Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Сравнительный анализ последовательностей биополимеров

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Сравнительный анализ последовательностей биополимеров"

ОРДЕНА ЛЕНИНА, ОРДЕНА ОКТЯБРЬСКОЙ РЕВОЛЮЦИИ И ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ имени М. В. ЛОМОНОСОВА

На правах рукописи

Константин Михайлович ЧУМАКОВ

УДК 577.212.8.001.33:519.254

СРАВНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ БИОПОЛИМЕРОВ: ПРИНЦИП МАКСИМАЛЬНОГО ТОПОЛОГИЧЕСКОГО ПОДОБИЯ

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой стелена доктора биологических наук в форме научного доклада

(03.00.03 - молекулярная биология)

Москва - 1988

Работа выполнена в Меяфакультетской проблемной лаборатории молекулярной биологии и'биоорганической химии имени А.Н.Белозерского МГУ.

Официальные оппоненты:

академик АН СССР, доктор биологических наук, профессор

М.В.Иванов

член-корр. АН СССР, доктор физико-математических наук, профессор

М.В.Волькенштейн доктор биологических наук, профессор А.С.Антонов

Ведущее учревдение - Институт цитологии и генетики АН СССР.

Защита состоится "_"_ 198 г.

в_часов_мин. на заседании Специализированного совета

Д. 053. 05. 70 при Московском государственном университете имени М.В.Ломоносова по адресу: 119899, Москва, В-234, Ленинские горы, МГУ. Биологический факультет.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МГУ.

Доклад разослан "_"_ 198 г.

Ученый секретарь Специализированного совета Кандидат химических наук

/

В.Н.Каграманов

Актуальность задачи сравнительного анализа последовательностей

" 1

биополимеров связана с тем, что в последние годы благодаря разра-ботке~н5вых методов определения последовательностей аминокислот в белках и нуклеотидов в ЯНК и РНК было накоплено большое количество информации о первичных структурах отдельных белков, генов, а также целых геномов. Возможность анализировать генетическую информацию на уровне первичного генетического текста диктует необходимость разработки соответствующих методов его расшифровки, которая становится мойным инструментом биологического исследования. Основной целью такой расшифровки является предсказание вторичной и третичной структур биополимеров и выяснение их функций.

Одним из наиболее эффективных подходов к решению этой задачи является сравнение последовательностей гомологичных биополимеров с целью выявления общих свойств, что позволяет находить функционально значимые особенности структуры. Плодотворность такого подхода была продемонстрирована на примере исследования пространственной организации рибосомальных РНК и выявления у многих белков новых ферментативных активностей.

Наряду с этим сравнительный анализ последовательностей биополимеров имеет и самостоятельную ценность как метод создания классификаций, основанных на филогенетических связях между объектами. Особенно актуально применение молекулярно-филогенетических методов в области микробиологии, в которой на повестку дня поставлена задача создания совершенно новой систематики, в которой ведущая роль отводилась бы филогенетическим данным. Выполнение этой задачи зависит от разработки надежных и эффективных методов филогенетического анализа, пригодных для обработки получаемых данных.

Цель и задачи настоящей работы состояли в разработке новой методологии филогенетической реконструкции на основе сравнения последовательностей гомологичных биополимеров, полученных из различных -источников, и ее применение для изучения филогении микроорганизмов.

Новизна работы состоит в том, что впервые сформулирован принцип построения филогенетических схем, названный принципом максимального топологического подобия (МТШ, ставящий целью построение такого дерева, общая структура (топология) которого в максимальной степени соответствует топологическим характеристикам, содержащимся в исходных данных. Для реализации этого нового направления филогенетического анализа разработан математический аппарат, созданы соответствующие алгоритмы и на их основе разработан комплекс прикладных компьютерных программ для филогенетического анализа последовательностей биополимеров. Определение последовательностей нуклеотидов 5Б рибосомной РНК из примерно 100 видов и штаммов микроорганизмов позволило продемонстрировать применимость разработанного подхода для решения частных вопросов систематики и впервые определить филогенетическое положение ряда важных групп микроорганизмов.

Практическая ценносг. работы определяется тем, что созданные на основе предложенного принципа МТП алгоритмы построения филогенетических деревьев, реализованные в комплексе компьютерных программ, могут быть применены для решения разнообразных филогенетических проблем как при анализе последовательностей биополимеров * так и при сравнении других количественных признаков (в нумерической таксономии). Определенные в работе последовательности 5Б рРНК позволили успешно исследовать ряд частных таксономических вопросов, а также определить биологическую природу предполагаемого

возбудителя вилюйского энцефалита.

Апробация работа. Работа была доложена на VII съезде Всесоюзного микробиологического общества (Алма-ата, 1985), конференции по фотосинтезирующим бактериям (Швейцария, 1985), Международной конференции по почвенным микроорганизмам (Копенгаген, 1985), сессии Института полиомиелита и вирусных энцефалитов АМН СССР (Мос:за,.

1985), школе-конференции "Структура и функции биополимеров" (Рига,

1986), конференции "Физиология, генетика и биохимия метилотрофннх бактерий" (Канев, 1986), школе-конференции "Фундаментальные науки народному здравоохранению" (Каунас, 1986), Всесоюзной конференции "Биология возбудителей инфекционных болезней и их экспресс-диагностика" (Горький, 1986), на симпозиуме, ш архебактериям (Пудано, 1987), совещании "Генинформ" (Москва, 1987), Всесоюзной школе-конференции по биотехнологии (Львов, 1987).

1. Методы филогенетической реконструкции 1.1. Постановка задачи

В основе молекулярной филогенетики лежит сравнение последовательностей биополимеров и создание на этой основе классификационных деревьев (феяограмм). Представление о том, что получаемые таким образом деревья являются филогенетическими, тесно связано с нейтралистской теорией, лежащей в основе современных представлений об эволюции на молекулярном уровне. Работы последних лет показали, что в ряде случаев процесс эволюции оказывается более сложным, нежели простое накопление селективно-нейтральных мутаций с постоянной скоростью (Волькешптейн, 1982, Антонов и др.. 1986, Ратнер а др., 1985). Это обстоятельство отражает необходимость повышенного вникания к методологии ретроспективного анализа хода эволюции.

В общих чертах методы филогенетической реконструкции складываются из нахождения оптимального (относительно выбранного

критерия) дерева и его филогенетической трактовки. Для того чтобы обеспечить адекватность решения второго этапа этой задачи, на этапе построения фекограмш необходимо в максимальной степени воздержаться от каких-либо априорных допущений. В противном случае биологически несостоятельные постулаты, принятые на первом этапе, могут исказить филогенетическую трактовку. 1.2. Постулаты

Сама идея реконструкции филогении (то есть дерева, описывающего эволюционную историю исследуемых объектов) неизбежно основана на ряде допущений, первым из которых является представление об их дивергенции от общего предшественника. В том случае, если бы мы располагали информацией о точном числе эволюционных событий, происходивших в ходе дивергенции, то реконструкция истинного филогенетического дерева не составляла бы труда и могла бы быть выполнена однозначно. Поскольку истинное число эволюционных событий неизвестно, то в качестве его меры принимается мутационное расстояние между парами последовательностей современных биополимеров (число замен, которое необходимо произвести для того, чтобы превратить одну последовательность в другую), либо некоторая величина, производная от этого числа. Использование мутационных расстояний делает ситуацию более сложной. Если бы процесс дивергенции происходил таким образом, что мутационные события в каждом из элементоЕ последовательности происходили лишь один раз, то мутационные расстояния в точности соответствовали бы истинным эволюционный расстояниям. Стохастический характер мутационного процесса приводит к тому, что такая ситуация, называемая аддитивной, может реализоваться лишь при весьма незначительном общем числе мутаций, поскольку по мере их накопления возрастает вероятность повторно® мутации.

Такш образом можно сформулировать второе допущение, лежащее в основе филогенетического анализа последовательностей'биополимеров: предположение о том, что мутационное расстояние отражает истинное эволюционное расстояние. Положение о том, что они в подавляющем числе реальных примеров оказываются не равными, следует не только из общих соображений о характере мутагенеза, но г из того, что получаемые при сравнении последовательностей биополимеров мутационные расстояния оказываются неаддшгивными (см. ниже). Однако даже в случае, если мы имеем дело с полностью аддитивными данными, мы никогда не можем быть уверены в том, что эта аддитивность является следствием "идеальной эволюции" (без повторных мутаций), а не есть результат причудливого сочетания прямых, повторных, обратных и параллельных мутаций, которые взаимна компенсировали и маскировали друг друга. Следовательно, сама задача реконструкции филогении на основе сравнения последовательностей современных макромолекул монет быть решена лишь предположительно, и не существует способа доказать что полученная схема описывает истинную эволюционную историю. Напротив, любая такая реконструированная филогения является лишь предположительной и эта предположительность вытекает из того, что реконструкция проводятся не на основе истинных, а на основе мутационных расстояний. Поэтому в дальнейшем, хотя мы для краткости и опускаем слово "предположительная", однако везде подразумеваем реконструируемую филогению именно в этом смысле.

Как уже отмечалось выше, в случае, если попарные мутационные расстояния аддитивны, реконструкция дерева может быть проведена легко и однозначно. Иначе говоря, можно построить такое дерево, в котором расстояния между всеми парами видов точно равны экспериментально определяемым мутационным расстояниям. Однако такие аддитивные данные на практике обычно не встречаются. Вместо этого

мутационные расстояния обычно обнаруживают отклонения от аддитивности, и следовательно построение точного дерева (то есть дерева, в котором расстояния между всеми видами равны мутационным расстояниям) становится невозможным. Поэтому при филогенетическом анализе реальных данных встает задача построения приближенного дерева (приближения к предполагаемому дереву). 1.3. Традиционные метода филогенетической реконструкции

Для нахождения приближенных деревьев существуют многочисленные способы. Естественно, что нет возможности и необходимости сколько нибудь подробна излагать здесь все эти методы, однако прежде, чем приступить к формулировке нового подхода, необходимо провести сравнение достоинств, недостатков и ограничений основных груш таких методов с тем, чтобы сформулировать основные требования, которые следует предъявлять к методам нахождения деревьев, пригодных для адекватной филогенетической трактовки.

Методы филогенетической реконструкции можно условно разделить на несколько групп. Первая груша основана на методологии кластерного анализа, и по существу ставит своей задачей именно восстановление хода эволюционного процесса как бы в обратном порядке. Филогенетическая трактовка деревьев, полученных этими методами, с неизбежностью предполагает равномерность накопления мутаций во всех филогенетических линиях. В том случае,, если такая равномерность - нарушается, эти методы приводят к реконструкции неправильного в топологическом отношении дерева. В связи с этим следует отметить, что стохастический и дискретный характер мутагенеза, а также возможность изменения функции макромолекул в ходе эволюции создают реальную возможность вариаций скорости накопления мутаций в различных линиях, что и было обнаружено при анализе многочисленных примеров. Поэтому эта груша методов в общем случае

является неприменимой для филогенетической реконструкции.

Вторая группа методов, объединяемых принципом максимальной экономии (МЭ). ставит задачей построение такого дерева, в котором расстояния между всеми парами видов были бы не меньше мутационных расстояний между ними, а суммарная длина ребер дерева была минимальной. Эти методы, несмотря на свое широкое распространение, имеют несколько недостатков. Одним из них является его черезвычайная вычислительная сложность (ЯР-полнота, или невозможность получения точного решения иначе, как путем полного перебора всех возможных вариантов деревьев). Поэтому этот подход обычно применяется лишь для поиска приближенных решений тем или иным эвристическим методом, а это значительно снижает его ценность. Другой, и пожалуй самый серьезный недостаток, состоит в отсутствии разумной биологической основы у этого принципа, поскольку требование минимальности длины дерева постулируется априорно, но не может быть доказано. Это накладывает существенное и необоснованное ограничение на возможные решения и, следовательно, затрудняет филогенетическую трактовку получаемой схемы.

Третья группа методов основана на построении деревьев путем анализа матриц попарных мутационных расстояний и минимизации некоторого функционала, характеризующего близость исходной матрицы мутационных расстояний и матрицы расстояний между видами в построенном дереве. Иными словами, делаются попытки найти дерево, наилучшим образом реализующее исходную матрицу расстояний. Методы этой группы не предполагают каких-либо особенностей эволюционного процесса, как методы двух предыдущих групп, однако также не лишены недостатков. Одним из главных недостатков является заметная неустойчивость решений к незначительным изменениям данных, которая вероятно связана с тем, что выбор топологии дерева тесно связан с определением длин

- а -

его ребер (ветвей), и обе задачи решаются одновременно.

Очевидно, что для тех целей, для которых проводится построение деревьев по последовательностям биополимеров, определение общей структуры (топологии) является существенно более важной задачей по сравнению с определением конкретных значений длин ветвей (ребер). При этом известно, что задача нахождения длин ребер (взвешивание) дерева с известной топологией решается эффективно, а основную сложность представляет именно выбор оптимальной топологии дерева. 1.4. Описание структуры дерева.

Для наиболее эффективного решения задачи нахождения оптимальной топологии дерева на начальном этапе построения дерева целесообразно отвлечься от конкретных значений расстояний, чтобы в максимальной степени сосредоточиться на определении структуры дерева. Для этого необходимо разработать аппарат, который позволил бы характеризовать топологическую структуру дерева, сравнивать деревья между собой, а также выявлять топологические соотношения', в которых находятся между собой объекты, подлежащие анализу. Такой топологический метод может быть основан на условии четырех вершин, впервые сформулированном Смоленским (1962) и Зарецким (1965), а впоследствии независимо переоткрытом Буннеманом (1971) и Добсон (1974). Это условие устанавливает связь между топологическими и метрическими характеристиками деревьев.

В любом . дереве можно выделить четыре висячих (концевых) вершины, и рассмотреть поддерево, составленное из этих вершин, двух внутренних вершин и пяти ребер, соединяющих их (рис. 1).

Легко видеть, что всегда найдутся две пары Еершин, которые можно назвать соседями, так как путь между ними составлен минимальным числом элементов дерева (два ребра и одна внутренняя вершина). Если мы обозначим эти пары видов {АВ} и {СО, то всегда

*АЗ+*СВ < *АС+ЙВП = йА0+аВ0' (1}

поскольку в две большие суммы в правой стороне неравенства входит

удвоенная длина центрального ребра, а в левую сумму не входит.

Условие четырех вершин позволяет выявить топологические отношения, в

которых находятся вершины дерева, не зная его вида, а лишь на

основании формального анализа расстояний между ними. Доказано, что

если это условие выполняется для Есех поднаборов из 4-х видов

(именуемых далее квартетами) некоторого множества видов, то такие

данные могут быть однозначно представлены в виде дерева, и именно

такие данные называются аддитивными.

Как уже указывалось выше, реальные данные о последовательностях биополимеров обычно оказываются неадаитивкыми. Это означает, что условие 4-х вершин нарушается по крайней мере для части квартетов. Естественно, что в первую очедедь нарушается равенство в правой части соотношения (1). Однако в любом случае три суммы расстояний между объектами можно упорядочить таким образом, что

^.п+й^ < < +(1 , (2)

АВ СО АС иВ АВ ВС Вполне естественно считать, что левая, меньшая сумма в этом ослабленном условии четырех вершин соответствует парам, которые на дереве должны быть расположены рядом, то есть являются соседями. Таким образом, ослабленное условие четырех вершин может быть использовано для выявления топологических отношений, в которых находятся объекты на основе формального анализа неаддитивной матрицу попарных расстояний. Для этого могут быть применены различные приемы. Фитч использовал для описания топологии деревьев (и матриц расстояний)

так называемые матрицы степеней соседства (МСС), то есть числовые матрицы, каждый элемент которых показывает, сколько раз соответствующая пара видов входит в отношение соседства при полном переборе всех сочетаний из 4-х видов. К сожалению, доказательства однозначности соответствия между МСС и каким-либо деревом, а также критерии и алгоритмы реализации МСС деревом Фитчем найдены не были. Поэтому предложенный им метод характеризации топологии дерева практического применения не нашел.

Колониус и Шульце (1981), а вслед за ними и Юшманов (1987) нашли критерии, позволяющие определять реализуемость анализируемого набора данных топологически эквивалентным деревом. Приведем критерий Ешманова, для чего введем две функции.•

Пусть Р (A.B.c.D) определена и равна 1, если пары {ab} и {cd} 1»

соседи, и не определена во всех остальных случаях. Пусть {^(А.в.с.Ш определена и равна 1, если ослабленное условие 4-х вершин (2) соблюдается, и не определена во всех остальных случаях. Иными словами, определим все упорядоченные сочетания 4-х вершин, которые могут быть описаны деревом на рис. 1.

Р может быть реализована топологически эквивалентным деревом, если выполнены четыре условия:

1. Если определена хотя бы на одном из наборов ABCD, CDAB и DCA8, то она определена на всех трех;

2. определена не более, чем на одном из наборов abcd, acbd, adbc;

3. Если Fd определена на наборах abcd, abde, adce, то она определена и на АБСЕ;

4. Если Р^ определена на наборе ABCD, то она определена на каком-то из наборов АБСЕ, ABED, AECD, EBCD.

Таким образом метод характеризации топологии деревьев через набор поддеревьев, порожденных квартетами висячих вершин, дает возможность

определить реализуемость того или иного набора данных деревом. 1.5. Принцип максимального топологического подобия

Приведенный выше способ описания топологии деревьев и возмоя-ность топологической характеризации матриц попарных расстояний позо-лили нам предложить новый принцип построения деревьев, названный принципом максимального топологического подобия (МТП). При этом ставится задача нахождения такого дерева, топологические свойства которого максимально близки топологическим свойствам исходной матрицы расстояний (в простейшем случае дерева, для которого число квартетов, на которых р^ 4= Р^ минимально).

Задача построения дерева, максимально близкого в топологическом отношении исходной матрице расстояний, имеет ряд преимуществ перед другими подходами. В отличие от большинства применяемых в настоящее время методов построения филогенетических деревьев, принцип МТП не вводит никаких дополнительных допущений по поводу хода эволюционного процесса и скоростей эволюции.

Для аддитивных, данных метод дает точные решения. Метод нечувствителен к малым погрешностям исходных данных. Так, если некая матрица аддитивна, то для любого квартета {А,в,с,Ш из трех суш ^ - + аот, з2 = <1АС + ^ и з3 = + ^ . две, скажем ^ и а , равны и много больше третьей. Любая малая погрешность вычисления з^" или з2 или входящих в него расстояний нарушает аддитивность матрицы, но не меняет значения функции г , и, следовательно, не нарушает ее реализуемости деревом. Таким образом, класс матриц, для которых г реализуется деревом, шире класса адди-

^ я

тивных матриц.

Функция ! Р - Р ! (т.е. топологическое несовпадение, которое

СС V«

в простейшем случае равно числу квартетов, на которых Ф Р^.), дает простой объективный способ оценки соответствия структуры

построенного дерева исходной матрице расстояний. Это, в частности, позволяет сравнивать между собой филогенетические деревья, построенные по разным критериям, то есть позволяет решать задачу, которая ранее осуществлялась путем экспертной оценки специалистами.

Сравнение функций Р и Р на всех квартетах, включающих какой-

и X

либо интересующий нас вид, позволяет получить количественную оценку надежности его помещения в конкретное положение на дереве в виде величины локального топологического несовпадения. Иными словами, 1 появляется возможность обнаруживать места в построенных деревьях, которые требуют более осторожной трактовки.

Метод МТП позволяет строить классификационные схемы, учитывающие информацию о разных признаках, выраженных в единицах различной размерности. При этом будет производиться усреднение именно топологии, а не самих расстояний в нескольких исходных матрицах. Принцип МТП позволяет при необходимости вводить априорные ограничения на структуру искомого дерева, которые могут быть .следствием каких-либо биологических соображений. И, наконец, прин-• цип МТП позволяет в явной форме получить алгоритмы построения деревьев.

1.6. Алгоритмы нахождения деревьев МТП

По существу принцип МТП и сопутствующий ему математический аппарат, основанный на условии 4-х вершин, позволяет получать полный набор поддеревьев, содержащих 4 вершины в оптимальной ориентации. Поэтому задача построения общего дерева сводится к объединению этих поддеревьев. Для этого возможно применение различных алгоритмов. Опишем некоторые из алгоритмов, предложенных нами. Алгоритм А. Найдем пару видов, которые при анализе функции чаще других входят в соотношение соседства. Естественно считать, что они являются соседями в дереве. -Запомним это и удалим один из них из

набора анализируемых видов. Будем проделывать эту процедуру до тех пор, пока в наборе не остается 4 вида. Построим дерево, содержащее эти 4 вида таким образом, что ? - Р . Будем в обратном порядке

а "С

добавлять удаленные на каждом шаге вершины рядом с теми, с которыми они были соседними. Дерево построено. Этот алгоритм, реал-изованнный в программе ТТНЕЕ. гарантирует нахождение точного дерева МТП при условии его существования.

Алгоритм Б. Второй алгоритм основан на локальной оптимизации структуры дерева путем перестановки ветвей. Эта процедура может быть применена к любому произвольному дереву, однако на практике удобно в качестве исходного дерева использовать "змейку", то есть дерево, в котором висячие вершины последовательно присоедини к цепочке внутренних вершин. Оптимизация производится следующим образом.

Зафиксируем некоторое внутреннее ребро I, и рассмотрим все квартеты, порождаемые этим ребром. Про квартет вершин будем говорить, что он порождается ребром I, если все цепи, соединяющие входящие в него вершины проходят по крайней мере через одну из внутренних вершин, смежных с ребром X. Иными словами, порождаемыми называются те квартеты, для которых данное ребро является внутренним.

Подсчитываем число квартетов, порождаемых I, для которых р Ф г . Находим такое расположение смежных с I ребер (одно из трех

и о

возможных), для которого эта величина минимальна, и запоминаем разницу между этими величинами (иными словами, определяем величину, на которую можно уменьшить топологическое несовпадение перестановкой

а

смежных ребер).

Просматривая все внутренние ребра, находим такое, перестановка ребер вокруг которого приводит к максимальному улучшению топологии дерева, и производим соответствующую перестановку ребер.* Будем

последовательно производить такие перестановки до тех пор, пока

ориентация ребер во всем дереве не будет соответствовать той, на

которую указывает Fd порождаемых внутренними ребрами квартетов.

Если Fd может быть реализована топологически эквивалентным

деревом (условие Шманова выполняется), этот алгоритм найдет это

дерево. Если нет - то алгоритм позволяет найти хорошие приближения.

Изменение структуры исходного дерева позволяет получать слегка

различные деревья и отобрать среди них то, для которого величина

топологического несовпадения (число квартетов, для которых р + р )

а t

минимальна. Этот алгоритм реализован в программе STREE.

Алгоритм В. Определение длины ребер (взвешивание дерева). Эта задача решается эффективно разными методами, например, линейным программированием. Однако в применении к большому числу видов этот метод громоздок. Поэтому для предварительного взвешивания дерева мы разработали быстрый приближенный метод. Он' основан на следующих соображениях. Длина внутреннего ребра может быть найдена при рассмотрении расстояний между четырьмя вершинами, порождаемыми этим ребром по формуле:

L = (dAC + «BD + dAD + *ВС - 2МАВ ' 2MCD) 7 4 Рассматривая последовательно все четверки видов, порождаемые данным

ребром, можно получить усредненную величину и считать ее длиной

ребра.

Аналогичная формула может быть применена для нахождения длины висячего ребра:

L = (dA£ + dAC " V 7 2

Усреднение по всем тройкам вершин, порождаемым данным ребром, дает его длину. Этот алгоритм, реализованный в программе MEASMAT, позволяет быстро находить достаточно хорошие приближения.

2. Описание комплекса программ для филогенетического анализа

Комплекс состоит из 20 специализированных, программ, написанных на языке "С" в операционной системе ШЛХ. Программы обмениваются между собой результатами вычислений через потоки данных (файлы), представленные в текстовом виде, что позволяет осуществлять контроль и редактирование обычными текстовыми редакторами. Объектами, с которыми оперируют программы комплекса, являются:

1. Наборы выравненных последовательностей, представленных в одном из следующих форматов: формате Гейдельбергской базы данных о нуклео-тидных последовательностях (ИШЬ), базе данных о последовательностях аминокислот (Рвмиж), либо в формате сжатой (побитовой) записи, разработанной наш для компактного хранения информации о последовательностях биополимеров на персональных компьютерах.

2. Матрицы расстояний, представленные в текстовом формате, которое для удобства редактирования разбиты на страницы. Все объекты в матрице, помимо имен, помечены номерами, начиная с 1.

3. Деревья, которые записаны в виде списка внутренних вершин степени Э (помеченных номерами, начиная с п+1, где п - число висячих вершин), с указанием соседних вершин и расстояний до них. Висячие вершины обозначены своими именами.

На рис. 2 показана схема обмена информацией между программами описываемого комплекса. Результаты работы каждой из программ могут быть либо записаны на дисковом файле, либо непосредственно переданы следующим программам через информационные каналы (потоки). Ниже дана краткая характеристика программ.

1. Программа ВАМ предназначена для поддержания базы данных о последовательностях биополимеров, представленных в побитовой (сжатой) записи. Для работы с Гейдельбергской базой данных и базой ротиамз имеются аналогичные программы емвь и ратшшв. Эти

Рисунок 2. Схема обмена информацией в комплексе программ для филогенетического анализа.

программы создают индексные файлы, в которых записываются адреса хранения всех последовательностей и их имена, и позволяют быстро извлекать любую последовательность в символьном (ASCII) формате, принятом в Гейдельбергской библиотеке.

2. Программа cross позволяет вести перекрестный поиск последовательностей по ключевым словам, используя индексные файлы, создаваемые программами bank, embl и pgtrans.

3. Программа dipmat производит рассчет матрицы мутационных расстояний между последовательностями нуклеотидов, допускающими использование специальных символов для обозначения неоднозначно определенных элементов последовательностей. Расстояния выражаются в виде доли отличающихся позиций.

4. Программа сомр рассчитывает матрицы расстояний между последовательвостяш аминокислот с использованием различных правил сравнения аминокислот (матрщ сходства MDM78, мутационной матрицы, и др.) либо по совпадению аминокислот.

5. Программа permumaï, используя датчик случайных чисел производит произвольную перестановку строк и столбцов матриц расстояний для того, чтобы иметь возможность получать слегка различные варианты дервьев, используя программу stree.

6. Программа quaimat позволяет определять характеристики матриц расстояний, их аддитивность, выполнение правила треугольника.

7. Программа РЕНТА позволяет определить представимость матрицы расстояний топологически эквивалентным деревом. Для этого используется критерий, предложенный Юшмановым (см. выше).

8. Программа CLUS строит деревья одним из нескольких возможных кластерных методов (opgma, WPGîîa, либо с усреднением, либо по минимальным, либо по максимальным расстояниям).

9. Программа stree является центральной программой комплекса'. Она

генерирует топологию невзвешенного дерева МТП, "используя алгоритм Б (см. вше).

ю. Программа MTREE генерирует топологию невзвешенного дерево, используя несколько матриц расстояний, и позволяет получать усредненную топологию дерева по многим признакам.

11. Программа TTREE генерирует топологию деревьев МТП несколькими другими алгоритмами, некоторые из которых описанны выше.

12. Программа ptree генерирует топологию дерева, построенного по принципу максимальной экономии алгоритмом Б (см. выше).

13. Программа improve генерирует новую топологию путем локальной оптимизации положения отдельных видов. Она позволяет определить величины локального топологического несовпадения для определенного вида, помещенного во все возможные положения на дереве, и таким образом оценить надежность и устойчивость построенного дерева.

14. Программа MEASMAI позволяет определить длины ребер дерева (взвешивание) матричным методом, описанным выше (алгоритм В).

15- Программа MEASSEQ позволяет провести взвешивание дерева путем восстановления предковых последовательностей.

16. Программа ТКЕИШ) рассчитывает матрицу расстояний для дерева и определяет суммарную длину ребер дерева.

17. Программа СМРМАГ сравнивает топологические и метрические свойства матриц расстояний и деревьев, и позволяет определить величины локального топологического несовпадения для всех видов, входящих в дерево.

18. Программа dtree выводит на экран дисплея бескорневое дерево.

3. Биологическая состоятельность принципа МТП

Вше уже отмечалось, что одним из главнейших требований, предъявляемых к методам филогенетической реконструкции, является их биологическая состоятельность. Такая состоятельность складывается из двух компонентов. Первым является отсутствие каких-либо априорных органичений, не содержащихся в исходных данных. Принцип МТП удовлетворяет этому требованию в той мере, в которой это возможно, учитывая неизбежное ограничение самой задачи. Второй компонент связан с тем, что получаемые решения не должны противоречить "здравому смыслу", базирующемуся на всей совокупности биологических данных. Именно такой подход, основанный на сравнении получаемых схем с общепринятыми филогенетическими представлениями, ранее заставил усомниться в адекватности ряда методов филогенетической реконструкции. Суждение по этому вопросу является более сложным, и неизбежно вовлекает некоторый элемент субъективности при сравнительной оценке. Однако в любом случае несоответствие получаемого результата "здравому смыслу" не должно трактоваться однозначно как указание на несостоятельность метода (естественно, если соблюдается первое условие), поскольку именно случаи несовпадения представляют наибольший интерес, указывая на неполноту и неточность наших представлений.

*

Естественно, что такой анализ может быть проведен только с той

группой организмов, для которой общепринятая филогения может

считаться достаточно надежной. В этом смысле микроорганизмы

абсолютно непригодны; лишь в груше высших эукариот - животных и

в

растений имеются более или менее надежные палеонтологические данные, на основании которых может быть составлена достаточно точная филогенетическая схема.

3.1. Филогенетический анализ цитохромов с

Последовательности цитохромов с давно использовались для филогенетических построений различными методами, в частности, классическим методом Фитча и Марголиаш (1967), основанном на минимизации среднеквадратичного отклонения. Некоторым ребрам этого дерева приписаны отрицательные длины, что вряд ли может иметь разумное биологическое содержание. Дерево МТП, построенное по этим же данным, сходно по топологии с деревом Фитча-Марголиаш, за исключением тех мест, которые в первом дереве характеризуются ребрами с отрицательной длиной. Величина топологического несовпадения дерева Фитча-Марголиаш примерно в 1,5 раза выше, чем у дерева, построенного нашим методом.

Высокая вычислительная сложность метода МЭ приводит к тому, что деревья МЭ могут быть получены только для весьма незначительных по общему наборов данных. Однако Фулдс и др. Д1979) разработали метод, который в ряде случаев позволяет получить оценку нижнего значения суммарной длины дерева, соответствующего какому-либо набору данных. Таким образом, если дерево, построенное каким-либо эвристическим методом, обладает длиной, соответствующей этой теоретически полученной нижней границе, то это может служить доказательством того, что это дерево является деревом МЭ. Пользуясь этим подходом, Фулдс и др. нашли дерево МЭ для последовательностей цитохромов с 23 видов животных. Это дерево приводится на рис. за. Биологическая трактовка ряда районов этого дерева вызывает затруднения. Так, например, сомнительно, чтобы положение мыши в группе млекопитающих соответствовало бы истинной филогении грызунов, равно как сомнителен именно такой порядок дивергенции в группе копытных. Мы считаем, что эти аберрации являются артефактами, связанными с искусственностью постулата, лежащего в основе метода МЭ. На рис. зб показано дерево

-Зек

Рисунок 3. Деревья МЗ (А) и МТП (Б), построенные по последовательностям цитохромов с. Обозначения:

КЕ кенгуру ЛМ летучая мышь ОБ обезьяна СО собака ЧП черепаха

МТП, построенное по тем же данным. Несомненно, оно намного лучше соответствует "здравому биологическому смыслу". Следует отметить, что дерево МЭ характеризуется величиной топологического несоответствия"равной 1604. в то время как дерево МТП - 1104. Кроме того важно подчеркнуть, что те вида, положение которых вызывает наибольшее недоумение в дереве МЭ, характеризуются максимальной величиной локвльного топологического несовпадения. Это показывает.

что топологический критерий является биологически адекватным, и его минимизация приводит к более состоятельным с эволюционной точки зрения схемам.

ГО голубь КР кролик ЗЕ зебра КУ курица

ЛЯ лягушка СБ свинья ТУ тунец МЫ мышь СК скумбрия ТЮ тюлень

КИ кит ЛО лошадь КУ курица КА карп

ПИ пингвин СТ страус ЭМ эму ЧЕ человек УТ утка

«

3.2. Филогенетический анализ вирусных РНК-полимераз.

В последнее время усилия многих авторов были направлены на расшифровку последовательностей геномов вирусов. В результате накопилось много информации о последовательностях важнейшего вирусного фермента - РНК-зависимой РНК-полимеразы. Сравнение этих структур у ряда вирусов позволило вывести консенсус (Камер и Аргос, 1984, Кунин и др. 1987). Такой консенсус был затем найден в последовательностях ряда позитивных рибовирусов, у которых локализация гена РНК-полимеразы ранее проведена не была. Кунин и др. (1987), провели выравнивание последовательностей РНК-полимераз позитивных рибовирусов (всего- около 30 последовательностей). Мы использовали этот массив данных для построения деревьев МТП. Такое дерево приводится на рис. 4.

САИМУ вту

■ОВМУУУ

Рисунок 4. -Дерево МТП, построенное по последовательностям РНК-полимераз позитивных рибовирусов.

Анализ его структуры позволяет выявить 2 достаточно компактные обширные группы вирусов эукариот, представление о монофилии которых, хорошо соответствует большой совокупности данных о структуре других вирусных белков и механизмах экспрессии вирусных геномов. Одна из этих, групп включает шнорнавирусы млекопитающих (РУ и др.) и две группы вирусов растений (комо- и потивирусы), а другая - альфавирусы животных и ряд групп вирусов растений (ТМУ и др.). Естественным также представляется выделение вирусов бактерий в отдельную ветвь №2 и др.). С другой стороны, локализация некоторых ветвей в дереве вызывает сомнения. Так, РНК-полимераза вируса паралича сверчка (СгРУ), относимого к пикорнавирусам, не только не группируется с полимеразами млекопитающих, но и отстоит от них намного дальше, чем полимеразы многих других вирусов, имеющих значительные молекулярно-биологические отличия. В настоящее время не представляется возможным решить, связано ли это с тем, что последовательность РНК-полимеразы этого вируса эволюционировала с весьма высокой скоростью, и сохранила лишь незначительное сходство с другими РНК-полимеразами на уровне, который не может обеспечить достоверные филогенетические выводы. На ненадежность положения этой последовательности в дереве указывает и высокая величина локального топологического несопадения, либо с тем, что выравнивание этой отдаленной последовательности было проведено неоптимально. Попытки перенести вершину, соответствующую вирусу паралича сверчка в другое место на дереве не приводят к улучшению глобального топологического критерия, однако, положение ее в ряде других районов дерева лишь ненамного хуже того, которое показано на рис. 4. Очевидно, что это подтверждает вывод о том, что удаленность этой последовательности от всех других обуславливает ненадежность ее положения в общей схеме, поэтому она, равно как и последовательность РНК-полимеразы

- ая -

коронавируса инфекционного бронхита кур 1ВУ, для которого величина локального топологического несовпадения также весьма велика, показаны пунктиром.

: В заключение этого раздела отметим, что в тех случаях, когда филогения установлена достаточно надежно, метод МТП дает достаточно приемлемое совпадение с этой филогенией. 4. Филогения микроогранизмов

Установление естественных эволюционных связей между микроорган> измами едва ли считалось осуществимым пару десятилетий назад. Сложность этой задачи определяется, с одной стороны, скудостью' палеонтологических данных, а с другой - тем, что большая часть доступных для определения свойств микроорганизмов имеет ярко выраженный адаптативный характер, и поэтому вряд ли отражает филогенетические связи мезду ними, а скорее является отражением общих условий существования (то есть могут иметь конвергентную природу). Именно поэтому существующая в настоящее время систематика микроорганизмов является почти искдаштельно фенотипической.

В последнее время делаются попытки подвести под нее филогенетическую основу, что связано с введением в употребление методов молекулярной филогенетики. Основным постулатом, лежащим в основе этого подхода, является представление о том, что филогения реперных макромолекул отражает филогению всего вида. Ряд исследователей, ссылаясь на принципиальную возможность горизонтального переноса генетической информации, например, при участии плазмид и трансдуцирующих вирусов считает, что это явление подрывает основу для использования макромолекул как реперов филогении биологических объектов. И хотя несомненно, что это явление может иметь место и в ряде случаев было экспериментально обнаружено, его широкое распространение в природе доказано не было. Одйако для того чтобы свести к

минимуму возможное влияние этого процесса на выводы филогенетического анализа, целесообразно4 также проводить исследования не с одним видом макромолекул, а с несколькими, выбирая в качестве объектов такие, для которых верог.тность горизонтального переноса минимальна.

4.1. Рибосомальная РНК как объект филогенетических исследований

Считается, что, выполняя черезвычайно важную, по-существу центральную роль в живой клетке, рибосома вряд ли может быть объектом горизонтального переноса. В связи с этим наиболее популярным объектом для исследований молекулярной филогенетики минроогранизмов являются молекулы рибосомальной РНК, в особенности РНК малой субчастииы (16б рРНК), сочетающие в себе консервативность и убихвитарность. Это позволяет проводить филогенетические исследования на самом высоком таксономическом уровне.

На начальном этапе, до введения в практику методов быстрого секвенирования нуклеиновых кислот, вместо сравнения собствено последовательностей РНК использовали сравнение наборов олигонуклео-тидов, получаемых из РНК обработкой рибонуклеазой т . Именно применяя такой подход был сделан вывод о том, что существующая систематика бактерий находится в серьезном противоречили с данными о филогении РНК, а также обосновано представление об архвбактериях как о своеобразной • разнородной в фенотилическом отношении группе, составляющей отдельное первичное царство, наряду с эукариотами и остальными бактериями (эубактериями).

Необходимость коренного пересмотра не только самой систематики микроорганизмов, но и ее принципов побудила нас в ряде случаев отказаться от использования общепринятых таксономических рангов ' и позволить себе употребление таких терминов, как "супергруппа пурпурные бактерии", не пытаясь пока придать ей какой-либо определенный

ранг. Более того, у нас нет убежденности в том, что в будущей систематике следует сохранить эти классические ранги.

В настоящее время стало возможным, в основном используя клонированные гены, определять полные последовательности рибоссмаль-ных РНК, однако до сих юр такая работа требует достаточно высокой квалификации и затрат труда. Альтернативой к 16Б рРНК является 5Б рРНК, которая также давно используется для филогенетических исследований. Преимуществом данного объекта является ее малый раз> мер и связанная с этим простота определения ее первичной структуры. Однако небольшая длина 5Б рРНК является и недостатком, обуславливая невысокую точность выводов, которые можно сделать на основании сравнения ее последовательностей. Несомненно, что наиболее ответственные филогенетические выводы следует делать с использованием по '"возможности более длинных молекул, таких как 16Б рРНК, но для широкомасштабного скрининга • и предварительной филогенетической характеризащш вполне достаточно той точности, которую обеспечивает 55 рРНК.

Именно имея ввиду апробацию предложенного нами метода филогенетической реконструкции на возможно более широком наборе . объектов мы выбрали именно 5Б рРНК, отдавая себе отчет в том, что в ряде случаев результаты следует считать предварительными. 4.2. Определение последовательностей 5Б рРНК микроорганизмов.

Работа проводились в сотрудничестве с исследователями из ' ю институтов Москвы, Киева, Риги и Пущино, которые предоставляли биомассу примерно юо видов и штаммов микроорганизмов. В качестве ■исходного материала мы использовали примерно 50-1000 мг влажной биомассы (осадок клеток обычно в логарифмической фазе роста). Экстракцию РНК проводили в 0.01М Иа-ацетатном буферном растворе рн 5,1 с 0,5% додецилсульфата натрия (зб&) фенолом при 60°С. РНК

метили in vitro [ Р]-цитидиндифосфатом (pCp) при помощи РНК-лигазы бактериофага Т4 (Икгланд, Уленбек, 1978). " Далее РНК очищали препаративным электрофорезом в s% полиакриламидном геле (ПААГ) с 7М мочевиной. Специфическую химическую модификацию РНК проводили по методу Питти (1979). а после гидролиза РНК анилином фрагменты разделяли электрофорезом в пластинах ПААГ размером .600x300x0,19 мм. 4.3. Происхождение риккетсий.

Риккетсии представляют собой своеобразную группу, прокариот, отличительной чертой которых является облигатный внутриклеточный паразитизм. В связи с этим практически все представители этой группы являются возбудителями тех или иных заболеваний человека, животных или растений. Риккетсии известны уже очень давно, и до середины 20 века относились к вирусам, благодаря малому размеру и внутриклеточному паразитизму. Обнаружение клеточной организации риккетсий и наличия у них белоксинтезирующего аппарата позволило установить их прокариотическую природу, однако филогенетическое положение риккетсий оставалось абсолютно неясным.

Мы определили последовательности 5S рРНК двух представителей родэ Rickettsia: R.prowazekii и R.moozeri. Сравнение показало, что они в наибольшей степени близки группе пурпурных несерных бактерий (подгруппа альфа по номенклатуре Вузе).

Интересно отметить, что именно к 5S рРНК бактерий этой группы близки 5S рРНК митохондрий растений (см. рис. 5). ' Нам представляется, что это может быть не случайным совпадением, а отражать тот факт, что бактерии данной группы обладают способностью к образованию симбиотических ассоциаций с другими клетками, что ' в случае свободноживуиих предшественников митохондрий привело' к возникновению эукариотических клеток, а в случав' риккетсий - к установлению паразитических взаимоотношений. Помимо сходства 5S'

рРНК, на родство риккетсий и предшественников митохо&дрий указывают и другие косвенные данные, например, наличие обменника АДФ-АТФ. 4.4. Филогенетический анализ легионелл.

Открытие легионелл и осознание роли бактерий этой группы в патогенезе ряда заболеваний было одним из важнейших открытий в медицинской микробиологии в 70-е годы. Наиболее известным и важным из легионеллезов является атипическая пневмония (болезнь легионеров). Легионеллы обладают рядом необычных свойств, что затрудняет их отнесение к какой-либо из известных груш бактерий. Многие исследователи считали, что легионеллы могут быть родственны риккет-сиям.

Людвиг и др. (1983) попытались определить филогенетическое положение легионелл на основе составления каталогов 16s рРНК, однако не смогли сделать это с полной определенностью. "Филогенетическое

положение легионелл не является бесспорным" заключили авторы этой

« / /' работы. /.

Мы провели исследование 5S рРНК /пяти представителей рода Legionella: L.pneumophila: штаммы Philadelphia-1 и Bloomington, L.bozemanii, L.dumoffii и L.longbeachae. При сравнении. этих последовательностей выявилось, что они распадаются на две группы ~ в одну входят представители L.pneumophila, а в другую - все остальные, причем расстояние между грушами превышает максимальное расстояние между последовательностями в пределах каждой из групп. Это согласуется с предложением выделить три последние вида в новый род -Piuoribacter. Однако для окончательного суждения по этому вопросу необходимы исследования других представителей легионелл и близких родов.

При сравнении последовательностей 5S рРНК легионелл и других бактерий максимальное родство было отмечено с группой пурпурных

;

серных бактерий - Ес^МогЬоскээргга и представителями семейства У1Ьг1опасеае, входящими в подгруппу бета пурпурных бактерий (см. рис. 5). Таким образом, это позволяет однозначно отвергнуть гипотезу о родстве легионелл и рнккетсий. 4.5. Пурпурные бактерии.

При сравнении результатов филогенетических исследований* проведенных на модели 16Б и 5Э рРНК неизбежно возникает вопрос о соотношении между филогениями этих молекул. Пурпурные и родственные им бактерии служили объектом широких филогенетических исследований с использованием олигонуклеотидных каталогов и полных последовательностей 163 РНК. В отличие от этого, до начала нашей работы была изучена лишь одна последовательность 5Б рРНК из этой группы: Июаов-рхгШш гиЬгшп. Мы решили восполнить этот пробел с целью сравнения выводов, которые можно сделать по этим различным молекулам рРНК. На рис. 5 приведена схема, на которой показано

Л h U

С

а а

а <

х

THIQö'^ö METHYL<5<<'

-EUQLENA»

и

ANACYSTI8« -NICOTIANA»

-ORYOPTERIS*

ВТЙ2 PTOfVtYGES*-

BAC1LLU9 BUQTILIS UREAPLASMA SPlROPLASMA

MYCOPLASMA«"'/^' BPIROSOM А

• 6 rtOOSACTE» CAPSULATA ,öV*cSi.coccua OENITPIFCAN8 ,?£:IoDOPBSUnOMONAS -"•S^odosirillum rubrum RICKETTSIA MOOZERV

PROWAZEK II

ZEA -—,

»GLYCINE ■ 'TRITICUM-

&&ЧМИТОХОНАРИИ

TERIUM

hW

^Ч^Й1 e°MICROBIUM

Рисунок 5. Дерево МТП, построенное по последовательностям 53 рРНК пурпурных и родственных им бактерий.

- зо -

филогенетическое положение представителей супергруппы "пурпурные бактерии", а также нескольких грам-полокительных бактерий. Основной вывод из проделанной работы состоит в том, что филогенетические схемы, полученные по 16S и 5S рРНК, в общих чертах совпадают.

Представители рода Rhodopseudomonas оказались довольно удаленными друг от друга в филогенетическом отношении, подтверждая справедливость выделения R.capsulata и R.sphaeroides в новый род Rhodobacter.

Пурпурные серные бактерии также характеризуются заметной филогенетической разобщенностью. Так, Chromatium не удается поместить шесте с Ectothiorhodospira, что опять же соответствует выделению его в отдельное семейство Chromatiaceae.

В целом проблема филогенеза пурпурных бактерий не может считаться окончательно решенной. Напротив, по нашему убеждению, исследование этого вопроса постепенно ■ 'подходит к наиболее существенному и интересному вопросу - о соотношении фенотипа, филогении РНК и филогении самих бактерий. Этот наиболее кардинальный вопрос всей филогенетики микроорганизмов, от ответа на который зависит стратегия создания микробной таксономии, может, быть исследован применительно к отдельным грушам в том случае, если будет накоплен достаточный по объему и репрезентативности массив данных. Такой массив, вероятно, в скором времени будет получен для пурпурных и родственных им бактерий.

Парадоксальность сложившейся ситуации состоит в том, что филогения, выявляемая по рибосомальной РНК, и классическая систематика, основанная на большей или меньшей совокупности фенотипических признаков, не могут быть совмещены на равноправных началах. В случае, если мы предполагаем, что филогения РНК отражает истине.-/ ход эволюции бактерий, . то мы 'вынуждены предположить либо

конвергентный характер большинства признаков (среда которых тип метаболизма, морфология и т.д.), либо горизонтальный перенос систем соответствующих генов. В противном случае мы вынуждены постулировать горизонтальный перенос самих генов рибосомальных РНК. Для того, чтобы решить этот вопрос и совместить мозаику разнообразных признаков, удачно охарактеризованную Заварзиным термином "пространство логических возможностей", с представлением о канонической дихотомической эволюции, либо отвергнуть саму применимость последнего представления к микроорганизмам, необходимо ■ подробно исследовать молекулярную филогению различных систем бактерий, а не только рибосомального аппарата. Представляется, что пурпурные бактерии, благодаря разнообразию их свойств и подробно изученной филогении рибосомальной РНК, являются хорошим объектом для проведения такого анализа. 4.6. Метилотрофные бактерии.

Одним из важнейших фенотипических признаков, используемых в традиционной систематике бактерий, являются трофические свойства, способность утилизировать те или иные субстраты. Метилотрофия - это способность использовать различные с соединения. Вполне естественен вопрос о систематическом значении этого признака, его связи с филогенией. Мы исследовали ряд метилотрофных бактерий, как облигатных, тек и факультативных. Дерево, показывающее филогенетические связи между ниш, приведено на рис. 6. Видно, что в целом метилотрофные бактерии распадаются на несколько ветвей, что согласуется с их фенотшшческими сзойствами. Так, облигатяые метзнокисляюпше и облигатные метилотрофные бактерии расположены в пределах обособленных кластеров, что свидетельствует о монофилетическом происхождении этих признаков.

Положение факультативных метилотрофных бактерий на общом дереве

нурномюповшм

«емЭВАСТБЖ тивеяоюавлстЕп»

лиспосусьи'9"4

оЮ дЬО,

„рДДООА 2Ч'мр5 МЕТН¥1-саА?ТЕС"и"

РВ. втитвЕР 1—1

ВСАВТОВАСТЕИ

"ллусавАстЕтим уасса®

АСЕТОВАСТЕР

лля. метнгиэрорн иа

«В)?**«,

МЮТАММООАСТЕЯ

РВ. ТШАЛиМОР^^О™ АЛЯ. МНТНАМО^"

РАЯАСОССив Иуиэсуат1«

стнчт.омамАв

У метнуюсоссио

-,п \ЛЖ1ТТ£МаиН*1

^с г,, "И-ОШНив

виЦАТиВ

Рисунок 6. Дерево, показывающее связи между метилотрофными бактериями.

показывает, что они расположены вперемежку с формами, для которых способность утилизировать с соединения не показана (см. например рис. 5). В целом, признаком метилотрофии обладают бактерии, которые, по классификации Вузе, принадлежат к супергруппе "пурпурные бактерии". Выше мы отмечали, что для этой группы характерна мозаика признаков, и метилотрофия является одним из них. Поэтому окончательное решение вопроса о дивергентном или конвергентном характере этого свойства требует дальнейшего исследования с использованием более представительного набора форм и детального анализа филогении отдельных ключевых ферментов метаболизма с соединений.

Проводя эту работу, мы исследовали не только коллекционные, хорошо охарактеризованные культуры, но и новые изоляты, прошедшие лишь первичное описание и идентификацию по классическим тестам. Изучение последовательностей ээ рРНК позволило в ряде случаев выявить ошибочность выводов, сделанных'на основе этих тестов.

- ээ -

Так, организм, идентифицированный вначале как "Mycobacterium vaccae" штамм 8, обладает 5S рРНК, отличающейся лишь на 4 нуклеотида от Blastobacter viscosus, то есть находится на филогенетическом расстоянии, характерном для представителей одного рода. Таким образом мы можем не только констатировать ошибочную идентификацию, но и предположить причину возникновения этой ошибки. Известно, что Blastobacter способен образовывать гифообразные клетки, которые при микроскопическом исследовании могли быть ошибочно приняты за мико-бзктерии.

Это показывает, что уже сейчас, несмотря нэ фрагментарность наших сведений о последовательностях 5S рРНК бактерий, их определение может дать не меньше, а зачастую больше, чем все осталь-• "tie геотн, проводимые при первичной идентификации. Мы считаем, что простота такого анализа позволяет ставить вопрос о введениии непреложного требования определения последовательностей 5S рРНК в ходе первичной идентификации, что существенно снизит вероятность грубых ошибок. 4.7. Олиготрофные бактерии.

Эта экологотрофическая груша микроорганизмов, включает такие роды как Caulobaoter, Hyphcmicrobium, Hyphomonas, Renobacter, Mioro-oyolus, ProsthecomicroMum, Seliberia и др (Никитин, 1985). Они обитают преимущественно в почве и пресной воде, и для них характерно приспособление к очень низкой концентрации субстратов; зачастую их рост даже ингиоируетая такими концентрациями субстратов, которые являются оптимальными для роста обычных микроорганизмов. Анализ 5S рРНК показал, что, за одним примечательным исключением (тороидальные бактерии), все они образуют филогенетически компактную группу, входящую в супергруппу "пурпурные бактерии". Интересно, что для некоторых олиготрофных бактерий черезвычэйно характерна своебразная,

довольно сложная форма, наличие простеков (выростов?, увеличивающих, поверхность клеток. Разнообразны они и в формально-таксономическом отношении. Тем не менее, сравнение их 53 рРНК показывает, что некоторые роды (Microcycius и Renobaoter) по этому признаку вполне могли бы быть объединены в один род.

Анализ липидов олиготрофных бактерий, проведенный Никитиным, Цирениной и Андреевым (1986), показывает хорошее соответствие с результатами сравнения 5S рРНК. Таким образом, можно сделать вывод о том, что разнообразие морфологических признаков олиготрофных бактерий являтся вторичным, недавним приобретением, которое имеет явное приспособительное значение и поэтому не может служить основой для филогенетических построений. 4.8. Тороидальные бактерии

Исследование 5S рРНК трех тороидальных бактерий: Spirosoma sp., Microcycius major и Microcycius flavus показало, что последняя бак-

ъ

терия, вероятно, идентична Spirosoma, а все они - черезвычайно , удалены от остальных бактерий. В связи с этим не вызывает сомнения необходимость и справедливость выделения Microcycius major в отдельный род Plectobacillus, для того чтобы подчеркнуть его отличие от Microcycius aquaticus, который определенно входит в только что обсуждавшуюся группу олиготрофов.

Spirosoma и i'lectobacillus, хотя и различаются между собой по 5S рРНК на довольно значительное число мутаций, максимально близки друг другу. Они имеют сходную делецию в шпильке "Е" 5S рРНК, что также является диагностическим признаком. Среди всех других бактерий, для которых известны последовательности 5S рРНК, наиболее близка тороидальным бактериям зеленая фотосинтезирукщая бактерия Chlorobium liir.icola, 5S рРНК которой также была исследована нами (см. рис. 7). Ее 5S рРНК также содержит характерную делецию.

Родство тороидальных бактерий и зеленой бактерии Chlorobium

Рисунок 7. Общее дерево прокариот, построенное методом МТП

по последовательностям 55 рРНК. достаточно отдаленное, но все же, вероятно, может считаться дос-товерннм, поскольку подтверждается рядом других косвенных признаков (липидный состав). Масштаб филогенетических расстояний в пределах этой группы, несомненно представляющей самостоятельную линию развития эубактерий, показывает, что они дивергировали довольно рано, и блике всего к грам-полокительным бактериям. 4.9. Архебактерии.

Само выделение архебактеркй в самостоятельное первичное царство живых существ целиком обязано исследованию молекулярной филогении

* 9

163 рРНК. Выводы, сделанные на основании этой работы, были в дальнейшем подтверждены при исследовании других свойств этих своеобразных микроорганизмов, что привело к практически полному признанию того факта, что таксономический ранг этой группы сравним- с рангом эукариот и всех остальных бактерий.

5в рРНК архебактерий до начала нашего исследова^я была изучена значительно хуже, чем 16Б рРНК. Поскольку мы считаем, что именно 5Э рРНК является перспективным объектом для экспресс-идентификации организмов, мы провели исследование примерно 25 штаммов архебактерий. В их число были включены как коллекционные культуры, так и недавно выделенные новые штаммы.

Мы исследовали две группы архебактерий - экстремально галофиль-ные бактерии и метаногеные бактерии, в частности, выделенные недавно Жилиной и Заварзиным новые формы галофильных метаногенных бактерий. Результаты проведенных филогенетических исследований суммированы на рис. 8. Филогения архебактерий, построенная по 5Б рРНК, хорошо согласуется с филогенией, построенной по 1бз рРНК. Видно, что гало-фильные бактерии образуют

МВ. 018ТЯ1ВиТив о. 'НВ013ТП 1витив (3 *<

матвонососс|,^'| нАТЯоыовдстец

нв. мео1тЁ^''в—

ИЕТИАНаНАШвШМС!!'

МС.МАСОВ1ив< Ю.АСЕТ ■ УОПАМ:

МСТМАМОВАГОМА УАСЦОСАТА! МЕТМАИСПД

МЕТМАМОСОССОЮЕВ*

жл.гелааив1

. О®»»©'1 -аСТЕВЮМ оштвюогив 1

13ити а 'З и Г * „,атвюитиа 4

МЕНА^ОВОЕУШАСТЕИ

МБТНАнавАСТЕтим РОЯМ1С1Сим

ма.тнЕяхлоАитаггясгэм ма.тнЕ1Чмсх=апм|С1сиу

МЕТнднасоссиг VANNIEU.II

МЕТНАМавРШ|^иМ

ТНЕЯМОРЬАбМА

виирипасассив

Рисунок 8. Дерево МТП, построенное по последовательностям 5Б рРНК архебактерий.

достаточно компактную группу, расположенную среди метаногенных бактерий, что указывает на- их взаимное родство. Алкалофильные экстремальные галофилы, принадлежащие к родам Ыа^опоЬас^ег и

Natronococcus, очень близки мевдУ собой.

Несколько наблюдений заслуживает серьезного внимания. Первое состоит в том, что изученные наш новые изоляты экстремально гало-фильных архебактерий, выделенные Звягинцегэй и Тарасовым, и помещенные юли в новый вид Halobacterium distributus, оказались черезвычайно гетерогенными в филогенетическом отношении. Это означает, что их следовало бы выделить по крайней мере в отдельные виды. Однако кроме последовательностей 5S рРНК, никаких других оснований для этого нет. Все остальные признаки, которыми они обладают, весьма сходны.

На возможную причину такого очевидного несоответствия гетерогенности филогении и сходства фенотипа указывает другое интересное наблюдение, которое мы сделали, изучая один из штаммов н.distributus - штамм 13. При очистке 5S рРНК из этого штамма электрофорезом в ПМГ в зоне 5S рРНК наблюдаются три полосы. Такая гетерогенность иногда наблюдается у некоторых организмов и обычно связана либо с отсутствием у части молекул одного -двух концевых нуклеотидов, либо с некоторой гетерогенностью последовательностей, связанной с одновременной активностью в клетке нескольких слегка различных копий гена 5S рРНК. В случае H.distributus 13 определенные нами две последовательности 5S рРНК (из верхней и средней полос) оказались различными на 25 нуклеотидов. Насколько нам известно, в литературе не сообщалось о гетерогенности такого масштаба в пределах одного генного семейства.

Причин, объясняющих наличие такого генного полиморфизма, может быть две. Первая и наименее вероятная состоит в горизонтальном переносе риОосомальных генов от какой-либо другой экстремально гало-фильной архебактерш. Вторая - независимая эволюция в течении длительного времени отдельных копий генов рРНК. Такая возможность вытекает из нейтралистской теории молекулярной эволюции. Поскольку

галобактерии населяют столь экзотическую экологическую нишу, они находятся под действием черезвычайно сильного стабилизирующего отбора, заставляющего консервировать Стенотипические признаки, что делает последние мало информативными в филогенетическом отношении. Последовательности макромолекул, в данном случае рРНК, в противоположность этому испытывают гораздо меньшее селективное давление, которое, вероятно, не намного отличается от того, которое испытывают рРНК других организмов. В результате взаимные скорости эволюции * ■ фенотипа и генотипа оказываются существенно различными у галофильных архебактерий, с одной стороны, и обычных - с другой. В результате длительной эволюции и дивергенции отдельных копий генов рРНК образуются "химерные" виды, каким, вероятно является н.<ИзЪг1Ьи1;из 13. При утрате различных копий генов рРНК могут возникнуть бактерии, которые при формальном сравнении последовательностей 5Б рРНК окажутся существенно различными, в то время как в действительности являются близкородственными. Таким образом, нейтральная эволюция независимых копий - представителей генного семейства с последующей утратой отдельных копий может наряду с горизонтальным переносом служить основой часто наблюдаемой "мозаичности" признаков бактерий.

Это рассуждение вызывает сомнение в применимости молекулярно филогенетического анализа, основанного на одном признаке, для получения надежных филогенетических схем. Следует отметить, что для того чтобы избежать ошибочных выводов, следует, с одной стороны, тщательно исследовать генный полиморфизм анализируемого признака, и с другой - не ограничиваться анализом лишь одного гена (генного семейства).

Исследование галофильных метаногенных бактерий показало, что они на дереве группируются надалеко от экстремально галофильных бактерий, и, возможно, могут быть переходными формами. Анализ 5Э рРНК позволяет сделать вывод, который можно сделать и на основе анализа

1бБ рРНК, о том, что метаногены являются черезвычайно

ч

филогенетически разнородной группой; возможно, это отражает древность этих бактерий. Они являются как бы связующим звеном между экстремальными галофилами, термоацидофилами, серозависимыми бактери-ами и эубактерияда. 4.Ю. Разные микроорганизмы

Помимо описанных выше больших груш микроорганизмов, мы исследовали 5Б рРНК некоторых отдельных представителей прокариот, что позволило уточнить или впервые определить их филогенетическое положение.

Филогенетическое положение Оеиюсоссшз гасИойигапз. своеобразного микроорганизма, отличительной чертой которого является экстремальная устойчивость к ионизирующему излучению, не было известно. Определение последовательности 5Б РНК этой бактерии позволило сблизить ее по этому признаку с бактериями рода тьегтиБ. Положение группы ОЬегтиз - Безлососсиз на общем дереве прокариот показывает, что они отдаленно родственны супергруппе "пурпурные бактерии", однако, вероятно, дивергировали в самом начале эволюции этой супергруппы и представляют собой самостоятельную ветвь. На родство • тьестшз и Вехпосоосиз указывают также и другие данные (например, относительно клеточной стенки), полученные в последнее время.

Егаш&а - ' представитель азотфиксирующих актиномицетоподобных микроорганизмов, при анализе 53 рРНК оказался близким актиномицетам и в филогенетическом отношении.

Определение последовательности 53 рРНК У1Ъг1о а1^о1у1;1сг»а, бактерии, у которой Скулачевым и др. (1986) показано наличие своеобразного механизма мембранного энергетического сопряжения ("Ла-энергетика"), позволило подтвердить, что этот организм по своей филогении не отличается сколько-нибудь значительно от. других представителей УНхгЛопасеае. Это дало основание предположить, что и

другие вибрионы также могут обладать этим своеобразным физиологическим механизмом.

Эукариотический микроорганизм Plasmodium berghei - малярийный плазмодий - оказался первым представителем класса споровиков, для которого было исследовано филогенетическое положение определением последовательности рибосомной РНК. Его положение в тотальном дереве МТП показано на рисунке д.

■ULPDLO,

FLECTOB АС»LL U В. CHLOHQ,

LACTOBAC ACHOLEPl.ae^<0 MVCOPLABMAOO UREAPLAs, " •PtPOPLASMAi CL.INNQCUUI

L.POCV^

•T«cp TOCOCCU8I

ТИС RMO BACTmRQi О 5:

«втеАйотм0*м OPHIUJS .

FRANKIA» ■TBEPTDMYCfe

OYCTIOOLOMU«'

OSJNOCOCCUB тив1

ANACVeTi«' pnQCHLOPON' CMtOROPCAST«^

.CTOTH^fo^4

PHOTHAM>»«r5(V0,i

,. «ияомми«

метнАкоадстЕтин 'МЕТИлловвсУ[адсТЕЯ

РОЯРНУЙ*

ЯАССИАИШУСЕВ инагоап» >АСЛКТИАМасОА ■Авмаянлаогг»

"•HAL1CLONA HCUX

эрозормк-а

CHLAMYDDWiaHAe

'< о VV<LVAY>

^CHONDPiO«

Рисунок 9. Тотальное дерево, построенное методом МТП

по последовательностям 53 рРНК. Совершенно очевидно, что дерева распадается на множество обособленных ветвей, вззгмное расположение которых вряд ли может восприниматься как однозначно установленное, поскольку набор входящих в него видов далеко не репрезентативен. К сожалению, несмотря на важность для понимания ранних этапов эволюции эукариот, молекулярная филогения простейших исследована не лучше, чем

филогения прокариот, и в этом отношеншш предстоит провести еще большую работу. 5. 4.5S РНК

При препаративной очистке электрофорезом во многих препаратах РНК из различных бактерий, наряду с 5S рРНК обнаруживается другая РНК со слегка большей подвижностью. У бактерий, принадлежащих к роду Legionella, эта полоса заметна наиболее отчетливо. В этом случае интенсивность ее мечения in vitro рСр примерно в ю раз выше, чем 5S рРНК, в то время как у других бактерий эта полоса обычно является минорной. Определение последовательностей РНК из этой полосы показало, что она гомологична 4.5S РНК, выделенной ранее из Escherichia coli. Сходство 4,5S РНК, выделеной из различных бактерий лишь ненамного ниже, чем сходство соответствующих 5S рРНК. Эволюционная консрватквность указывает на то, что она скорее всего выполняет важную функцию в клетках.

Роль 4.5S РНК в клетке неясна. Известно лишь, что она требуется для нормального протекания процесса синтеза белка (Фурнье, 1987). Значительное по сравнению с другими бактериями количество этой РНК в бактериях рода Legionella позволяет предложить этот объект для изучения функции и механизма действия этой РНК.

Для 4,5S РНК е.coli была предложена вторичная структура в виде единой шпильки с незначительными нарушениями спиральной структуры. Анализ последовательностей других 4.5S РНК показывает, что нуклео-твдные замены по сравнению с E.coli являются взаимно компенсирующими и не нарушают шшлькообразной вторичной сруктуры, показывая, что именно такая вторичная структура является биологически важной.

Интересно отметить, что мы пока не обнаружили 4.5S РНК у бактерий за пределами филогенетической группы, выделенной Вузе при анализе 16S рРНК и обозначаемой им как "пурпурные бактерии групп бета и гамма". Это наблюдение находится в некотором противоречии с

зажностью функции этой молекулы. Помимо гипотезы о том, что мы не обнаружили ее благодаря небольшому количеству или несовершенству применявшихся методов, можно предположить, что либо функция, выполняемая этой РНК, осуществляется молекулами РНК с другой электрофоретической подвижностью, либо какими-то белками, либо вообще не нужна в этих бактериях. Ответ на этот интересный вопрос может быть получен при сравнительном исследовании различных микроорганизмов.

6. Определение последовательностей биополимеров как метод идентификации микроорганизмов

6.1. Определение биологической природы агента КПН - предполагаемого возбудителя вилюйского энцефалита.

Выше мы продемонстрировали эффективность сравнения последовательностей биополимеров для уточнения идентификации и классификации микроорганизмов. Помимо этого, такой подход может успешно применяться и для экспресс-идентификации'вновь выделяемых микроорганизмов. Ниже мы приведем лишь один пример, показывающий эффективность этого подхода для целей практической определительной систематики.

В ходе поиска этиологического агента вилюйского энцефалита -тяжелого неврологического заболевания, эндемичного для ряда районов Якутии, был выделен агент, обозначенный КПН, размножающимся в культуре клеток. На основании ряда косвенных данных было высказано предположение, что этот агент, во-первых, является возбудителем вилюйского энцефалита, и во-вторых, представляет собой РНК-содержащий вирус. Однако, несмотря на почти ю-летние исследования с применением канонических методов вирусологической идентификации, сколько-нибудь определенной его характеризации достичь не удалось. Ряд его свойств оказался весьма необычным, а ряд - не удалось определить совсем: так, морфологические исследования остались

безрезультатными.

В ходе изучения макрсмолекулярного синтеза в зараженных агентом КПН культурах и при исследовании состава очищенного агента наряду с тремя видами высокомолекулярной РНК (20S) был найден набор низкомолекулярных РНК, по своему поведению при электрофорезе в ПАЯ1 напоминавший тРНК и 5S рРНК (рис. 10).

А5ВГАЕ

Рисунок ю. Электрофорез в ПААГ нм РНК, выделенных из очищенного

агента КПН (А.Б), незаракенных клеток СПЗВ (Д), клеток, зараженных агентом КПН (Е), тРНК (Г) и 5S рРНК E.coli (В).

Такой результат заставил поставить под сомнение вирусную природу агента КПН, поскольку вирусы не содержат рибосомального аппарата. Определение последовательности 5S рРНК этого агента показало ее полную идентичность 5S рРНК простейшего из класса саркодовых -Acanthamoeba castelanii.

Такой результат позволил однозначна идентифицировать агент КПН как амебоидное простейшее и предположить, что вилюйский энцефалит

является амебиазом ШС. Такая определенная идентификация биологической природы агента КПН открывает перспективу целенаправленного поиска амеб в организме больных и окружающей среде, что может подтвердить или опровергнуть выдвинутую гипотезу, В любом случае, это существенно продвигает вперед исследование природы этого заболевания. 7. Заключение

В этой работе мы ставили перед собой задачу разработать новый эффективный подход к филогенетическому анализу последовательностей биополимеров и продемонстрировать его применимость для решения частных вопросов филогении микроорганизмов. При этом мы не стремились к исчерпывающему решению этих вопросов, отдавая себе отчет в том, что реконструкция филогении представляет собой намного более сложную задачу, нежели построение дерева по одному признаку. Очевидно, что новое направление филогенетического анализа имеет хорошую перспективу и может служить основой разнообразных'работ, посвященных вопросам эволюции и систематики микроорганизмов. Кроме того, с нашей точки зрения, имеет перспективу и само развитие топологического подхода. В частности, дальнейшему усовершенствованию . должны подвергнуться алгоритмы построения деревьев МТП. Комплекс программ для филогенетического анализа следует сделать более интерактивным, его следует адаптировать к вычислительным средствам большей мощности, для того чтобы сделать возможным совместный анализ большего числа признаков большего числа видов. Этот подход может стать основой одного из новых направлений молекулярной филогенетики в будущем.

ВЫВОДЫ

1. Сформулирован пришил максимального топологического подобия, ставящий целью построение такого дерева, топологические свойства которого были бы идентичны либо в максимально возможной степени близки топологическим свойствам исходной матрицы попарных расстояний. Для решения этой задачи разработан математический аппарат для сравнения топологии матриц попарных расстояний и деревьев. Этот принцип имеет следующие достоинства:

- метод свободен от допущений относительно особенностей хода эволюционного процесса, его равномерности, относительных скоростей, минимальности и т.д.

- метод позволяет находить точные решения для класса матриц более широкого, нежели класс аддитивных матриц

- метод в достаточно широких пределах устойчив к погрешностям в определении взаимных расстояний

- метод позволяет проводить совместный анализ множества разнородных признаков, выраженных в единицах различной размерности

- метод позволяет получать объективную количественную оценку топологии деревьев, построенных различными методами

- метод позволяет выявить те места в построенном дереве, в которых величины топологического отклонения максимальны, указывая тем самым на необходимость более осторожной биологической интерпретации этих районов

- метод позволяет учитывать априорную информацию при гостроении деревьев.

- метод позволяет сформулировать несколько вычислительно эффективных алгоритмов для построения филогенетических деревьев.

:. Созданы алгоритмы для построения филогенетических деревьев максимального топологического подобия, характеризующиеся следующими свойствами:

- высокая вычислительная эффективность (сложность ~ oxN ).

- возможность получения различных, альтернативных решений с различными величинами топологического несовпадения.

- возможность работы не только с последовательностями биополимеров но и с другими признаками, информация о которых может быть представлена в виде матрицы попарных расстояний.

- возможность использования различных критериев для построения деревьев, включая принцип максимальной экономии.

3. Создан комплекс компьютерных программ для филогенетического анализа последовательностей биополимеров. Этот комплекс может быть использован для нахождения филогенетических деревьев и по другим признакам объектов, которые представимы в виде матрицы попарных расстояний. ■■/ , ■

4. Определены последовательности 5S рибосомных РНК примерно 100 видов и штаммов микроорганизмов, что позволило исследовать некоторые частные вопросы филогении: /.' •'

- впервые определено филогенетическое положение Rickettsia prowazekii и R.moozeri, уникальной группы внутриклеточных паразитических прокариот, и высказано предположение, об их родстве с предшественниками митохондрий эукариот.

- на основе определения последовательностей 5S рРНК 5 видов рода Legionella сделан определенный вывод о положении этих бактерий среди организмов, родственных пурпурным серным бактериям и энтеробактериям, а также выяснены филогенетические взаимоотношения в пределах рода.

- сделан вывод о том, что бактерия Deinooooous radiodurans родственна бактериям рода тьегииз, что позволяет поместить эту до сих пор неклассифицированную бактерию в общую систему прокариот.

- на основе исследования 5S рРНК 7 видов пурпурных

фотосинтезирующих бактерий сделан вывод о совпадении результатов анализа 1бэ и чз рибосомных РНК, и тем самым еще раз подтверждена пригодность 5Э рРНК в качестве объекта для экспресс-идентификации микроорганизмов.

- сравнение 53 рРНК зеленой фотосинтезирующей бактерии сыогоыш 11лп.со1а И тороидальных бактерий Р1ес4оЬасШиз И Зр1гозота показало, что эти бактерии родственны и составляют группу, черезвычайно удаленную в филогенетическом отношении от всех остальных исследованных эубактерий.

- исследование примерно ю штаммов экстремально галофнльных архе-бактерий относящихся к родам На1оЬа(^ег1ш), НаХососсиБ и Яагго-поЬасгег1ит и ^гопососсиз Енявяло своеобразие соотношения филогенетических и фенотипических свойств бактерий этой группы, что заставляет усомниться в надежности молекулярно филогенетического анализа единичных признаков для систематики бактерий этой группы.

исследованию примерно 12 штаммов галофильных метаногенных архебактеркй показало, что они родственны как экстремально галофильннм бактериям, так и метаногенным бактериям, исследование примерно 30 видов так называемых олиготрофных бактерий показало, что эта группировка, выделенная по эколого-трофическим особенностям. является довольно однородной в филогенетическом отношении. Широкое морфологическое разнообразие, наблюдаемое у бактерий этой группы, плохо коррелирует с филогенетическим положением, указывая на вторичность морфологических признаков и их неприменимость для решения филогенетических вопросов за пределами таксономического уровня отдельного рода.

• исследование примерно 35 видов и штаммов микроорганизмов, утилизирующих с -соединения, позволило предположить, что

признак факультативной метилотрофии не является монофилетическим, в то время как облигатные метанокисляжщие бактерии составляют обособленный кластер на филогенетическом дереве. Применение анализа последовательностей 5S рРНК некоторых бактерий этой группы позволило выявить неточности в их первичной классификации проведенной классическими методами. - Впервые методами молекулярной филогенетики изучено положение Plasmodium berghei - представителя класса споровиков.

5. Исследованы 4.5S РНК с неизвестной функцией у бактерий родов Legionella, Pseudomonas И Ectothiorhodospira. Эволюционная консервативность последовательностей позволила сделать выеод о важности этой молекулы для жизнедеятельности "пурпурных" бактерий, однако за рределами этой группы 4,5S РНК пока не найдена.

6. Определена последовательность малой РНК, выделяемой из очищенных препаратов выращенного в культуре ткани предполагаемого возбудителя вилюйского энцефалита - агента КПН. Идентичность этой последовательности 5S рРНК Acanthamoeba castellanii позволила однозначно определить биологическую природу этого агента и тем самым продемонстрировать эффективность анализа последовательностей биополимеров для идентификации микроорганизмов.

ПЕРЕЧЕНЬ РАБОТ. ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. А.С.Караванов, К.М.Чумаков. Некоторые характеристики штамма КПН - предполагаемого этиологического агента вилюйского энцефалита. Молек.генетика, микробиол., вирусол., 1, стр. 27-34, 1983.

2. К.М.Чумаков, А.С.Караванов. Выяснение биологической природы агента КПН. В кн.: Актуальные вопросы медицинской вирусологии.

под ред. С.Г.Дроздова. М., 1985, стр. 216.

3. K.M.Chumakov, E.N.Kondratieva. Phylogeny of prototrophic bacteria by sequencing oi 55 RNA. Тезисы v международного, симпозиума по фотосинтезирующим прокариотам, Гриндельвальд, 1985, стр. 162.

4. D.I.Nikitin, K.M.Chumakov. The functional role of oligotrophia ogranisms. В кн.: Microbial communities in soil, ПОД ред. V.Jensen, A.Kjoller, L.H.Sorensen, Elsevier publ., London and N.Y., p. 177-189, 1985.

5. К.М.Чумаков, О.А.Огаркова. Происхождение риккетсий. Труда всесоюзн. съезда миробиол. об-ва, т. 1, стр. 53, 1985.

6. K.M.Chumakov, A.S.Karavanov. Preliminary characterization oi an organism isolated from the case of Viluy encephalomyelitis indicates a protozoal rather than viral, aetiology. J.Gen.Microbiol. 132, p. 1127-1133, 1985. •

7. К.М.Чумаков, Д.И.Никитин, М.Л.Циренина. Филогенетическое положение олиготрсфных бактерий. Известия АН СССР, сер. биол.. стр. 125-131, 1986.

8. L.E.Bakeeva, A.L.Drachev, A.L.Metlina, V.P.Skulachev, K.M.Chumakov. The sodium cycle. III. Vibrio alginolyticus resembles Vibrio cholerae and some other vibriones by flagellar motor and ribosomal 5S-RNA,structures. Biochim.biophys. acta, 850, p. 466-472. 1986.

9. К.М.Чумаков, И.С.Тартаковский, О.А.Огаркова, С.В.Прозоровский. Изучение филогении бактерий рода Legionella путем определения последовательностей нуклеотидов 5S рибоссмной РНК. Молек.генетика, микробиол., вирусол., 8, стр. 38-40, 1986.

ю. А.Е.Булыгина, К.М.Чумаков, А.И.Нетрусов. Определение последовательностей 5S рибосомной РНК ряда метилотрофных бактерий. В сб. Физиология, генетика и биохимия метилотрофшх

бактерий, стр. 11-16, Киев, 1986.

11. К.М.Чумаков, И.С.Звягинцева. А.Л.Тарасов, Т.Н.Жилина, Г.А.Заварзин 5S РНК у архебактерий. Журнал общей биологии, т.

: 68, С. 167-184-, 1987.

12. K.Ii.Chumaicov. Evolution of nucleotide sequences. В КН.: Soviet Sei. Rev., V.P.Skulachev, ed., vol.7, 215-264, 1987.

13. Е.В.Кунин, А.Е. Горбаленя, К.М.Чумаков, А.П.Донченко, В.М.Блинов. Эволюция РНК-зависимых РНК полимераз позитивных

> рибовирусов. Молек. генетика, микробиол., вирус, т. 7, стр. 27-39. 1987.

14. Л.Е.Бакеева, А.Л.Драчев, А.Л.Метлина, В.П.Скулачев, К.М.Чумаков. Сходство Vibrio alginolyticus,V.choi.: и некоторых других вибрионов по строению.фибриллярного мотора,и структуре 5S-PHK. Биол. мембраны т. 52, с.8-14, 1987.

15. К.М.Чумаков, С.В.Юшманов. Принцип максимального топологического подобия в молекулярной систематике. Молек. генетика, микробиол.

вирус. 1983, т. з, 28-37. /.

16. С.В.К*шанов, К.М.Чумаков. Алгоритмы построения филогенетических деревьев максимального топологического подобия. Молек. генетика, микробиол. вирус. 1988, т. з, 38-48.

17. Е.В.Кунин, К.М.Чумаков, С.В.Кшманов, А.Е.Горбаленя. Эволюция РНК-зависимых РНК-полимераз позитивных рибовирусов: сравнение филогенетических деревьев, построенных различными способами. Молек. генетика, микробиол. вирус. 1988, т. 3, 49-55.

Л-£9625.пода.к печ.Ю/П-88 Бак.Й 203,гир.100.0РТП МГТ