 160

480

170

490

500

510

520

440 450 460 470____

САСТСТССССТТТСТССТТАТТАТААССТССТССА рТСЗСТАСССАССОАТТСАСАТААААТССАСААТТАТСТСААвСТССТСААО С1иЗегАгдЬеи5егА1аТугТугАзпЬеиЬеиК1 зСузНеиАгдАгдАзрЙегШзЬуаПеАзрАзпТугЬеиЬузЬеиЬеиЬуз

СЬ_¿._ » , I- ■1яп_ топ

XI)

530 540 550 560 570 580 590 600

ЬСААТСАТССАСААСААСААрТ^СТААССССАСАТССАТТТСАТСТАТТТСТСАСААССТССТТААТСАТСССТТССАТТССАА [ СузДгдИеНегивАвпАзпАБпСузч**

ССТТСТТТТАСТТСГАТСТСТТТТаААТССАТССТТСССТОТААСАвбТСТССТСТТААА 1ААТ,

еао [3 690 кСТСАСТССТТА(ЗА(ЗАСАТ

700

СААААТСТ-ро1у(А)

Рис. 10 Нуклеотидная последовательность секвенированной кДНК пролактина из гипофиза человека. Участок пролактина, соответствующий консенсусной аминокислотной последовательности [С-(Ь,1, У,М,Р, У)-Х2-О Х4-(Е,0,(Ь,!, У)-Х-(1„Г, У,М,Р, У)-Х2-С], на основании которой можно отличить белки, относящиеся к семейству пролактина, гипофизарного гормона роста (соматотропина) и плацентарного лактогена, заключен в тонированную рамку. Знаком ••• показан терминирующий кодон мРНК. Нумерация аминокислотных остатков пролактина норки приведена в соответствие с принятой для полноразмерного пролактина. Светлыми овалами показаны аминокислотные остатки цистеина, которые располагаются в высококонсервативных позициях и вовлечены в образование дисульфидных связей в молекуле белка. Сигнал полиаденилирования - ААТААА в З'-нетранслируемой области мРНК пролактина человека заключен в рамку и подчеркнут. Знаком Га показан потенциальный сайт М-гликозилирования аминокислотного остатка - аспарагин-31, определенный на основании компьютерного анализа аминокислотной последовательности пролактина человека. Потенциальные сайты фосфорелирования пролактина человека указаны как Р в овале. Отличия от кДНК пролактина из пролактиномы человека показаны над нуклеотидной последовательностью.

♦ с мРНК пролактина человека из пролактиномы (Cooke N.E. и сотр., 1981) - 99.7%

♦ с мРНК пролактина человека из плаценты (Takahashi Н. и сотр., 1984) - 59.4%

♦ с мРНК из плаценты обезьяны Масаса mulatta (Brown N.A. и сотр., 1994) - 97.3%;

♦ с мРНК пролактина из гипофиза свиньи (Schulz-Allen M.-F. и сотр., 1989) - 83.8%;

♦ с мРНК пролактина из гипофиза овцы (Adams Т.Е. и сотр., 1989) - 80%

♦ с мРНК пролактина из гипофиза быка (Sasavage N.L. и сотр., 1982) - 80%;

♦ с мРНК пролактина из гипофиза норки (собственные данные) - 83.8%;

♦ с мРНК пролактина из гипофиза хомяка (Southard J.N. и сотр., 1991) - 83.8%;

♦ с мРНК пролактина из гипофиза мыши (Harigaya Т. и сотр., 1986,) - 73.5%;

♦ с мРНК пролактина из гипофиза крысы (Cooke N.E. и сотр., 1980) - 73.2%.

Определенная нами нуклеотидная последовательность кДНК пролактина из гипофиза человека зарегистрирована в базе данных EMBL nucleotide sequence database (Англия) и в банке данных GenBank (США) под номером PN0082.

Нуклеотидная последовательность мРНК пролактина из гипофиза норки.

Нуклеотидная последовательность кДНК пролактина нерки (рис.11), определенная нами впервые, представляет собой неполную копию мРНК. Она имеет размер 682 н.п., кодирует пролак-тин норки за исключением двадцати четырех N-концевых а.к. остатков, а также сигнального пептида, входящего в состав препролактина. Она содержит полную 3'- нетранслируемую облает мРНК размером 154 н.п. и в ее составе два возможных сигнала полиаденилирования ААТААА (поз. 646-651 и 675-680). Используя базу данных EMBL nucleotide sequence database (Англия) и пакет программ PCGENE v.6.0 фирмы IntelliGenetics Inc. (США), мы провели сравнительный компьютерный анализ определенной нами нуклеотидной последовательности кДНК пролактина норки и мРНК различных видов животных, кодирующих белки данного семейства - про-лактин, гипофизарный гормон роста (соматотропин), плацентарный лактоген и пролиферин. При этом степень гомологии нуклеотидных последовательностей составила 70.3-8S.8%, 52.553.5%, 61.7-68.1% и 58.8-61.4% соответственно. А при внутривидовом сравнении первичной структуры определенной нами кДНК пролактина и мРНК сэматотропина норки (Mustela vison) [регистрационный номер EMBL - Р19795] степень гомологии составила 52.5%. Потенциальный сайт гликозилирования пролактина норки, определенный нами согласно консенсусной последовательности Asn-HePro-Ser/Thr-HePro (Bause Е. 1983), также как и у пролактина человека, соответствует аспарагину в 31-м положении (рис. 11). Потенциальные сайты фосфорилирования пролактина норки располагаются на а.к. остатках Ser-(79, Ser-64, Thr-65, Ser-90 и Туг-96 (рис. 11). Нуклеотидной последовательности кДНК пролактина норки присвоен регистрационный номер Х63235 в базе данных EMBL nucleotide sequence database (Англия) и банке данных GenBank (США).

1 10 20 30 40 50 60 70 80

СТТТСССАСТАСАТССАТМССТСТССТСТСАСАТСТТСААС(1ЛАТТСаАТААААааТАТОСССАСС«:СОООООТТСАТТАССААа Ьви8егН1вТуг11еН1ьШ1Ьви8ег^егс1иМвгРЬеАвпС1иРЬвАврЬувАгдТугА1а01па1уАгдс:1уРЬв11аТЬгЬуа 25 зорн 40 50

90 100 110 120 130 140 150 160 170

СССАТСААСАСО^^бСАСАСТТССТСССТСТССАССССТСААСАСААССАССААССССАССАСАТССАТСАТСААСАССТТСТСААС

^-МГ 60 70 80

180 190 200 210 220 230 240 250 260

ТТСАТАСТСС<1АСТССТаС0СТССТССААСаАСССССТСТАТСАТСТАаТСТСАаАА0ТСС0аСССАТССААаАА0ССССА0АТТС0 Ьви11вЬеиАтдУа1ЬвиАгд8^гТгрАвпА8рРгоЬеиТ1|гН18ЬвиУа1БвгС1иУа1АгдС1уМвЪС1пС1иА1аРгоАвр8вг

юо но

270 280 290 300 310 320 330 340

АТТСТСТССАС<л(^САТС(ЗДЗДТТСАС<ЗААСААААСАСААЗДСТТСТАСАСССТАТС<^СААСАТАСТСССССАССТТСАТССТС(ЗД 11еЬеиБвгАгдА1а11еа1и11е<;1иа1иС1лА8пАгдАгдЬеиЬеиС1иа1уМе1а1иЬув11е¥а1С1уС1пУа1Н1вРгоС1у 120 130 140

360 370 380 390 400 410 420 430

ОТСАСАСААААССАССТТТАСТСССТСТССТСАССАСТТССАТСТСТССАСАТСССТСАТСААСАСТСАССССТТТТТССТТТТТАТ Уа1АгдС1иА8пС1иУа1Туг8егУа1Тгр8вгС1уЬвиРго8вгЬвиС1пМв1А1аАвра1иАвр8вгАгдЬеиРЬеА1аРЬвТуг 150 160

440 460 470 480 450 1 810 520

ААССТССТСС^ТО^ТАСССАСССАТТСАСАСААСАТТСАСААТТАТСТСААССТССТСАл€таОССаАТССТСТАССАСАС5СААС А*пЬ«иЬвин18Су^»иАгдАгфА8р6с|гн1й£уа11вАарА«пТугЬви1уеЬеи1виЬ1еСубкгд11аУа1ТугЛвр8егАвп 170 -1.Ац»0_____

-ф

530 540 550 560 570 580 590 600

ИГГОТААССССАСАТССССССССЗТС^СТТТССООААСТТТСТТААТСАТССаТСССАТАОСААССТССТСТТАОСТТТАСАОСТТТСТ

таг

660 670

едтссА<5(^тте<^тст1Атсс<зтетеА^

^ J ч_^

Рис. 11 Нуклеотидная последовательность секвенированной к ДНК пролактина норки. Участок пролактина норки, соответствующий консенсусной аминокислотной последовательности 1С-(и и V, М, Р, УуХ2-0-Х4-(Е, 0,5>-Х2- (Ь, I, У)-Х-(Ь, I, V, М, Г, У>-АГ2-С/, на основании которой можно отличить белки, относящиеся к семейству пролактина, гипофизарного гормона роста (соматотропина) и плацентарного лактогена, заключен в тонированную рамку. Знаком ••• показан терминирующий кодон. Нумерация аминокислотных остатков пролактина норки приведена в соответствие со структурой полноразмерного пролактина. Кружками показаны аминокислотные остатки цистеина, которые располагаются в высококонсервативных позициях и вовлечены в образование дисульфидных связей в молекуле белка. Альтернативные сигналы полиаденилирования - ААТААА в 3 нетранслируемой области мРНК пролактина норки заключены в рамки и подчеркнуты. Знаком Га показан потенциальный сайт М-

гликозилирования остатка Азп-31, определенный на основании компьютерного анализа аминокислотной последовательности пролактина норки. Вероятные сайты фосфорилирования указаны как Р в тонированном круге.

Сравнительный анализ первичных структур пролактина человека и ряда млекопитающих, а также мРНК их кодирующих. Аминокислотная последовательность всех биоактивных доменов ПОМК, границы которых четко коррелируют с границами вариабельных и консервативных участков мРНК, обусловлена в конечном счете первичной структурой одного протяженного экзона - экзона 3. Из 833 н.пар последовательности экзона 3 - 669 н.п. соответствуют кодирующей области мРНК ПОМК человека (Takahashi Н. и сотр., 1983; собственные данные). Кодирующая область нуклеотидной последовательности мРНК пролактина (цифры подчеркнуты), отличия в которой обуславливают замены в последовательности белка, определяется пятью короткими экзонами размером -5fi+28. 176. 108. 180 и 193+153 н.п. (Truong А.Т. и сотр., 1984). Поэтому, без анализа первичной структуры прилегающих нитронов гена пролактина, трудно говорить о влиянии свойств нуклеотидной последовательности гена на возникновение замен в аминокислотной последовательности пролактина, в отличие от экзона 3 гена ПОМК. Однако, интересно все же отметить, что значительно более низкое содержание разного рода повторов (табл.1) и GC пар (рис.12), как показал анализ последовательностей секвенированных нами кДНК пролактина человека и норки, должно понижать вероятность образования вторичных структур ДНК, по крайней мере в области экзонов, и реализацию, таким образом, предложенного здесь для гена ПОМК механизма. Сравнение известных аминокислотных последовательностей препролакгина млекопитающих показало, что в целом аминокислотная последовательность препролактина высококонсервативна. У млекопитающих аминокислотные остатки цистеина, вовлеченные в образование дисульфидных связей, располагаются идентично. Отличия же в последовательностях пролактина млекопитающих, в большинстве своем, представляют замены консервативного типа, когда аминокислотные остатки белка сменяются аналогичными (рис.13), т.е. принадлежащими к одной и той же группе - основные на основные, полярные на полярные и т.д.. Имеются также небольшие вариабельные районы: сигнальный пептид - позиции а.к. остатков от -28 до -18 и от -4 до -1; область пролактина - позиции от 45 до 59, от 73 до 79, от 140 до 146 и от 165 до 172. Наибольшее количество идентичных аминокислотных остатков наблюдается в районе 174-191, соответствующем вышеупомянутому консенсусу, на основании которого можно отличить белки, относящиеся к семейству гормона роста - пролактина. от остальных (M.Wallis и соавт. 1985). Поскольку в литературе практически нет данных о влиянии тех или иных групп или отдельных аминокислотных остатков пролактина на его функциональную активность, проведенный сравнительный анализ может оказаться полезным в исследованиях такого рода. Видно, например, что в достаточно вариабельном сигнальном пептиде препролактина содержится высоконсервативный лейциновый блок. Аминокислотный остаток Lysjg; (рис.13) пролактина, критичный для связывания пролактина с рецептором (Cunningham B.C. сотр., 1989) идентичен у всех млекопитающих.

.9 "

°7ох100

кДНК пролактина человека

Рис. 12 График распределения нуклеотидных оснований вС в последовательности секвенированных нами кДНК пролактина человека (верхний) и норки (нижний), полученный анализом нуклеотидной последовательности при помощи программы РСвЕИЕ. Интервал расчета 30 н.п..

-30 1 10 20 30

* . * * в * ^ * # * * * * # * * * * ...****

Человек НШКСвРИКСЗ — Т,Ы,Ы, У8Н1,Ы,Сд8УАР1,Р 1СРССААКСдУТЬН01,Е0НЛУ УЬ8ВУ1В

Обезьяна МШКСБРИКСЗ—Ы,1.Ы,У8Ш,Ы.СдЫУАР1,Р1СР0еААВСдУ,Г1,В01,ЕПНАУУ1,8ВУ1В

Бык МО8КО88дКО8НЫ,Ы,1,УУ8Ш,1,1,СдвУУ8ТРУСРНСРОНСдУ81,К01,Е0КАУМУ8ВУ1В

Овца МВ8КС8АдКС8Я1,Ы,1,1,УУ8Ы1,1,1.СдвУУ8ТРУСР11еРСИСдУ81,и01,Е0КАУМУ8В¥1В

Свинья М0тС88дК08ЬЫ,1,1.И.У8Н1,Е1,СК8УА81,Р1СР8еАУИСдМ81,К01,Е011АУ1Ь8В11В

Крыса МН8дУ8АККАСТЬЫ,1.ММ-81»1,ЬЕСдНУдТ1,РУС80С—ОСОТРЬРЕЬЕОНУУМЬЗВУХН

Мышь М№дв8АдКАСТЫ,1,1,Ы-8Ш,1,ЕСдНУдР1,Р1С8АС— ОСдТ8Ы1Е1,ЕОКУУ:Г1,8ВУ1Н

Хомячок МН80С8Ш1КАУТ1,Ы,1.УМ-8Н1.1.РСдЫАВР1,Р1СРСС— ЛС0МР1,дЕ1,Е011У1М1.8ВУ1 У

Норка ------------------------------------------------------ЬвВПН

КВТ ------------------------------1,Р1СР80АУМСдУ8ЬК01,Е011АУ11,ЗВУ 1Н

Верблюд ------------------------------ЬР1СР8САУКС0У8ЬКВЬЕаКАУ1Ь8В'/1В

Лошадь ------------------------------1,Р1СР80АУКСдУ81,11Е1,Е011АУ11,8НХ1Н

СЛОН ------------------------------1РУСР11С8УНСдУ81,Р0ЪЕ0КАУМ1.8Н¥1Н

* . * *. ***..***.-*. * * * * * *.****...****

40 50 60 70 80 90

*..***..*.* . * . . ****.*•*.*..* ..*....*

Человек ЫЬ88ЕМГ8ЕГОККУТНСЙвЕ1ТКА1Н8СНТ88ЬАТРЕОКЕОАООН№КОЕЬ8ЫУ81ЬК8 Обезьяна Ш.38ЕМЕ8ЕЕ0ККУТНС11СЕ1ТКА1Н8СНТ881,РТРЕ0КЕдАддМЫдК0Е1,81ЛУ811,К8 Бык РЬ88ЕМЕИЕЕОККУАдОКСЕ1ТМА1,НЗСНТ381,РТРЕОКЕдАддТВВЕУ1.М31,11,С1,1,118

Овца НЬ88ЕМЕМЕЕОКЕГА0СГвГ1ТМАЬи8СНТ88ЬРТРЕВКЕ0А00ТВВЕУЬМ8Ь1ЬСЬЬК8 Свинья МЬ88ЕНГЫЕЕОККУА0СКВЕ1ТКА1Н8СВТ88Ь8ТРЕОКЕ0А0(}1ВВЕУЬЬЫЫЬКУЬК8 Крыса ТЬУТОМЕ1ЕЕОКОУУООКЕЕ1АКА1НОСРТ88ЬАТРЕОКЕдАОКУРРЕУЬЬКЫЬ8ЬУН8 Мышь Т1,УТСМЕ1ЕЕОКдУУд011ЕЕМУКУ1ИОСРТ831,АТРЕОКЕдА1,КУРРЕУ1ХШ.11,31,Уд8

Хомячок НХ.8АОМЕ1ЕЬПК{гУА0ОВЕЕ1АКА18ОСРТ88ЬАТРЕСКЕЕА(}(}УРРЕУЬЬНЫЬ8ЬУН8 Норка НЬ38ЕНЕНЕЕ0ККХАдеКСЕ1ТКА1Н8СНТ881,8ТРЕ0КЕдАдд1ННЕ01.ЬШ,1ЬКУ1,И8 квт н^ззЕИЕНЕЕОккхАосксЕхткАюгснтггьотРЕОКЕОАдххввЕУЬУгьхьеуька

Верблюд Ш.3 8ЕМРЫЕЕОКР.ХАдС11СЕМТКА1М8СНТ881,ЗТРЕОКЕдАдд:1ВВЕОЫ,Ш.У1,КУ1,К8 Лошадь Щ,8 8ЕМЕЫЕЕ0К1чУАдСКСЕУТКА1Н8СНТ881,ЗТРЕ0КЕдАдд1ВВЕ01|ЫЛ,11|КУ1.К8 Слон 8Ь88ВМЕВЕЕНКдУАЬСК0Е1РКА1Ы8СНТ8318ТРЕПКВдАддТНВЕУ1,М01,11,01,1,1*8

100 11Л 120 130 140 150

. **,*,,,. .....*..*'..»****.** * * . ***

Человек ИМЕРЬ1НЬУТЕУКвМ0ЕАРЕА1Ь8КАУЕ1ЕЕдТККЫ,ЕСМЕЫУ8дУНРЕТКЕНЕ1УРУИ Обезьяна ИКЕР1,УВ1,УТЕУ110МЕЕАРЕА11,8КАУЕ1ЕЕдТККЫ,Е0НЕ1,1У8дУНРЕТКЕМЕ1УРУН Бык ИН0РЫНЬУТЕУКСМКСАР0А1Ь8КА1Е1ЕЕЕЫКЯЫ,ЕСМЕМ1ЕСдУ1РвАКЕТЕРУРУЯ

Овца ЯМОРЬУНЬУТЕУКОНКОУРОА1ЬЗКА1Е1ЕЕЕНККЫ,ЕСМЕМ1Ь,ОдУ1РСАКЕТЕРУРУН Свинья НМ0РЬУНЬУТЕУКСМдЕАР0А1Ь8ЯА1Е1ЕЕдНКЯЬЬЕСМЕК1УСдУНР01КЕНЕУУЗУК Крыса НЫОРЬЕд1,1101,001 НЕ АРРА118ЕАКЕ1ЕЕдНК111,ЬЕ01 ЕЕ 118дАУРЕАК0НЕ1УЬУН Нышь 88ВРЬЕдЫТйУСО10ЕАРЕУ1Ь8КАКЕ1ЕЕдНК0Ы.Е0УЕК118дАУРЕА1СеНеХУЕУИ

ХОМЯЧОК НМОРЬЕд1,УТЕУ001НЕА8ПА118КАКЕ10ЕдИК111,1.ЕС1ЕК1ЬОдАУРЕАКОНЕ1¥ЗУН

Норка КН0РЬУВЬУ8ЕУКСМдЕАРП81Ь8КА1Е1ЕЕдКЕКЬЬЕСМЕК1УСдУВРСУКЕНЕУУ8УН Кит ИЫХРЪУВЬУТЕУЕ0МдЕАР0А1Ь8КА1д1ЕЕЕНКЕЬЬЕСМЕК1У0дУВРСУКЕЫЕУУ8УИ Верблюд УН0РЬУВЬУТЕУК0МдЕАР0А1Ь8КА1Е1ЕЕдЫККЫ,ЕСМЕК1УСдУВР5УКЕИЕ1У8УИ Лошадь ННОР1,УБ1,У8ЕУКОМдЕАРЕА1Ь8КА1Е1ЕЕдНКК1,1,ЕСМЕК1УСдУдР!иКЕНЕУУ8УИ Слов ИИ0РЬСВЬА8ЕУН8ЬРКАР8АЬЬТКАТЕУКЕЕНдНЬЬЕС1ЕК1У0дУНР0АКЕНКАУ8УН . .....*..*...****.** * * , ***

160 170 180 190 199

# * * * * **... . . ***** * *,* # * * * .**

Человек SGLPSLQMADEESRLSAYYNbLHCLRRDSHKIDNYLKLLKCRIIHNNNC

Обезьяна TGLPSLQMADEESRLSAYYNLLHCLRRDSHKIDNYLKLL1CCRIIHNNNC

Бык SGLPSLQTKDEDARYSAFYNIiLHCLRRDSSKIDTYLKLLNCRlI YNNNC

Овца SGLPSLQTKDEDARHSAFYNLLHCLRRDSSKIDTYLKLLNCRIIYNNNC

Свинья SGLPSLQMADEDTRLFAFYNLLHCLRRDSHKIDNYLKLLKCRIIYDSNC

Крыса SQLPSLQGVDEESKDLAFYNNIRCLRRDSHKVDNYLKFLRCQIVHKNNC

Мышь SQLPSLQGVDEESKILSLRNTIRCLRRDSHKVDNFLKVLRCQIAHQNNC

Хомячок SQFPSLQGVDEESRDLAXYNKVRCLRRDSHKVDHYLKLLRCRVVHKNNC

Норка SGLPSLQMADEDSRLFAFYNLLHCLRRDSHKIDHYLKLLKCRIVYDSNC

Кит SGLPSLQHADEDTRLFAFYDLLHCLRRDSHKIDSYLKLLKCRIIYNSNC

Верблюд SGLPSLQMADEDTRLFAFYNLLHCLRRDSHKIDNYLKLLKCRIXYDSNC

Лошадь SGLPSLQMADEDSRLFAFYNLLHCLRRDSHKIDNYLKLLKCRIVYDSNC

Слон SGLPSLQTTDEDARLFAFYNLFRCLHRDSHKIDSYLKLLKCRIVYNNNC

. * * л * »*... . . .****** * щ* . * * * ,**

Рис. 13 Результаты сравнения известных аминокислотных последовательностей препролактина млекопитающих. Последовательность препролактина из гипофиза человека реконструирована из собственных данных плюс недостающие 16 N-концевых а. к. остатков пролактина и сигнальный пептид по данным Cooke N.E. и сотр.(1981) для мРНК пролактина из аденомы гипофиза человека. Идентичные у всех млекопитающих аминокислотные остатки препролактина показаны звездочкой. Похожие - обозначены точкой под последовательностями. Нумерация аминокислотной последовательности пролактина показана над последовательностью, причем а.к. остаткам сигнального пептида присвоены, как это принято для препролактина, отрицательные номера. Пунктирными линиями внутри последовательности обозначены делеции а.к. остатков по данным сравнения. N-концевые пунктиры обозначают отсутствующую информацию о данной области пролактина.

Результаты сравнения нуклеотидных последовательностей кодирующей области мРНК пролактина млекопитающих, как и следовало ожидать, оказались аналогичны сравнению кодируемых белков. Нуклеотидная последовательность мРНК, кодирующая собственно пролактин, равномерно высоко консервативна и содержит всего несколько небольших вариабельных участков, соответствующих вариабельным районам пролактина (см.выше). Как и при сравнении аминокислотных последовательностей, в кодирующей области мРНК, наибольшее количество отличий наблюдается в районе, кодирующем сигнальный пептид. 5'- нетранслируемая область мРНК пролактина млекопитающих довольно различна и, как правило, известна лишь частично, З'-нетранслируемый район значительно более вариабелен, чем кодирующая часть и содержит делеции в области сигнала полиаденилироЕания.

ВЫВОДЫ

1. Впервые проведено клонирование и определение первичной структуры кДНК ПОМК (909 н.п.) из гипофиза человека, кодирующей все биоактивные домены ПОМК. Полученная нуклеотидная последовательность кДНК ПОМК человека подтверждает экзон-интронную структуру гена ПОМК человека, определенную ранее Takahashi и сотр. (1983) только теоретически.

2. Впервые проведено клонирование и определение нуклеотидной последовательности кДНК ПОМК (585 и.п.) из гипофиза норки, кодирующей все основные биоактивные домены ПОМК. Показано, что мРНК ПОМК норки кодирует перед доменом АКТГ дополнительную пару основных аминокислотных остатков Arg-Arg, что ведет к возникновению альтернативного сайта протеолиткческого проаессинга ПОМК. Впервые ген проопиомеланокортина локализован в виде единственной копии на 11 хромосоме норки.

3. Сравнительным анализом последовательностей ПОМК и мРНК ПОМК млекопитающих показано, что степень консервативности последовательностей неравномерна по всей длине, причем границы консервативных и вариабельных участков мРНК четко совпадают с границами биологически активных доменов ПОМК, т.е. коррелируют с ее функциональной топографией.

1. На основании сравнительного анализа перзичных и вторичных структур ДНК, кодирующих ПОМК человека, быка и норки, предложен возможный механизм возникновения мутаций и вариабельных районов в генах ПОМК, основанный на репарационной коррекции несовершенных самокомплементарных последовательностей, с высокой вероятностью образующих шпилечные структуры в процессе репликации геномной ДНК.

5. Проведено клонирование и определение нуклеотидной последовательности кДНК пролактина (704 н.п.) из гипофиза человека. Гомология полученной первичной структуры кДНК пролактина из гипофиза человека составляет 99 7% с известной для мРНК пролактина из пролакти-номы человека и 99.4% с мРНК пролактина из плаценты человека.

6. Впервые проведено клонирование и определение нуклеотидной последовательности кДНК пролактина (682 н.п.) из гипофиза норки. Гомология нуклеотидной последовательности кДНК пролактина норки с известной для мРНК соматотропина норки, относящегося к одному с пролактином семейству белков, составила 52.5%.

7. Сравнительным анализом показано, что отличил пролактинов млекопитающих друг от друга представляют в большинстве своем замены консервативного типа. Как пролактин, так и мРНК пролактина высококонсервативны и в них отсутствуют четко выраженные протяженные вариабельные участки в противоположность ПОМК.

Автор благодарит: своих научных руководителей профессора, д.б.н. Мертвецова Н.П. и к.х.н. Каргинова В.А. за чуткое научное руководство и всестороннюю поддержку настоящей работы; д.б.н. Серова О.Л., к.б.н. Головина С.Я. и к.б.н. Чехранову М.К. за плодотворное сотрудничество; Морозова И.В. за неоценимую помощь в компьютерной обработке данных, написанные оригинальные программы и идеи в области модифицирования методик секвенирова-ния ДНК; к.х.н. Зеленина С.М. за всестороннюю помощь в освоении микробиологических методов работы; к.б.н. Мишина В.П. за моральную поддержку при написании диссертации; всех сотрудников отдела Молекулярной биологии гена, лаборатории структуры и функции гена и

сотрудников отдела Молекулярной биологии iei;a, лаборатории структуры и функции гена и

сектора САНК НИБХ СО РАН за уникальную дружескую атмосферу в отделе, способствующую плодотворной работе.

Основные результаты диссертации опубликованы в следующих работах:

1. Мертвецов Н.П., Головин С.Я., Беклемишев А.Б., Каргинов В.А., Мамаев Л.В., Скобельци-на Л.М., Зеленин С.М., Морозов И.В., Бондарь А.А., Панков Ю.А. Клонирование ДНК, комплементарной мРНК проопиомеланокортина гипофиза быка, крысы и человека. Гормональная регуляция содержания мРНК ПОМК в гипофизе крысы // Биохимия.- 1987.- Т.52, N5.- С.707-714.

2. Головин С.Я., Каргинов В.А., Бондарь А.А., Беклемишев А.Б., Чехранова М.К., Мертвецов Н.П., Панков Ю.А. Синтез, клонирование и определение первичной структуры ДНК, комплементарной мРНК проопиомеланокортина из гипофиза человека / / Биоорганическая химия.- 1987,- Т.13, N4,- С.562-564.

3. Мертвецов Н.П., Зеленин С.М., Морозова Т.В., Каргинов В.А., Чехранова М.К., Бондарь А.А., Чесноков В.Н., Стефанович Л.Е., Панков Ю.А., Скобельцина Л.М. Синтез, клонирование и определение первичной структуры ДНК, комплементарной мРНК пролактина из гипофиза человека // Биоорганическая химия.- 1987.- Т.13, №12,- С.1687-1690.

4. Головин С.Я., Бондарь А.А., Каргинов В.А., Морозов И.В., Зеленин С.М., Попова B.C., Мертвецов Н.П. Синтез, клонирование и определение первичной структуры кДНК проопиомеланокортина из гипофиза норки (Mustela vison) // Биооргаштчсская химия.- 1988.- Т.14, N2,- С.273-275.

5. Khlebodarova Т.М., Karasik G.I., Matveeva N.M., Serov O.L., Golovin S.Y, Bondar A.A., Karginov V.A., Morozov I.V., Zelenin S.M., Mertvctsov N.P The mink proopiomelanocortin gene: Characterization of cDNA and chromosomal localization // Genomics.- 1988.- V.2.-P.185-188.

6. Матвеева H.M., Хлебодарова T.M., Карасик Г.И., Рубцов Н.Б., Серов О.Л., Головин С.Я., Бондарь А.А., Каргинов В.А., Морозоп И.В., Зеленин С.М. Мертвецов Н.П. Хромосомная локализация гена проопиомеланокортина у американской норки (Mustela vison) // Доклады АН СССР.- 1988,- Т.-298, №6,- С. 1464-1469

7. Каргинов В.А., Головин С.Я., Бондарь А.А., Морозов И.В., Блинов В.М., Мертвецов Н.П. Сравнительный анализ первичных структур ДНК, кодирующих проопиомеланокортины ряда животных и человека // Биополимеры и клетка.- 1989.- Т.5, №4.- С. 46-51

8. Mertvetsov N.P., Karginov V.A., Golovin S.Ja., Bondar A.A., Morozov I.V., Zelenin S.M., Blinov V.M. Nucleotide sequence of cDNA coding for mink proopiomelanocortin (POMC) and its comparative analysis with POMC mRNA primary structures from pituitaries of other animal species and man // Biomed. Biochim. Acta.- 1991.'- V.50, N9.- P.1057-1064.

9. Бондарь A.A., Головин С.Я., Мертвецов Н.П Нуклеотидная последовательность матричной РНК пролактина из гипофиза норки // Сибирский биологический журнал.- 1993.- N2- С.10-15.

10.Mertvetsov N.P., Zelenin S.M., Morozov I.V., Mishin V.P., Bondar A.A., Karginov V.A., Chesnokov V.N. The structure and regulation of mammalian tyrosine aminotransferase and proopiomelanocortin genes.// In:"Isozymes: Organization and Roles in Evolution, Genetics and Physiology", Ed. by C.L. Markert, J.G. Scandalios, H.A. Lim, O.L. Serov.- World Scientific Publishing Co. Inc., New Jersey.- 199-1.- P.-95-105