Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Сравнительные характеристики дендритных клеток человека, дифференцированных in vitro, и проявляющих иммуностимулирующие или иммунорегуляторные свойства

ВАК РФ 03.03.04, Клеточная биология, цитология, гистология

Автореферат диссертации по теме "Сравнительные характеристики дендритных клеток человека, дифференцированных in vitro, и проявляющих иммуностимулирующие или иммунорегуляторные свойства"

На правах рукописи

Каралкин Павел Анатольевич

Сравнительные характеристики дендритных клеток человека, дифференцированных in vitro, а проявляющих иммуностимулирующие или иммунорегуляторные свойства

03.03.04 - Клеточная биология, цитология, гистология.

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

0046049

Москва, 2010

004604912

Работа выполнена на кафедре биологии педиатрического факультета ГОУ ВПО «Российский государственный медицинский университет Росздрава» и в лаборатории клеточной биологии отдела протеомных исследований Учреждения российской академии медицинских наук института биомедицинской химии имени В.Н.Ореховича РАМН.

Научный руководитель кандидат биологических наук

Лупатов Алексей Юрьевич

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор

Дубовая Татьяна Клеониковна

доктор биологических наук, профессор Егоров Егор Евгеньевич

Ведущая организация: ФГУ Московский научно-исследовательский онкологический институт им. П.А.Герцена Росздрава

Защита диссертации состоится « 3 » июня 2010 г. в ^ .00 часов на заседании Диссертационного совета Д 212.203.08 при ГОУ ВПО «Российский университет дружбы народов» по адресу: 117198, г. Москва, ул. Миклухо-Маклая, 8.

С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке ГОУ ВПО «Российский университет дружбы народов» по адресу: 117198, г. Москва, ул. Миклухо-Маклая, 6.

Автореферат разослан "3&" апреля 2010 г.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук

Саврова Ольга Борисовна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Дендритные клетки (ДК) человека являются объектом интенсивного изучения как со стороны клеточных биологов и иммунологов, так и ученых, специализирующихся в области клинических исследований. Это обусловлено центральной ролью ДК в функционировании иммунной системы и возможностью их использования в терапевтических целях. Исключительные свойства ДК, как наиболее специализированных антигенпрезентирующих клеток в организме, проявляются в выраженной способности к инициации адаптивных иммунных реакций. Именно поэтому использование ДК в качестве «природных адьювантов» белковых антигенов находит все большее применение в различных направлениях клеточной иммунотерапии (Shortman and Caux, 1997; Steinman and Dhodapkar, 2001; Figdor et al., 2004).

В настоящее время ДК расцениваются как гетерогенная популяция антигенпрезентирующих клеток, широко распространенных в различных тканях организма, и непосредственно контролирующих развитие первичного иммунного ответа (Hart, 1997). Первоначальное взаимодействие ДК с наивными Т-лимфоцигами является ключевым событием индукции клеточного звена иммунитета и определяет направление будущего антигенепецифичского ответа. ДК способствуют дифференцировке специфических клонов Т-хелперов и эффееторных Т-лимфоцитов, действие которых направлено на уничтожение патогенных возбудителей, а также собственных клеток, зараженных вирусами, или претерпевших опухолевую трансформацию. С другой стороны, многочисленные данные указывают на то, что в зависимости от физиологических условий ДК могут осуществлять не только позитивную, но и негативную регуляцию иммунитета (Steinman et al., 2003). Толерогенные эффекты ДК могут проявляться в индукции анергии Т-лимфоцигов либо в индукции дифференцировки Т-регуляторных клеток, что необходимо для поддержания периферической толерантности иммунной системы к аутологичным антигенам (Adler and Steinbrink, 2007).

Пластичность функциональной активности ДК позволяет использовать их для создания терапевтических клеточных вакцин с целью коррекции иммунодепрессивных или аутореактивных состояний иммунной системы. Варьируя условия in vitro, можно получать иммуностимулирующие ДК для лечения

онкологических и хронических инфекционных заболеваний или иммунорегуляторные ДК - для лечения аутоиммунных заболеваний и улучшения приживления аллотрансплантатов. Есть основания полагать, что ключевым показателем, определяющим по какому из двух путей пойдет иммунологический процесс, является степень зрелости ДК (Morelli, 2006). Таким образом, учитывая сложность и разнонаправленность проявляемых ДК иммунологических эффектов, чрезвычайно актуальным является изучение механизмов, обеспечивающих их стимулирующее или регуляторное действие.

Современные высокопроизводительные методы молекулярной и клеточной биологии дают возможность проводить комплексную оценку иммунологических свойств ДК. Анализ экспрессии генома ДК позволяет определить гены, продукты которых обеспечивают их функционирование. На основе таких данных могут быть выявлены маркеры функционального состояния ДК и мишени для их фармакологической регуляции. Все это позволит повысить эффективность проводимой иммунотерапии клеточными вакцинами на основе ДК.

Целью настоящей работы явился сравнительный анализ in vitro функциональных особенностей незрелых и зрелых ДК, а также поиск различий в профилях их генной экспрессии.

Исходя из цели исследования, были сформулированы следующие конкретные задачи:

1. Отработать воспроизводимый метод дифференцировки и созревания ДК в культуре.

2. Изучить способность незрелых и зрелых ДК стимулировать иммунологические реакции в смешанной культуре с аллогенными Т-лимфоцитами.

3. Сравнить негативные иммунорегуляторные свойства, проявляемые ДК на разных стадиях созревания in vitro.

4. Сравнить фагоцитарную активность незрелых и зрелых ДК. Оценить возможность использования микро- и наноразмерных синтетических частиц для мечения и доставки антигенов внутрь ДК.

5. Изучить влияние секреторных факторов мезенхимальных стволовых и раковых клеток на созревание ДК.

6. Охарактеризовать дифференциальный профиль генной экспрессии незрелых и зрелых ДК.

Научная новизна работы. В настоящей работе впервые было показано, что основным механизмом иммунорегуляторного действия незрелых ДК в смешанной культуре является индукция анергии Т-лимфоцитов, а не дифференцировки Т-регуляторных клеток.

При помощи проточной щггоф луориметрки и флуоресцентной микросколии была впервые выявлены различия между механизмами поглощения микро- и наноразмерных частиц ДК, а также продемонстрирована возможность применения флуоресцентных наночастиц Quantum dots для мечения и визуализации ДК в организме.

Кроме того, впервые был проведен сравнительный полногеномный транскрипгомный анализ экспрессии генов незрелых и зрелых ДК, полученных в результате стимуляции созревания комбинацией TNF-a и PGE2. Транскрипгомный анализ выявил в незрелых ДК экспрессию ряда иммунорегуляторных генов. Были найдены определенные различия между профилями генной экспрессии незрелых ДК и описанных в литературе другими авторами толсрогенных ДК.

Практическая ценность полученных результатов заключается в возможности их применения на различных этапах создания и проведения доклинических исследований индивидуальных клеточных вакцин, направленных на лечение онкологических, хронических инфекционных или аутоиммунных заболеваний.

Для изучения условий созревания ДК в настоящем исследовании был разработан метод получения и оценки чистоты первичных культур раковых клеток, основанный на измерении уровней экспрессии поверхностных маркеров CD24, CD70 и CD90. Этот метод должен найти свое применение в биомедицинских исследованиях рака почки для отделения раковых клеток от клеток стромы.

Кроме того, на основании полученных в ходе транскриптомного анализа профилей экспрессии генов возможна разработка новых фармакологических препаратов для регуляции функций ДК в рамках проведения иммунотерапии.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на 5,6,7-й ежегодных конференциях «Стволовые клетки и перспективы их использования в

здравоохранении» в ГОУ ВПО РГМУ Росздрава (Москва, 2006-2008), на конференции «BD FACS User's Meeting» (Петрозаводск, 2007), на Всемирном конгрессе «HUPO 2008 7th World Congress» (Амстердам, 2008), на 4-й Международной конференции "Genomics, Proteomics, Bioinformatics and Nanobiotechnologies for Medicine" (Москва-Нижний Новгород-Москва, 2008), а также на Конференции молодых ученых в ФГУ НИИ ФХМ Росздрава (Москва, 2009).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 7 печатных работ: 3 статьи в рецензируемых научных журналах и 4 публикации в материалах научных конференций.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов, их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы, содержащего ссылки на 201 источник. Диссертация изложена на 130 страницах, содержит 24 рисунка и 3 таблицы.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследования

Биологический материал.

В работе были использованы образцы периферической крови здоровых добровольцев и онкологических больных, а также образцы ткани почечноклеточной карциномы (ПКК), полученные в клинике урологии ММА им. И.М.Сеченова. Мезенхимальные стволовые клетки (МСК) костного мозга человека были предоставлены лабораторией клеточных медицинских технологий отдела биомедицинских технологий ГОУ ВПО РГМУ Росздрава.

Культуры клеток.

Мононуклеарную фракцию лейкоцитов получали центрифугированием крови в градиенте фиколла-урографина с плотностью 1.077 г/см3 ("ПанЭко", Россия) и переносили в среду RPMI-1640 ("GIBCO", США), с 5% эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС), 50 мкг/мл гентамицина и 2 мМ HEPES ("Stem Cells", США). Моноциты выделяли путем адгезии к лабораторной пластиковой посуде.

Дифференцировку ДК индуцировали добавлением в культуру прикрепившихся моноцитов GM-CSF и IL-4 ("ProSpec", Израиль) в конечных концентрациях 80 и 50 нг/мл соответственно. Созревание дифференцированных ДК стимулировали добавлением 20 нг/мл TNF-a и 1 мкг/мл PGE2 ("Sigma-AIdrich") на 6-й день культивирования, после чего инкубация продолжалась еще 2 суток.

Пролиферацию Т-лимфоцитов оценивали в 6-дневных смешанных культурах с ДК. 1х105 ДК сокультивировали с аллогенными лимфоцитами в соотношении 1:5. Изменение количества IFN-y -продуцирующих Т-клеток оценивали в 7-дневных смешанных культурах. Для изучения способности ДК индуцировать дифференцировку Т-регуляторных клеток ДК культивировали с аллогенными лимфоцитами 7 суток в соотношении 1:10.

Первичные культуры опухолевых клеток получали из образцов опухолевой ткани с использованием 0,1 мг/мл коллагеназы, 0,01% гиалуронвдазы и 0,01% диспазы ("Sigma-AIdrich", США). Полученные клетки культивировали в среде DMEM/F-12 ("GIBCO", США), содержащей 10% ЭТС и инсулин-трансферрин селенит ("ПанЭко", Россия), при стандартных условиях (5% С02,37°С).

Культуры МСК поддерживали в среде DMEM:F12 ("Gibco", США), содержащей 10% ЭТС ("Hyclone"), 1 мМ пирувата натрия, 100 ед/мл пенициллина, 100 ед/мл стрептомицина, 2 мМ глютамина и 10 нг/мл bFGF ("Sigma-AIdrich", США). В экспериментах использовали клетки, прошедшие не более 10 пассажей и достигшие 50% конфлюэнгаости.

Сокультивирование незрелых ДК с МСК и клетками первичной культуры ПКК проводили для изучения влияния секреторных факторов на процессы созревания ДК. В исследовании использовали полупроницаемые мембраны ThinCert с диаметром пор 0,4 мкм ("Greiner Bio-One", Германия). 5х105 ДК культивировали в течение 48 часов в верхних камерах 12-луночных планшетов в присутствии факторов созревания. В нижних камерах планшетов находились адгезионные МСК или клетки ПКК в соотношениях 1:100-1:10 с ДК.

Проточная цитофлуориметрия.

Цитофлуориметрический анализ проводили при помощи проточного цигофлуориметра-сортера клеток FACSAria ("BD biosciences", США).

Для определения количества Т-регуляторных клеток в крови раковых больных в цельную кровь добавляли airm-CD4 (РегСр) и анти-СБ25 (Ре-Су5) антитела ("BD biosciences", США) и инкубировали в течение 30 минут при +4°С. Иммунофенотипирование ДК проводили при помощи первично меченых антител к поверхностным антигенам клеток человека - CD14, CD40, CD80, CD83, CD86, CD209, HLA-ABC, HLA-DR и CCR7 ("BD biosciences", США). Процентное содержание зрелых клеток в общей популяции ДК оценивали после двойного окрашивания анти-СБвЗ и анти-HLA-DR антителами. Статистический анализ и графическое представление результатов осуществляли с помощью компьютерной программы WinMDI.

Клетки первичных культур рака почки окрашивали антителами к поверхностным антигенам CD10, CD24, CD34, CD70, CD71 и CD90 ("BD biosciences", США). Фенотипирование МСК проводили при помощи комбинации антител к маркерам HLA-ABC, CD13, CD44, CD54, CD90, CD91 и CD105 ("BD biosciences", США). В качестве негативного контроля использовали идиотипические антитела, меченные соответствующими флуоресцентными красителями.

Дифференцировку Т-регуляторных клеток в культуре оценивали путем окрашивания анти-СМ и анти-СБ25 антителами ("BD biosciences", США). Окрашенные клетки фиксировали и пермеабилизовывали согласно инструкции производителя, а затем окрашивали антителами к внутриклеточному фактору транскрипции Foxp3. Для оценки пролиферации CD4+ Т-лимфоцитов использовали коммерческий набор BrdU Flow Kits ("BD biosciences", США). После инкубации с 10 мкМ бромдезоксиуридина (BrdU) в течение 1 часа, клетки окрашивали awm-CD4, а затем анти-BrdU антителами согласно рекомендациям производителя. Количество IFN-у-продуцирующих CD3+ Т-лимфоцитов измеряли путем окрашивания внутриклеточных цитокинов с помощью специфических антител Для усиления продукции IFN-y в культуры на 4 часа добавляли смесь факторов активации лейкоцитов ("BD biosciences", США), состоящую из форболового эфира (РМА), ионофора Са2+ (Ionomycin) и ингибитора белкового транспорта (Brefeldin А).

Активность эндоцигоза ДК при +37°С изучали с помощью флуоресцентных микрочастиц Fluoresbrite yellow-green beads диаметром 0,2 мкм ("Polysciences Inc.", США) в соотношении 1:1000 и флуоресцентных наночастиц "Qtracker-655 поп

targeted quantum dots" ("Molecular Probes - Invitrogen", США) в конечной концентрации 10 нМ. В качестве негативного контроля ДК инкубировали с частицами при температуре +4'С.

Микроскопия.

Микроскопические исследования осуществляли при помощи флуоресцентного микроскопа Zeiss Axiovert 200М ("Zeiss", Германия), снабженного цифровой камерой Zeiss AxioCam MRC и компьютерной программной средой AxioVision АС 4.1.

Иммуноферментный анализ (ИФА).

Измерение концентрации IL-12, секретируемого ДК, в культуральных средах проводили при помощи набора Human IL-12+p40 ("BioSource", Бельгия) в 96-луночных планшетах согласно методике и рекомендациям производителя. 500 тыс. ДК инкубировали в течение 48 часов в 24-луночных планшетах и затем получали супернатант для проведения ИФА. Измерение концентрации IL-12 проводили на планшетном ридере GENios Plus ("TECAN", Германия) при длине волны поглощаемого света 450 нм.

Транскриптомный анализ.

В каждом опыте использовали приблизительно 1 млн. незрелых или зрелых ДК. Общую РНК выделяли при помощи набора RNeasy Mini Kit ("Qiagen", Германия) согласно стандартному протоколу. Качество выделенной РНК определяли при помощи прибора 2100 Bioanalyser ("Agilent", США) и электрофорезных чипов Agilent RNA 6000 Pico LabChip. 500 нг полученной РНК использовали в качестве матрицы для синтеза кДНК по стандартному протоколу набора Agilent Low RNA Input Fluorescent Linear Amplification Kit ("Agilent", CILLA). Полученную кДНК использовали в качестве матрицы для синтеза флуоресцентно меченой кРНК. В параллельных опытах в кРНК зрелых и незрелых ДК вводили соответственно нуклеотиды СуЗ-СТР или Су5-СТР ("PerkinElmer", США).

Для транскриптомного анализа использовали экспрессионные микрочипы G4112A фирмы Agilent, содержащие около 44 000 зондов, соответствующих всем аннотированным генам человеческого генома. После гибридизации кРНК проводили

промывку микрочипов. Сканирование проводили на конфокальном лазерном сканере G2505B (Agilent) с разрешением 10 мкм при помощи фирменного программного обеспечения. Первичная обработка транскриптомных данных осуществлялась в программной среде Feature Extraction 9.1 фирмы Agilent Technologies.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Изменение морфологии и экспрессии поверхностных маркеров при созревании дендритных клеток.

Дендритные клетки получали in vitro из моноцитов периферической крови путем направленной дифференцировки. В присутствии GM-CSF и IL-4 моноциты теряли контакт с подложкой и переходили в суспензию в виде небольших клеточных скоплений. К 6-му дню культивирования практически все ДК находились в неприкрепленном состоянии (рис. 1а). Спустя 48 ч. после добавления факторов созревания у значительной части клеток увеличивалось проявление морфологических признаков, характерных для зрелых ДК (рис. 16).

Рис.1. Культуры дендритных клеток, а- незрелые ДК на 6-е сутки культивирования; б-зрелые ДК на 2-е сутки после добавления факторов созревания в культуру незрелых ДК. Световая микроскопия, увеличение х40.

В процессе дифференцировки и созревания изменялся набор поверхностных мембранных молекул ДК. Незрелые ДК обладали низкими уровнями экспрессии костимулирующих молекул CD40, CD80, CD83, средним уровнем экспрессии CD86 и высоким уровнем экспрессии лектинового рецептора CD209 (рис. 2). Добавление TNF-a и PGE2 способствовало увеличению количества CD40, CD80, CD83, CD86, а также повышало экспрессию молекул МНС, особенно 2-го класса (HLA-DR). При этом в культуре зрелых ДК снижался уровень экспрессии CD209. На поверхности

клеток появлялись хемокиновые рецепторы ССЯ7, отвечающие за миграцию зрелых ДК в направлении регионарных лимфатических узлов (рис. 2).

а

31 з

е.

г

0040

С080

С083

СБ86

стт

НЬА-АВС

юлок

ССИ7

а

Ал

а

Рис. 2. Экспрессия поверхностных молекул на мембранах незрелых и зрелых ДК. По оси абсцисс - интенсивность флуоресценции, отражающая уровень экспрессии поверхностного маркера; по оси ординат - количество регистрируемых событий (клеток). Изотопический контроль обозначен черной линией.

Процент созревания ДК определяли путем двойного окрашивания клеток антителами к С083 и НЬА-ОЯ. Зрелыми считали метки, у которых экспрессия обоих маркеров была в несколько раз увеличена по сравнению с незрелыми ДК (рис. 3). Количество спонтанно созревающих клеток в культурах ДК без факторов созревания не превышало 10-15%. Добавление в культуру ЮТ-а и РОЕ? в независимых экспериментах увеличивало содержание зрелых СШЗтНЬА-ОИ* клеток до 49,3 ± 11,3%.

Рис.3. Процентное содержание зрелых дендритных клеток на 6-й (а) и 8-й (б) дни культивирования. Цифрами отображено количество СШЗШ.А-ОГ^ клеток в процентах от общей популяции ДК.

Секреция ГЬ-12 дендритными клетками до и после их созревания.

Способность ДК секретировать 1Ь-12, играющий важнейшую роль в активации клеточного иммунного ответа по Тх1-типу, оценивали при помощи метода ИФА. Двухдневная инкубация ДК в присутствии факторов созревания приводила к примерно 5-кратному увеличению концентрации 1Ь-12 в культуральной среде по сравнению с незрелыми ДК (рис. 4).

I.

Рис. 4. Содержание 1Ь-12 в среде культивирования (по данным ИФА). Эксп. - номер эксперимента

Эндоцитоз микро- и наноразмерных частиц дендритными клетками.

Одним из ключевых свойств ДК, характеризующих их участие в иммунологических реакциях, является способность к эндоцитозу, оценка которого Г имеет большое значение при создании индивидуальных клеточных вакцин. В нашем г исследовании для повышения эффективности эндоцитоза и предотвращения клеточной гибели ДК мы проводили предварительную опсонизацию микрочастиц 1 эмбриональной телячьей сывороткой. По данным цитофлуориметрического анализа [-

около 16% незрелых ДК активно поглощали опсонизированные микрочастицы (рис.5а). Понижение температуры инкубации до +4°С предотвращало поглощение микрочастиц, что свидетельствует об активном характере процесса. В отличие от незрелых клеток, поглощение микрочастиц зрелыми ДК при +37°С было незначительным (рис.56), что указывает на снижение активности фагоцитоза в ходе созревания. Аналогичные результаты были получены с использованием флуоресцентной микроскопии (рис. 5в и 5г). По-видимому, снижение фагоцитарной активности отчасти связано с изменением профиля экспрессии поверхностных мембранных рецепторов, таких как CD209 (DC-SIGN), что было ранее показано в нашем исследовании.

Рис. 5. Поглощение флуоресцентных микрочастиц ДК.

Цитофлуориметрнческий анализ поглощения микрочастиц незрелыми (а) и зрелыми (б) ДК. Зеленой линией обозначены клетки, инкубированные в присутствии микрочастиц при 37'С, черной линией - клетки, инкубированные при 4°С. Флуоресцентная микроскопия

незрелых (в) и зрелых (г) ДК после их инкубации с флуоресцентными микрочастицами (зеленое

окрашивание). Клетки окрашены антителами к HLA-DR,

конъюгированными с АРС (красное окрашивание). Увеличение xlOO, масляная иммерсия. Масштабные полоски - 20 мкм.

В отличие от микрочастиц наночастицы не обладали токсическим действием на ДК, поскольку имели покрытие полиэтиленгликолем, препятствующее неспецифической адсорбции на мембранах клеток. По данным цитофлуориметрии активность поглощения наночастиц незрелыми и зрелыми ДК была практически одинаковой (рис. 6а,б). При этом количество клеток, поглощающих наночастицы составляло около 8% от общей популяции. Подобно микрочастицам эндоцитоз наноразмерных частиц прекращался при снижении температуры окружающей среды до 4 С. Увеличение концентрации и времени инкубации немного увеличивало процент клеток, захвативших наночастицы, но не изменяло соотношение эффективности эндоцитоза у зрелых и незрелых ДК.

Рис. 6. Поглощение флуоресцентных наночастиц ДК.

Цитофлуориметрический анализ

поглощения наночастиц Quantum dots -655 нм незрелыми (а) и зрелыми ДК (б). Красной линией обозначены клетки, инкубированные в присутствии наночастиц при 37°С, черной линией -клетки, инкубированные при 4°С. Флуоресцентная микроскопия незрелых (в) (увеличение х 40) и зрелых (г) (увеличение х 100, масляная иммерсия) ДК после их инкубации с наночастицами (красное окрашивание). Масштабные полоски: в - 50 мкм, г - 20 мкм.

Флуоресцентная микроскопия выявляла одиночные клетки, содержащие различное количество наночастиц (рис. 6в). При максимальном увеличении видно, что флуоресцентные наночастицы с различной интенсивностью накапливались в цитоплазме клеток (рис. 6г). Это наблюдалось как в случае незрелых, так и зрелых ДК. Таким образом, проникновение наночастиц внутрь ДК не зависело от стадии их созревания и, по-видимому, было опосредовано механизмом, отличным от эндоцитоза микрочастиц. Подобное свойство позволило предположить возможность использования флуоресцентных частиц Quantum dots для мечения и визуальной оценки ДК вне зависимости от степени их зрелости.

Влияние секреторных факторов, продуцируемых клетками почечноклеточной карциномы и мезенхимальными стволовыми клетками, на созревание дендритных клеток в культуре.

Существующие экспериментальные и клинические данные свидетельствуют о том, что прогрессивный рост опухоли либо введение стволовых клеток в организм может вызывать негативную регуляцию иммунитета. В связи с этим было решено изучить влияние растворимых факторов, выделяемых МСК костного мозга человека и клетками первичной опухолевой культуры, на созревание ДК in vitro.

Основным критерием выбора опухолей для экспериментов была их повышенная способность индуцировать CD4+CD25+ Т-регуляторные клетки in vivo. Для этого у пациентов с различными типами опухолей оценивали изменение процентного

Тире: 5зтр1е

РорШаКоп #Еуеп!з ИРагЫ %ТоШ

□ АН Е»еп1г 30,000 ЮО.О

НИ 1утрЬосу1ез 9,007 30.0 30.0

'—И Т-Ье/регэ 4,233 47.0 14.1

■ СР4 С0251" 444 1.5

Тире: еатр1е

рори1аиоп #Еуеп1з %Рагеп1 %То1а1

□ лиЕуе^э 30,000 100.0

—11утрИосу1ез 14,211 47.4 47.4

Ит-Ье1ре-з 5,616 39.5 18.7

ЯС04С025|- 1,727 5.8

содержания Т-регуляторных клеток в популяции СЭ4+ лимфоцитов периферической крови по сравнению со здоровыми донорами (рис.7).

Рис. 7. Относительное содержание СЮ4+С025+ Т-лимфоцитов в крови пациентов, а- здоровый донор; б- рак почки (пациентка Г.Т.).

Среднее содержание Т-регуляторных клеток в крови исследуемьгх нами здоровых доноров составило 8,5%. В то же время, имеющаяся выборка обследованных пациентов позволила выявить увеличение процентного содержания СБ4+С025+ клеток в крови больных раком почки, назначенных к оперативному лечению (табл. 1). Послеоперационный опухолевый материал от трех больных раком почки, имеющих максимальное количество регуляторных клеток в крови был использован для получения первичных культур опухолевых клеток. Таблица 1. Содержание С04+СБ25+ Т-регуляторных клеток в крови раковых больных.

№ п/п Ф.И. пациента Пол Возраст Заболевание Процент СБ25+ клеток в популяции С04+

1 Г.А. Муж 63 Здоров 9,4

2 В.М. Муж 42 Здоров 8,3

3 Л.А. Муж 43 Здоров 9,0

4 К.Н. Жен 27 Здоров 7,8

5 с.ю. Жен 21 Здоров 10,5

6 Б,И. Муж 20 Здоров 7,7

7 Ч.Н. Муж 18 Здоров 6,2

8 п.д. Жен 22 Здоров 10,3

9 с.в. Муж 26 Здоров 7,1

10 И.А. Муж 21 Здоров 8,2

11 Ш.О. Жен 44 РШМ в анамнезе, 11,2

в наст. вр. здорова

12 М.Л. Жен 57 РМЖ, стабилизация 3 года после химио- и иммунотерапии 9,3

13 К.Н. Муж 63 Рак простаты 8,3

14 В.А. Муж 76 Рак простаты 9,8

15 Ж.М. Муж 58 Рак желудка 21Д

16 Ш.Т Жен 63 Рак поджел. жел. 10,8

17 П.Е. Жен 53 Рак почки, пйз печень 26,0

18 Г.Т Жен 42 Рак почки 30,8

19 Г.Н. Жен 58 Рак почки, гйв печень 38,5

20 Г.В. Муж 33 Рак почки 20,0

21 К.А. Жен 47 Рак почки 25,7

22 С.Ю, Муж 44 Рак почки 18,4

На начальных этапах получения первичных культур часто возникает необходимость разделения опухолевых и неопухолевых клеток, не редко имеющих более высокую скорость пролиферации in vitro. Поэтому' перед нами стояла задача верификации опухолевой природы полученных культур. Для иммунофенотипирования клеток ПКК мы использовали следующие маркеры: CD24, характерный для эпителиальных клеток; CD70, характеризующий степень злокачественности опухолей: и CD90 - маркер фибробластов (рис.14).

даиг ггог

w О 1Г

CD2* FTTC.A

Рис. 8. Соотношение раковых и стропильных клеток в первичной культуре ПКК. Окрашивание культуры конъюгатами антител, специфичных для: а- СШ4; б- СБ70; в-0)90. По оси абсцисс - интенсивность флуоресценции, отражающая уровень экспрессии молекул, по оси ординат - параметры прямого светорассеивания. Процентами обозначено содержание раковых клеток в популяции.

Благодаря разработанной схеме проводилась оценка контаминированности полученных опухолевых культур клетками стромы. Так, в смешанной культуре RCC-3 (renal cell carcinoma) были обнаружены две клеточные популяции (рис. 8). 89% клеток составляли фибробласты, обладающие высоким уровнем экспрессии CD90. В то же время приблизительно 11% клеток экспрессировали CD24 и CD70, т.е.

сохраняли опухолевый фенотип. В отличие от ЯСС-З, другие культуры ПКК не содержали элементов стромы (результат не показан) и были использованы для совместного культивирования с ДК.

Помимо опухолевых клеток на данном этапе мы использовали аллогенные МСК, полученные из костного мозга человека, и прошедшие не более 10 удвоений. Мультипотентные свойства МСК были ранее подтверждены путем индуцированной дифференцировки в направлении костной, хрящевой и жировой ткани. Клетки полученных культур обладали фенотипическим профилем, характерным для МСК костного мозга - НЬА-АВС1™, С013тос1, С044'°", С054ы, С09110", СОЮ5'°".

Совместное культивирование незрелых ДК с МСК костного мозга и клетками первичной культуры ПКК производили по схеме, включающей использование полупроницаемой мембраны, что исключало контактное взаимодействие между клетками верхней и нижней камер и учитывало только эффекты секреторных факторов, выделяемых МСК или ПКК. Результаты измерений количества зрелых СП83тНЬА-ОЯт+ ДК, а также концентрации 1И2 в культуральных средах через 48 часов после начала сокультивирования представлены на рис. 9.

У

<3° <3®" 'Я .«Г сР

1600

1400

1200

с £ 1000

и. С 800

СЧ 600

400

200

0

.¿Г

Рис. 9. Влияние МСК костного мозга и клеток ПКК на созревание ДК. а- содержание зрелых СПвЗ^ЬА-ОК^ ДК через 48 часов культивирования; б- концентрация 1Ь-12 в культуральной среде через 48 часов культивирования . нДК- незрелые ДК; зДК- зрелые ДК; МСК - мезенхимальные стволовые клетки костного мозга; ПКК - почечноклеточная карцинома; факторы созревания - Т№-а и РвЕг.

Было установлено, что ни МСК, ни клетки ПКК самостоятельно не стимулировали созревание ДК. Совместное культивирование с МСК в присутствии

TNF-a и PGE2 препятствовало созреваншо ДК, что выражалось в низком проценте зрелых клеток (рис. 9а) и сниженной секреции ими IL-12 (рис. 96). В то же время, клетки первичных культур ПКК не оказывали существенного влияния на эффективность созревания ДК в присутствии факторов созревания. Несмотря на некоторое снижение процента зрелых ДК и концентрации IL-12 в присутствии ПКК, в целом, значения были сопоставимы с интактными культурами зрелых ДК.

На основании полученных результатов был сделан вывод о супрессорном влиянии МСК косного мозга на созревание ДК. По всей видимости, секреторные факторы МСК способны регулировать дифференцировку и созревание ДК, что может являться первичным звеном регуляции всего иммунного ответа. В то же время, в данных экспериментах не был выявлен значимый супрессорный эффект ПКК в отношении ДК, несмотря на выраженное увеличение количества циркулирующих Т-регуляторных клеток в крови пациентов. Это указывает на возможное значение контактных межклеточных взаимодействий для поддержания опухолевой иммуносупрессии у больных с ПКК.

Функциональная характеристика дендритных клеток в смешанной культуре с аллогенными Т-лимфоцитами.

Иммунологические свойства ДК оценивались in vitro по способности стимулировать пролиферацию и выработку провоспалигельных цитокинов аллогенными лимфоцитами, а также по их способности индуцировать дифференцировку Т-регуляторных клеток.

Процентное содержание пролиферирующих CD4+ Т-лимфоцигов в общей популяции лимфоцитов подсчитывали на 6-й день смешанной культуры. Как видно из результатов (рис. 10), зрелые ДК в значительно большей степени активировали процессы пролиферации CD4+ Т-лимфоцигов, чем незрелые. В независимых экспериментах было получено приблизительно 4-кратное увеличение процента пролиферирующих клеток при культивировании со зрелыми ДК.

1.0%

Рис. 10. Пролиферативный ответ аллогенных ОР-Г Т-лимфоиитов в смешанной культуре с ДК.

а- нестимулированные лимфоциты; б- лимфоциты, стимулированные ФГА (2 мкг/мл); в- смешанная культура незрелых ДК и лимфоцитов; г- смешанная культура зрелых ДК и лимфоцитов. Процентами указано содержание пролиферируюших клеток.

Способность ДК вызывать дифференцировку и активацию покоящихся Т-лимфоцитов в смешанной культуре оценивали по изменению количества 1Р>}-у-продуцирующих клеток. Количество 1РЫ-у-продуцирующих клеток подсчитывалось среди всех СБЗ+ Т-лимфоцитов. В ходе 7-дневной инкубации ДК и Т-лимфоцитов происходило увеличение процентного содержания 1Р1Ч-у- продуцирующих клеток в культуре по сравнению с негативным контролем (рис. 11). Процент 1РК-у-продуцирующих клеток в отсутствии стимуляции составлял 5-8%, в то время как добавление в культуру незрелых или зрелых ДК увеличивало их содержание до 1114% и 24-27% соответственно. Таким образом, было отмечено, что в процессе созревания дифференцированных ДК усиливалась их способность стимулировать функциональную дифференцировку покоящихся Т-лимфоцитов в направлении Тх1-иммунного ответа.

ш-гт»

12,0 %

Рис.11. Продукция 1П\-у Т-лимфоцитами в смешанной культуре с ДК. а- культура лимфоцитов; б- смешанная культура незрелых ДК и лимфоцитов; в-смешанная культура зрелых ДК и лимфоцитов. Процентами указано содержание клеток-продуцентов ^¡Ч-у внутри прямоугольных гейтов.

Иммунорегуляторные свойства ДК изучали по способности индуцировать дифференцировку Т-регуляторных клеток in vitro. Т-регуляторными считали CD4+ Т-лимфоциты, имеющие высокий уровень экспрессии поверхностного рецептора для 1L2 (CD25) и характеризующиеся наличием экспрессии наиболее изученного на сегодняшний день маркера Foxp3. В отсутствии ДК содержание CD25hlFoxp3 в общей популяции CD4+ Т-лимфоцитов составляло 2,1-4,0%. По результатам серии проведенных независимых экспериментов не удалось выявить статистически достоверной способности незрелых и зрелых ДК индуцировать Т-регуляторные клетки (рис. 12).

5,9 %

г

3

В

20-lmm ОС

3,9%

+ нДК

I 4,7%

Z E-Allo»M3tDC

5.8 %

iff

+ зДК

Рис. 12. Индукция Т-регуляторных клеток в смешанной культуре.

а, б, в- примеры независимых экспериментов. нДК- незрелые ДК; зДК- зрелые ДК. Процентами отмечено содержание С04+СП251"ГохрЗ+Т-лимфоцитов.

Отсутствие индуцирующего влияния на дифференцировку Т-регуляторных клеток позволило сделать предположение о наличии иных механизмов иммунорегуляторного действия ДК. Мы изучили способность незрелых ДК вызывать состояние анергии аллогенных СВ4+ Т-лимфоцитов. Для этого проводили совместное культивирование лимфоцитов с незрелыми ДК в течение 5 сут., после чего в культуру еще на 3 сут. добавляли зрелые ДК с целью стимуляции пролиферации. В другой серии экспериментов проводили двукратное последовательное культивирование лимфоцитов с незрелыми ДК (5+3 сут.), а затем их стимулировали зрелыми ДК.

FMP3APC-

Рис. 13. Индукции незрелыми ДК состояния анергии СБ4+ Т-лимфоцитов. Лф - аллогенные лимфоциты, нДК - незрелые ДК, зДК - зрелые ДК. Процентами обозначено содержание пролиферирующих клеток. Подписи под колонками отражают очередность внесения клеток в смешанные культуры

Результаты измерений процентного содержания пролиферирующих С04' Т-лимфоцитов представлены на рис. 13. После культивирования со зрелыми ДК в среднем 15,2% Т-лимфоцитов включали пролиферативную метку. После однократного культивирования с незрелыми ДК аллогенные Т-лимфоциты не отвечали на последующее стимулирующее действие зрелых ДК, Процент пролиферирующих клеток при этом находился в одном диапазоне с процентом спонтанно пролиферирующих интактных лимфоцитов, служивших негативным контролем (7,4% против 7,7% соответственно). В то же время, двукратное сокультивирование с незрелыми ДК приводило к выраженному снижению процентного содержания пролиферирующих €04 Т-лимфоцитов (2,8%) по сравнению с однократным сокультивированием или негативным контролем (рис. 13). Таким образом, предварительное взаимодействие с незрелыми ДК препятствовало последующей активации Т-лимфоцитов зрелыми ДК. При этом степень угнетения лимфоцитов зависела от кратности сокультивирования с незрелыми ДК.

Изменение профиля экспрессии генов при созревании дендритных клеток.

Транскриптомный анализ позволяет определять изменения в синтезе мРНК в масштабе всего генома или его части. В нашей работе были использованы экспрессионные микрочипы, содержащие 44 ООО олигонуклеотидных зондов, соответствующих всем аннотированным генам человеческого генома.

Полученные в процессе синтеза с кДНК образцы меченой кРНК зрелых и незрелых ДК гибридизовали с экспресеионными микрочипами. После сканирования микрочипов проводили программную обработку полученных результатов. С учетом того, что биологический эффект обычно является результатом различия в генной экспрессии в несколько раз (Сгоуап с( а!., 2008), для дальнейшего анализа в обеих

популяциях ДК мы использовали гены с разницей сигнала более, чем в три раза по сравнению с нормализованным сигналом (рис. 14). Анализ статистической достоверности различий при помощи теста АМОУА с р<0,05 позволил выявить точное количество генов с дифференциальной экспрессией. В итоге, экспрессия 554 генов была повышена у зрелых ДК, в то время как экспрессия 732 была снижена по сравнению с незрелыми ДК.

Рис. 14. Графическое изображение распределении генов по уровню экспрессии. Красным цветом показаны гены с повышенной экспрессией в незрелых ДК, синим - с повышенной экспрессией в зрелых ДК. Зелеными линиям очерчены гены, уровень экспрессии которых различался более, чем в 3 раза по сравнению с нормализованным сигналом.

Среди всех установленных в ходе анализа генов с дифференциальной экспрессией наибольший интерес представляли, прежде всего, те малоизученные гены, продукты которых могли напрямую или опосредованно участвовать в обеспечении иммунологических функций ДК (табл. 2). Среди генов, продукты которых потенциально связаны с индукцией механизмов иммунологической регуляции, у незрелых ДК мы обнаружили экспрессию генов НБЭП, В1С1()В, €1)163 и ЫЬКВ2. Н8Ш1В1 относится к группе 11-бета гидроксистероидных дегидрогеназ, и обеспечивает превращение внутриклеточного кортизона в активный кортизол, относящийся к группе глюкокортикоидных гормонов. Компонент комплемента С1ч позволяет незрелым ДК связывать и поглощать фрагменты апоптотических клеток и формировать периферическую толерантность к аутоантигенам. Рецептор СШбЗ обеспечивает поглощение фрагментов разрушенных клеток макрофагами, а также

способствует подавлению воспалительных процессов в тканях. Ген ШЯВ2 кодирует белок из В-подсемейства лейкоцитарных иммуноглобулиноподобных рецепторов (1ЬТ4), включающий тирозин-содержащий иммунорецепторный ингибирующий мотив (1Т1М) и встречающийся в популяциях ДК, проявляющих толерогенные свойства. В то же время, мы не обнаружили экспрессии генов, кодирующих известные иммуносупрессорные цитокины, такие как 1Ь-10, ТСР-р или УЕОР.

Таблица 2. Дифференциальный профиль экспрессии генов ДК.

Группы генов Незрелые ДК Зрелые ДК

Хемокины и хемокиновые рецепторы CCL4, CCL13, CCL23, CCL26, CCR1, CCR5 CCL21, CCR7, CCL22, CX3CL1, CXCLS

Рецепторы и молекулы адгезии CDla,b,c, CD31, FCER1A, IL1RAP ITGA4, ICAMI, CD58

Молекулы апоптоза CASP1, 4, 5, BCL6 CASP7, BCL2

Маркеры активации - IL2RA (CD25) 117R (CD127)

Иммунорегуляторные факторы C1QB, HSD11B1, CD163, LILRB2(ILT-4) INDO

Зрелые ДК, в свою очередь, обладали выраженной экспрессией гена INDO, продуктом которого является фермент indoleamine-pyrrole 2,3-dioxygenase или IDO, катализирующий превращение триптофана в кинуренин, характеризующийся подавлением функций Т-лимфоцитов.

Таким образом, исходя из полученных нами результатов, был сделан вывод о наличии у ДК разнообразных иммунорегуляторных механизмов на всех стадиях их жизнедеятельности. Существование подобных механизмов необходимо для предотвращения развития реактивного иммунного ответа в случае отсутствия воспаления и инфекционного процесса. Кроме того, негативная иммунологическая регуляция необходима для подавления индуцированных защитных процессов после уничтожения патогенных возбудителей. В нашей работе было установлено, что молекулярные факторы, опосредующие иммунорегуляторные свойства, экспрессируются в основном в незрелых ДК.

выводы

1. Днфференцировка моноцитов периферической крови in vitro, индуцированная наличием в среде GM-CSF и IL-4 и дальнейшее созревание клеток в присутствии TNF-a и PGE2 позволяет получать зрелые дендритные клетки, стимулирующие иммунные реакции по Тх1-типу.

2. Дендритные клетки не индуцируют образование CD4+CD25+Foxp3+ Т-регуляторных клеток в смешанной культу ре с аллогенными лимфоцитами.

3. Незрелые дендритные клетки инициируют анергию Т-лимфоцитов в аллогенной смешанной культуре.

4. Незрелые дендритные клетки обладают повышенной способностью к эвдоцитозу микро-, но не наноразмерных частиц. Наночастицы могут использоваться для мечения дендритных клеток вне зависимости от степени их зрелости.

5. Растворимые факторы, секретируемые мезенхимальными стволовыми клетками, оказывают негативное влияние на созревание дендритных клеток в культуре. Растворимые факторы почечноклеточной карциномы не влияют на этот процесс.

6. Транскриптомный анализ выявил наличие экспрессии ряда генов, включая LILRB2(ILT4), C1QB, HSD11B1, CD163, продукты которых опосредуют иммунорегуляторные свойства незрелых ДК. В то же время зрелые ДК характеризуются повышенной экспрессией генов, кодирующих специфические молекулы адгезии, цитокины, хемокины, хемокиновые рецепторы и маркеры активации, необходимые для стимуляции адаптивного иммунитета.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Лупатов А.Ю., Каралкин П.А., Суздальцева Ю.Г., Бурунова В.В., Ярыгин В.Н., Ярыгин К.Н. Цитофлюориметрический анализ фенотипов фибробластоподобных клеток из костного мозга и пуповины человека // Клеточные технологии в биологии и медицине, 2006, №4, с. 212-217.

2. Каралкин П.А., Ковтун Н.Е., Лупатов А.Ю., Курынин Р.В., Чалый М.Е., Аляев Ю.Г., Ярыгин К.Н. CD24 и CD70 - дифференциальные маркеры почечноклеточной карциномы человека в культуре // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины, 2007, №12, с. 668-671.

3. Каралкин П.А., Лупатов А.Ю., Ярыгин К.Н. Эндоцитоз микро- и наноразмерных частиц дендритными клетками человека в культуре // Биологические мембраны, 2009, №5, с. 394-400.

4. Лупатов А.Ю., Каралкин П.А., Суздальцева Ю.Г., Бурунова В.В., Ярыгин К.Н. Дифференциальный профиль поверхностных маркеров мезенхимальных стволовых клеток и фибробластов кожи человека// Сб. тезисов 6-ой ежегодной Всероссийской и международной научной конференции "Стволовые клетки и перспектива их использования в здравоохранении", Москва, 2007, стр. 67.

5. Каралкин П.А., Ковтун Н.Е., Лупатов А.Ю., Курынин Р.В., Ярыгин К.Н. Дифференциальные маркеры первичных культур почечноклеточной карциномы и колоректапьного рака человека // Сб. тезисов 7-ой ежегодной Всероссийской и международной научной конференции "Стволовые клетки и перспектива их использования в здравоохранении", Москва, 2008, стр. 23.

6. Лупатов А.Ю., Курбатов Л.К., Каралкин П.А., Чеглаков И.Б., Ярыгин К.Н. Сравнительные особенности Т-регуляторных клеток человека, индуцированных раковыми или мезенхимальными стволовыми клетками // 7-я ежегодная конференция «Стволовые клетки и перспективы их использования в здравоохранении», Москва, 2008, стр. 38-39.

7. Lupatov A.Yu., Kurbatov L.K., Karalkin P.A., Cheglakov I.B., Yarygin K.N. Full Genome Transcryptome Analysis of T-Regulatory Cells Isolated from Cancer Patients // 4th International Conf. "Genomics, Proteomics, Bioinformatics and Nanobiotechnologies for Medicine", Moscow-Nizhny Novgorod-Moscow, 2008, p.28-29.

Каралкин П.А.

Сравнительные характеристаки дендритных клеток человека, дифференцированных in vitro, и проявляющих иммуностимулирующие или иммунорегуляторные свойства

Проведена комплексная сравнительная оценка свойств незрелых и зрелых дендритных клеток (ДК) человека, полученных в культуре в результате направленной дифференцировки из моноцитов периферической крови. С использованием методов проточной цитофлуориметрии, ИФА и полногеномного транскрипгомного анализа был получен целый ряд данных, позволяющих охарактеризовать незрелые ДК как клетки, обладающие преимущественно негативной иммунорегуляторной активностью. Было показано, что незрелые ДК способны вызывать анергию алло генных Т-лимфоцитов, но не стимулировать образование CD4+CD25+Foxp3+ Т-регуляторных клеток. В то же время, зрелые ДК способствовали активации Txl-иммунного ответа, что выражалось в увеличении пролиферативной активности и продукции IFN-y аллогенными Т-лимфоцигами в смешанной культуре. Иммуностимулирующая активность зрелых ДК коррелировала с их повышенной способностью сскретировать IL-12. Сравнительный анализ профилей генной экспрессии выявил преимущественную экспрессию генов, ответственных за негативную иммунорегуляцию, в незрелых ДК, тогда как зрелые ДК в основном экспрессировали гены, ответственные за развитие адаптивного иммунного ответа. Кроме того, в работе были изучены особенности эндоцигоза микро- и наноразмерных частиц зрелыми и незрелыми ДК. Вьивлено негативное влияние растворимых факторов мезенхимальных стволовых клеток на созревание ДК.

Karalkin P.A.

Comparative characteristics of human dendritic cells differentiated in vitro and exhibited immunostimulatory or immunoregulatory properties

To compare the immunological properties of immature and mature dendritic cells (DCs) differentiated in vitro from the peripheral blood monocytes FACS analysis, ELISA and full genome DNA microarray analysis were employed. Immature DCs were characterized as the cells that have predominantly negative immunoregulatory activity. It was shown that immature DCs were able to induce anergy of allogeneic T-lymphocytes, but did not stimulate CD4 + CD25 + Foxp3 + T-regulatory cells induction. In contrast, the mature DCs contributed to activation of Thl-immune response that was manifested in an increase of proliferation and IFN-y production in mixed culture with allogeneic T-lymphocytes. Immunologic activity of mature DCs correlated with their increased ability to secrete IL-12. Comparative analysis of gene expression profiles showed a high level of expression of genes responsible for the negative immunoregulation in immature DCs, whereas mature DCs mainly expressed genes responsible for the adaptive immune response. In addition, the features of endocytosis of micro- and nano-sized particles and negative influence of soluble factors from mesenchymal stem cells on the DCs maturation were revealed.

Бумага "ЗуйоСору". Формат 60x90 1/16. Тираж 100 экз. Подписано в печать 22.04.2010 г. Отпечатано в типографии ООО КМП «Фирма ЭРА» 105484, Москва, Сиреневый б-р, д. 72 Тел. (495)464-1774

Содержание диссертации, кандидата медицинских наук, Каралкин, Павел Анатольевич

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Дендритные клетки — ключевое звено в первичном иммунологическом распознавании.

1.1.1. Типы дендритных клеток и их функциональная специализация в организме.

1.1.2. Клеточные взаимодействия в процессе развития первичного иммунного ответа. Роль дендритных клеток.

1.1.3. Возможные механизмы участия дендритных клеток в негативной регуляция иммунного ответа.

1.2. Особенности экспрессии генов в дендритных клетках.

1.2.1. Транскриптомный анализ в изучении генной экспрессии.

1.2.2. Экспрессия генов, отвечающих за иммунологические функции дендритных клеток.

1.3. Перспективы клинического применения дендритных клеток.

1.3.1. Способы создания терапевтических вакцин на основе дендритных клеток.

1.3.2. Вакцины на основе дендритных клеток в лечении онкологических и хронических инфекционных заболеваний.

1.3.3. Возможности клинического использования дендритных клеток, обладающих иммунорегуляторными свойствами.

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1. Биологический материал.

2.1.1. Кровь.

2.1.2. Опухолевая ткань.

2.2. Культуры клеток.

2.2.1. Дифференцировка дендритных клеток в культуре.

2.2.2. Смешанные культуры лимфоцитов и дендритных клеток.

2.2.3. Получение и культивирование первичных культур опухолевых клеток.

2.2.4. Культура фибробластоподобных мезенхимальных стволовых клеток.

2.2.5. Сокультивирование ДК с мезенхимальными стволовыми клетками и клетками первичной опухолевой культуры.

2.3. Проточная цитофлуориметрия.

2.3.1. Анализ поверхностных и внутренних маркеров клеток.

2.3.2. Оценка пролиферации CD4+ Т-лимфоцитов.

2.3.3. Измерение IFN-y -продуцирующих Т-лимфоцитов.

2.3.4. Определение активности эндоцитоза.

2.4. Микроскопия.

2.5. Иммуноферментный анализ.53,

2.6. Транскриптомный анализ.

2.6.1. Выделение и анализ РНК.

2.6.2. Определение качества РНК.

2.6.3. Синтез комплементарной ДНК (кДНК).

2.6.4. Синтез и очистка меченой комплементарной РНК (кРНК).

2.6.5. Гибридизация кРНК.

2.6.6. Промывка чипов после гибридизации кРНК.

2.6.7. Получение и первичная обработка транскриптомных данных.

Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

3.1. Изменение морфологии и экспрессии поверхностных маркеров при созревании дендритных клеток.

3.2. Секреция IL-12 дендритными клетками до и после их созревания.

3.3. Эндоцитоз микро- и наноразмерных частиц дендритными клетками.

3.4. Влияние секреторных факторов, продуцируемых клетками почечноклеточной карциномы и мезенхимальными стволовыми клетками, на созревание дендритных клеток в культуре.

3.5. Функциональная характеристика дендритных клеток в смешанной культуре с аллогенными Т-лимфоцитами.

3.6. Изменение профиля экспрессии генов при созревании дендритных клеток.

Глава 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.

4.1. Дифференцированные in vitro зрелые дендритные клетки активируют иммунный ответ по Txl-типу.

4.2. Незрелые дендритные клетки обладают повышенной способностью к эндоцитозу микро-, но не наноразмерных частиц.

4.3. Мезенхимальные стволовые клетки, в отличие от клеток рака почки, подавляют созревание дендритных клеток в культуре.

4.4. Незрелые дендритные клетки индуцируют анергию аллогенных Т-лимфоцитов, а не дифференцировку Т-регуляторных клеток.

4.5. Незрелые и зрелые дендритные клетки характеризуются экспрессией различных генов, отвечающих за иммунологическую регуляцию.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Сравнительные характеристики дендритных клеток человека, дифференцированных in vitro, и проявляющих иммуностимулирующие или иммунорегуляторные свойства"

Дендритные клетки (ДК) человека являются объектом интенсивного изучения как со стороны клеточных биологов и иммунологов, так и ученых, специализирующихся в области клинических исследований. Это обусловлено центральной ролью ДК в функционировании иммунной системы и возможностью их использования в терапевтических целях. Исключительные свойства ДК, как наиболее специализированных антигенпрезентирующих клеток в организме, проявляются в выраженной способности к инициации адаптивных иммунных реакций. Именно поэтому использование ДК в качестве «природных адъювантов» белковых антигенов находит все большее применение в различных направлениях клеточной иммунотерапии (Shortman and Caux, 1997; Steinman and Dhodapkar, 2001; Figdor et al., 2004).

В настоящее время ДК расцениваются как гетерогенная популяция антигенпрезентирующих клеток, широко распространенных в различных тканях организма, и непосредственно контролирующих развитие первичного иммунного ответа (Hart, 1997). Первоначальное взаимодействие ДК с наивными Т-лимфоцитами является ключевым событием индукции клеточного звена иммунитета и определяет направление будущего антигенспецифичского ответа. ДК способствуют дифференцировке специфических клонов Т-хелперов и эффекторных Т-лимфоцитов, действие которых направлено на уничтожение патогенных возбудителей, а также собственных клеток, зараженных вирусами, или претерпевших опухолевую трансформацию. С другой стороны, многочисленные данные указывают на то, что в зависимости от физиологических условий ДК могут осуществлять не только позитивную, но и негативную регуляцию иммунитета (Steinman et al., 2003). Толерогенные эффекты ДК могут проявляться в индукции анергии Т-лимфоцитов либо в индукции дифференцировки Т-регуляторных клеток, что необходимо для поддержания периферической толерантности иммунной системы к аутологичным антигенам (Adler and Steinbrink, 2007).

Пластичность функциональной активности ДК позволяет использовать их для создания терапевтических клеточных вакцин с целью коррекции иммунодепрессивных или аутореактивных состояний иммунной системы. Варьируя условия in vitro, можно получать иммуностимулирующие ДК для лечения онкологических и хронических инфекционных заболеваний или иммунорегуляторные ДК - для лечения аутоиммунных заболеваний и улучшения приживления аллотрансплантатов. Есть основания полагать, что ключевым показателем, определяющим по какому из двух путей пойдет иммунологический процесс, является степень зрелости ДК (Morelli, 2006). Таким образом, учитывая сложность и разнонаправленность проявляемых ДК иммунологических эффектов, чрезвычайно актуальным является изучение механизмов, обеспечивающих их стимулирующее или регуляторное действие.

Современные t высокопроизводительные методы молекулярной и клеточной биологии дают возможность проводить комплексную оценку иммунологических свойств ДК. Анализ экспрессии генома ДК позволяет определить гены, продукты которых обеспечивают их функционирование. На основе таких данных могут быть выявлены маркеры функционального состояния ДК и мишени для их фармакологической регуляции. Все это позволит повысить эффективность проводимой иммунотерапии клеточными вакцинами на основе ДК.

Целью настоящей работы явился сравнительный анализ in vitro функциональных особенностей незрелых и зрелых ДК, а также поиск различий в профилях их генной экспрессии.

Исходя из цели исследования, были сформулированы следующие конкретные задачи:

1. Отработать воспроизводимый метод дифференцировки и созревания ДК в культуре.

2. Изучить способность незрелых и зрелых ДК стимулировать иммунологические реакции в смешанной культуре с аллогенными Т-лимфоцитами.

3. Сравнить негативные иммунорегуляторные свойства, проявляемые ДК на разных стадиях созревания in vitro.

4. Сравнить фагоцитарную активность незрелых и зрелых ДК. Оценить возможность использования микро- и наноразмерных синтетических частиц для мечения и доставки антигенов внутрь ДК.

5. Изучить влияние секреторных факторов мезенхимальных стволовых и раковых клеток на созревание ДК.

6. Охарактеризовать дифференциальный профиль генной экспрессии незрелых и зрелых ДК.

Заключение Диссертация по теме "Клеточная биология, цитология, гистология", Каралкин, Павел Анатольевич

выводы

1. Дифференцировка моноцитов периферической крови in vitro, индуцированная наличием в среде GM-CSF и IL-4 и дальнейшее созревание клеток в присутствии TNF-a и PGE2 позволяет получать зрелые дендритные клетки, стимулирующие иммунные реакции по Txl-типу.

2. Дендритные клетки не индуцируют образование CD4+CD25+Foxp3+ Т-регуляторных клеток в смешанной культуре с аллогенными лимфоцитами.

3. Незрелые дендритные клетки инициируют анергию Т-лимфоцитов в аллогенной смешанной культуре.

4. Незрелые дендритные клетки обладают повышенной способностью к эндоцитозу микро-, но не наноразмерных частиц. Наночастицы могут использоваться для мечения дендритных клеток вне зависимости от степени их зрелости.

5. Растворимые факторы, секретируемые мезенхимальными стволовыми клетками, оказывают негативное влияние на созревание дендритных клеток в культуре. Растворимые факторы почечноклеточной карциномы не влияют на этот процесс.

6. Транскриптомный анализ выявил наличие экспрессии ряда генов, включая LILRB2(ILT4), C1QB, HSD11B1, CD 163, продукты которых опосредуют иммунорегуляторные свойства незрелых ДК. В то же время зрелые ДК характеризуются повышенной экспрессией генов, кодирующих специфические молекулы адгезии, цитокины, хемокины, хемокиновые рецепторы и маркеры активации, необходимые для стимуляции адаптивного иммунитета.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В результате исследования нами были получены данные о механизмах, обеспечивающих разнонаправленное иммунологическое действие ДК человека. Был проведен сравнительный анализ in vitro функциональных особенностей незрелых и зрелых ДК, найдены существенные различия в профилях их генной экспрессии, что полностью соответствует заявленной цели работы.

Достижение цели исследования стало возможным в результате решения ряда конкретных задач: а) был отработан воспроизводимый метод индуцированной дифференцировки и созревания ДК человека в культуре; б) изучена способность незрелых и зрелых ДК стимулировать иммунологические реакции в смешанной культуре с аллогенными Т-лимфоцитами; в) проведено сравнение негативных иммунорегуляторных свойств, проявляемых ДК на разных стадиях созревания in vitro; г) оценена фагоцитарная активность незрелых и зрелых ДК с использованием микро- и наноразмерных частиц; д) изучено влияние секреторных факторов мезенхимальных стволовых и раковых клеток на созревание ДК; е) охарактеризован дифференциальный профиль генной экспрессии незрелых и зрелых ДК. Таким образом, в ходе выполнения работы в полном объеме были решены все поставленные задачи, получены экспериментальные результаты, которые должны найти свое применение как в области медико-биологических исследований, так и в клинической практике.

Было показано, что в смешанной культуре с аллогенными лимфоцитами зрелые ДК активируют иммунологические реакции, протекающие по Txl-типу, т.е. с преобладанием клеточного звена иммунитета. Данное свойство зрелых ДК может быть использовано при создании клеточных вакцин, направленных на лечение онкологических и хронических инфекционных заболеваний, поскольку именно этот тип иммунного ответа необходим для эффективной иммунотерапии. В то же время, было установлено, что незрелые ДК могут самостоятельно инициировать состояние анергии Тлимфоцитов в смешанной культуре. Таким образом, исходя из характера иммунорегуляторных свойств, незрелые ДК можно использовать для специфического подавления реактивных клонов Т-лимфоцитов в ходе иммунотерапии аутоиммунных заболеваний, а также для улучшения результатов приживления аллотрансплантатов.

При изучении физиологических свойств ДК нами было установлено, что они обладают различными механизмами эндоцитоза в зависимости от размера поглощаемых частиц. Исходя из полученных данных, микроразмерные частицы можно использовать в процессе создания клеточных вакцин для оценки фагоцитарной активности ДК, а также, при необходимости, осуществлять с их помощью активную загрузку антигенов в незрелые ДК. Наноразмерные частицы, в свою очередь, могут быть использованы для мечения ДК вне зависимости от степени созревания с целью определения их локализации после введения в организм.

Для изучения иммунологических свойств ПКК нами был разработан метод оценки чистоты получаемых первичных культур раковых клеток, основанный на измерении уровней экспрессии поверхностных маркеров CD24, CD70 и CD90. Этот метод может найти свое применение в биомедицинских исследованиях рака почки для отделения раковых клеток от клеток стромы.

Кроме того, в нашей работе впервые был проведен сравнительный полногеномный транскриптомный анализ, характеризующий изменение спектра экспрессии генов при созревании ДК, стимулированном добавлением комбинации факторов TNF-a и PGE2 в культуру. Полученные профили генной экспрессии могут быть востребованы для разработки новых фармакологических препаратов, модулирующих функцию ДК при проведении иммунотерапии.

В целом стоит отметить, что полученные в ходе настоящей работы данные могут быть использованы при создании и проведении доклинических исследований клеточных вакцин на основе ДК, обладающих иммуностимулирующей или иммунорегуляторной активностью. В то же время широкое клиническое внедрение подобных вакцин в медицинскую практику сопряжено с выработкой конкретных протоколов, включающих оптимальный метод загрузки антигенов, а также схему вакцинации для достижения эффективного терапевтического ответа при конкретных заболеваниях. Изучение подобных методологических аспектов должно явиться предметом будущих исследований. i

1 1 ■и

Библиография Диссертация по биологии, кандидата медицинских наук, Каралкин, Павел Анатольевич, Москва

1. Арчаков А.И. Постгеномные технологии и молекулярная медицина // Вестник РАН, Т.74, 2004, С.423-429.

2. Арчаков А.И., Говорун В.М. Методы и подходы в протеомике // Биохимия, 2002, №67, С. 1341-1359.

3. Воробьев А.А., Быков А.С., А.В. Караулов. Иммунология и аллергология / М.: Практическая медицина, 2006, 288 с.

4. Лупатов А.Ю., Каралкин П.А., Суздальцева Ю.Г., Бурунова В.В., Ярыгин В.Н., Ярыгин К.Н. Цитофлюориметрический анализ фенотипов фибробластоподобных клеток из костного мозга и пуповины человека // Клет. техн. в биол. и мед., 2006, №4, С.212-217.

5. Лысов Ю., Флорентьев В., Хорлин А., Мирзабеков А. Определение нуклеотидной последовательности ДНК гибридизацией с олигонуклеотидами // Докл. Акад. наук СССР, 1988, Т. 303, С.1508-1511.

6. Прокопович С.К., Винницкий В.Б. Дендритные клетки и перспективы их использования в иммунотерапии злокачественных новообразований // Онкология, 2001, №2-3, С. 126-131.

7. Телетаева Г.М. Цитокины и противоопухолевый иммунитет // Практ. Онкология, 2007, №4, С.211-218.

8. Ярилин А.А. Основы иммунологии / М.: Медицина, 1999, 608 с.

9. Adler H.S., Steinbrink К. Tolerogenic dendritic cells in health and disease: friend and foe // Eur. J. Dermatol., 2007, v. 17, P.476-491.

10. Akira S., Takeda K., Kaisho T. Toll-like receptors: critical proteins linking innate and acquired immunity //Nat. Immunol., 2001, v.2, P.675-680.

11. Alwine J.C., Kemp D.J., Stark G.R. Method for detection of specific RNAs in agarose gels by transfer to diazobenzyloxymethyl-paper and hybridization with DNA probes // Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1977, v.74, P.5350-5354.

12. Ammon C., Mondal K., Andreesen R., Krause S.W. Differential expression of the transcription factor NF-kappaB during human mononuclear phagocyte differentiation to macrophages and dendritic cells // Biochem. Biophys. Res. Commun., 2000, v.268, P.99-105.

13. Apostolopoulos Y., Pietersz G.A., McKenzie I.F. MUC1 and breast cancer. Curr. Opin. Mol. Ther., 1999, v.l, P.98-103.

14. Banchereau J., Palucka A.K. Dendritic cells as therapeutic vaccines against cancer // Nat. Rev. Immunol., 2005, v.5, P.296-306.

15. Baumjohann D., Lutz M.B. Non-invasive imaging of dendritic cell migration in vivo II Immunobiology, 2006, v.211, P.587-597.

16. Bell G.W., Lewitter F. Resources for small regulatory RNAs // Curr. Protoc. Mol. Biol., 2009, Ch.19, Unitl9.8.

17. Berger T.G., Schulze-Koops H., Schafer M., Muller E., Lutz M.B. Immature and maturation-resistant human dendritic cells generated from bone marrowrequire two stimulations to induce T cell anergy in vitro II PLoS One, 2009, V.4, e6645.

18. Berzofsky J.A., Terabe M., Oh S., Belyakov I.M., Ahlers J.D., Janik J.E., Morris J.C. Progress on new vaccine strategies for the immunotherapy and prevention of cancer // J. Clin. Invest., 2004, v.l 13, P. 1515-1525.

19. Beyth S, Borovsky Z, Mevorach D, Liebergall M, Gazit Z, Asian H, Galun E, Rachmilewitz J: Human mesenchymal stem cells alter antigen-presenting cell maturation and induce T-cell unresponsiveness // Blood, 2005, Y.105, P.2214-2219.

20. Bohnenkamp H.R., Noll T. Development of a standardized protocol for reproducible generation of matured monocyte-derived dendritic cells suitable for clinical application // Cytotechnology, 2003, Y.42, P. 121-131.

21. Bottino C., Castriconi R., Moretta L., Moretta A. Cellular ligands of activating NK receptors // Trends Immunol., 2005, v.26, P.221-226.

22. Brandes M., Willimann K., Bioley G., Levy N., Eberl M., Luo M., Tampe R., Levy F., Romero P., Moser B. Cross-presenting human gammadelta T cells induce robust CD8+ alphabeta T cell responses // Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2009, v.106, P.2307-2312.

23. Cambi A., Lidke D.S., Arndt-Jovin D.J., Figdor C.G., Jovin T.M. Ligand-conjugated quantum dots monitor antigen uptake and processing by dendritic cells // Nano Lett., 2007, V.7, P.970-977.

24. Castellano G., Woltman A.M., Nauta A.J., Roos A., Trouw L.A., Seelen M.A., Schena F.P., Daha M.R., van Kooten C. Maturation of dendritic cells abrogates Clq production in vivo and in vitro II Blood, 2004, V.l03, P.3813-3820.

25. Chen Z., Moyana Т., Saxena A., Warrington R., Jia Z., Xiang J. Efficient antitumor immunity derived from maturation of dendritic cells that had phagocytosed apoptotic/necrotic tumor cells // Int. J. Cancer., 2001, v.93, P.539-548.

26. Chomarat P., Dantin C., Bennett L., Banchereau J., Palucka A.K. TNF skews monocyte differentiation from macrophages to dendritic cells // J. Immunol., 2003, v.171, P.2262-2269.

27. Christopherson K. 2nd, Hromas R. Chemokine regulation of normal and pathologic immune responses // Stem Cells, 2001, v. 19, P.3 88-396.

28. Chung D.J., Rossi M., Romano E., Ghith J., Yuan J., Munn D.H., Young J.W. Indoleamine 2,3-dioxygenase-expressing mature human monocyte-derived dendritic cells expand potent autologous regulatory T cells // Blood, 2009, V.l 14, P.555-563.

29. Colonna M., Nakajima H., Cella, M. A family of inhibitory and activating Ig-like receptors that modulate function of lymphoid and myeloid cells // Semin. Immunol., 2000, V.12, P.121-127.

30. Conway Т., Schoolnik G.K. Microarray expression profiling: capturing a genome-wide portrait of the transcriptome // Mol. Microbiol., 2003, v.47, P.879-889.

31. Coquerelle C., Moser M. Are dendritic cells central to regulatory T cell function? // Immunol. Lett., 2008, V.l 19, P.12-16.

32. Corcoran L., Ferrero I., Vremec D., Lucas K., Waithman J., O'Keeffe M., Wu L., Wilson A., Shortman K. The lymphoid past of mouse plasmacytoid cells and thymic dendritic cells // J. Immunol., 2003, v. 170, P.4926-4932.

33. Coyle A.J., Gutierrez-Ramos J.C. The expanding B7 superfamily: increasing complexity in costimulatory signals regulating T cell function // Nat. Immunol., 2001, v.2, P.203-209.

34. Curiel T.J. Tregs and rethinking cancer immunotherapy // J. Clin. Invest., 2007, v.117, P.l 167-1174.

35. Decker W.K., Xing D., Shpall E.J. Dendritic cell immunotherapy for the treatment of neoplastic disease // Biol. Blood. Marrow. Transplant., 2006, v.12, P.l 13-125.

36. Dejbakhsh-Jones S., Jerabelc L., Weissman I.L., Strober S. Extrathymic matutation of alpha beta T cells from hemopoietic stem cells // J. Immunol., 1995, V.155, P.3338-3344.

37. Dieckmann D., Plottner H., Berchtold S., Berger Т., Schuler G. Ex vivo isolation and characterization of CD4(+)CD25(+) T cells with regulatory properties from human blood//J. Exp. Med., 2001, v.193, P.1303-1310.

38. Dietz A.B., Bulur P.A., Knutson G.J., Matasic R., Vuk-Pavlovic S. Maturation of human monocyte-derived dendritic cells studied by microarray hybridization // Biochem. Biophys. Res. Commun., 2000, v.275, P.731-738.

39. Dorf M.E., Kuchroo V.K., Collins M. Suppressor T cells: some answers but more questions // Immunol. Today., 1992, v. 13, P.241-243.

40. Drexhage H.A., Mullinlc H., de Groot J., Clarke J., Balfour B.M. A study of cells present in peripheral lymph of pigs with special reference to a type ofcell resembling the Langerhans cell // Cell. Tissue Res., 1979, v.202, P.407-430.

41. Druyan S., de Oliveira J.E., Ashwell C.M. Focused microarrays as a method to evaluate subtle changes in gene expression // Poult Sci., 2008, v.87, P.2418-2429.

42. Fazekas de St Groth B. DCs and peripheral T cell tolerance // Semin. Immunol., 2001, v. 13, P.311-322.

43. Ferlazzo G., Tsang M.L., Moretta L., Melioli G., Steinman R.M., Mtinz C. Human dendritic cells activate resting natural killer (NK) cells and are recognized via the NKp30 receptor by activated NK cells // J. Exp. Med. 2002, v.195, P.343-351.

44. Figdor C.G., van Kooyk Y., Adema G.J. C-type lectin receptors on dendritic cells and Langerhans cells // Nat. Rev. Immunol., 2002, v.2, P.77-84.

45. Figdor C.G., de Vries I.J., Lesterhuis W.J., Melief C.J. Dendritic cell immunotherapy: mapping the way // Nat. Med., 2004, V.10, P.475-480.

46. Flatekval G.F., Sioud M. Modulation of dendritic cell maturation and function with mono- and bifunctional small interfering RNAs targeting indoleamine 2,3-dioxygenase //Immunology, 2009, V.128(Suppl), e837-848.

47. Foged C., Brodin В., Frokjaer S., Sundblad A. Particle size and surface charge affect particle uptake by human dendritic cells in an in vitro model I I Int. J. Pharmaceutics, 2005, v.98, P.315-322.

48. Freudenthal P.S., Bhardwaj N. Dendritic cells in human blood and synovial exudates // Int. Rev. Immunol., 1990, v.6, P.103-116.

49. Frohman E.M., van den Noort S., Gupta S. Astrocytes and intracerebral immune responses // J. Clin. Immunol., 1989, v.9, P. 1-9.

50. Frumento G., Piazza Т., Di Carlo E., Ferrini S. Targeting tumor-related immunosuppression for cancer immunotherapy // Endocr. Metab. Immune Disord. Drug Targets, 2006, v.6, P.233-237.

51. Gallucci S., Matzinger P. Danger signals: SOS to the immune system. Curr. Opin. Immunol., 2001, V. 13, P. 114-119.

52. Gant T.W., Zhang S.D., Taylor E.L. Novel genomic methods for drug discovery and mechanism-based toxicological assessment // Curr. Opin. Drug Discov. Devel., 2009, v. 12, P.72-80.

53. Garg S., Oran A., Wajchman J., Sasaki S., Maris C.H., Kapp J.A., Jacob J. Genetic tagging shows increased frequency and longevity of antigen-presenting, skin-derived dendritic cells in vivo II Nat. Immunol., 2003, v.4, P.907-912.

54. Gilliet M., Liu YJ. Generation of human CD8 T regulatory cells by CD40 ligand-activated plasmacytoid dendritic cells // J. Exp Med., 2002, v.l95, P.695-704.

55. Goldberg A.L., Rock K.L. Proteolysis, proteasomes and antigen presentation //Nature, 1992, v.357, P.375-379.

56. Goldschneider I., Cone R.E. A central role for peripheral dendritic cells in the induction of acquired thymic tolerance // Trends. Immunol., 2003, v.24, P.77-81.

57. Grouard G., Rissoan M.C., Filgueira L., Durand I., Banchereau J., Liu Y.J. The enigmatic plasmacytoid T cells develop into dendritic cells with interleukin (IL)-3 and CD40-ligand // J. Exp. Med., 1997, v. 185, P. 1101-1111.

58. Groux H. Type 1 T-regulatory cells: their role in the control of immune responses // Transplantation, 2003, v.75, P.8S-12S.

59. Han Т.Н., Jin P., Ren J., Slezak S., Marincola F.M., Stroncek D.F. Evaluation of 3 clinical dendritic cell maturation protocols containing lipopolysaccharide and interferon-gamma // J. Immunother., 2009, V.32, P.399-407.

60. Hart D.N.J. Dendritic Cells: Unique Leukocyte Populations Which Control the Primary Immune Response // Blood, 1997, v.90, P.3245-3287.

61. Huang Q., Liu D., Majewski P., Schulte L.C., Korn J.M., Young R.A., Lander E.S., Hacohen N. The plasticity of dendritic cell responses to pathogens and their components // Science, 2001, v.294, P.870-875.

62. Holt P.G., Schon-Hegrad M.A., McMenamin P.G. Dendritic cells in the respiratory tract // Int. Rev. Immunol., 1990, v.6, P. 139-149.

63. Hsu F.J, Benike С., Fagnoni F., Liles T.M., Czerwinski D., Taidi В., Engleman E.G., Levy R. Vaccination of patients with B-cell lymphoma using autologous antigen-pulsed dendritic cells //Nat. Med., 1996, v.2, P.52-58.

64. Imai Y., Yamakawa M., Kasajima T. The lymphocyte-dendritic cell system // Histol. Histopathol., 1998, v. 13, P.469-510.

65. Inaba K., Pack M., Inaba M., Sakuta H., Isdell F., Steinman R.M. High levels of a major histocompatibility complex on dendritic cells from the T cell areas of lymph nodes // J. Exp. Med., 1997, v. 186, P.665-672.

66. Jager D., Jager E., Knuth A. Vaccination for malignant melanoma: recent developments // Oncology, 2001, v.60, P. 1-7.

67. Jarrossay D., Napolitani G., Colonna M., Sallusto F., Lanzavecchia A. Specialization and complementarity in microbial molecule recognition by human myeloid and plasmacytoid dendritic cells // Eur. J. Immunol., 2001, v.31, P.3388-3393.

68. J Fong L., Brockstedt D., Benike C., Wu L., Engleman E.G. Dendritic cells injected via different routes induce immunity in cancer patients // Immunol. 2001, v.166, P.4254-4259.

69. Jonuleit H., Schmitt E. The regulatory T cell family: distinct subsets and their interrelations // J. Immunol., 2003, v. 171, P.6323-6327.

70. Jordan M.S., Boesteanu A., Reed A.J., Petrone A.L., Holenbeck A.E., Lerman M.A., Naji A., Caton A.J. Thymic selection of CD4+CD25+ regulatory T cells induced by an agonist self-peptide // Nat. Immunol., 2001, v.2, P.301-306.

71. Junker K., Hindermann W, von Eggeling F., Diegmann J., Haessler K., Schubert J. CD70: a new tumor specific biomarker for renal cell carcinoma // J. Urol, 2005, v.173, P.2150-2153.

72. Kadowaki N, Antonenko S, Lau J.Y, Liu Y.J. Natural interferon a/(3-producing cells link innate and adaptive immunity // J. Exp. Med, 2000, v.192, P.219-226.

73. Kaye J., Kersh G., Engel I., Hedrick SM. Structure and specificity of the T cell antigen receptor// Semin. Immunol., 1991, v.3, P.269-281.

74. Kelsall B.L., Stiiber E., Neurath M., Strober W. Interleukin-12 production by dendritic cells. The role of CD40-CD40L interactions in Thl T-cell responses // Ann. N. Y. Acad. Sci., 1996, v.795, P.l 16-126.

75. Khorlin A.A., Khrapko K.R., Ivanov I.B., Lysov Yu.P., Yershov G.K., Vasilenko S.K., Florentiev V.L., Mirzabekov A.D. An oligonucleotide matrix hybridization approach to DNA sequencing // Nucleic Acids Symp. Ser., 1991, v.24, P.l91-192.

76. Kiama S.G., Cochand L., Karlsson L., Nicod L.P., Gehr P. Evaluation of phagocytic activity in human monocyte-derived dendritic cells // J. Aerosol. Med., 2001., v. 14, P.289-299.

77. Kidd P. Thl/Th2 balance: the hypothesis, its limitations, and implications for health and disease //Altern. Med. Rev., 2003, v.8, P.223-246.

78. Kiertscher S.M., Luo J., Dubinett S.M., Roth M.D. Tumors promote altered maturation and early apoptosis of monocyte-derived dendritic cells // J. Immunol., 2000, V.164, P.1269-1276.

79. Kim R., Emi M., Tanabe K. Cancer immunosuppression and autoimmune disease: beyond immunosuppressive networks for tumour immunity // Immunology, 2006, V.l 19, P.254-264.

80. Kimber I., Cumberbatch M. Stimulation of Langerhans cell migration by tumor necrosis factor alpha (TNF-alpha) // J. Invest. Dermatol., 1992, v.99, P.48-50.

81. Koller M., Willheim M., Krugluger W., Kurz M., Hocker P., Forster O., Boltz-Nitulescu G. Immunophenotyping of human bone marrow-derived macrophages // Scand. J. Immunol., 1996, v.43, P.626-632.

82. Корр E.B., Medzhitov R. The Toll-receptor family and control of innate immunity // Curr. Opin. Immunol., 1999, v.l 1, P. 13-18.

83. Kovacsovics-Bankowski M., Clark K., Benacerraf В., Rock K.L. Efficient major histocompatibility complex class I presentation of exogenous antigenupon phagocytosis by macrophages // Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1993, v.90, P.4942-4946.

84. Krampera M, Glennie S, Dyson J, Scott D, Laylor R, Simpson E, Dazzi F. Bone marrow mesenchymal stem cells inhibit the response of naive and memory antigen-specific T cells to their cognate peptide // Blood, 2003, V.101, P.3722-3729.

85. Kronick M.N. Creation of the whole human genome microarray // Expert. Rev. Proteomics, 2004, v.l, P. 19-28.

86. Kuwana M. Induction of anergic and regulatory T cells by plasmacytoid dendritic cells and other dendritic cell subsets // Hum. Immunol., 2002, v.63, P.l 156-1163.

87. Kyewski В., Klein L. A central role for central tolerance // Annu. Rev. Immunol., 2006, v.24, P.571-606.

88. Lashkari D.A., DeRisi J.L., McCusker J.H., Namath A.F., Gentile C., Hwang S.Y., Brown P.O., Davis R.W. Yeast microarrays for genome wide parallel genetic and gene expression analysis // Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1997, v.94, P. 13057-13062.

89. Le Blanc K. Immunomodulatory effects of fetal and adult mesenchymal stem cells // Cytotherapy, 2003, v.5, P.485-489.

90. Lee N.H., Saeed A.I. Microarrays: an overview // Methods Mol. Biol., 2007, v.353, P.265-300.

91. Liau L.M., Black K.L., Prins R.M., Sykes S.N., DiPatre P.L., Cloughesy T.F., Becker D.P., Bronstein J.M. Treatment of intracranial gliomas with bone marrow-derived dendritic cells pulsed with tumor antigens // J. Neurosurg., 1999, v.90, P.l 115-1124.

92. Lim S.C., Oh S.H. The role of CD24 in various human epithelial neoplasias // Pathol. Res. Pract., 2005, v.201, P.479-486.

93. Lipscomb M.F., Masten В.J. Dendritic cells: immune regulators in health and disease // Physiol Rev., 2002, v.82, P.97-130.

94. Liu G., Wu C., Wu Y., Zhao Y. Phagocytosis of apoptotic cells and immune regulation // Scand. J. Immunol., 2006, v.64, P.l-9.

95. Liu Z., Tugulea S., Cortesini R., Suciu-Foca N. Specific suppression of T helper alloreactivity by allo-MHC class I-restricted CD8+CD28- T cells // Int. Immunol., 1998, v.10, P.775-783.

96. Lutz M.B. Differentiation stages and subsets of tolerogenic dendritic cells / Handbook of Dendritic Cells Biology, Diseases and Therapy. 2006. Weinheim: VCH-Wiley. P.517-543.

97. Macian F., Im S.H., Garcia-Cozar F.J., Rao A. T-cell anergy // Curr. Opin. Immunol., 2004, v. 16, P.209-216.

98. MacPherson G.G., Jenkins C.D., Stein M.J., Edwards C. Endotoxinmediated dendritic cell release from the intestine. Characterization of released dendritic cells and TNF dependence // J. Immunol., 1995, v. 154, P: 1317-1322.

99. Maldonado-Lopez R., Moser M. Dendritic cell subsets and the regulation of Thl/Th2 responses // Semin. Immunol., 2001, v.13, P.275-282.

100. Manavalan J.S., Rossi P.С., Vlad G., Piazza F., Yarilina A., Cortesini R., Mancini D., Suciu-Foca N. High expression of ILT3 and ILT4 is a general feature of tolerogenic dendritic cells // Transpl. Immunol., 2003, V.l 1, P.245-258.

101. Martin-Fontecha A., Sebastiani S., Hopken U.E., Uguccioni M., Lipp M., Lanzavecchia A., Sallusto F. Regulation of dendritic cell migration to the draining lymph node: impact on T lymphocyte traffic and priming // J. Exp. Med., 2003, v.198, P.615-21.

102. Masten B.J., Yates J.L., Pollard Koga A.M., Lipscomb M.F. Characterization of accessory molecules in murine lung dendritic cell function: roles for CD80, CD86, CD54, and CD40L // Am. J. Respir. Cell. Mol. Biol., 1997, v. 16, P.335-342.

103. Melief C.J. Cancer immunotherapy by dendritic cells // Immunity, 2008, V.29, P.372-383.

104. Merlo A., Tagliabue E., Menard S., Balsari A. Matured human monocyte-derived dendritic cells (MoDCs) induce expansion of CD4+CD25+FOXP3+ T cells lacking regulatory properties // Immun. Lett., 2008, Y.l 17, P.106-113.

105. Messmer D., Messmer В., Chiorazzi N. The global transcriptional maturation program and stimuli-specific gene expression profiles of human myeloid dendritic cells // Int. Immunol., 2003, v.15, P.491-503.

106. Miller M.J., Hejazi A.S., Wei S.H., Cahalan M.D., Parker I. T cell repertoire scanning is promoted by dynamic dendritic cell behavior and random T cell motility in the lymph node // Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2004, v. 101, P.998-1003.

107. Mitchell D.A., Nair S.K., Gilboa E. Dendritic cell/macrophage precursors capture exogenous antigen for MHC class I presentation by dendritic cells // Eur. J. Immunol., 1998, v.28, P. 1923-1933.

108. Moestrup S.K., Moller H.J. CD 163: a regulated hemoglobin scavenger receptor with a role in the anti-inflammatory response // Ann. Med., 2004, V.36, P.347-354.

109. Morelli A.E. The immune regulatory effect of apoptotic cells and exosomes on dendritic cells: its impact on transplantation // Am. J. Transplant., 2006, v.6, P.254-261.

110. Morelli A.E., Thomson A.W. Dendritic cells: regulators of alloimmunity and opportunities for tolerance induction //Immunol Rev., 2003, v.196, P.125-146.

111. Moretta A., Vitale M., Sivori S., Morelli L., Pende D., Bottino C. Inhibitory and activatory receptors for HLA class I molecules in human natural killer cells // Chem. Immunol., 1996, v.64, P.77-87.

112. Mosier D. A requirement for two cell types for antibody formation in vitro 11 Science, 1967, v.158, P.1573-1575.

113. Nair S., Babu J.S., Dunham R.G., Kanda P., Burke R.L., Rouse B.T. Induction of primary, antiviral cytotoxic, and proliferative responses with antigens administered via dendritic cells // J. Virol., 1993, v.67, P.4062-4069.

114. Nauta A.J., Kruisselbrink A.B., Lurvink E., Willemze R., Fibbe W.E. Mesenchymal stem cells inhibit generation and function of both CD34+-derived and monocyte-derived dendritic cells // J. Immunol., 2006, v. 177, P.2080-2087.

115. Norbury C.C., Hewlett L.J., Prescott A.R., Shastri N., Watts C. Class I MHC presentation of exogenous soluble antigen via macropinocytosis in bone marrow macrophages // Immunity, 1995, v.3, P.783-791.

116. O'Neill D.W., Adams S., Bhardwaj N. Manipulating dendritic cell biology for the active immunotherapy of cancer // Blood, 2004, v.104, P.2235-2246.

117. Pariset L., Chillemi G., Bongiorni S., Spica V.R., Valentini A. Microarrays and high-throughput transcriptomic analysis in species with incomplete availability of genomic sequences //N. Biotechnol., 2009, v.25, P.272-279.

118. Pavli P., Woodhams C.E., Doe W.F., Hume D.A. Isolation and characterization of antigen-presenting dendritic cells from the mouse intestinal lamina propria // Immunology, 1990, v.70, P.40-47.

119. Prazma C.M., Tedder T.F. Dendritic cell CD83: a therapeutic target or innocent bystander? // Immunol. Lett., 2008, v.l 15, P.l-8.

120. Provenzano M., Mocellin S. Complementary techniques: validation of gene expression data by quantitative real time PCR // Adv. Exp. Med. Biol., 2007, v.593, P.66-73.

121. Pytlik R., Hofman P., Kideryova L., Cervinkova P., Obrtlikova P., Salkova J., Trneny M., Klener P. Dendritic cells and T lymphocyte interactions in patients with lymphoid malignancies // Physiol. Res., 2008, v.57, P.289-298.

122. Randolph G.J., Angeli V., Swartz M.A. Dendritic-cell trafficking to lymph nodes through lymphatic vessels //Nat. Rev. Immunol, 2005, v.5, P.617-628.

123. Randolph G.J., Beaulieu S., Lebecque S., Steinman R.M., Muller W.A. Differentiation of monocytes into dendritic cells in a model of transendothelial trafficking // Science, 1998, v.282, P.480-483.

124. Rissoan M.C, Soumelis V, Kadowaki N, Grouard G, Briere F, de Waal Malefyt R, Liu Y.J. Reciprocal control of T helper cell and dendritic cell differentiation // Science, 1999, v.283, P.l 183-1186.

125. Rock K.L, Shen L. Cross-presentation: underlying mechanisms and role in immune surveillance // Immunol. Rev, 2005, v.207, P. 166-183.

126. Rutella S, Danese S, Leone G. Tolerogenic dendritic cells: cytokine modulation comes of age // Blood, 2006, v.108, P.1435-1440.

127. Ryan JM, Barry FP, Murphy JM, Mahon BP. Mesenchymal stem cells avoid allogeneic rejection // J. of Inflamm. 2005; 2:8.

128. Ryman-Rasmussen J.P, Riviere J.E, Monteiro-Riviere N.A. Surface coatings determine cytotoxicity and irritation potential of quantum dot nanoparticles in epidermal keratinocytes // J. Invest. Dermatol, 2007, v.127, P.143-153.

129. Scandella E, Men Y, Gillessen S, Forster R, Groettrup M. Prostaglandin E2 is a key factor for CCR7 surface expression and migration of monocyte-derived dendritic cells // Blood, 2002, V.100, P.1354-1361.

130. Schena M., Shalon D., Heller R., Chai A., Brown P.O., Davis R.W. Parallel human genome analysis: microarray-based expression monitoring of 1000 genes//Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1996, v.93, P.10614-10619.

131. Schwartz R.H., Mueller D.L., Jenkins M.K., Quill H. T-cell clonal anergy // Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol., 1989, V.54, P.605-610.

132. Shi G.P., Munger J.S., Meara J.P., Rich D.H., Chapman H.A. Molecular cloning and expression of human alveolar macrophage cathepsin S, an elastinolytic cysteine protease // J. Biol. Chem., 1992, V.267, P.7258-7262.

133. Shortman K., Caux C. Dendritic cell development: multiple pathways to nature's adjuvants // Stem Cells, 1997, v. 15, P.409-419.

134. Shortman K., Liu Y.J. Mouse and human dendritic cell subtypes // Nat. Rev. Immunol., 2002, v.2, P. 151-161.

135. Siegal F.P., Fitzgerald-Bocarsly P., Holland B.K., Shodell M. Interferon-alpha generation and immune reconstitution during antiretroviral therapy for human immunodeficiency virus infection // AIDS, 2001, v. 15, P. 1603-1612.

136. Smits H.H., de Jong E.C., Wierenga E.A., Kapsenberg M.L. Different faces of regulatory DCs in homeostasis and immunity // Trends. Immunol., 2005, v.26, P.123-129.

137. Sprent J. Antigen-presenting cells. Professionals and amateurs // Curr. Biol., 1995, v.5, P.1095-1097.

138. Stanley M.A. Human papillomavirus vaccines // Curr. Opin. Mol. Ther., 2002, v.4,P.l5-22.

139. Starzl Т.Е., Demetris A.J., Trucco M., Murase N., Ricordi C., Ildstad S., Ramos H., Todo S., Tzakis A., Fung J.J. Cell migration and chimerism after whole-organ transplantation: the basis of graft acceptance // Hepatology, 1993, v.l7,P.l 127-1152.

140. Steinbrink K., Wolfl M., Jonuleit H., Knop J., Enk A. Induction of tolerance by IL-10-treated dendritic cells // J. Immunol., 1997, v. 159, P.4772-4780.

141. Steinman R.M. The dendritic cell system and its role in immunogenicity // Annu. Rev. Immunol., 1991, v.9, P.271-296.

142. Steinman R.M., Cohn Z.A. Identification of a novel cell type in peripheral lymphoid organs of mice. I. Morphology, quantitation, tissue distribution // J. Exp. Med., 1973, v.137, P. 1142-1162.

143. Steinman R.M., Dhodapkar M. Active immunization against cancer with dendritic cells: the near future // Int. J. Cancer., 2001, v.94, P.459-473.

144. Steinman R.M., Hawiger D., Nussenzweig M.C. Tolerogenic dendritic cells // Annu. Rev. Immunol., 2003, v.21, P.685-711.

145. Strickland F.M., Kripke M.L. Immune response associated with nonmelanoma skin cancer // Clin. Plast. Surg., 1997, v.24, P.637-647.

146. Thomas R., Lipsky P.E. Dendritic cells: origin and differentiation // Stem Cells, 1996, v.14, P.196-206.

147. Thomson A.W., Sacks J.M., Kuo Y.R., Ikeguchi R., Horibe E.K., Unadkat J., Solari M.G., Feili-Hariri M., Lee W.P. Dendritic ceil therapy in composite tissue allotransplantation // Transplant Proc., 2009, V.41, P.537-538.

148. Trayhurn P. Northern blotting // Proc. Nutr. Soc., 1996, v.55, P.583-589.

149. Treon S.P., Raje N., Anderson K.C. Immunotherapeutic strategies for the treatment of plasma cell malignancies // Semin. Oncol., 2000, v.27, P.598-613.

150. Tuan R.S., Boland G., Tuli R. Adult mesenchymal stem cells and cell-based tissue engineering // Arthritis Res. Ther., 2003, v.5, P.32-45.

151. Villadangos J.A., Cardoso M., Steptoe R.J., van Berkel D., Pooley J., Carbone F.R., Shortman К. MHC class II expression is regulated in dendritic cells independently of invariant chain degradation // Immunity, 2001, v.14, P.739-749.

152. Walsh S.R., Bhardwaj N., Gandhil R.T. Dendritic cells and the promise of therapeutic vaccines for human immunodeficiency virus (HIV)-l // Curr. HIV Res., 2003, v.l,P.205-216.

153. Wang J., Ioan-Facsinay A., van der Voort E.I., Huizinga T.W., Toes R.E. Transient expression of FOXP3 in human activated nonregulatory CD4+ T cells // Eur. J. Immunol., 2007, V.37, P.129-138.

154. Weiner H.L. Induction and mechanism of action of transforming growth factor-beta-secreting Th3 regulatory cells // Immunol. Rev., 2001, v. 182, P.207-214.

155. Whiteside T.L., Stanson J., Shurin M.R., Ferrone S. Antigen-processing machinery in human dendritic cells: up-regulation by maturation and down-regulation by tumor cells // J. Immunol., 2004, v.l73, P. 1526-1534.

156. Wilson S.B., Delovitch T.L. Janus-like role of regulatory iNKT cells in autoimmune disease and tumour immunity // Nat. Rev. Immunol., 2003, v.3, P.211-222.

157. Wolf A.M., Wolf D., Steurer M., Gastl G., Gunsilius E., Grubeck-Loebenstein B. Increase of regulatory T cells in the peripheral blood of cancer patients. Clin Cancer Res., 2003, v.9, P.606-612.

158. Woltman A.M., van Kooten C. Functional modulation of dendritic cells to suppress adaptive immune responses // J. Leukoc. Biol., 2003, v.73, P.428-441.

159. Yang F., Yang X.F. New concepts in tumor antigens: their significance in future immunotherapies for tumors // Cell. Mol. Immunol., 2005, v.2, P.331-341.

160. Yang L., Carbone DP. Tumor-host immune interactions and dendritic cell dysfunction // Adv. Cancer. Res., 2004, v.92, P. 13-27.

161. Yannelli J.R., Wroblewski J.M. On the road to a tumor cell vaccine: 20 years of cellular immunotherapy // Vaccine, 2004, v.23, P.97-113.

162. Zhou L.J., Tedder T.F. CD 14+ blood monocytes can differentiate into functionally mature CD83+ dendritic cells // Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1996, v.93, P.2588-2592.

163. Zhou Т., Chen Y., Hao L., Zhang Y. DC-SIGN and immunoregulation // Cell. Mol. Immunol., 2006, v.3, P.279-283.

164. Ziegler S.F. FOXP3: of mice and men // Annu. Rev. Immunol., 2006, V.24, P.209-226.

165. Zinov'ev A.S., Kononov A.V. Chronic inflammation of mucous membranes: integration of immunity and regeneration // Arkh. Patol., 1997, v.59, P. 18-24.