Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Сравнительное изучение и прикладная биохимия иммуноглобулина G куньих
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия
Автореферат диссертации по теме "Сравнительное изучение и прикладная биохимия иммуноглобулина G куньих"
На правах рукописи
□□34 73634 КУЗНЕЦОВ АЛЕКСАНДР ИВАНОВИЧ
СРАВНИТЕЛЬНОЕ ИЗУЧЕНИЕ И ПРИКЛАДНАЯ БИОХИМИЯ ИММУНОГЛОБУЛИНА С КУНЬИХ
Специальность 03.00.04 - биохимия
1 5 ОКТ 2009
АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
Казань - 2009
003479634
Работа выполнена на кафедре биохимии и биотехнологии ГОУВПО Удмуртский государственный университет
Научный руководитель: кандидат биологических наук,
Барсуков Алексей Константинович
Официальные оппоненты: доктор химических наук,
профессор Дзантиев Борис Борисович, (заведующий лабораторией иммунобиохимии, Учреждение Российской академии наук Институт биохимии им. А.И. Баха РАН, г. Москва)
кандидат биологических наук, Уразов Наиль Гумерович (заведующий отделом культивирования и идентификации вирусов Республиканского центра по борьбе со СПИД и ИБ МЗ РТ, г. Казань)
Ведущая организация: Учреждение Российской академии медицинских
наук Научно-исследовательский институт гриппа СЗО РАМН, г. Санкт-Петербург.
Защита состоится «29» октября 2009 г. в 13 часов на заседании диссертационного совета Д 212.081.08 при ГОУВПО Казанский государственный университет по адресу: 420008, Казань, ул. Кремлевская 18, аудитория 209.
С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке им. Н.И. Лобачевского Казанского государственного университета
Автореферат разослан «29» сентября 2009 г.
Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук, профессор
.И. Абрамова
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы.
Успехи физико-математической и физико-химической биологии обеспечили принципиально новое качественное состояние теоретической медицины и вошли как прикладное знание в современные биомедицинские технологии. С этих позиций значимый интерес представляет международный исследовательский проект «Протеом плазмы крови». Наличие в составе плазмы от 3020 до 9504 индивидуальных белков позволяет рассматривать этот сложный коллоидный раствор как обобщенную многофакторную субстанцию, в которой только один белок-IgG имеет четко выраженную направленность в отношении чужеродной генетической информации (States et al., 2006; Omenn, 2006). На основании фундаментальных представлений о роли антител в элиминации бактерий в составе IgG полагают целесообразным присутствие lgM (Garbett et al., 1989; Werdan et al., 1996). Структурно-функциональные особенности IgA и его целесообразное присутствие в составе иммуноглобулиновых биопрепаратов также учитывается прикладной наукой при проектировании научно-технических нововведений в технологии фракционирования плазмы (сыворотки) крови (Wadsworth et al., 1976). Вместе с тем медицинской генетикой выявлены индивидуальные особенности, согласно которым в человеческой популяции всегда присутствуют отдельные нндивидумы, неспособные к биосинтезу IgA. В клинической практике такое генетическое своеобразие выявляется по биосинтезу антител, специфичных к IgA после парэнтералыюго введения иммуноглобулина, в составе которого присутствует IgA (Eijkhout et al., 2003). Известно, что олигомеры индивидуальных белков, в частности IgG, способны к активации системы комплемента (Boughton et al., 1990; Nachbaur et al., 1997). Целый ряд работ опубликован о фракционировании плазмы с целью обеспечения инфекционной безопасности конечного продукта (Klein et al., 2005; Horowitz et al., 2004; Burnouf et al., 2000; Панов, 2004). Однако процессы инактивации инфекционных агентов как правило влияют на конформацию белка, что в конечном итоге выражается в олигомеризации и фрагментации молекулы IgG (Le Moli et al., 1989; Hetherington et al., 1984). С точки зрения экономических подходов актуальным вопросом является изучение возможности использования межвидовых субстанций IgG в клинической практике с минимизированным нежелательным (антиген-индуцирующим) эффектом (Mathews, 2008; Martin et al., 2008; Burnouf et al., 2004). К настоящему времени стало возможным компьютерно-аналитическое сопоставление аминокислотных и нуклеотидных последовательностей IgG млекопитающих, в т.ч. выявление межвидовых особенностей их строения (Naumoff, 2005; Finn et al.,. 2006; Abhiman et al., 2006). Однако для практической биохимии методы информатики имеют определенные ограничения. Во-первых, невозможно однозначно предсказать ориентацию экспонированных участков пептидных цепей IgG, поскольку проблематика фолдинга до настоящего времени не полностью раскрыта (Dill et al., 2007; Moore, 2007). Во-вторых, при сопоставлении нуклеотидных последовательностей геномов не учитываются постгранскрипционные
модификации и последствия, обусловленные белок-денатурирующим эффектом, присущим схемам выделения и очистки ^О. Следовательно, актуален прямой иммунохимический подход, позволяющий по совокупности эпитопов проводить сравнительный анализ видовых Очевидно также, что схема выделения образцов должна обеспечивать препаративную наработку индивидуальных белков без использования агентов и приемов, обладающих денатурирующим эффектом.
Цель исследования - заключалась в создании исследовательской схемы для определения антигенных характеристик близкородственных видов в рамках научно-технического задела, касающегося фракционирования плазмы (сыворотки) крови для получения иммуноглобулиновой субстанции с надлежащим уровнем инфекционной и биологической безопасности Задачи исследования:
- Разработать исследовательскую технологию получения стандартизованных форм образцов человека и животных;
- Создать лабораторный набор на основе иммуноферментного анализа для определения норки;
- Оценить различные иммунологические подходы, направленные на описание антигенных характеристик некоторых зоологических видов, формирующих семейство куньих;
- Апробировать способы заготовки и получение 1§0-обогащенных фракций для отработки условий проведения стадий, обладающих инактивирующим и элиминирующим действием на инфекционные агенты.
Научная новизна.
Разработаны оригинальные схемы выделения видовых ^О и условия их хранения с минимальным уровнем (до 3%) образования олигомерных форм индивидуальных белков.
Создана исследовательская схема для оценки антигенных свойств 1§0 близкородственных видов.
Определены приемы крупномасштабного фракционирования гемолизной плазмы (сыворотки), полученной из трупной крови норки при которых сохраняется нативная конформация ^О.
Подобранны условия и определены концентрации риванола и каприловой кислоты позволяющие проводить наработку биопрепаратов ^О из полуфабриката обогащенного
Отсутствие передачи вирусного начала в составе иммуноглобулинового биопрепарата (Иммуно Н) подтверждено клинико-лабораторными исследованиями экспериментальных серий, изготовленных из инфекционно-опасного сырья.
Практическая значимость.
Результаты исследований легли в основу разработки, согласования и утверждения в соответствии с порядком, действующим в России, нормативно-технической и технологической документации на изготовление экспериментальных серий препарата «Иммуно Н»:
- технические условия (ТУ 9382-003-43683877-03) на препарат "Иммуно Н", 27 стр.;
- экспериментально-производственный регламент на технологию производства фармацевтического биопрепарата "Иммуно Н", №001515-0п, 300 стр.;
- наставление по применению препарата "Иммуно Н" для норок № 13-4-03/0692; № ООШ5-ОП от 06.03.03 г., 2 стр.
На пилотный проект по производству экспериментальных серий препарата «Иммуно Н» был получен федеральный аттестат № 886 от 02.04.03 г. Из экспертного заключения ФГУ «Всероссийский государственный центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов» (ФГУ «ВГНКИ») следует, что по показателям качества экспериментальные серии препарата «Иммуно Н» аналогов в России не имеют. Результаты проведенных исследований по разработке схем получения стандартизованных форм видовых иммуноглобулинов заложены в проект «Инструкции по изготовлению и контролю видовых IgG человека и животных». В настоящее время материалы и натуральные образцы проходят согласование и испытания в ФГУ «Всероссийский государственный центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов» (ФГУ «ВГНКИ»),
На предложенный способ хранения и получения IgG-обогащенной фракции для изготовления биопрепаратов крови выдан патент на изобретение №2338375 «Способ хранения плазмы или сыворотки крови для получения иммуноглобулиновых и альбуминовых биопрепаратов». Положения, выносимые на защиту:
1. Исследовательская технология получения стандартизованных форм IgG животных и человека.
2. Разработка лабораторного набора на базе иммуноферментного анализа для определения IgG норки в сыворотке крови, полуфабрикатах и бросовых осадках.
3. Иммунологические принципы выявления гомологии видовых IgG в рамках проблематики использования в клинике гетерологичных иммуноглобулинов.
4. Оценка приемов фракционирования плазмы (сыворотки) крови для проектирования технологии изготовления IgG.
Апробация работы. Результаты исследований представлены на Региональной конференции биохимиков Урала, Поволжья и Западной Сибири, 20-21 сентября 2001 г., г. Ижевск; на Международной конференции «Биотехнология на рубеже тысячелетия», 12-15 сентября 2001 года., г. Саранск; на 5-ой Российской университетско-академической научно-практической конференции, г. Ижевск, 2001 г.; на 6-ой Российской университетско-академической научно-практической конференции, г. Ижевск, 2003 г.; на II Евразийском конгрессе по медицинской физике и инженерии "Медицинская физика - 2005", Москва, 2005; на I съезде физиологов СНГ, Сочи, 2005; на Международной конференции инженерного образования, 25-29 июля 2005 г., г. Гливиц (Польша); на II Всероссийском форуме «Здоровье нации - основа
процветания России», Москва, 2006; на Второй международной научно-практической конференции «Исследование, разработка и применение высоких технологий в промышленности», Санкт-Петербург, 2006; на XIX Международной научно-технической конференции «Химические реактивы, реагенты и процессы малотоннажной химии», Уфа, 2006; на Третьей международной научно-практической конференции «Исследование разработка и применение высоких технологий в промышленности», Санкт-Петербург, 2007; на Четвертой международной научно-практической конференции «Исследование, разработка и применение высоких технологий в промышленности», Санкт-Петербург, 2007; на VI конференции иммунологов Урала, Ижевск, 2007.
Публикации результатов исследований. По материалам диссертации опубликовано 10 работ. В соответствии с порядком, действующим в РФ, разработан, согласован и утвержден комплект нормативно-технической и технологической документации на изготовление и изучение ветеринарного иммуноглобулинового препарата нового поколения «Иммуно Н»: Технические условия ТУ (ТУ 9382-003-43683877-03, 27 стр.), Экспериментально-производственный регламент производства на препарат «Иммуно Н» (№001515-0п, 300 стр.) и наставление по применению препарата «Иммуно Н» (№ 13-4-03/0692; № 001515-0п, 2 стр.).
Структура и объем диссертационной работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов собственных исследований, обсуждения результатов, заключения, выводов и списка литературы. Работа изложена на 125 страницах, содержит 10 рисунков и 19 таблиц. Список используемой литературы включает 185 источников, в том числе 154 иностранных.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
В проведенном исследовании использовали нижеследующие материалы, реагенты и комплектующие.
Получение плазмы (сыворотки) крови
Заготовку сырья для получения плазмы (сыворотки) крови пушных животных проводили в зверохозяйствах «Можгинское» (Республика Удмуртия), «Бирюли» и «Кощаковское» (Республика Татарстан). Кровь норки (Mus tela vision), хорька (Mus tela putorius), соболя (Martes zibellina), песца (Alopex lagopus), лисы (Vulpes vulpes.) собиралась во время проведения плановых забоев животных. Сбор крови осуществляли с использованием антикоагулянта (9% Na3P04) в соотношении кровь/антикоагулянт 2:1. Далее кровь разделяли на форменные элементы крови и плазму с помощью сепаратора (Ж5-АС-2Ж). Плазма (сыворотка) крови человека предоставлена Республиканской станцией переливания крови г. Ижевска (Республика Удмуртия). Полученные плазма и сыворотка крови подвергались в дальнейшем обработке фенолом (1%) и сульфатом аммония (50% от насыщения) (патент на изобретение №2338375). Сыворотка домашних животных (лошади, коровы, барана, свиньи, собаки) предоставлена Можгинской районной ветеринарной
лабораторией, полученная из сельскохозяйственных предприятий Можгинского района (Республика Удмуртия), сыворотка крысы из вивария Удмуртского госуниверситета. Полученные кровь и сыворотка использовались для выделения образцов IgG.
Оборудование и реактивы
Приборная база исследований представлена вертикальным абсорбциометром Multiskan Ascent (Termo Fisher Scientific, Финляндия), жидкостным хроматографическим комплексом низкого давления (Pharmacia, Швеция), укомплектованным коллектором фракций, проточным детектором, регистратором, градиентным формером и комплектом колонок, установкой для электрофореза и иммуноэлектрофореза Hoefer (Amersham Biosciences, Великобритания), денситометром гелей ImageScaner (Amersham Biosciences, Великобритания).
Хроматографические стадии выполняли с помощью сорбентов: аффинных - протеин А-сефароза CL 6В (Pharmacia, Швеция); гидрофобных -бутил-тойоперл (Toyo Soda, Япония), фенил-сефароза (Pharmacia, Швеция); ионообменных - DE-52 (Whatman, Великобритания); гель-хроматографию на сефадекс G-200 (Pharmacia, Швеция). Стадии концентрирования белка и удаления низкомолекулярных примесей проводились с помощью ультрафильтрационной установки на полых волокнах УВА-ПА-0,1 с номинально отсекаемой молекулярной массой 10 кД. Для проведения ИФА использовали планшеты «Nunc» (Дания).
Аналитические процедуры осуществляли с использованием реактивов SIGMA" (США), Serva" (Германия), "Reanal" (Венгрия): Меркаптоэтанол-2, Акриламид 4-кристализованный, Персульфат аммония, Глицин, Бис-акриламид, ТЕМЭД, Додецилсульфат-Na, Три(оксиметил)аминометан, Агароза со средним показателем электроэндоосмоса. При синтезе иммунопероксидазного коньюгата, специфичного к IgG норки, использовали пероксидазу хрена с RZ~3,0 «SIGMA» (США), периодат натрия и боргидрид натрия. Для нехроматографического фракционирования коллоидных растворов белка использовали реагенты, предназначенные и разрешенные к использованию Национальным контролирующим органом (НКО) РФ в производстве фармацевтических биопрепаратов: ПЭГ 4000 (ФС 42-3337-96), риванол (этакридин лактат, ФС 42-2799-91), каприловая кислота (ТУ 6-09-52975), этанол (ФС 42-3072-00).
Методы исследования
Хроматографическое фракционирование при получении IgG человека и норки выполняли в колоночном варианте с учетом рекомендаций и методологических подходов, изложенных в монографиях и оригинальных исследованиях (Protein Purification. Handbook. 2001; The Protein Protokols. Handbook. 2002; Остерман, 1985).
Электрофоретический анализ проводили в соответствии с базовыми методами Лэммли и Дэвиса в градиентном 5-25% ПААГ в нативных и восстанавливающих условиях (Garfin, 1990).
Иммуноэлектрофорез проводили согласно рекомендациям, изложенным в монографии изложенным в монографии под редакцией Фримеля (1987).
Ферментативную активность протеаз в фенольно-сульфатной суспензии оценивали методом на основе определения трипсиноподобной активности в надосадочном растворе по методу Эрлангера (Erlanger et al., 1961) в модификации В.А. Шатерникова (Шатерников, 1966).
Концентрацию общего белка определяли биуретовым методом (Досон и др., 1991).
Определение остаточных концентраций сульфата аммония оценивали по титру S042" в качественной реакции с ионами бария по образованию осадка или появлении опапесценции (в зависимости от концентрации сульфат-ионов).
Метод дробного осаждения белков использовали при нехроматографическом фракционировании плазмы (сыворотки) крови с применением сульфата аммония, ПЭГ 4000, риванола, каприловой кислоты, этанола Осадок и надосадок получали центрифугированием суспензии при 5000 об/мин в течение 30 мин., на центрифуге ОПН-8 или РС-6.
Препаративную схему фракционирования плазмы (сыворотки) отрабатывали в заводских условиях при объемах сырьевой закладки в пределах 190-206 литров плазмы (сыворотки) крови.
Получение антисывороток осуществляли стандартным образом (Dresser, 1986) с небольшими модификациями.
Мониторинг за процессом иммунизации осуществляли методом двойной иммунодиффузии (ДИД) по Ouchterlony О. (1962).
Синтез иммунопероксидазных конъюгатов для проведения ИФА осуществляли согласно M.B Wilson, R.K Nakane (1978). Иммуноферментный анализ оптимизировали для непрямого и прямого конкурентного методов (Егоров, Дзантиев, 1991).
Определение иммуноглобулинов класса IgM, IgA в различных фракциях, определяли методом радиальной иммунодиффузии по G. Manchini (1965) с использованием наборов стандартных моноспецифических сывороток против иммуноглобулинов человека (IgA, IgM) производства «ИмБио» в соответствии с методическими рекомендациями [Фримель, 1987].
Оценку микробного роста в фенольно-сульфатной суспензии в процессе хранения проводили при помощи посева образцов на мясо-пептонный агар в чашках Петри. Подсчёт колонии микроорганизмов проводили через 2-5 суток инкубации. Результаты параллельных высевов из одной пробы суммировали и определяли среднее число колоний, выросших при высеве на одной чашке.
Процент чистоты IgG для иммунизации, оценивали электрофорезом в градиентном 5-25% ПААГ в нативных и восстанавливающих условиях с последующим денситометрированием гелей на приборе ImageScaner «Amersham Biosciences» (Великобритания) в красном свете. Минимальное количество белка в треке, при котором максимальная оптическая плотность в пятне достоверно отличалась от фонового сигнала - 0.5 мкг. В иммуноэлектрофорезе чистота оценивалась по отсутствию преципитационных полос отличных от IgG.
Процент чистоты 1еО при оптимизации стадий очистки нехроматографическими и хроматографическими способами рассчитывали как отношение количества во фракции (определенного с помощью
сконструированного в лаборатории набора на основе прямого конкурентного ИФА) к количеству общего белка во фракции.
Фактор очистки рассчитывали как отношение процента чистоты во фракции к проценту чистоты ^С в исходном сырье.
Процент выхода рассчитывали как отношение количества во
фракции к количеству в исходном сырье.
Процент иммунологической гомологии (сходства) рассчитывался в в двойной иммунодиффузии (ДИД) как обратный титр специфических получаемый в гомологичной системе, который принимали равным 100 %, а связывание всех гетерологичных иммуноглобулинов оценивали как долю от соответствующего связывания гомологичного % сходства в ДИД = Г/Нх 100%, где
Г - величина обратная титру видовых ^С; Н - величина обратная титру норки.
Расчет уровня иммунологического сходства в прямом ИФА основан на определении соотношения оптических плотностей (ОП) при максимальных (10 мкг/мл) концентрациях иммобилизованных различных животных и
человека.
Уровень иммунологического сходства рассчитывали в %, по формуле: ОПк-К
% в прямом ИФА = ---------------- х ¡00%, где
ОП„ -К
К - величина оптической плотности фона в пробе при концентрации сывороточного альбумина норки 10 мкг/мл; ОПк - оптическая плотность образцов видовых при их постоянной концентрации 10 мкг/мл; ОПн -оптическая плотность при концентрации ^О норки 10 мкг/мл
Расчет уровня иммунологического сходства в прямом конкурентном ИФА основан на определении соотношения оптических плотностей при значениях оптической плотности, обеспечивающей 50% уровень ингибирования (связывания ИПК анти-^С норки).
Уровень иммунологического сходства рассчитывали в %, по формуле: К — ОП конкурента
% в конкурентном ИФА : = --------------------------- х 100%, где
К - ОП50 норки
К - величина оптической плотности в отсутствие конкурентов, ОП50 -оптическая плотность при концентрации норки, обеспечивающая 50% уровень связывания ИПК анти^О норки, ОП конкурента - оптическая плотность образцов видовых ^О при их постоянной концентрации
Статистическая обработка результатов. При анализе и обобщении результатов исследований использовали методы статистической обработки,
общепринятые в биологии. Достоверными считали различия при уровне значимости р<0,05. Полученные результаты подвергали статистической обработке средствами программы Microsoft Excel.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Получение стандартизованных форм видовых IgG
Задачей проведенных экспериментов, представленных в данном разделе было создание универсальной схемы выделения IgG с необходимым уровнем электрофоретической гомогенности и мономерных по составу фракций белка.
С целью получения очищенных и конформационно нативных образцов видовых IgG использовали реагенты и методы фракционирования с минимальным белок-денатурирующим эффектом. Осаждение IgG из пула плазмы (сыворотки) крови осуществляли с помощью ПЭГ при концентрации 15% и значениях рН среды равной 8,0±0,1.
Далее обогащенные IgG осадки растворяли в соответствующих буферных растворах с необходимыми значениями рН и ионной силы для проведения стадий хроматографической очистки. Для дальнейшей очистки были использованы различные виды сорбентов. На основе протеин А-сефарозы выделяли фракцию IgG. Полученные продукты имели высокую степень чистоты (92-97%), но процент выхода целевого белка варьировал в достаточно широком интервале (75-95%). От дальнейшего применения аффинного сорбента на первых стадиях очистки для использования в универсальной схеме получения высокоочищенной формы видовых IgG, было решено отказаться ввиду малой сорбционной емкости сорбента, достаточно жестких условий десорбции (низкое значение рН) и отсутствие сорбции определенных подклассов IgG некоторых видов животных на протеин-A. Относительно высокий процент выхода IgG (78-94% и 80-92% для фенил-сефарозы и бутил-тойоперл, соответственно) и низкая селективность хроматографии (56-75% чистоты) позволяют заключить, что данная стадия не имеет дальнейших перспектив в рамках цели проводимых исследований. Сравнительный анализ данных показал, что анионообменное фракционирование позволяет получать IgG с наиболее высоким выходом (75-83%) и степенью чистоты в пределах 8596%. При этом в составе IgG фракций в иммуноэлектрофорезе регистрируется трансферрин, IgA и IgM. Для повышения уровня чистоты целевого белка в дальнейших исследованиях изучалась возможность анионообменной сорбции IgA на основе различий в изоэлектрических точках IgG и примесных белков. За счет варьирования рН и ионной силы уравновешивающего буферного раствора определяли условия, при которых из состава фракции, представленной на 8596% IgG происходит сорбция IgA. Далее изучали количественное соотношение белок-сорбент с целью минимизации сорбции IgG при установленном значении рН и ионной силы уравновешивающего буферного раствора. Указанный эффект достигался при использовании 0.05 M трис-HCl уравновешивающего раствора, рН 8.5, в соотношении 200 мг стандартизированной (85-96% чистоты) IgG фракции/мл сорбента. Таким образом, первая стадия анионообменной
1 1
хроматографии (табл. 1, 3.2) имеет своей задачей получение фракции 1§0 при уровне очистки 85-96%. Вторая (ключевая) стадия (табл. 1, 3.3) позволяет удалять из очищенной формы примеси ^А. Полагаем, что снижение выхода видовых на 10-13% не является принципиальным, т.к. данная стадия позволяет удалить ^А, сходный по молекулярной массе целевому белку, а также ^М и трансферрин, включая гем-производные, в т.ч. модифицированные гемом молекулы иммуноглобулина в. Стадия гель-хроматографии (табл. 1, 3.4.) предназначена для выделения мономерных форм без их олигомеров, фрагментов, денатурированных форм белка и остаточных концентраций ПЭГ.
Таблица 1
Характеристика лабораторных схем выделения особо чистых форм норки, хорька, соболя, человека.
Шифр стадии Стадия % чистоты % выхода Фактор очистки
Анионообменная хроматография
3.1 Осаждение ПЭГ (15% рН 8.0) 48-55 91-97 3,8-5,5
3.2 Анионообменная хроматография 1 (сорбция примесных белков: рН 6.5, 0.0175 М натрий-фосфатный буфер; соотношение масса белка/объем сорбента не превышало 50 мг/мл) 85-96 75-83 6,8-9,4
3.3 Анионообменная хроматография 2 (сорбция примесных белков: рН 8.5, 0.05 М трис-НС1 буфер; соотношение масса белка/объем сорбента составляло 200 мг/мл) 90-96 60-70 7,2-9,6
3.4 Гель-хроматография 96-99 35-54 7,7-9,9
Рис. 1 Электрофореграммы стадий выделения иммуноглобулина в:
1 - фракция, полученная при осаждении 15 %-ным ПЭГ при рН 8.0 (стадия 3.1);
2 - после анионообменной хроматографии 1 в режиме сорбции примесных белков (стадия 3.2);
3 - после анионообменной хроматографии 2 в режиме сорбции примесных белков (стадия З.З.);
4 - после гель-хроматографии хроматографии (стадия 3.4)
Г
На рисунке 1 (1-4) в качестве примера приведены электрофореграммы последовательных стадий фракционирования сыворотки крови для получения стандартизованной формы
Образцы очищенных форм видовых ^С представлены на рис. 2
12 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
Рисунок 2. Электрофореграмма образцов стандартизованных форм IgG человека и животных.
Электрофорез проводился в градиентном (3-25%) полиакриламидном геле, количество белка на трек 40 мкг (в первом треке 60 мкг). Образцы восстановлены меркаптоэтанолом.
1 - плазма крови человека, 2 - IgG барана, 3 - IgG лошади, 4 - IgG соболя, 5 - IgG человека, 6 - IgG лисы, 7 - IgG норки, 8 - IgG собаки, 9 - IgG свиньи, 10 - IgG песца, 11 - IgG курицы, 12 - IgG хорька. Alb — альбумин, Н — тяжелая цепь иммуноглобулина, L - легкая цепь иммуноглобулина
Изучалось влияние длительного хранения очищенных образцов IgG на их свойства. С этой целью образцы IgG хранили при (8±2) °С в присутствии сульфата аммония при его конечной концентрации 50% от насыщения. Установлено, что в течение года в составе образцов IgG формировались олигомеры, регистрируемые в ПААГ-электрофорезе и с помощью гель-хроматографии на геле сефадекса G-200. Через 2 года хранения фрагментирование целевых белков нами не обнаружено, а уровень олигомеров возрос до 3%. Не исключено, что процесс олигомеризации мономерных форм индивидуальных белков обеспечивает им новые свойства, в т.ч. на уровне представительства антигенных детерминант в составе сформировавшихся агрегатов. Изменение антигенных свойств образцов IgG определяли в прямом и прямом конкурентном ИФА, используя для конструирования аналитических иммуносорбентов и градуировочных зависимостей образцы хранения и их мономерные формы. В прямом варианте ИФА чувствительность анализа была одинаковой и составляла 9,8 нг/мл в системе взаимодействия с адсорбционно иммобилизованными IgG норки и специфическими ИПК-aHTHlgG. Аналогичный вывод следует из сравнительных исследований на основе прямого конкурентного ИФА, в котором чувствительность 39,1 нг/мл была
одинаковой независимо от использования мономерных форм или их образцов хранения. Изучение свойств образцов хранения этих белков позволяет обсуждать их применение в качестве стандартов при исследовании производственных серий иммуноглобулиновых и альбуминовых биопрепаратов, а также ИПК антикв, в т.ч. из иммуноферментных диагностикумов для выявления антител из класса ^О.
Представленные результаты позволяют сделать заключение, что предложенная универсальная схема выделения видовых позволяет
получить высокоочищенную мономерную форму иммуноглобулина в из плазмы (сыворотки) различных животных и человека. В предложенных условиях хранения возможна олигомеризация до 3%, но, тем не менее, она не влияет на его поведение в различных вариантах ИФА.
Разработка лабораторного набора для определения норки
В разработку набора для определения 1§С норки на базе иммуноферментного метода входило изготовление необходимых иммунореагентов. Выделение норки для проведения иммунизации
проводили на основе разработанной и описанной ранее схемы. Специфичность иммуносыворотки и соответствующего набора обеспечивали качеством иммуногена, схемой иммунизации и контролем в иммуноэлектрофорезе. Индивидуальные образцы иммуносывороток объединяли, если в иммуноэлектроферезе с норки формировалась единственная дуга
преципитации в области подвижности у-глобулинов при активности антител в пределах 1/16 - 1/32. В оптимизацию анализа входило определение стандартного разведения синтезированного ИПК. Для этого в течение ночи адсорбировали иммуноген (^С норки) при постоянной концентрации белка 1 мкг/мл общепринятым способом. Стандартным разведением ИПК антикв норки считали такое его разведение, которое в прямом методе анализа обеспечивало формирование оптической плотности ОП493 = 1,2 ± 0,1 с субстратом ОФД. На основе ИПК анти-^С} норки в стандартном разведении конструировали прямой метод иммуноферментного анализа.
Установлено, что чувствительность прямого варианта ИФА составляла 9,8 нг/мл. Изменения оптической плотности и достоверные различия ее значений определяют линейный интервал градуировочной зависимости. Линейная часть градуировочной зависимости находилась в интервале 9,8 - 1250 нг/мл, а рабочая (нелинейная часть) соответствовала концентрациям вплоть до 10 мкг/мл. Для оценки неспецифической сорбции использовали альбумин норки и различных видов животных и человека. Использовались
концентрация альбумина норки - 10 мкг/мл, концентрации видовых составили 1,25 и 10,0 мкг/мл. Уровень неспецифической сорбции ИПК антинорки на адсорбционно иммобилизованный альбумин норки составил 0,078±0,011 ед. оптической плотности. Что демонстрирует незначительную сорбцию в пределах допустимых значений. Значения сорбции ИПК на иммобилизованные видовые варьировали в достаточно широких пределах от 0,082±0,010 до 0,587±0,05 при концентрации 1,25 мкг/мл и от
0,095±0,011до 0,887±0,062 при концентрации 1§С 10,0 мкг/мл. Необходимо подчеркнуть, что прямой метода анализа ИФА непосредственно в аналитической биохимии не используется. В данном случае его применение сводилось к оптимизации конкурентного ИФА и выявлению уровня гомологии видовых среди животных одного и того же семейства в условиях максимально возможного лимитирования ИПК анти-^О.
На основании предварительных результатов, полученных в прямом методе ИФА, конструировали конкурентный метод анализа при концентрации 1 мкг/мл адсорбционно иммобилизованного норки, а ИПК анти-^в норки использовали в стандартном разведении (ОП493 = 1,2±0,1). Градуировочная зависимость гомологичных находилась в пределах 2,4 нг/мл - 5 мкг/мл. Чувствительность набора определена на уровне 39,1 нг/мл. Линейный участок кривой находится в интервале 39,1 - 625 нг/мл. Холостая проба, содержащая 10 мкг/мл альбумина норки, формировала оптическую плотность 1,205±0,098.
При использовании твердофазных методов за счет адсорбционной иммобилизации ^О невозможно обеспечить необходимую для количественного определения точность анализа (Войцеховский, 1988). Также невозможно достичь необходимого показателя качества набора в тесте на открытие ввиду диффузионных ограничений и протекания реакции на границе раздела фаз (Вербов, 1988). Результаты определения важнейшего показателя -отсутствие перекрестных реакций с близкородственными белками или белками со сходными структурами с точки зрения наличия подобных антигенных детерминант - определить не представляется возможным. Данные, полученные с помощью ДИД или иммуноэлектрофореза, не могут полностью удовлетворять необходимым требованиям. Поскольку чувствительность данных методов примерно на три порядка ниже по сравнению с методами, основанными на иммуноферментном варианте анализа. На основании вышеизложенного были проведены исследования, представленные в следующем разделе, направленные на изучение иммунологического сходства видовых 1§0 с использованием методологических принципов анализа и соответствующих подходов представленных в настоящем разделе.
С учетом изложенного использовали следующие исследовательские подходы к проведению экспериментов: 1) при постановке ДИД вместо иммуносыворотки, использовали фракцию кролика, специфичную к норки при постоянной концентрации белка 10 мг/мл; 2) объектом исследования служили видовые образцы 1еО в биохимически чистой форме, гомогенные в ПААГ-электрофорезе, без олигомеров и фрагментов целевого белка; 3) постановка ИФА базировалась на оптимизированных вариантах схем, с соответствующими градуировками и контролями, воспроизводимыми в каждом планшете; 4) градуировочные зависимости и результаты анализа фиксировались непосредственно, без использования математических моделей обработки информации (Войцеховский, 1988).
Исследование антигенной структуры видовых в гомологичной системе анализа (^С норки - анти-^в норки)
Проведено изучение антигенного строения видовых с помощью иммунореагента на основе поликлональных антител с целью определения усредненных значений иммунологического сродства. Для сравнительных исследований 1§С различных видов животных и человека были использованы варианты иммунопреципитационных и иммуноферментных методов анализа. При постановке ДИД использовали небольшие модификации. Вместо цельной антисыворотки использовалась фракция ^С с концентрацией 10 мг/мл, выделенная из пула иммуносывороток, специфичных к норки. Для повышения чувствительности в состав агарозы вводили ПЭГ до концентрации 3 %, а преципитаты окрашивали с помощью амидочерного 4В [Кэтти и др., 1991]. В прямом варианте ИФА в системе анализа ^О норки - ИПК анти-^С норки исследовали калибровочные пробы, приготовленные на основе видовых ^С. Гомологичные и гетерологичные калибранты использовали также в прямом конкурентном методе.
Таблица 2
Уровень иммунологического сходства иммуноглобулина в норки и ^С
различных животных и человека
Животное ДИД Прямой ИФА, ОПп Конкурентный ИФА, ОПк
титр % х±<з % х±а %
Норка 1/64 100 1,214±0,153 100 0,582±0,05** 100
Соболь 1/64 100 0,907±0,110* 73 0,933±0,087** 44
Хорек 1/64 100 0,782±0,080* 62 1,014 ±0,073** 32
Лиса 1/16 25 0,327±0,043* 22 1,173±0,089 4
Песец 1/16 25 0,248±0,036* 15 1,192±0,110 1,3
Собака 1/16 25 0,192±0,017* 10 1,196±0,077 0,7
Человек 1/8 12,5 0,112±0,015* 3 1,178±0,091 3,5
Баран 1/1 (цельная) 1,6 0,111±0,014* 3 1,191±0,085 1,5
Лошадь 1/1 (цельная) 1,6 0,108±0,013* 3 1,207±0,086 1,1
Корова 1/1 (цельная) 1,6 0,098±0,011* 2 1,182±0,107 2,9
Свинья 1/1 (цельная) 1,6 0,092±0,010* 1 1,205±0,084 0,8
Крыса 1/1 (цельная) 1,6 0,091±0,009* 1 1,203±0,084 0,5
фон 0 0,078±0,011 (САН, 10 мкг/мл) 1,205±0,098 (отсутствие конкурента)
Примечание: X - ср. арифметическая, а - ср. квадратичное отклонение, п=6;
ОПп - оптическая плотность образцов при концентрации адсорбционно иммобилизованных 10 мкг/мл; ОПк - оптическая плотность образцов 1дС'г при их постоянной концентрации (156 нг/мл), которая обеспечивает в гомологичной системе анализа (^О норки) ~50% ингибирование;
* - достоверные различия по сравнению с гомологом (^О норки) при уровне значимости р < 0,05
** - достоверные различия по сравнению с фоном (отсутствие конкурентов) при уровне значимости р < 0,05
На основании результатов, представленных в табл. 2 можно сделать вывод, что анализ на основе иммунопреципитации выявляет сходство практически всех видовых При этом разницы между представителей семейства куньих (норка, соболь, хорек) не выявлено, следовательно, образцы сравнения характеризуются 100% иммунологической идентичностью поскольку титр в гомологичной системе анализа составил 1/64 для всех представителей куньих. Если сравнивать видовые семейства куньих в прямом методе ИФА, то уровень сродства различен для соболя, хорька. Об этом свидетельствуют прежде всего профили градуировочных зависимостей, воспроизведенных для образцов семейства куньих (табл. 2, рис. 3). В табл. 2 представлены численные значения различий в антигеном строении образцов сравнения, которые вычислены по формуле как отношение в % величины ОП493 гетерологичного ^О к ОП493 гетерологичного 1§0 при максимально возможной (10 мкг/мл) концентрации антигена. Оставшиеся .видовые ^О связывали ИПК антикв норки на уровне значений контроля.
О 1000 2000 3000 4000 5000 6000 7000 8000 9000 10000
|дС, нг/мл
-норка -соболь "хорек
-собака человек 'барам -лошадь -корова 'свинья - крыса
Рис. 3. Градуировочные зависимости гомологичных и гетерологичных прямом варианте ИФА
ДО в
В условиях лимитирования концентрации аналитических антител в составе ИПК антикв норки (стандартное разведение связывающего иммунореагента при постоянной концентрации антигена (1 мкг/мл) моделировали конкуренцию за центры связывания избытка антигеннородственных (гетерологических ^в) белков. Если сравнивать видовые в конкурентном анализе в условиях лимитированных
концентраций, то различия между образцами сравнения носят достоверный характер. При сравнении одинаковых концентраций ^С соболя и хорька, соответствующих концентрации норки (156 нг/мл) и 50%-ому
ингибированию в градуировочной зависимости, уровни сродства для гетерологичных образцов составили 44 и 32 %, соответственно (табл. 2, рис. 4).
Таким образом, иммунопреципитационный метод и прямой метод ИФА показали наличие гомологии (перекрестных реакций) с различными гетерологичными в то время как наиболее адекватный метод для оценки гомологии (прямой конкурентный ИФА) выявил наличие перекрестных реакций с \gG норки только у представителей семейства куньих.
1§С, нг/мл
Рис. 4. Градуировочные зависимости гомологичных и гетерологичных в прямом конкурентном варианте ИФА
Способ получения и хранения фракции 1§С из плазмы (сыворотки) крови
Для производства биопрепаратов из плазмы крови используются различные способы заготовке сырья и его хранения. В ходе проведенного исследования изучалась возможность создания способа заготовки сырья включающего в себя возможность длительного хранения без использования энергоемких технологий (типа глубокой заморозки), совмещенной с созданием условий способствующих инактивации вирусных частиц. В рамках этой задачи исследовалась возможность хранения заготовленной плазмы (или сыворотки) крови при обработке ее фенолом с последующим фракционированием при помощи сульфата аммония. Фенол обладает бактерицидными и вирусинактивирующими свойствами. Сульфат аммония считается реагентом
способным длительно сохранять биологическую активность молекул белка, следовательно сохранять их нативную структуру.
40%-й раствор фенола в глицерине вносили до его конечной концентрации 0,3%, 0,5%, 1,0% при заготовке плазмы или сыворотки крови и выдерживали в течение 5 суток при температуре (10+2) °С. В процессе хранения контролировали бактериальный рост в заготовке, отбирая ежедневно пробы на протяжении 5 суток. Пробы высевали на МПА. При концентрации фенола 0,3% наблюдалось уменьшение количества колоний по сравнению с контролем. В то же время в отобранных образцах при концентрациях фенола 0,5% и 1,0% бактериальный рост отсутствовал. На основании полученных результатов определен минимальный интервал концентраций фенола, обеспечивающих бактериостатическое действие, который составляет 0,5-0,7%. Далее в плазму (сыворотку) крови вносили сульфат аммония и доводили его до концентрации 50% от насыщения с целью максимального осаждения иммуноглобулина в. Полученную таким образом фенольно-сульфатную суспензию хранили при температуре (10+2)°С. Согласно полученным данным электрофореза в ПААГ практически весь ^О представлен в осадке.
Из полученных суспензий в течение 12 месяцев через определенные интервалы времени отбирали пробы и проводили исследования по нескольким показателям. Было изучено влияние предложенного способа хранения сырьевой заготовки на активность антител. Уровень активности антител определяли при помощи метода ИФА по изменению титра антител к овальбумину - у предварительно иммунизированных овальбумином норок и к клещевому энцефалиту - у человека в пуле образцов абортно-плацентарной сыворотки. Полученные данные свидетельствуют, что активность антител после 12 месяцев хранения сохраняется практически на исходном уровне вне зависимости от вида сырья и 12 месяцев хранения не влияют на биологические функции белков, в частности Так титр антител норки к овальбумину сохранялся в течение изученного срока хранения на уровне 1/6400-1/12800, а титр к клещевому энцефалиту в абортно-плацентарной сыворотке оставался в интервале 1/12800-1/25600.
Изучалась возможность микробного роста в процессе хранения сырья, пробы на посев отбирались с интервалом месяц. Результаты демонстрируют отсутствие бактериального роста в отобранных образцах в течение 12 месяцев хранения сырьевой заготовки. Следовательно, в процессе хранения создаются условия предотвращающие рост микроорганизмов и накапление бактериальных пирогенов в заготовленном сырье.
В процессе производственной заготовки плазмы (сыворотки) крови пушных зверей происходит гемолиз эритроцитов и других клеточных компонентов крови, что приводит к загрязнению сырьевой заготовки различными клеточными протеазами. Что ведет в конечном итоге к нарушению нативной структуры молекул целевых белков и к их дальнейшей фрагментации. Ферментативную активность протеаз в фенольно-сульфатной суспензии оценивали с помощью определения трипсиноподобной активности в надосадочном растворе. Полученные результаты свидетельствуют о снижении
активности протеолитических ферментов в суспензии по сравнению с контрольными показателями в образцах исходного сырья в среднем 35-40 раз. Таким образом, в предложенном варианте хранения создаются условия, способствующие снижению протеазной активности и уменьшению повреждающего действия различных протеаз на целевые белки.
Перевод фенольно-сульфатной суспензии в полуфабрикат ^С для дальнейшей работы осуществляли с помощью различных методов. Наиболее оптимальным и универсальным для дальнейших манипуляций по фракционированию является осадок белка, полученный осаждением ПЭГ. ПЭГ считается наиболее мягким и неиногенным осадителем, в связи с этим не препятствует последующему использованию нехроматографического методов фракционирования и различных вариантов хроматографической очистки Для использования в последующих экспериментах фенольно-сульфатную суспензию подвергали центрифугированию для осаждения фракции, обогащенной иммуноглобулином. С целью предотвращения расслоения раствора при применении в качестве осадителя ПЭГ, необходимо снизить концентрацию БО«2". Для удаления примесей БО«2" были использованы различные способы: диализ, ультрафильтрация, гель-хроматография, перевод сульфат-иона в малорастворимый осадок. На основании полученных результатов в дальнейшем использовали удаление примесей БО/" за счет формирования малорастворимого Са804 в процессе экстракции осадков раствором хлорида кальция. Данный способ наиболее быстрый по времени, в тоже время позволяющий сохранить активность антител и обеспечивающий высокий процент выхода белка. При экстракции осадка в 1-2 %-ом растворе хлорида кальция центрифугированием удаляют малорастворимый сульфат кальция, а 1§0-обогащенную фракцию получают переосаждением с помощью 18% ПЭГ 4000 при рН 8,0. Далее исследовались осадки для изготовления препаратов полученные предложенным выше способом из сырья
различной видовой принадлежности. В результате процент выхода и процент чистоты 1§С норки и человека в полуфабрикатах для получения препаратов иммуноглобулина составили следующие значения, соответственно: куньи - 9294% и 49-51 %, человек - 93% и 51 % . Полученные результаты демонстрируют, что проведенные стадии фракционирования позволяют получать полуфабрикаты целевого белка с высоким процентом выхода независимо от видовой принадлежности сырья. Значение процента чистоты сопоставимо с показателями фракционирования нехроматографическими способами очистки. На предложенный способ хранения и получения 1§0-обогащенной фракции для изготовления биопрепаратов крови выдан патент на изобретение (№2338375 «Способ хранения плазмы или сыворотки крови для получения иммуноглобулиновых и альбуминовых биопрепаратов»). Растворы конечных осадков обладают заданными характеристиками для дальнейшего их фракционирования и получения иммуноглобулиновых биопрепаратов либо с помощью хроматографических подходов, либо с помощью нехроматографических технологий на основе этанола, риванола или каприловой кислоты.
Таким образом, предложенный способ обеспечивает длительное хранение сырьевой заготовки при плюсовых значениях температуры в условиях способствующих инактивации бактериальных и вирусных агентов, обеспечивающих сохранение биологических свойств белков, что позволяет проводить формирование обогащенной фракции для проведения
дальнейших стадий фракционирования с целью изготовления биопрепаратов крови.
Биохимические параметры ^С фракции, полученной с помощью
риванола
Были проведены исследования на предмет перспективности использования риванола для получения иммуноглобулинового препарата норки. С этой точки зрения изучали возможность очистки путем его экстракции раствором риванола из осадка у-глобулинов, полученных фракционированием плазмы под действием ПЭГ (изложенным выше способом). Суспендирование осадков осуществляли в пределах значений рН от 4,0 до 10,0 при концентрации риванола от 0,4 до 2,0%. Концентрацию определяли прямым конкурентным методом ИФА для расчета процента чистоты и процента выхода целевого белка.
Установлено, что при рН 4,0 и концентрациях риванола 0,6-2,0% у-глобулиновый осадок практически полностью (96%) растворялся. С увеличением рН растворимость белков существенно снижалась, а при рН 9,010,0 в надосадочный раствор риванола переходит до 37% от общего белка.
При концентрации риванола 0,6% и рН экстрагирующей среды 5-9 отмечались (зарегистрированы) наименьшие концентрации общего белка в надосадочных фракциях. С увеличением концентрации риванола до 0,8-1,5% при рН 6,0-8,0 в надосадочном растворе концентрации общего белка увеличились в среднем в 1,5-1,9 раза. Наименьший уровень экстракции наблюдался при рН 10,0 в надосадочной фракции содержалось 4-18% от общего белка.
В образцах надосадочных фракций прямым конкурентным методом определяли концентрацию для оценки биохимических параметров
фракции. В качестве контроля использовали эквивалентное количество сырого осадка, экстрагированного в 5 объемах (вес/объем) 0,85% раствора натрия хлорида. Установлено (табл. 3 и 4), что при рН 4,0 и в присутствии риванола 0,6-2,0% процент чистоты целевого белка колеблется в пределах 43-51% и не отличается от величины такового показателя в контроле. В таких условиях зарегистрирован наивысший показатель экстрагируемости (96%), который из-за погрешности используемого метода может на 4% превышать максимально возможное его содержание в исходном осадке. Аналогичная закономерность - отсутствие влияния риванола на процент выхода и процент чистоты - наблюдалось при рН инкубационной среды 5,0. Экстракция при рН 6,0 приводила к увеличению процента чистоты (60-85%) целевого белка и снижала его выход до 60-83%. Наиболее существенный фактор очистки достигался при рН 7,0-10,0. В частности, наименьшая величина процента
чистоты при нейтральных и щелочных значениях рН была не ниже 72%. Наиболее очищенные образцы (90-101%) формировались в условиях рН 9,0-10,0. Однако выход целевого белка при этом существенно снижался. Так при концентрации риванола 0,6% и рН в пределах значений 6,0-10,0 выход по убывающей составил 64-30%. При тех же значениях рН и в присутствии 0,8% риванола обсуждаемый показатель снижался от 85% до 35%. В условиях нейтрально-щелочной экстракции (рН 7,0-9,0), при концентрации риванола 1,02,0% до 50% присутствовало в надосадочной фракции. Наименьший выход в его максимально очищенной форме характерен для рН 10,0. Надосадочные фракции и осадки, полученные под действием риванола, анализировали в градиентном (3-25%) ПАГ электрофорезе. Установлено, что максимально очищенные образцы (степень чистоты 100 и более
процентов), полученные при рН 9,0 или 10,0, имели в своем составе примеси трансферрина и гемоглобина, а при высоких концентрациях риванола (1,52,0%) зарегистрировано усиление полосы гемоглобина и появление на электрофореграммах высокомолекулярных примесных белков или олигомеров В риванольных надосадках присутствовали также другие индивидуально различные 3-4 белка в качестве следовых количеств примесей. При рН от 4,0 до 6,0 белковые спектры обогащенных фракций принципиально не
отличались от бросовых осадков. В риванольных растворах только при рН 7,0 альбумин присутствовал в следовых количествах и далее при рН 8,0-10,0 в обогащенных фракциях альбумин зарегистрировать не удалось. Аналогичный электрофоретический анализ проводили с образцами бросовых осадков, сформированных в процессе риванольного фракционирования. Установлено, что при всех использованных концентрациях риванола и рН 8,010,0 альбумин практически полностью переходил в осадок, а трансферрин более или менее равномерно распределялся между целевой надосадочной фракцией и осадком. Необходимо также отметить особенности белкового спектра осадков, формирующихся при кислых значениях рН. Известно, что при рН 4,0-4,5 риванол не взаимодействует с белками, т.е. не обладает агрегирующе-осаждающим действием. Тем не менее, по нашим данным около 4% от общего белка в обсуждаемых условиях переходило в осадок, в котором содержался преимущественно и в меньшей степени альбумин.
Таблица 3
Процент чистоты норки в надосадке в зависимости от значения рН раствора и концентрации риванола, полученных экстракцией у-глобулинового
осадка
рН Концентрация риванола,%
0,6 0,8 1,0 1,2 1,5 2,0
4 43,2+1,2 45,4±1,4 40,6+1,2 42,8+1,1 51,6+1,5 50,5±0,9
5 54,3±0,9 42,2±1,5 46,1±1,3 51,6±1,9 53,3+1,4 55,9±1,8
6 74,8+0,8 68,4±1,6 68,2±1,6 72,5+1,5 80,3+1,7 85,1±1,8
7 85,3±1,4 86,1±1,3 93,4±1,7 89,1 + 1,4 84,7+1,8 72,6±1,2
8 94,3+1,3 95,1 + 1,6 93,5+1,3 96,6±1,5 90,3±1,8 89,8±1,4
9 92,6±1,6 95,8+1,3 99,3±1,2 96,1±1,7 104,1 + 1,5 100,8+1,7
10 90,6±1,4 96,5±1,5 94,2+1,6 100,2±1,7 98,7±1,3 90,7+1,3
Примечание: Х-ср. арифметическая, м-ошибка средней, п=5
Таблица 4.
Процент выхода норки в в надосадке в зависимости от значения рН раствора и концентрации риванола, полученных экстракцией у-глобулинового
осадка
РН Концентрация риванола,%
0,6 0,8 1,0 1,2 1,5 2,0
4 98,1+1,3 104,3±1,9 101,5± 1,6 96,6±1,5 102,1+1,4 101,3+1,3
5 96,5+1,4 101,8+1,6 98,2±1,7 99,3+1,7 95,8±1,5 95,3±1,5
6 64,8+0,8 85,3+1,6 72,1+1,5 74,9+1,8 66,3+1,5 60,2±1,3
7 55,6±1,3 79,7±1,4 70,3±1,1 48,9±1,4 50,1±1,6 55,3±1,7
8 48,2+1,1 82,3+1,4 64,9±1,5 56,1 + 1,5 50,8±1,7 61,9+1,5
9 33,3±1,3 51,2±1,2 49,6±1,7 54,8+1,5 47,4±1,4 50,5+1,6
10 30,5±0,9 35,4±0,9 41,2+1,2 30,8+1,4 16,8±0,7 25,2+1,1
Примечание: Контроль 100+7%, Х-ср. арифметическая, м-ошибка средней, п=5
Таким образом оптимальными условиями экстракции из
обогащенных ПЭГ-овских осадков являются: значение концентрации риванола от 0,6 до 0,8 % и интервал рН от 7,0 до 8,0.
Биохимические параметры фракции, полученной с помощью каприловой кислоты
Каприловая кислота используется в производстве препаратов плазмы как осаждающий и как вирус-инактивирующий реагент. В то же время ее соли при нейтральных рН используются как стабилизаторы белка (в частности альбумина) (81е{пЬисЬ, 1980; Русанов и др., 1983). Исследовали влияние концентрации каприловой кислоты и рН в процессе экстрагирования из состава у-глобулиновой фракции, полученной с помощью ПЭГ (способ изложен выше). Установлено, что при рН 3,0 или 4,0 до 47% общего белка находилось в форме осадка. Наибольший осаждающий эффект зарегистрирован при рН 4,0 и концентрации каприловой кислоты 1,0%. Концентрации каприловой кислоты 0,3% и 0,5%, а также рН инкубационно-экстрагирующей среды 3,0 и 4,0 приводили к осаждению 23-40% от общего белка. При рН 5,0 и 6,0 в присутствии концентраций каприловой кислоты от 0,3% до 1% в осадке оставалось не более 13% от общего количества белка (табл. 6).
Таблица 6.
Процент выхода общего белка в надосадке в зависимости от условий экстракции осадка с помощью каприловой кислоты
рН инкубационной среды Концентрация каприловой кислоты (В %)
0,3 0,5 1,0
3 77,5±1,2 60,6+1,1 75,2+1,2
4 70,4±1,1 74,5±1,1 53,1±0,7
5 88,2+1,3 98,1±1,1 70,6+1,1
6 87,1±1,3 99,3±0,9 96,7±0,8
Примечание: Х-ср. арифметическая, м-ошибка средней, п=5
Степень очистки (табл. 7) в зависимости от величины рН варьировала от 45% до 85%. Установлено, что в условиях инкубирования при рН 3,0 и концентрации каприловой кислоты 0,3%-1% процент чистоты составил 70-80%. Показано также, что эта тенденция сохраняется при рН 4,0. При рН 5,0 и 6,0 степень очистки не отличалась от контрольных показателей, свойственных исходному раствору осадка, предназначенного к фракционированию. Процент выхода при рН 3,0 и 4,0 находился в пределах 70-85%, а при рН 5,0 и выше - достигал 99%.
Таблица 7.
Процент выхода и процента чистоты ^С норки в надосадке в зависимости от условий экстракции осадка с помощью каприловой кислоты
РН Показатели Концентрация каприловой кислоты, %
качества ^С-
обогащенион 0,3 0,5 1,0
фракции
3 % чистоты 70,6± 0,7 75,6+ 1,1 80,7+ 1,1
% выхода 80,4+ 1,5 80,2+ 1,6 70,9+ 1,2
4 % чистоты 75,1+ 1,6 80,4 ± 1,4 85,6+ 1,4
% выхода 85,2+ 1,5 75,7 ± 1,3 80,5±1,2
5 % чистоты 50,2+1,2 56,7+1,3 45,8+1,1
% выхода 95,3±1,6 97,1±0,8 99,1 ±0,7
Примечание: Х-ср. арифметическая, м-ошибка средней, п=5
Электрофоретический анализ образцов надосадочных фракций и осадков, полученных в процессе фракционирования, свидетельствует, что даже при использовании неагрегирующих (не осаждающих) концентраций каприловой кислоты (0,3-0,5%) в составе нерастворившихся белков всегда присутствовал Наименьшее содержание альбуминов в обогащенной фракции
характерно для экстракции при рН 3,0 и 4,0. В условиях более высоких значений рН белковый спектр надосадка не отличим от такового в контроле.
На основании полученных данных оптимальными условиями экстракции из осадка при помощи каприловой кислоты являются 0,5-]% концентрация кислоты и интервал рН от 4,0 до 5,0.
Биологические свойства субстанции иммуноглобулинового биопрепарата
Проблема производства инфекционно безопасных биопрепаратов крови, с точки зрения предотвращения передачи вирусных инфекций, до сегодняшнего дня остается актуальной (Панов, 2004). Ее сущность заключается в невозможности обеспечить безопасность сырья, используемого для производства препаратов крови, только проведением скрининговых тестов. Помимо этого необходимо использовать специальные технологические стадии в производстве, обеспечивающие инактивацию и(или) удаление вирусных частиц в процессе фракционирования плазмы (сыворотки) крови (WHO Technical Report Series, №924, 2004). С точки зрения вирусной природы заболевания, типа вируса алеутской болезни норок и его широкой распространенности среди звероводческих хозяйств была изучена возможность получения инфекционно безопасных биопрепаратов крови. Плазму (сыворотку) крови заготавливали от норок имеющих соответствующие клинические симптомы заболевания алеутской болезнью и дающих положительную реакцию в РИЭОФ (реакция иммуноэлектроосмофореза). Изготовление иммуноглобулиновых биопрепаратов осуществляли с помощью технологии, включающей изложенные в предыдущих разделах способ заготовки и хранения сырьевой закладки, а также с использованием стадий фракционирования риванолом и каприловой кислотой. С целью безопасности и профилактики распространения гемотрансфузионным путем алеутской болезни норок при применении биопрепарата, с разрешения национального контролирующего органа, был проведен необходимый комплекс профилактических противоэпизоотических мероприятий. С учетом инкубационного периода алеутской болезни норок от 30 дней до 2-х лет (Сюрин и др., 1998), наблюдение за животными продолжалось в течение 4-х месяцев после введения иммуноглобулинового биопрепарата, с периодическим исследованием образцов сыворотки крови на наличие антител к вирусу алеутской болезни норок. На протяжении всего периода исследования у животных не было выявлено положительных реакций в РИЭОФ. В течение всего срока наблюдения у животных также не было выявлено клинических признаков заболевания алеутской болезнью норок. С учетом фармакокинетики всасывания препарата и периода полувыведения иммуноглобулина G из кровяного русла (который составляет в среднем 21 день) исследовали наличие положительной реакции в РИЭОФ образцов сыворотки крови норок на 3, 10, 15, 20 и 30 день после введения иммуноглобулинового биопрепарата. Несмотря на положительную реакцию на наличие антител против вируса алеутской болезни норок в образцах 3-х серий препарата, противовирусные антитела во всех образцах сыворотки крови норок не были обнаружены. С помощью ДИД изучили наличие иммунного ответа на введение иммуноглобулинового биопрепарата представителям семейства куньих (хорек, соболь). Исследовали образцы сывороток хорьков и соболя против иммуноглобулина G норки на 3, 10, 15, 20 и 30 день после введения. Наличия преципитационных полос не обнаружено.
На основании полученных результатов после применения иммуноглобулинового биопрепарата, можно сделать заключение, что технология изготовления иммуноглобулинового биопрепарата позволяет получать серии препарата из инфекционно опасного сырья, положительного в РИЭОФ, не обладающие способностью переноса вируса алеутской болезни норок. Введение иммуноглобулинового биопрепарата представителям семейства куньих (хорек, соболь) не вызывает индукцию синтеза антител на введение иммуноглобулина норки.
ВЫВОДЫ
1. Разработана универсальная схема получения различных видов животных и человека, основанная на осаждении с помощью ПЭГ 4000 с дальнейшими 2 циклами анионообменной хроматографии на ДЕАЕ-целлюлозе и заключительной гель-хроматографией на сефадексе С-200. Конечные образцы различных видов животных и человека гомогенны в градиентном 5-25% электрофорезе ПААГ и представлены мономерной формой на 99%.
2. На основе выделенных норки сконструированы два лабораторных варианта ИФА на базе прямого и прямого конкурентного метода для определения норки. Чувствительность прямого метода 9,8 нг/мл, прямого конкурентного 39,1 нг/мл. Линейный участок градуировочной зависимости находится в интервале у прямого метода 9,8 - 1250 нг/мл, у прямого конкурентного 39,1-625 нг/мл.
3. С помощью полученных видовых изучено иммунологическое сходство
норки с различных видов животных и человека. Установлено, что наибольшим сродством обладают образцы ^О представителей семейства куньих (соболь и хорек). Численные значения, полученные с помощью наиболее специфичного метода (прямой конкурентный ИФА), составили для соболя - 44%, для хорька - 32%. представителей других видов животных и человека имели незначительный перекрест с норки.
4. Разработан способ хранения и получения ^в-обогащенных фракций из плазмы (сыворотки) крови включающий 1% обработку фенолом и сульфатом аммония 50% концентрацией от насыщения. Предложенный способ обеспечивает длительное хранение сырьевой заготовки при плюсовых значениях температуры в условиях способствующих инактивации бактериальных и вирусных агентов, при сохранении биологических свойств белков.
5. Изучены закономерности фракционирования 1§С-обогащенных фракций при помощи риванола и каприловой кислоты. Определены наиболее оптимальные физико-химические параметры процесса экстрагирования
с учетом чистоты и процента выхода конечного продукта.
6. Экспериментальная технология получения иммуноглобулинового биопрепарата, включающая стадии, способствующие инактивации и элиминации вирусных частиц (постадийная схема
фракционирования/обработки фенолом, риванолом, каприловой кислотой, этанолом) позволяет получать из инфекциоиио опасной сырьевой заготовки конечный продукт, не обладающий способностью переноса вируса алеутской болезни норок.
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
1. Барсуков А.К. К вопросу о совершенствовании технологии производства фармацевтических биопрепаратов / А.К. Барсуков, А.В Бармин, О.Ю. Нестерова, E.H. Желтышев, А.И. Кузнецов, О.В. Кожевникова, В.А. Грачева, Ф.М. Касимов, А.Н. Панин, В.И. Смоленский, В.И. Уласов// Сельскохозяйственная биология. - 2005. - № 6. - С. 84-91.
2. Барсуков А.К. Стандартизация биопрепаратов крови / А.К. Барсуков, А.В Бармин, Ф.М. Касимов, А.И. Кузнецов, О.Ю. Нестерова, Г.Н. Бурдов, А.Н. Панин, В.И. Смоленский, В.И. Уласов, В.Л. Свидерский, А.Е. Хованских// Ветеринария. - 2005. - № 7. - С. 43-48.
3. Барсуков А.К. Иммунобиопрёпараты: показатели качества и перспективы развития / А.К. Барсуков, А.В Бармин, А.И. Кузнецов, О.Ю. Нестерова, Ф.М. Касимов, О.В. Кожевникова, А.Н. Панин, В.И. Уласов, В.И. Смоленский, Е.Ф. Панарин, М.В. Соловский, О.В. Назарова, И.В. Москвичева, Свидерский, А.Е. Хованских, В.Х. Хавинсон, Г.А. Рыжак, В.А. Ситников, С.И. Стяжкина, В.А. Грачева// II Евразийский конгресс по медицинской физике и инженерии «Медицинская физика - 2005». Сборник материалов. - Москва. 2005. - С. 332333.
4. Barsukov А.К. Informational priority of international development of socially usefull biotechnology / A.K. Barsukov, Zhuravlev V.A., Savinsky S.S., Barmin A.V., Kuznetsov A.I., Nesterova O.Yu., Kozhevnikova O.V., Ushnurtseva S.A., Zheltyshev E.N.// International Conference on Engineering Education. - Gliwice, Poland. 2005. - Conference Proceedings. - P. 76-81.
5. Кузнецов А.И. Фармацевтическая биотехнология: фундаментальные, прикладные исследования и научно-технические разработки /А.И. Кузнецов,
A.К. Барсуков, А.Н. Бохан, Ф.М. Касимов, О.Ю. Нестерова, О.В. Кожевникова, E.H. Желтышев, В.А. Храмов, Д.И. Шелехов, А.Н. Панин, В.И. Уласов, В.И. Смоленский, Е. Ф. Панарин, М. В. Соловский, О. В. Назарова, А.Е. Хованских,
B. X. Хавинсон, Г. А. Рыжак // II Всероссийский форум «Здоровье нации -основа процветания России». Сборник материалов Москва.- 2006.- С. 86-87.
6. Барсуков А.К. Совершенствование технологии производства биопрепаратов крови / А.К. Барсуков, О.Ю. Нестерова, А.И. Кузнецов, Ф.М. Касимов, В.А. Журавлев, E.H. Желтышев, В.А. Храмов // XIX Международная научно-техническая конференция «Химические реактивы, реагенты и процессы малотоннажной химии». Сборник материалов. - Уфа. 2006. - С. 54-55.
7. Барсуков А.К. Необходимые составляющие целесообразного развития нормативно-технической базы за контролем качества фармацевтических биопрепаратов / А.К. Барсуков, О.Ю. Нестерова, А.И. Кузнецов, О.В. Кожевникова, E.H. Желтышев, В.А. Храмов // Третья международная научно-практическая конференция «Исследование, разработка и применение высоких
технологий в промышленности». Сборник трудов. - Санкт-Петербург. 2007. -С. 160-162.
8. Барсуков А.К. Биохимические основы технологии производства бипрепаратов из некондиционной (утильной) плазмы (сыворотки) крови / А.К. Барсуков, О.Ю. Нестерова, А.И. Кузнецов // Четвертая международная научно-практическая конференция «Исследование, разработка и применение высоких технологий в промышленности». Сборник трудов. - Санкт-Петербург. 2007. -С. 250-251.
9. Барсуков А. К. Выделение белков-стандартов иммуноглобулина в и альбумина, изучение их олигомеризации и антигенных свойств в процессе хранения в насыщенном растворе сульфата аммония. / А.К. Барсуков, А. В. Бармин, А. И. Кузнецов, О. Ю. Нестерова, С. А. Ушнурцева, А. Н. Панин, В. И. Смоленский, В. И. Уласов, В. Л. Свидерский, А. Е. Хованских. //Прикладная биохимия и микробиология. - 2009. - т. 45. - №3. - С. 378-383.
10. Барсуков А. К. Разработка экспериментальных подходов на основе белков-стандартов для оценки качества биопрепаратов крови и иммунопероксидазных конъюгатов, специфичных к иммуноглобулинам С человека и животных. / А.К. Барсуков, А. В. Бармин, А. И. Кузнецов, О. Ю. Нестерова, С. А. Ушнурцева, А. Н. Панин. В. И. Смоленский, В. И. Уласов, В. Л. Свидерский, А. Е. Хованских. // Прикладная биохимия и микробиология. -2009,- т. 45. - №4. - С. 487-492.
Отпечатано с оригинал-макета заказчика
Подписано в печать 25.09.2009. Формат 60x84 1/16. Тираж 100 экз. Заказ № 1494.
Типография ГОУВПО «Удмуртский государственный университет» 426034, Ижевск, ул. Университетская, 1, корп. 4.
Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Кузнецов, Александр Иванович
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
ВВЕДЕНИЕ 5 I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1. Биохимия и молекулярная биология ^О представителей 14 семейства куньих
1.2. Препаративная и аналитическая биохимия выделения 1^
1.3. Биохимические основы биотехнологических нововведений для 31 обеспечения инфекционной и биологической безопасности иммуноглобулинов
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
II МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
2.1. Оборудование и реактивы
2.2. Получение плазмы (сыворотки) крови
2.3. Биохимические методы
2.4. Иммунологические методы
2.5. Микробиологические методы
2.6. Способы расчета показателей
2.7. Статистическая обработка результатов
III РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
3. Схема выделения и сравнительное изучение гомологии ^О 48 человека и животных
3.1. Получение видовых
3.2. Разработка лабораторного набора для определения ^О норки
3.3. Исследование антигенной структуры видовых в 70 гомологичной системе анализа (^О норки - анти-^О норки)
4. Прикладная биохимия фракционирования плазмы (сыворотки) 84 крови норки с целью получения биопрепаратов на основе
4.1. Способ получения и хранения фракции
§0 из плазмы сыворотки) крови
4.2 Характеристика ^О фракции, полученной с помощью риванола
4.3. Характеристика фракции, полученной с помощью 95 каприловой кислоты
4.4. Изучение инфекционных и антигенных свойств 97 экспериментальных серий иммуноглобулинового биопрепарата ЗАКЛЮЧЕНИЕ 99 ВЫВОДЫ 104 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
ДИД - двойная иммунодиффузия
ИПК - иммуннопероксидазный конъюгат ИФА - иммуно ферментный анализ МПА - мясопептонный агар
ОП493 - оптическая плотность при длине волны 493 нм
ПААГ - полиакриламидный гель
ПЭГ - полиэтиленгликоль
САН - сывороточный альбумин норки
А - иммуноглобулин класса А
О - иммуноглобулин класса О
М - иммуноглобулин класса М
ТУ - технические условия
ФС - фармакопейная статья
ФСП - фармакопейная статья предприятия
Введение Диссертация по биологии, на тему "Сравнительное изучение и прикладная биохимия иммуноглобулина G куньих"
Актуальность проблемы.
В 21 веке стало понятно, что 1014 клеток человеческого организма, в т.ч. организмы высших млекопитающих, представляют собой регулируемую биологическую систему, воспринимающую внеклеточные сигналы от лигандов белковой, пептидной или биоорганической природы. При этом белки-регуляторы как управляющие сигналы обладают множественной спецификой в отношении клеток-мишеней. Так, например, трансферрин помимо функции белка-переносчика имеет свойство фактора роста. Полагают, что практически всем белкам присущ такой множественный регуляторный эффект, за исключением антител [Зинченко с соавт., 2003]. С этих позиций актуальный интерес представляет международный исследовательский проект «Протеом плазмы крови». Наличие в составе плазмы от 3020 до 9504 индивидуальных белков позволяет рассматривать этот сложный коллоидный раствор как обобщенную многофакторную субстанцию, в которой только' иммуноглобулины имеют четко выраженную направленность в отношении чужеродной генетической информации [States D.J., et ciL, 2006; Omenn G S.,. 2006].
Изложенное выше имеет непосредственное отношение к прикладным исследованиям и научно-техническим разработкам биотехнологического характера. В частности, к описанию в объективных количественных критериях качества гемостатических, иммуноглобулиновых, комплексных, ферментных биопрепаратов, производство которых базируется на получении целевых белков из тканей и органов животных и человека. Отметим, что международный исследовательский проект «Протеом плазмы крови» касается, прежде всего, изучения структуры-функции и физиологической активности белков человека. В отдаленном будущем новые сведения о физиологической активности белков плазмы будут учитываться при проектировании технологий и соответствующих фармакопейных стандартов или технических условий. В настоящее время такого рода фундаментальной 5 информации нет. Из-за отсутствия основополагающей фактологии в фармакопейных стандартах либо ТУ вносятся разного рода неопределенности, касающиеся наличия примесных белков с неопределенными физиологическими свойствами. Например, в составе медицинских иммуноглобулинов допускается 2-3 белка не иммуноглобулиновой природы в качестве примесей. В иммуноглобулиновых препаратах ветеринарного назначения в описательной части ТУ допускается присутствие практически всех белков плазмы (сыворотки), включая альбумин.
В соответствии с содержанием ФС, ФСП и ТУ в части, касающейся требований, предъявляемых к белковому спектру иммуноглобулиновых биопрепаратов, можно выделить два научно-теоретических направления, обеспечивающих реальное качество прошлых и современных биотехнологических нововведений. Первое направление в современных условиях, по сути, нацелено на неопределенное расширение нормативно-технической (приборно-методической) базы с целью обеспечения, биологической безопасности иммуноглобулиновых биопрепаратов с гетерогенным электрофоретическим спектром примесных белков, имеющих неопределенные физиологические свойства. Второе направление целесообразного развития науки и научно-технических разработок в области Фарминдустрии базируется на создании принципиальных технологических схем, позволяющих производить гомогенные в электрофорезе субстанции целевых белков. Именно это направление науки и технологии позволяет совершенствовать прикладную биохимию для обеспечения биологической безопасности конечной продукции. Имеется в виду контролировать в составе биопрепаратов предельно-допустимые концентрации физиологически активных белков. Полагаем, что достаточно общая информация, согласно которой «целевой белок биопрепарата должен иметь надлежащий уровень очистки и нативную конформацию» необходимо в качестве требований заложить в ФС, ФСП и ТУ. Предлагаемая конкретика, по нашему мнению, должна сводиться к решению прикладных задач биохимии и разработке производственных технологий, позволяющих достигать хотя бы 80% уровня чистоты целевого белка. При наличии примесных белков в объеме не более 20% еще возможно адаптировать методы аналитической биохимии к выявлению в составе конечной продукции нежелательную физиологическую активность и совершенствовать прикладную составляющую биохимии технологических нововведений.
В информации фундаментального и прикладного характера обсуждается состав иммуноглобулиновых биопрепаратов, производимых промышленным способом из плазмы (сыворотки) крови человека и животных. На основании фундаментальных представлений о роли антител в элиминации бактерий в составе IgG полагают целесообразным присутствие IgM [Garbett et al., 1989; Werdan et al., 1996]. Структурно-функциональные особенности IgA и его присутствие в составе иммуноглобулиновых биопрепаратов также учитывается прикладной наукой при проектировании научно-технических нововведений в технологии фракционирования плазмы (сыворотки) крови* [Wadsworth et al., 1976]. Вместе с тем медицинской генетикой выявлены индивидуальные особенности, согласно которым в человеческой популяции всегда присутствуют отдельные индивидуумы, неспособные к биосинтезу IgA. В клинической практике такое генетическое своеобразие выявляется по биосинтезу антител, специфичных к IgA, после парэнтерального введения иммуноглобулина, в составе которого присутствует IgA [Eijkhout et al., 2003].
Известно, что олигомеры индивидуальных белков, в частности IgG, способны к активации системы комплемента [Boughton et al., 1990; Nachbaur et al., 1997]. Опубликован целый ряд работ о фракционировании плазмы с целью обеспечения инфекционной безопасности конечного продукта [Burnouf et al., 2000; Horowitz et al., 2004; Панов, 2004; Klein et al 2005]. Однако процессы инактивации инфекционных агентов, как правило, влияют на конформацию белка, что в конечном итоге выражается в олигомеризации и фрагментации молекулы IgG [ Hetherington et al., 1984; Le Moli et al., 1989]. С точки зрения экономических подходов актуальным вопросом является изучение возможности использования межвидовых субстанций IgG в клинической практике с минимизированным и нежелательным (антитело-индуцирующим) эффектом. К настоящему времени стало возможным компьютерно-аналитическое сопоставление нуклеотидных и аминокислотных последовательностей, кодирующих и составляющих IgG млекопитающих, в т.ч. на уровне выявление межвидовых особенностей их строения [Naumoff, 2005; Finn et al.,. 2006; Abhiman et al., 2006]. Однако для практической биохимии методы информатики имеют определенные ограничения. Во-первых, невозможно однозначно предсказать ориентацию экспонированных участков пептидных цепей IgG, поскольку проблематика фолдинга до настоящего времени не полностью раскрыта [Dill et al., 2007; Moore, 2007]. Во-вторых, при сопоставлении нуклеотидных последовательностей геномов не учитываются посттранскрипционные модификации и последствия, обусловленные белок-денатурирующим эффектом, присущим схемам выделения и очистки IgG. Следовательно, актуален прямой иммунохимический подход, позволяющий по совокупности эпитопов проводить сравнительный анализ видовых IgG. Очевидно также, что схема выделения образцов IgG должна обеспечивать препаративную наработку индивидуальных белков без использования агентов и приемов, обладающих денатурирующим эффектом.
С учетом изложенного, экспериментальная составляющая работы представлена нижеследующими взаимовложенными направлениями:
- получение электрофоретически гомогенных и хроматографически мономерных образцов видовых IgG для определения олигомеров и фрагментов целевого белка в составе иммуноглобулиновых биопрепаратов, производимых промышленными предприятиями России;
- создание схемы анализа видовых IgG для совершенствования научно-практических представлений об антигенных характеристиках белков, включая уровень иммунологического сходства близкородственных ^С; - совершенствование препаративной и аналитической биохимии для получения в заводских условиях с учетом требований производственного характера. Цель и задачи исследования.
Цель - изучить в сравнительном аспекте ^С куньих для разработки технологии производства иммуноглобулинового биопрепарата с надлежащим уровнем инфекционной и биологической безопасности.
В связи с поставленной целью решались следующие задачи:
- Разработать лабораторную схему получения электрофоретически гомогенных человека и животных без олигомеров и фрагментов для обеспечения контроля качества производственных серий иммуноглобулиновых биопрепаратов.
- Изготовить иммунореагенты и оптимизировать анализ для выявления антигенных свойств видовых 1^0, включая образцы из семейства куньих, и определения норки в составе технологических полупродуктов.
- Апробировать приемы дробного фракционирования плазмы крови норки в заводских условиях и создать принципиальную биохимическую основу для выпуска экспериментальных серий препарата «Иммуно Н». Научная новизна.
Разработаны оригинальные схемы выделения видовых 1^0 и условия их хранения с минимальным уровнем (до 3%) образования олигомерных форм индивидуальных белков.
Создана исследовательская схема для оценки антигенных свойств ^С близкородственных видов.
Определены приемы крупномасштабного фракционирования гемолизной плазмы (сыворотки), полученной из трупной крови норки, при которых сохраняется нативная конформация
Подобраны условия и определены концентрации риванола и каприловой кислоты, позволяющие проводить очистку 1§0 из полуфабриката, обогащенного целевым белком.
Отсутствие передачи вирусного начала в составе иммуноглобулинового биопрепарата «Иммуно Н» подтверждено клинико-лабораторными исследованиями экспериментальных серий, изготовленных из инфекционно-опасного сырья.
Практическая значимость.
Результаты исследований легли в основу разработки нормативно-технической и технологической документации на изготовление экспериментальных серий препарата «Иммуно И», ее согласование и утверждение в соответствии с порядком, действующим в Российской Федерации:
- технические условия (ТУ 9382-003-43683877-03) на препарат «Иммуно Н», 27 стр.;
- экспериментально-производственный регламент на технологию производства фармацевтического биопрепарата «Иммуно Н», №001515-0п, 300 стр.;
- наставление по применению препарата «Иммуно Н» для норок № 13-4-03/0692; № 001515-0п от 06.03.03 г., 2 стр.
На пилотный проект по производству экспериментальных серий препарата «Иммуно Н» был получен федеральный аттестат № 886 от 02.04.03 г. Из экспертного заключения ФГУ «Всероссийский государственный центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов» (ФГУ «ВГНКИ») следует, что по показателям качества экспериментальные серии препарата «Иммуно И» аналогов в России не имеют. Результаты проведенных исследований по разработке схем получения стандартизованных форм видовых иммуноглобулинов заложены в проект «Инструкции по изготовлению и контролю видовых ^О человека и животных». В настоящее время материалы и натуральные образцы проходят согласование и испытания в ФГУ «Всероссийский государственный центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов» (ФГУ «ВГНКИ»).
На предложенный способ хранения и получения ^в-обогащенной фракции для изготовления биопрепаратов крови выдан патент на изобретение №2338375 «Способ хранения плазмы или сыворотки крови для получения иммуноглобулиновых и альбуминовых биопрепаратов». Положения, выносимые на защиту:
- Разработка биохимических основ получения электрофоретически гомогенных форм ^О без олигомеров и фрагментов необходима для целесообразного развития нормативно-технической (приборно-методической) базы и обеспечения биологической безопасности иммуноглобулиновых биопрепаратов.
- Выявление уровня иммунологического сходства видовых ^О является основой для создания перспективной технологии производства гетерологичных иммуноглобулинов с надлежащим уровнем биосовместимости.
- Совершенствование подходов препаративной и аналитической биохимии в условиях крупномасштабного фракционирования плазмы (сыворотки) крови представляет собой одну из составляющих обеспечения инфекционной и биологической безопасности производства иммуноглобулиновых биопрепаратов.
Апробация работы.
Результаты исследований представлены на Региональной конференции биохимиков Урала, Поволжья и Западной Сибири, 20-21 сентября 2001 г., г. Ижевск; на Международной конференции «Биотехнология на рубеже тысячелетия», 12-15 сентября 2001 года, г. Саранск; на 5-ой Российской укиверситетско-академической научно-практической конференции, г. Ижевск, 2001 г.; на 6-ой Российской университетско-академической научно-практической конференции, г. Ижевск, 2003 г.; на II Евразийском конгрессе по медицинской физике и инженерии "Медицинская физика - 2005", г.
Москва, 2005 г.; на I съезде физиологов СНГ, г. Сочи, 2005 г.; на Международной конференции инженерного образования, 25-29 июля 2005 г., г. Гливиц (Польша); на II Всероссийском форуме «Здоровье нации - основа процветания России», г. Москва, 2006 г.; на Второй международной научно-практической конференции «Исследование, разработка и применение высоких технологий в промышленности», г. Санкт-Петербург, 2006 г.; на XIX Международной научно-технической конференции «Химические реактивы, реагенты и процессы малотоннажной химии», г. Уфа, 2006 г.; на Третьей международной научно-практической конференции «Исследование, разработка и применение высоких технологий в промышленности», г, Санкт-Петербург, 14-17 марта 2007 г.; на Четвертой международной научно-практической конференции «Исследование, разработка и применение высоких технологий в промышленности», г. Санкт-Петербург, 2-5 октября 2007 г.; на VI конференции иммунологов Урала, г. Ижевск, 2007 г.
Публикации результатов исследований.
По материалам диссертации опубликовано 10 работ. В соответствии с порядком, действующим в РФ, разработан, согласован и утвержден комплект нормативно-технической и технологической документации на производство экспериментальных серий иммуноглобулинового препарата нового поколения «Иммуно Н»: технические условия на препарат «Иммуно Н» (ТУ 9382-00343683877-03, 27 стр.), экспериментально-производственный регламент производства на препарат «Иммуно Н» (№001515-0п, 300 стр.) и наставление по применению препарата «Иммуно Н» (№ 13-4-03/0692; № 001515-0п, 2 стр.).
Структура и объем диссертационной работы.
Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов собственных исследований, обсуждения результатов, заключения, выводов и списка литературы. Работа изложена на 125 страницах, содержит 10 рисунков и 19 таблиц. Список
Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Кузнецов, Александр Иванович
выводы
1. Разработана универсальная схема получения электрофоретически гомогенного и хроматографически мономерного ^С человека и животных, основанная на осаждении ПЭГ 4000 с последующими 2 циклами анионообменной хроматографии на ДЕАЕ-целлюлозе и заключительной гель-хроматографией на сефадексе С-200.
2. Оптимизированы два варианта ИФА на основе прямого и прямого конкурентного методов для определения норки. Чувствительность прямого метода 9,8 нг/мл, прямого конкурентного 39,1 нг/мл. Определены уровни иммунологического сродства соболя и хорька, которые по отношению к норки в прямом методе ИФА составили 73% и 44%, а в прямом конкурентном 62% и 31%, соответственно.
3. Разработан способ хранения и получения 1§С-обогащенных фракций из плазмы (сыворотки) крови (патент №2338375) который заложен в основу постадийной схемы экстрагирования и дробного осаждения целевого белка с помощью риванола, три-н-бутилфосфата/(твин-80 или тритон X-100), каприловой кислоты и этанола. Результаты исследований апробированы в заводских условиях и являются основой технологических нововведений: ТУ 9382-003-43683877-03 на препарат «Иммуно Н», экспериментально-производственный регламент на технологию производства №001515-ОП; наставление по применению № 13-4-03/0692; №001515ЮП от 06.03.03 г.
4. Экспериментальная технология изготовления иммуноглобулинового биопрепарата позволяет получать из инфицированной вирусом алеутской болезни норок сырьевой заготовки конечный продукт, не обладающий способностью переноса вирусной инфекции.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
На основе анализа данных литературы и полученных экспериментальных результатов была создана схема получения и исследования стандартизованных форм видовых 1^0 и альбуминов. Разработан исследовательский подход изучения антигенных свойств видовых в т.ч. среди животных близкородственных видов из семейства куньих. Сравнительные характеристики иммунологического и иммунохимического сродства свидетельствуют об общих принципах антигенного строения норки, соболя и хорька. Однако в иммуноферментном анализе и, в частности, с помощью прямого конкурентного метода выявляются индивидуальные особенности антигенного строения 1^0, характерные для указанных зоологических видов. Фундаментальная наука (междисциплинарная область знаний, объемлющая достижения молекулярной биологии, физической, биоорганической химии, иммунологии и технологии эпитопного картирования белков) позволяет всего лишь обсуждать антигенные детерминанты с точки зрения их идентичности либо структурного подобия. Предлагаемые нами подходы выявляют «обобщенную гомологию антигенного строения» близкородственных видов ^О, которая выражается в численных значениях. Так уровень антигенного подобия ^С норки с соболя составляет 44-73%. Установленные нами различия позволяют утверждать, что иммуноглобулиновые биопрепараты, изготовленные из плазмы крови норки, при введении их в организм соболя будут вызывать нежелательный иммунный ответ. С аналогичных нежелательных позиций оцениваются нами потенциальные возможности индукции иммунной реакции в организме хорька. Уровень иммунологического сродства между 1§0 норки и ^О хорька составил 31-62%.
Для совершенствования теоретических воззрений эволюционной биохимии основной фактологической составляющей являются результаты секвенирования геномов и сопряженная биоинформатика. В нашем исследовании предлагается исследовательская схема для фрагментарного описания видовых и функционально аналогичных белков на уровне их иммунологического сродства. Такой подход имеет в т.ч. и прикладной характер, т.к. направлен на предсказание потенциально возможной реактогенности, свойственной гетерологичным биопрепаратам фармацевтического назначения. Именно разработка теоретических принципов препаративной и аналитической биохимии в рамках создания предметного задела в области фракционирования плазмы крови близкородственных видов для получения иммуноглобулиновых биопрепаратов требовала численной определенности для проектирования иммунологической совместимости ^С близкородственных видов, формирующих семейство куньих.
Очевидно также, что фракционирование плазмы крови возможно только при крупномасштабном получении боенской крови. Такое возможно в условиях концентрированного разведения животных и прежде всего в наиболее крупных хозяйствах, специализированных на получении пушнины норок. В сравнительном аспекте проблематика обеспечения инфекционной безопасности сырьевых заготовок животного происхождения носит принципиально неопределенный характер. Имеется в виду отсутствие оптимальной комбинации скрининговых тестов и сопряженных диагностических наборов для выявления вирус безопасных индивидуальных кроводач. Поэтому целесообразность научных исследований, направленных на обеспечение инфекционной безопасности наиболее актуально для фармацевтических биопрепаратов, изготовленных из сырья животного происхождения. С учетом изложенного наиболее приоритетным направлением исследований и разработок следует считать физико-химические приемы, инактивирующие инфекционные агенты в сложных по составу индивидуальных белков коллоидных растворов. Остается отметить, что методы инактивации вирусов в нативной плазме и в полупродуктах плазмы в т.ч. сопровождаются денатурацией целевых белков в составе конечных биопрепаратов.
В опубликованных исследованиях [Тегрв^а а1., 2006; ТеэсЬпег е1 а1., 2007] отмечалось, что обеспечение инфекционной безопасности биотехнологических продуктов обусловлено, по-видимому, комплексным эффектом, основанном и на инактивации вирусов и на удалении инфекционных вирусов из состава целевых белков, формирующих субстанцию фармацевтических биопрепаратов. В наших исследованиях мы исходили из возможности получения очищенной субстанции ^О норки и апробации сопряженного иммуноглобулинового биопрепарата («Иммуно Н», ТУ 9382-003-43683877-03), изготовленного из плазмы крови норок -вирусоносителей алеутской болезни. Предложенный нами принцип постадийного фракционирования плазмы основан на использовании химических реагентов, обладающих белок-денатурирующими свойствами: фенол, риванол, каприловая кислота, этанол. В предметно-конкретные задачи целесообразного развития препаративной и аналитической биохимии входило масштабирование фракционирования от 50 до 200 литров плазмы крови норок с целью получения субстанции и препарата «Иммуно Н», отвечающих ранее выдвинутым нам требованиям. В частности, белковый спектр иммуноглобулинового биопрепарата предлагается оценивать в электрофорезе в градиентном ПААГ с целью определения электрофоретической гомогенности целевого белка. Полагаем, что степень очистки в составе иммуноглобулиновых биопрепаратов является в т.ч. и показателем его инфекционной безопасности. Очевидно также, что такое направление развития прикладной биохимии обеспечивает и биологическую безопасность фармацевтических биопрепаратов, поскольку в составе минимизировано количество примесных белков с неопределенной физиологической активностью. В нашем понимании, потенциально возможная физиологическая активность неопределенных примесных белков является основой биологической опасности фармацевтических биопрепаратов. В фундаментальной биохимии не вызывает сомнений методологический стандарт, согласно которому исследуется максимально очищенная и хроматографически мономерная (конформационно нативная) форма индивидуального белка. В прикладной биохимии, касающейся разработки технологий производства фармацевтических биопрепаратов плазмы аналогичный стандарт заложен в систему контроля качества образцов производственных серий на наличие в них олигомеров и фрагментов целевого белка. Однако до настоящего времени отечественные научно-производственные объединения, задействованные в производстве биопрепаратов плазмы человека, не имеют стандартных образцов для контроля собственных серий иммуноглобулинов на наличие в них олигомеров и фрагментов. Полагаем, что лабораторная схема получения стандартизованных форм человека и животных может стать основой микротоннажной технологии производства стандартов для биотехнологических предприятий России. Отметим, что данное направление выполненных нами исследований является актуальной задачей в масштабах России, поскольку направлено на устранение в т.ч. антикомплементарной активности, индуцированной олигомерными формами В опубликованных нами материалах приводятся биохимические критерии качества серийных образцов иммуноглобулиновых и альбуминовых биопрепаратов отечественного производства. С методологических позиций современной биохимии можно утверждать, что исследование серийных образцов производственной продукции с целью определения, например, качества иммуноглобулиновых биопрепаратов по наиглавнейшим критериям их безопасности невозможно. Наличие в составе иммуноглобулиновых биопрепаратов до 8-12 примесных белков, выявленных нами при электрофорезе в ПААГ, не позволяет проектировать инфекционную безопасность серийной продукции. Наличие в составе серийных образцов все тех же примесных белков делает принципиально невозможной количественную оценку олигомеров и фрагментов в составе иммуноглобулиновых биопрепаратов. Полагаем, что для устранения инфекционной и биологической опасности биопрепаратов плазмы необходим избыток результатов фундаментальных исследований с надлежащим уровнем качества. В настоящем диссертационном исследовании получение безопасных форм иммуноглобулинов основано на создании технологии сравнения иммунологической совместимости близкородственных видов животных из семейства куньих с целью проектирования биотехнологических нововведений с учетом реактогенности гетерологичных субстанций. Второе взаимовложенное направление фундаментально ориентированных исследований касалось поведения белков в растворах белок-денатурирующих реагентов. В прикладных исследованиях нами подобраны конкретные условия, позволяющие выпускать иммуноглобулиновые биопрепараты, в которых степень чистоты не ниже 80%, а уровень олигомеризации индивидуальных молекул ^О не превышает - 15 % (по ТУ 9382-00343683877-03). Изложенные достижения позволили по разрешению ВГНКИ апробировать биохимические нововведения в технико-технологической и клинико-лабораторной практике. В частности, апробировались серии иммуноглобулинового биопрепарата «Иммуно Н», изготовленного из плазмы крови норок с идентифицированным носительством вируса алеутской болезни (семейство Парвовирусы (Рагуоутёае)), обладающей повышенной резистентностью к физико-химическим инактивирующим воздействиям. Его аналог - парвовирус человека - является одним из этиологических агентов гемотрансфузионной передачи вирусной инфекции с биопрепаратами плазмы [Воб а1., 1998; Маш et а1., 2007]. По предварительным данным, обобщенным на результатах клинико-лабораторных исследований 3000 норок-реципиентов, вирус алеутской болезни норок не передается препаратом «Иммуно Н» при его внутримышечном и внутрибрюшинном введении. Последнее обстоятельство мы оцениваем только с биохимических позиций. Полагаем, что очищенные формы менее инфекционны, в т.ч. позволяют производить серии иммуноглобулинов без нежелательной антикомплементарной активности.
Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Кузнецов, Александр Иванович, Ижевск
1. Баранов O.K. Эволюционная иммуногенетика сывороточных белков животных. Новосибирск.- Наука.- 1981.- 226 с.
2. Барсуков А. К. Стандартизация биопрепаратов крови / А.К. Барсуков, A.B. Бармин, Ф.М. Касимов, А.И. Кузнецов, О.Ю. Нестерова, Г.Н. Бурдов, А.Н. Панин, В.И. Смоленский, В.И. Уласов, B.JI. Свидерский, А.Е. Хованских // Ветеринария.- 2005.- №7.- С. 43-48.
3. Битюков И.П. Практикум по физиологии сельскохозяйственных животных / И.П. Битюков, В.Ф. Лысов, H.A. Сафонов // М.: Агропромиздат.- 1990. 256 с.
4. Бобровник С.А. Специфичные и неспецифичные взаимодействия антител и иммуноглобулинов с антигенами и способы анализа этих взаимодействий // Укр. 6ioxiM. журн,- 2004.- т.76.- №5.- С. 132-139.
5. Вербов В.Н. Принципы твердофазного иммуноферментного анализа / Твердофазный иммуноферментный анализ // Сб. научных трудов.- Л.-Изд. Института им. Пастера.-1988.- С. 3-27.
6. Войцеховский Б.Л. Математическая обработка результатов гетерогенного иммуноферментного анализа / Твердофазный иммуноферментный анализ // Сб. научных трудов.- Л.- Изд. Института им. Пастера.-1988.- С. 42-58.
7. Глин Л. Структура и функции антител. / Л. Глин, М. Стьюард // М.-Мир.- 1983.-200 с.
8. Гордиенко А.И. Взаимодействие хаотропно модифицированных иммуноглобулинов с белковыми и гликолипидными антигенами / А.И. Гордиенко, Н.В. Химич // Укр. 6ioxiM. журн,- 2006.- т. 78,- № 6.- С.78-85.
9. Джеске Д.Д. Иммуноглобулины: строение и функции / Д.Д. Джеске, Д.Д. Кепра//Иммунология.-М.- 1987.- т.1.- С. 204-254.
10. Дзантиев Б.Б. Современное состояние и перспективы развития иммуноферментного анализа / Б.Б. Дзантиев, A.M. Егоров // Журн. Всесоюз. хим. общ-ва им. Д.И. Менделеева.- 1982.- Т. 24.- №4,- С. 442449.
11. Егоров A.M. Теория и практика иммуноферментного анализа / A.M. Егоров, А.П. Осипов, Б.Б. Дзантиев, Е.М. Гаврилова // М.- Высш. шк.-1991.- 278 с.
12. Зинченко В.П., Долгачева Л.П. Внутриклеточная сигнализация. Пущино.- 2003.- 84 с.
13. Камышников B.C. Клинико-биохимическая лабораторная диагностика // в 2 т.- Минск.- Интерпрессервис.- 2003.- 958 с.
14. Кэтти Д. Антитела. Методы. / Д. Кэтти, Ч. Райкундалия, Дж. Браун,
15. H.Р. Линг, Д. Гордон, Ж. Арвие, А.Ф. Уильяме. Под ред. Д. Кэтти. // Кн.1.- М.-Мир.- 1991.287 с.
16. Макс Э.Э. Иммуноглобулины: молекулярная генетика // Иммунология.-М.- 1987.- т.1.- с. 255-312.
17. Остерман Л.А. Хроматография белков и нуклеиновых кислот. М.-Наука.- 1985,- 536 с.
18. Панов В. П. Принципы обеспечения вирусной безопасности продуктов крови (обзор). // Хим.-фарм. Журнал.- 2004.- т.38.- №3.- с. 39-47.
19. Петров Р.В. Иммунология и иммунохимия / Р.В. Петров, И.В. Березин // Журн. Всесоюз. хим. общ-ва им. Д.И. Менделеева.- 1982.- Т.24.- №4.-С. 362-368.
20. Пол У. Иммунология / в 3 т. под ред. У. Пола // М.- Мир,- 1989.- 1 292 с.
21. Ройт А. Иммунология / А. Ройт, Дж. Бростофф, Д. Мейл // М.- Мир.-2000.- 592 с.
22. Русанов В.М. Фракционирование белков плазмы в производстве препаратов крови / В.М. Русанов, Л.И. Скобелев // М.- Медицина.- 1983.223 с.
23. Русанов В.М. Лечебные препараты крови / В.М. Русанов, И. Левин // М.: Медпрактика, 2004. 284 с.
24. Самарцев М.А. Современное состояние патентных разработок в области твердофазного иммуноферментного анализа / М.А. Самарцев, Н.В. Беляков // Твердофазный иммуноферментный анализ.- Сб. научных трудов.- Л,- Изд. Института им. Пастера.-1988.- С. 28-41.
25. Скоупс Р. Методы очистки белков. М.: Мир.- 1985.- 358 с.
26. Сюрин В.М. Вирусные болезни животных / В.М. Сюрин, А.Я. Самуйленко, Б.В. Соловьев, Н.В. Фомина // Москва.- ВНИТИБП.- 1998.928 с.
27. Тукачинский С.Е. Физико-химические основы риванольного метода фракционирования белков // Биохимия.- 1961. т.26. - вып. 1. - с. 133136.
28. Фомичева И.И. Иммуноглобулины американской норки; генетика, экспрессия, эволюция / И.И. Фомичева, О.Ю. Волкова, Л.В. Мечетина, A.M. Наякшин // Новосибирск.- Наука.- 1991.- 160 с.
29. Христофоров B.C. Исследование структурно-функциональных свойств иммуноглобулинов G и их фрагментов методом 'Н-ЯМР / B.C.
30. Христофоров, В.П. Кутышенко, В.П. Завьялов // Биоорганическая химия.-1987.- т.13.- №11.- С. 1446-1464.
31. Чард Т. Радиоиммунологические методы // М.- Мир.- 1981.- 248 с.
32. Abhiman S. Prediction of function divergence in protein families using the substitution rate variation parameter alpha / S. Abhiman, C.O. Daub, E.L. Sonnhammer // Mol. Biol. Evol.- 2006.- V. 23.- №7.- P. 1406-1413.
33. Amzel L.M. The three dimensional structure of a combining region-ligand complex of immunoglobulin NEW at 3.5-A resolution / L.M. Amzel, R.J. Poljar, F. Saul, J.M. Varga, F.F. Richards // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.-1974.- V. 71.- №4.- P. 1427-1430.
34. Arouri A. Hydrophobic interactions are the driving force for the binding of peptide mimotopes and Staphylococcal protein A to recombinant human IgGl / A. Arouri, P. Garidel, W. Kliche, A. Blume // Eur. Biophys. J.- 2007.- V.36.-№6.-P. 647-660.
35. Benammar A. Genetic polymorphism of rabbit immunoglobulins: description of b98, a nineth allele at the к b-locus / A. Benammar, P.-A. Gazenave //Molec. Immunology.- 1982а,- V. 19.- №4.- P. 565-570.
36. Bertolini J. Purification of immunoglobulins / J. Bertolini, J. Davies, J. Wu, G. Coppola // WO 98/05686.
37. Black C.M. Cross-reactivity of 75 monoclonal antibodies to human immunoglobulin to sera of non-human primates / C.M. Black, J.S. McDougal, R.C. Holman, B.L. Evatt, C.B. Reimer //Immunol. Lett.- 1993.- V. 37.- № 2-3.-P. 207-213.
38. Bloom M.E. Characterization of Aleutian disease virus as a parvovirus / M.E. Bloom, R.E. Race, J.B. Wolfmbarger // J. Virol.- 1980.-V. 35.- №3.- P. 836-843.
39. Bloom M.E. Characterization of the Aleutian disease vims genome and its intracellular forms / M.E. Bloom, L.W. Mayer, C.F. Garon // J. Virol.- 1983.-V.45.-№3.- P. 977-984.
40. Blumel J. Inactivation of parvovirus B19 during pasteurization of human serum albumin / J. Blumel, I. Schmidt, H. Willkommen, J. Lower // Transfusion.-2002.-V. 42.- №8.- P. 1011-1018.
41. Blumel J. Parvovirus B19 transmission by heat-treated clotting factor concentrates / J. Blumel, I. Schmidt, W. Effenberger, H. Seitz, H. Willkommen, H.H. Brackmann, J. Lower, A.M. Eis-Hubinger // Transfusion.-2002.-V.42.-№ll.-P. 1473-1481.
42. Bos O.J. Virus validation of pH 4-treated human immunoglobulin products produced by the Cohn fractionation process / O.J. Bos, D.G. Sunye, C.E. Nieuweboer, F.A. van Engelenburg, H. Schuitemaker, J. Over // Biologicals.-1998,- V. 26.-P. 267-276.
43. Brezin C. Allotypes of the a series and their variants in rabbit immunoglobulins / C. Brezin, P.-A. Cazenave // An. Immunol. (Inst. Pasteur).-1976.- V. 127.- №3-4.- P. 333-346.
44. Buchacher A. Purification of intravenous immunoglobulin G from human plasma aspects of yield and virus safety / A. Buchacher, G. Iberer // Biotechnology Journal.- V.I.- №2.-P. 148-163.
45. Burnouf M. Reducing the risk of infection from plasma products: specific preventative strategies / M. Burnouf, M. Radosevich //Blood rev.- 2000.-V.14.-№2.- P. 94-110.
46. Burnouf T. Affinity chromatography in the industrial purification of plasma proteins for therapeutic use / T. Burnouf, M. Radosevich // J. Biochem. Biophys. Methods.- 2001.- V. 49.-№l-3.- P. 575-586.
47. Burnouf T. Assessment of viral inactivation during pH 3.3 pepsin digestion and caprylic acid treatment of antivenoms / T. Burnouf, F. Terpstra, G. Habib, S. Seddik //Biologicals.- 2007.- V.35.- №4.- P.329-334.
48. Burnouf T. Assessment of the viral safety of antivenoms fractionated from equine plasma / T. Burnouf, E. Griffiths, A. Padilla, S. Seddik, M.A. Stephano, J.-M. Guetierrez // Biologicals.- 2004.- V. 32.- P. 115-128.
49. Busch M.P. Current and emerging infectious risks of blood transfusions / M.P. Busch, S.H. Kleinman, G.J. Nemo // JAMA.- 2003.- V.289.- №8,- P. 959-962.
50. Butler J.E. Bovine immunoglobulins // Vet. Immuniology and Immunopathology.- 1983.- V. 4.- P. 43-152.
51. Chapman M.S. Structure, sequence, and function correlations among parvoviruses / M.S. Chapman, M.G. Rossmann // Virology.- 1993.- V.194.-№2.-P. 491-508.
52. Chen J. Comparison of standard and new generation hydrophobic interaction chromatography resins in the monoclonal antibody purification process / J. Chen, J. Tetrault, A. Ley // J. Chromatogr. A.- 2008.- V. 1177- №2.- P. 272281.
53. Chen K.C. Complete nucleotide sequence and genome organization of bovine parvovirus / K.C. Chen, B.C. Shull, E.A. Moses, M. Lederman, E.R. Stout, R.C. Bates // J. Virol.- 1986.- V. 60.- №3.- P. 1085-1097.
54. Chothia C. Genomic and structural aspects of protein evolution / C. Chothia, J. Gough // Biochem J.- 2009.- V. 419.- №1,- P. 15-28.
55. Colombo M. Transmission of non-A, non-B hepatitis by heat-treated factor VIII concentrate / M. Colombo, P.M. Mannucci, V. Carnelli, G.F. Savidge, C. Gazengel, K. Schimpf// Lancet.- 1985,- V.2.- P. 1-4.
56. Committee for Proprietary Medicinal Products (CPMP). Note for guidance on plasma-derived medicinal products // CPMP/BWP/269/95.- London: The European Agency for the Evaluation of Medicinal Products.-1998.
57. Corthier G. Improved method for IgG purification from various animal species by ion exchange chromatography / G. Corthier, E. Boschetti, J. Charley-Poulain // J. Immunol. Methods. 1984.- V.66.-№1.- P. 75-79.
58. Cotmore S.F. The autonomously replicating parvoviruses / S.F. Cotmore, P. Tattersall // Adv. Virus Res.- 1987.- V. 33.- P. 91-174.
59. Crispin M. Carbohydrate and domain architecture of an immature antibody glycoform exhibiting enhanced effector functions / M. Crispin, T.A. Bowden,
60. C.H. Coles, K. Harlos, A.R. Aricescu, D J. Harvey, D.I. Stuart, E.Y. Jones // J. Mol. Biol.- 2009.- V.387.- №5.- P. 1061-1066.
61. Deisenhofer J. Crystallographic refinement and atomic models of a human Fc fragment and its complex with fragment B of protein A from Staphylococcus aureus at 2.9- and 2.8-Ä resolution // Biochemistry.- 1981.-V.20.- №9.- P. 2361-2370.
62. Dieterle M. Microcalorimetric study of adsorption of human monoclonal antibodies on cation exchange chromatographic materials / M. Dieterle, T. Blaschke, H. Hasse // J. Chromatogr A.- 2008.- V.1205.- №1-2.- P. 1-9.
63. Dill K.A. The protein folding problem: when will it be solved? / K.A. Dill, S.B. Ozlcan , T.R. Weikl, J.D. Chodera, V.A. Voelz // Curr. Opin. Struct. Biol.- 2007,- V.17.- №3,- P. 342-346.
64. Dresser W.D. Immunization of experimental animals. / Immunochemistry.-Ed. D.M. Waire. London: Blackwell Scientific Publications.- 1986.- P. 8.7 -8.27.
65. Dry S. Allogroups rabbit Ig heavy chains / S. Dry, B.S. Kim, A. Gilman-Sachs // An. Immunol. (Inst. Pasteur).- 1974.- 125c.- №1-2.- P. 41-47.
66. Dyson H.J. Coupling of folding and binding for unstructured proteins / H.J. Dyson , P.E. Wright // Curr. Opin. Struct. Biol.- 2002.- V.12.- №1.- P. 54-60.
67. Eijkhout H.W. Substitution therapy in immunodeficient patients with anti-IgA antibodies or severe adverse reactions to previous immunoglobulin therapy / H.W. Eijkhout, P.J. Broek, J.W.M. Meer // Netherlands J. Med. -2003.-V. 61.-№6.-P. 213-217.
68. Ey P.L. Isolation of pure IgGl, IgG2a, and IgG2b immunoglobulins from mouse serum using protein A-sepharose / P.L. Ey, S. J. Prowse, C. R. Jenkin // Immunochemistry.- 1978.- V.15.- P. 429-436.
69. Feige M.J. Structure of the murine unglycosylated IgGl Fc fragment. / M.J. Feige, S. Nath, S.R. Catharino, D. Weinfurtner, S. Steinbacher, J. Buchner // J. Mol. Biol.- 2009,- V. 391.- №3.- P. 599-608.
70. Franek F. Purification of IgG monoclonal antibodies from ascetic fluid based on Rivanol precipitation // Methods in enzymology.- 1986.- N-Y: Acad. Press.-V.121.- P.631-638.
71. Friesen A. // Process for preparing purified immune globulin (IgG). 1986,-CA 1 201 063.
72. Fudenberg H.H. Overview: Allotypes //Handbook of experimental immunology.- Oxford: Blackwell Scientific Publications.- 1986.- V.3.: Genetics and molecular immunology.- P. 93.1-93.4.
73. Garbett N.D. Opsonic activity of a new intravenous immunoglobulin preparation: Pentaglobin compared with sandoglobulin / N.D. Garbett, C.S. Munro, PJ. Cole // Clin. Exp. Immunol.- 1989.- V.76.- №1,- P.8-12.
74. German Federal requirements ' 'Requirements of validation studies for demonstrating the virus safety of medicinal products derived from human blood plasma" (Bundesanzeiger № 84, Mai 1994).-1994.
75. Ghose S. Protein interactions in hydrophobic charge induction chromatography (HCIC) / S. Ghose, B. Hubbard, S.M. Cramer // Biotechnol. Prog.- 2005.- V.21.- №2.- P. 498-508.
76. Guidelines on viral inactivation and removal procedures intended to assure the viral safety of human blood plasma products. // WHO Technical Report, Series №. 924.- 2004. P. 151-219.
77. Gutman G. Structure and regulation of immunoglobulins: kappa allotypes in the rat have multiple amino-acid differences in the constant regions / G.
78. Gutman, E. Loh, L. Hood // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 1975.- V.72.- №> 12.-P.5046-5050.
79. Habeeb A.F. Preparation of human immunoglobulin by caprylic acid precipitation / A.F. Habeeb, R.D. Francis // Prep. Biochem.- 1984.- V.14.-№1.- P.1-17.
80. Hahn R. Bovine whey fractionation based on cation-exchange chromatography. / R. Hahn, P.M. Schulz, C. Schaupp, A. Jungbauer // j. Chromatogr. A.- 1998.- V.795.- №2.- P. 277-287.
81. Hale J.E. Purification of humanized murine and murine monoclonal antibodies using immobilized metal-affinity chromatography / J.E. Hale, O.E. Beidler // Anal. Biochem.- 1994.- V. 222.- №1.- P. 29-33.
82. Hamers-Casterman C., Loo W. Pronolagns: a lagomorph with d-locTis allotypic specificity / C. Hamers-Casterman, W. Loo // Archives Internat. Physiol. Biochimie.- 1979.- V. 87.- №1.- P. 181-182.
83. Harada S. Evaluation of production and characterization of monoclonal antibodies to human IgG of four subclasses / S. Harada, S. Nishimura, A. Saiga, S. Hosoi, H. Mikawa // Microbiol. Immunol.- 1989.- V.- 33.- №7.- P. 579-592.
84. Hao Y.L. Fractional Precipitation of Proteins with Polyethylene Clycol / Y.L. Hao, K.C. Ingham, M. Wickerhauser // Methods of Plasma Protein Fractionation. Ed. J.M. Curling.- 1980.- N.-Y.:Academic Press.- P. 57-70
85. Henzler-Wildman K.A. A hierarchy oftimescales in protein dynamics is linked to enzyme catalysis. / K.A. Henzler-Wildman, M. Lei, V. Thai, S.J. Kerns, M. Karplus, D. Kern // Nature.- 2007.- V.450. P. 913-916.
86. Hermanson G.T. Immobilized Affinity Ligand Techniques / G.T. Hermanson, A. K. Mallia, P. K. Smith // San Diego, CA: Academic Press.-1992.- 454 p.
87. Hetherington S.V. Opsonic activity of immunoglobulin prepared for intravenous use / S.V. Hetherington, G.S. Giebink // J. Lab. Clin. Med.- 1984-.-V.104, №6.- P. 977-86.
88. Holgate R.G. Circumventing immunogenicity in the development of therapeutic antibodies / R.G. Holgate, M.P. Baker // IDrugs.- 2009.- V. 12.-№4.- P. 233-237.
89. Horsjsi J. The isolation of gamma globulin from bloodserum by Rivanol / J. Horsjsi, R. Smetana//Acta Med. Scand.- 1956.- vol.155.- №1.- P.- 65-70.
90. Horowitz B. WHO Expert Committee on Biological Standardization / B. Horowitz, P. Minor, J.J. Morgenthaler, T. Burnouf, R. Mclntoch, A. Padilla, R. Trorpe., W.G. van Aken // World Health Organ Tech Rep Ser.- 2004.- №924.-P. 1-232.
91. Jendeberg L. The mechanism of binding staphylococcal protein A to immunoglobin G does not involve helix unwinding / L. Jendeberg, M. Tashiro, R. Tejero, B.A. Lyons, M. Uhlen, G.T. Montelione, B. Nilsson // Biochemistry.- 1996.- V.35.- №1.- P. 22-31.
92. Jerne N.K. Towards a Network Theory of the Immune System // An. Immunol. (Inst. Pasteur).- 1974.- 125c.- №1-2.- P. 373-389.
93. Kabat E.A. The structural basis of antibody complementarity // Adv. Protein Chem.- 1978.- V. 32.-P. 1-75.
94. Kabir S. Immunoglobulin purification by affinity chromatography using protein A mimetic ligands prepared by combinatorial chemical synthesis // Immunol. Invest- 2002.- V.31.- №3-4.- P. 263-278.
95. Kistler P. Ethanol precipitation / P. Kistler, H. Friedli // Methods of plasma protein fractionation.- ed. J.M. Curling.- Academic Press: New Yorlc.-1980.-P. 3-15.
96. Klein H.G. Pathogen inactivation technology: cleansing the blood supply // Journal of Internal Medicine.- 2005.- V.237.- №3.- P. 224-237.
97. Krapp S. Structural analysis of human IgG-Fc glycoforms reveals a correlation between glycosylation and structural integrity / S. Krapp, Y. Mimura, R. Jefferis, R. Huber, Sondermann // J. Mol. Biol.- 2003.- V. 325.-№5.- P. 979-989.
98. Le Moli S. Intravenous immunoglobulin preparations: a comparative in vitro study of Fc mediated functions /S. Le Moli, R. Nisini, A. Fattorossi, P.M. Matricardi, R. D'Amelio ¿¿J. Clin. Lab. Immunol.- 1989.- V.29.- №2.-P.79-84.
99. Lienqueo M.E. Current insights on protein behaviour in hydrophobic interaction chromatography / M.E. Lienqueo, A. Mahn, J.C. Salgado, J.A. Asenjo // J. Chromatogr. B. Analyt. Technol. Biomed. Life Sci.- 2007,- V. 849.- №1-2.- P.53-68.
100. Lindmark R. Binding of immunoglobulins to protein A and immunoglobulin levels in mammalian sera. / R. Lindmark, K. Thoren-Tolling, J. Sjoquist // J. Immunol. Meth.- 1983.- V.62.- P. 1-13.
101. Liu C.C. Protein evolution with an expanded genetic code / C.C. Liu, A.V. Mack, M.L. Tsao, J.H. Mills, H.S. Lee, H. Choe, M. Farzan, P.G. Schultz, V.V. Smider // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 2008.- V. 105.- №46.- P. 17688-17693.
102. Lôchelt M. A novel replicative form DNA of Aleutian disease virus: the covalently closed linear DNA of the parvoviruses / M. Lôchelt, H. Delius, O.R. Kaaden//J. Gen. Virol.- 1989.- V.70.- Pt 5.- P. 1105-1116.
103. Mage R. Immunoglobulin allotypes / R. Mage, R. Lieberman, M. Potter, W.D. Terry // The Antigens.- N.Y.: Acad. Press.- 1973.- V.I.- P. 299376.
104. Mage R. Rabbit immunoglobulin allotypes // Handbook of experimental immunology.- Oxford: Blackwell Scientific Publications.- 1986.-V.3: Genetics and molecular immunology.- P. 99.1-99.25.
105. Majidi J. Production and purification of polyclonal antibody against bovine immunoglobulins in rabbits / J. Majidi, J. Abdolalizadeh, M.B. Amirkhiz, S. Majidi //African Journal of Biotechnology.-2007.- Vol. 6.- №12.-P. 1369-1372.
106. Manchini G. Immunochemical quantitation of antigens bay single radial immunodiffusion / G. Manchini, A.O. Carbonara, J.F. Heremans // Immunochemistry.-1965.-№3.- P. 235-254.
107. Mani B. Molecular mechanism underlying B19 virus inactivation and comparison to other parvoviruses / B. Mani, M. Gerber, P. Lieby, N. Boschetti, C. Kempf, C. Ros // Transfusion.- 2007.- V.47.- №10.- P. 1765-1774.
108. Marchalonis J.J. Shared antigenic determinants of immunoglobulins in phylogeny and in comparison with T-cell receptors / J.J. Marchalonis, V.S. Hohman, H. Kaymaz, S.F. Schluter // Comp. Biochem. Physiol. B.- 1993.- V. 105.-№3-4.- P. 423-441.
109. Martin L.G. Serum antibodies against human albumin in critically ill and healthy dogs / L.G. Martin, T.Y. Luther, D.C. Alperin, J.M. Gay, S.A. Hines //J. Am. Vet. Med. Assoc.- 2008.- V. 232.- №7.- P. 1004-1009.
110. Mathews K.A. The therapeutic use of 25% human serum albumin in critically ill dogs and cats / K.A. Mathews // Vet. Clin. North. Am. Small. Anim. Pract.- 2008.- V. 38.- № 3.- P. 595-605.
111. McKinney M.M. A simple, non-chromatographic procedure to purify immunoglobulins from serum and ascites fluid / M.M. McKinney, A. Parkinson // J. Immunol. Methods.- 1987.- V.96.- №2,- P. 271-278.
112. Moore P. Let's call the whole thing off: Some thoughts on the Protein structure initiative // Structure.- 2007.- V.15.- P. 1350-1352.
113. Morahan G. An idiotypic determinant formed by both immunoglobulin constant and variable regions / G. Morahan, C. Berek, G.F. Miller//Nature.- 1983.- V.301.- №5902.- P. 720-722.
114. Montoya A. Long-term storage of peroxidase-labelled immunoglobulins for use in enzyme immunoassay // A. Montoya, J.V. Castell / J. Immunol. Methods.- 1987.- V.99.- № 1.- P. 13-20.
115. Gächter, M. Pichl, D. Niederwieser //Immunology.- 1997.- V.90.- №2.- P. 212-218.
116. Naumoff D.G. GH97 is a new family of glycoside hydrolases, which is related to the a-galactosidase superfamily // BMC Genomics.- 2005.- V.6.-P. 112.
117. Neurath A.R. Fraction of proteins with different isoelectric point by Rivanol. / A.R. Neurath, R. Brunner // Experientia.- 1969.- V. 25.- P.668-671.
118. Nübling C.M. Hepatitis C transmission associated with intravenous immunoglobulins / C.M. Nübling, H. Willkommen, J. Löwer // Lancet.- 1995.-V.345.-P. 1174.
119. Nygren P.A. Species-dependent binding of serum albumins to the streptococcal receptor protein G / P.A. Nygren, C. Ljungquist, H. Tromborg, K. Nustad, M. Uhlen // Eur. J. Biochem.- 1990.- V. 193.- №1.- P. 143-148.
120. Omar A. Virus inactivation by pepsin treatment at pH 4 of IgG solutions:factors affecting the rate of virus inactivation / A. Omar, C. Kempf, A. Immelmann, M. Rentsch, J J. Morgenthaler // Transfusion.- 1996.- V. 36.-№10.- P. 866-872.
121. Omenn G S. Strategies for plasma proteomic profiling of cancers // Proteomics.- 2006,- V.6.- №20. P. 5662-5673.
122. Pace C.N. How to measure and predict the molar absorption coefficient of a protein / C.N. Pace, F. Vajdos, L. Fee, G. Grimsley, T. Gray // Protein Sei.- 1995.- V. 4.- №11.- P. 2411-2423.
123. Ouchterlony O. Diffusion-in-gel methods for immunological analysis.II //Prog. Allergy.- 1962.- №6.- P. 30-154.
124. Papoian G.A. The physics and bioinformatics of binding and folding-an energy landscape perspective / G.A. Papoian, P.G. Wolynes // Biopolymers.- 2003.- V.68.- №3.- P. 333-349.
125. Parson M. Mouse immunoglobulin allotypes / M. Parson, L.A. Herzenberg, A.M. Stall, L.A. Herzenberg // Handbook of experimental immunology.- Oxford: Blackwell Scientific Publications.- 1986.- V.3: Genetics and molecular immunology.- P. 97.1-97.17.
126. PervushinK. Structure and dynamics of a molten globular enzyme / K. Pervushin, K.Vamvaca, B Vogeli, D. Hilvert // Nat. Struct. Mol. Biol.-2007.- V. 14.- №12.- P. 1202-1206.
127. Phillips A.P. The choice of methods for immunoglobulin IgG purification: yield and purity of antibody activity / A.P. Phillips, K.L. Martin, W.H. Horton // J. Immunol. Methods.- 1984.- V.74.- №2.- P. 385-393.
128. Pillonel J. Trends in residual risk of transfusiontransmitted viral infections (HIV, HCV, HBV) in France between 1992 and 2002 and impact of Nucleic Acid Testing / J. Pillonel, S. Laperche // Transfus. Clin. Biol.- 2004.-V. 11.-№2.-P. 81-86.
129. Poison A. The Fractionation of Protein Mixtures by Linear Polymers of High Molecular Weight / A. Poison, G.M. Potgieter, J.F. Largier, G.E.F. Mears, F.J. Jourbet // Biochim. Biophys. Acta.- 1964.- V. 82, P. 463-475.
130. Prince A.M. Inactivation of hepatitis B and Hutchinson strain non-A, non-B hepatitis viruses by exposure to Tween 80 and ether / A.M. Prince, B. Horowitz, B. Brotman, T. Huima, L. Richardson, M.C. van den Ende // Vox Sang.- 1984.- V.46.-№1.- P. 36-43.
131. Protein Purification. Handbook. 18-1132-29 / Ed. AC. Upsala.-Amersham Biosci.- 2001.- P. 11-25.
132. Requirements for the collection, processing and quality control of blood, blood components and plasma derivatives (Requirements for Biological Substances №. 27, revised 1992). II In: WHO Expert Committee on Biological
133. Standardization. Forty-third report. Geneva, World Health Organization.-1994.- Annex 2 (WHO Technical Report Series, № 840).- 99 p.
134. Rollag H. Viral safety of blood derivatives by immune neutralization / H. Rollag, B.G. Solheim, J.L. Svennevig // Vox Sang.- 1998.- V.74.- P. 213217.
135. Roux K.H. Direct demonstration of multiple VH allotopes on rabbit molecules: allotrope characteristics and Fab arm rotational flexibility revealed by immunoelectron microscopy // Europ. J. Immunol.- 1984a.- V. 14.- №5.- P. 459-464.
136. Roux K.H. Immunoelectron microscopic localization of idiotypes and allotypes on immunoglobulin molecules / K.H. Roux, D.W. Metzger // J. Immunol.- 1982.- V. 129.- №6.- P. 2548-2553.
137. Salier J.-P. Quantitative studies of Gm allotypes. IV. Quantitative variation Gml(3) antigenicity in relation to light chain type and Vk sub-group/ J.-P. Salier, C. Rivat, L. Rivat // Mol. Immunol.- 1980a.- V. 17.- №2.- P. 229235.
138. Schanfield M.S. Human immunoglobulin allotypes / M.S. Schanfield, E. Loghem //Handbook of experimental immunology.- Oxford: Blackwell Scientific Publications.- 1986.- V.3: Genetics and molecular immunology.- P. 94.1-94.18.
139. Schaub A. Self-reactivity in the dimeric intravenous immunoglobulin fraction / A. Schaub, S. Wymann, M. Heller, M. Ghielmetti, Z. Beleznay, B.M. Stadler, R. Bolli, S. Miescher // Ann. N.-Y. Acad. Sci.- 2007.- V.1110.- P. 681-693.
140. Schur P. Human gamma-g subclasses // Prog. Clin. Immunol.- 1972.-№1.-P. 71-104.
141. Sela M. Antibodies to sequential and conformational determinants / M. Sela, B. Shechter, J. Shechter, F. Borek // Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol.- 1967.- V. 32.- P. 537-545.
142. Shade R.O. Nucleotide sequence and genome organization of human parvovirus B19 isolated from the serum of a child during aplastic crisis / R. O. Shade, M.C. Blundell, S.F. Cotmore, P. Tattersall, C.R. Astell // J. Virol.-1986.- V.58. -№3.- P. 921-936.
143. Siegl, G. Biology and pathology of autonomous parvoviruses // The parvoviruses. Ed. K. I. Berns.-N.-Y.: Plenum Press, 1984.- P. 297-348.
144. Sisti A.M. Preparation of lyophilized and liquid intravenous immunoglobulin G: development and scale-up / A.M. Sisti, M.S. Vitali, M.J. Manfredi, J.A. Zarzur // Vox Sang.- 2001.- V. 80.- № 4.- P. 216-224.
145. Specht K. The role of DNA damage in PM2 viral inactivation by methylene blue photosensitization // Photochemistry and Photobiology.- 1994.-V.59.- №5.- P. 506-514.
146. Spiegelberg H.L. Biological activities of immunoglobulins of different classes and subclasses // Adv. Immunol.- 1974.- V. 19.- P. 259-294.
147. Stein A. Cation exchange chromatography in antibody purification: pH screening for optimised binding and HCP removal / A. Stein, A. Kiesewetter // J. Chromatogr. B. Analyt. Technol. Biomed. Life. Sci.- 2007.-V.848.- №1.- P. 151-158.
148. Steinbuch M. Protein Fractionation by Ammonium Sulphate, Rivanol and Caprylic Acid Precipitation. // Methods of Plasma Protein Fractionation. Ed. J.M. Curling.- 1980.-N.-Y.:Academic Press.- P. 32-36.
149. Strosberg A.D. Multiple amino acid sequence differences between rabbit kappa light chain of allotype b4, b6 and b9 / A.D. Strosberg, J. Janssens, R. Zeeuws // Fed. Proc.- 1976.- V.35.- №3.- P. 629.
150. Suomela H. An Ion Exchange Method for Immunoglobulin Production. // Methods of Plasma Protein Fractionation. Ed. J.M. Curling.-1980.- N.-Y.:Academic Press.- P. 107-116.
151. Tabel H. Immunoglobulins of mink. Evidence for five immunoglobulin classes of 7S type / H. Tabel, D.G. Ingram // Immunology.-1972.- V.22.-P. 933-942.
152. Tchernov A.A. Method for B-phycoerythrin purification from Porphyidium cruentum / A.A. Tchernov, K.M. Minkova, D.I. Georgiev, N.B. Houbavenska //Biotechnol. Tech. 1993.- V.7.- P. 853- 885.
153. Tegerani J. Amino acid sequence of the CH2 domain from various lagomorph IgGs / J. Tegerani, J.D. Capra, W.J. Mandy / /Mol. Immunol. 1982.- V.19.- №7.- P. 841-846.
154. Terpstra F.G. Viral safety of CI-inhibitor NF / F.G. Terpstra, ML Kleijn, A.H.L. Koenderman, J. Over, F.A.C. van Engelenburg, H. Schuitemaker, A.B. van't Wout // Biologicals.- 2007.- V.35.- №3.- P. 173-181.
155. Tijssen P. Practice and Theory of Enzyme Immunoassays. Amsterdam: Elsevier.- 1985.- 549 p.
156. Vermeer A.W. The thermal stability of immunoglobulin: unfolding and aggregation of a multi-domain protein / A.W. Vermeer, W. Norde // Biophys. J.- 2000.- V.78.- №1,- P. 394-404.
157. Verkhovsky O.A. Determination of cross-reactive (common) epitopes of animal and human immunoglobulins using monoclonal antibodies / O.A. Verkhovsky, Yu.N. Fedorov // Russian Journal of Immunology.- 1997.- V. 2. — № 1.- P. 24-28.
158. Wadsworth C. IgA in commercial gamma-globulin preparations / C. Wadsworth, L.A. Hanson // Scand. J. Immunol. 1976. - V.5.- № 1-2. - P. 15-22.
159. Wagner S.J. Differential sensitivities of viruses in red cells suspensions to methylene blue photosensitization / S.J. Wagner, D. Robinette, J. Storry, X.Y. Chen, J. Shumaker, L. Benade // Transfusion.- 1994.- V.34.-№6.- P. 521-526.
160. Werdan K. Supplemental immune globulins in sepsis: a critical appraisal / K. Werdan, G. Pilz // Clin. Exp. Lmmunol.- 1996.- V.104 (suppl. 1).- P. 83-90.
161. Yokoyama T. Removal of small non-enveloped viruses by nanofiltration / T. Yokoyama, K. Murai, T. Murozuka, A. Wakisaka, M. Tanifuji, N. Fujii, T. Tomono // Vox Sang.- 2004.- V. 86.- P. 225-229.
-
Кузнецов, Александр Иванович
-
кандидата биологических наук
-
Ижевск, 2009
-
ВАК 03.00.04
- Разработка технологии получения нового поколения иммуноглобулинов для терапии инфекционных и аутоиммунных заболеваний человека
- Разработка биотехнологической схемы получения препарата гетерологичного антирабического иммуноглобулина на основе F(ab`)2-фрагментов
- Разработка технологии лиофильного высушивания гетерологичного антирабического иммуноглобулина
- Разработка технологии приготовления сухих дозированных форм комплексного иммуноглобулинового препарата
- Технология получения и характеристика моноклональных антител к иммуноглобулинам классов G и М свиньи
