Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Сравнительное изучение действия N-нитрозометилмочевины и ряда пестицидов на генетическую активность дрожжей Saccharomyces cerevisiae

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Сравнительное изучение действия N-нитрозометилмочевины и ряда пестицидов на генетическую активность дрожжей Saccharomyces cerevisiae"

РГ6 од

2 3 ШО!^К'|®ШПИЯ НАУК РЕСПУБЛИКИ УЗБЕКИСТАН ИНСТИТУТ МИКРОБИОЛОГИИ

На правах рукописи ЯДГАРОВ Хаджиакбар Ташпулатович

УДК 579:233.43

СРАВНИТЕЛЬНОЕ ИЗУЧЕНИЕ ДЕЙСТВИЯ М-НИТРОЗОМЕТИЛМОЧЕВИНЫ И РЯДА ПЕСТИЦИДОВ НА ГЕНЕТИЧЕСКУЮ АКТИВНОСТЬ ДРОЖЖЕЙ 5АССНА1}ОМУСЕ5 СЕ1*ЕУ151АЕ

Специальность: 03.00.07 — микробиология 03.00.15 — генетика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

ТАШКЕНТ — 1993

Работа выполнена в Институте ядерной фклики АН России (г. Санкт-Петербург) и в Институте микробиологии АН Республики Узбекистан.

Научные руководители:

доктор биологических наук, профессор И. А. ЗАХАРОВ

кандидат биологических наук, старший научный сотрудник

Ш. МУСАЕВ

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, академик АН РУз

М. И. МАВЛАНИ

доктор биологических наук А. К. Э. ЭРГАШЕВ

Ведущая организация: кафедра низших растений и микробиологии Ташкентского Государственного университета.

Защита диссертации состоится /8 июня 1993 г. в « Р »

часов на заседании специализированного совета Д.015.02.21 по защите диссертаций па соискание ученой степени доктора наук в Институте микробиологии АН РУз (700128, г. Ташкент, ул. А. Кодырий, 7-Б).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института микробиологии АН РУз.

Автореферат разослан « » & Я 1993 г.

Ученый секретарь специализировадного совета, У

доктор биологических наук (¿^¿А^я^^уг?)К. САФИЯЗОВ

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. В .связи с интенсификацией выпуска целого ар-сенала химических соединений и, в частности, синтетического происхождения, возникла острая проблема оценки действия этих веществ на функционирование клеток и организмов.

Оценка мутагенной опасности химических соединений на высших организмах требует длительной работы и к тому же значительных материальных затрат. Поэтому для первичной характеристики мутагенности веществ необходимы такие тест-системы, которые позволяют быстро, достаточно точно и дешёво определять цутагенность исследуемого соединения.

Для определения мутагенности химических веществ н их скрининга, различными исследователями разработаны и использованы, ряд тест-систем: Saccharomycea cerevisiae (Захаров и др., 1979), Ealoonellв th,phimuriua (Ames, 1975), ТА 98, ТА 100, K.ooll WP2 , Веа.~А, Pol A Bridges et all. , I?73), Chlorella vulgariu (Мусаев, Ядгаров, 1984).

Перечисленные тест-системы позволяют учитывать не только пндунцкп генных нутаций, но и других генетических событий! цлтоплаэиатическчх мутаций, внутри- и межгенной рекомбинации, ютоткческого кроссинговера. Мутационная система, хорошо разработанная на осноЕв генов ade I и ade 2, способствовала..выяснению молекулярных механизмов мутагенеза при действии нитрозометил-мочевпны (НМ!<) и испытуемых пестицидов, а также'определить роль репарации в этом процессе.

Цель и задача исследования. Целью настоящей работы явилось сравнительное изучение действия нитрозометилмочевкин и ряда пестицидов на генетическую активность гаплоидных и диплоидных нталшов дрожжей ..Saccharomyces- cerevisiae р. таяяа некоторых других тест-систем.

В связи с этим в задачи работы входило:

- определение летального и мутагенного действия алкилирую-щэго агента НУЫ на штамм дрожжей EaccharomyceB cerevisiae^ чувствительный к ультрафиолетовым и рентгеновым лучам;

- выяснить природу цутаций на гаплоидных штаммах дронжей разной радиочувствительности (rad2, гad 54, хм-2) в локусе гена ade 2, индуцированных НИМ;

- изучение индукции митотического кроссинговера между геном mde 2 и его центромерой под действием НММ и ряда пестицидов, а также влияние мутаций rod 2 и rad 54 в этом процессе;

- проведение сравнительного изучения действия испытуемых пестицидов на различных тест-системах: Salmonella thyphimurium, E.coli, Chlorella.vulgaris, Saccharomyces cerevisiae.

Научная новизна и практическое значение работы. На радиочувствительных штаммах дрожжей Saccharomyces cerevisiae различной плоидности показано, что цутации rad 2, rad 54 и хгв 2 влияют на летальный, мутагенные и рекомбиногенные эффекты,индуцируемые нмм.

Охарактеризовано мутагенное действие НММ на системе прямых генных мутаций в локусах ade I и ade 2. В результате проведенных исследований было выяснено, что характерной чертой прямого мутагенеза на мутационной системе Saccharomyces cerevisiae является индукция НММ большого числа нечетких (leaky) мутантов, индуцирующих неполярно-комплементирующие, преимущественно одно-веронные мутации в локусе ade 2. На основании анализа ыежаллель-ной комплементации выявлено, что НММ в основном индуцирует точ-ковые мутации по типу замены пар оснований. Показано, что мик-росомальная активирующая фракция S-9 на дрожжах Saccharonyceß cerevisiae не' оказывает влияния на генетическую активность испытанных препаратов. .

Впервые предпринята попытка определения мутагенного эффекта пестицидов и НММ на тест-системах с различным уровнем организации. Пестициды: бутифос, бутилкаптакс, кельтан, тиодан, гидрель обладают инактивирующим действием на штаммы, несущие мутации с различными путями репарации. Было выявлено также, что НММ, гидрель, тиодан, кельтан индуцируют генные и цитоплазматические мутации с высокой частотой.

Установлено, что частота индукции митотического кроссинговера, вызываемого бутифосом, бутилкаптаксом,_ ТХФМ,. гидрелем ыожет быть сравнима с частотой индукции,вызываемой НММ.

На основании полученных данных, тест-система Saccharomyces cerevisiae может быть рекомендована для определения генетической активности применяемых в республике различных пестицидов, а также целого ряда других химических соединений,обладающих м/та-геккык действием на здоровье человека.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

•I. Влияние цутаций радиочувствительности на летальные и мутагенные эффекты НММ

4

В экспериментах по изучению летального и мутагенного действия НММ, были использованы радиочувствительные мутанты rad 2, дефектный по эксцизионноцу пути репарации, rad 54 и хгв 2 дефектные, по-видимому» по пострепликативной репарации. Наиболее чувствительным к летальному действии НММ оказался штамм хгв 2. Штамм rad 54 оказался более чувствительным к летальноц/ действии НММ только при малых экспозициях обработки мутагеном (до 30 минут) (табл. 3).

Таблица 3

Частота мутаций ade", индуцированных НММ, в -зависимости от. времени воздействия мутагена -

Гаплоидные¡Время обра-¡Количество!Частота цутаций!Выживаемость, штаммы ботки мута- просмотре- мя тл4 „п %. дрожжей геном, (мин) иных колон _;_

15В-П4 10 294350 5,90+2,88 70,47+10,44

30 207582 18,80+3,52 32,95+9,75

90 271500 16,00+3,15 9,58+2,54

150 ' 268537 13,37+3,78 Z,BUp,77

rad 2 10 239313 5,81+2,88 67,13+10,27

30 162538 12,45+4,75 ' 31,02+6,03

90 •173270 9,54+3,31 8,68+2,47

150 254280 4,15+2,33 2,00+р,40.

rad yv 10 153049 5,47+2,50 55,09+2,45

30 164380 10,68+5,20 17,38+3,79

90 I5I283 6,27+3,69 5,48+2,24

150 228540 6,27+1,69 1,41+0,35

хгв 2 10 • 162392 5,43+2,99 43,18+3,32

30 I588I4 8,30+1,11 12,39+2,67

90 179836 б, 07+4,30 1,50+0,27

150 160925 5,88+2,22 0,57+0,21

Трудно объясним факт устойчивости штамма га(1 54 при более высоких дозах НММ, поскольку известны данные о перекрестной чув-

ствительности рентгенчувствительных 1^тантов к другому монофункциональному алкилирующецу соединению - метилметансульфонату (ММС (Zimmermann, 1968). Мутант гаа 2 по чувствительности к летально^ действию НММ не отличается от контроля 15В-П4. Полученные результаты указывают на то, что: I) эксцизионная репарация не принимает участия в ликвидации летальных повреждений, индуцированных 1Ш; 2) отдельные этапы пострепликативной репарации, контролируемые генами rad 54 и хгв 2, могут участвовать в этом процессе.

В табл. 3 представлены также данные по изучению влияния мутаций радиочувствительности в процессе, индуцированном НММ. Результаты исследований показали, что »мутанты rad 2, rad 54 и xrs2 по сравнению со штаммом 15В-П4 характеризовались пониженной частотой стаций, особенно при высоких дозах НММ. По-видимому, нормальный продукт генов räd 2, rad 54 и хгв 2 необходим для возникновения мутаций аденинзависимости, иццуцируемых НММ, а пути репарации, блокируемые этими генами, принимают участие в НШ-индуцированном мутагенезе.

2. Природа мутаций,индуцированных НММ

Особый интерес представляет изучение механизмов действия НММ на радиочувствительные штаммы дрожжей гай 2, rad54, хгв 2 в локусе генаем/г.С (этой целью был использован метод межаялель-ной комплементации. Распределение НММ-индуцированных мутаций по генам ade I и ade 2 и мутаций в локусе ade 2 по группам комплементации у. радиочувствительных штаммов дрожжей представлены в

iCC/Iü^iS 1

Распределение ШШ-гндддгрозазнх! к?тацкй по гена?, ade 1 и ade 2

ШтаммШроана-!Число! Мутации 'Классы комплементации кутаний, $

лизиро-вано мутантов нтпп" ade1! ade2! комплемен-тирующие ■ !полярно-ком-плементирую-шиё !некомпле ментирух щие

15В-П4 140 11,4 25,0 75,0 86,7 2,8 10,5

124 16,9 16,9 83,1 87,4 5,8 6,8

ioa 8,0 19,4 80,6 80,5 9,2 10,3

112 12,5 24,4 75,6 64,7 20,5 14,8

У всех изучаемых штаммов мутации в локусе ade 2 возникали в 3-4 раза чаще, чем в локусе ade I, по частоте lesky-цутаций, т.е. мутаций с неполным блоком синтеза аденина, мутанты достоверно не отличались от дикого типа. По характеру комплементации в локусе ade2 все исследуемые стации можно разделить на три класса: комплементирующие (возникают только за счет замен пар оснований ДНК), к заменам пар оснований могут быть отнесены и все leaky-мутации, полярно-комплемёнтирующие и нвкомплементирующие (возникают за счет как замен, так и вставок, выпаданий пар оснований). Из приведенных в табл. 4 данных следует, что НШ индуцирует у всех штаммов в основном комплементирующие мутации (75-80%), Только у штамма хгв 2 частота их была несколько ниже - 64,7По частоте некомплементирующих стаций различий между штаммами не наблюдалось, а частота полярно комплементирующих мутаций у штамма ъас/2 была немного повышена.

Полученные результаты дают основание полагать, что НШ в основном у изученных нами штаммов индуцирует мутации типа замен пар оснований, а мутации радиочувствительности практически не оказывают существенного влияния на природу индуцированных НММ мутаций в локусе ade 2. Таким образом, алкилирующий агент НММ у использованных нами радиочувствительных гаплоидных штаммов, дрожжей Saccharonyces cerevisiae в основном индуцирует МУТации В локусе ade 2.

3. Индукция НММ митотической сегрегации и митотического кроссинговера у.диплоида дикого типа ПГ-154 и диплоида ПГ-157, г'омозиготного по мутации rad 54

Изучение индукции митотической сегрегации и кроссинговера на участке гена ade 2 и его центромерой у диплоидных штаммов 'разной радиочувствительности мы проводили на специально сконструированных диплоидных штаммах ПГ-154 (TI) и ПГ-157 (Т2) (Захаров и др., 1979). Митотический кроссинговер на участке ХУ хромосомы между центромерой и локусом ade 2 приводил к появлению двух сестринских ядер: одного гомозиготного - по ь^тации ade 2-192 и другого - по мутации ade 2 g-45. Первая мутация в гомозиготе вызывала появление красной окраски колоний, а вторая - розовой. В результате митотического кроссинговера появляются колонии, имеющие д]за близнецовых сектора - красный и розовый. Если крое-

Таблица .5

Индукция НММ митотической сегрегации и митотического кроссинговера у

диплоида дикого типа ПГ-154 (Т1) и дигатоида, гомозиготного по цутации га<154, ПГ-157 (Т1)

Штаммы 'Доза НММ,'Вылива-!Всего просмот-!Целые красные!Секторные красно-!Секторные!Всего сег-% емость» рено колоний и розовые белые и розово- красно- регантных '% белые розовые и колоний

--------—: ,------- красно-ро-

_;_зово-белые_-

ПГ-154 К 100,0 3227

0

27

158

177

108

.0 .

84

405

191

90

2 (0,06) 2 (0,06) 70 (0,65) 181 (1,68) 117 (0,99) 680 (5,78) 56 (1,02) 424 (7,78) 48 (1,08) 246 (5,53)

0,01 72,0 . 10747

0,05 43,0 11764

0,10 14,7 5490

0,20 4,9 4447

оэ

ПГ-157 К 100,0 ' 2151

II 33 44 49 54

7

35 64 29 23

3 (0,14) 21 (0,98)

14 (0,26) 82 (1,50)

10 (0,21) 118 (2,46)

6 (0,19) 84 (2,77)

9 (0,37) 86 (3,55)

0,001 62,7 5460

0,010 - 22,8 - 4791

0,050 . 5,0 3032

0,100 .0,5 2421

Примечание: в скобках представлены проценты от общего числа просмотренных колоний

синговер имел место при втором, после мутагенной обработки, клеточном делении, то возникали трехцветные колонии, состоящие, из белого, красного и розового секторов. Появление цельных красных или розовых колоний или одноцветных секторов является следстви- . ем либо митотического кроссинговера при гибели одной из кроссин-говерных нлеток, либо объясняется другими генетическими событиями, приводящими к митотической сегрегации. Митотический нрос-синговер индуцировался НММ у штамма дикого типа и составлял л*

общей митотической сегрегации, следовательно, остальные 86$ сегрегантов возникали за счёт разнообразных событий, упомянутых нами ранее. Частота сегрегации у штамма ПГ-157, гомозиготного по цутации rad 54, значительно понижена, а кроссинговер практически не индуцировался (табл. 5). Таким образом, мутация rad. 54 обнаруживает свойства гес~ в отношении рекомбинации, индуцированной НММ.

4. Генетические активности пестицидов на дрожжевой тест-системе ЗаосЬаготусев cerevisiae

В настоящем разделе приводятся результаты исследований по испытанию (выявлению влияния на генетическую активность) ряда пестицидов: кельтана, тиодана, бутифоса, бутилкаптакса, фентиу-рама и его составных частей, а также гидреля на гаплоидном штамме 15В-П4, rad 2 и диплоидных штаммах TI, Т2.

Индукцию митотического кроссинговера между геном ade 2 и его центромерой определяли.на диплоидных штаммах TI и Т2.

В табл.б представлены данные по определению влияния бутйфоса и бутилкаптакса на генетическую активность гаплоидных штаммов 15В-П4 и rad 2.

Таблица 6

Мутагенные эффекты бутифоса и бутилкаптакса на гаплоидных штаммах дрожжей Baccharomyces cerevisiae 15В-П4 И rad 2

Штаммы! Препарат !Концен- fBpeiiH Г Мутации ! Выжив а-

трация, обработки час !ауксо- !с дыхат. • трофные недост. ! теш. емЗсть чувс. /0 мутац

15В-П4 бутифос 0,1 4 5,33 6,53 3,79 2,10

15В-П4 бутилкалтакс 0,1 4 3,44 20,62 15,98 2,75

rad 2 бутифос 0,1 4 9,97 32,50 27,40 2,27

rad 2 бутилкалтакс 0,1 4 ' 7',20 28,30 20,30 1,97

15В-П4 та (контволь)ОЛ 4 3.30 27,70 19,50 0,90

/Из да»tux таблицы видно, что бутифос на штаммах 15В-П4 и rad 2 индуцирует ауксотрофные ц/тации больше, чем НММ.'Заметно снижены у штамма 15В-П4 и индукция мутаций с дыхательной недостаточностью (6,53) и, что еще, под'действием бутифоса и бутил-каптакса, заметно и влияние мутации red 2 на индукцию ауксотроф-шх и цитоплаэматических цутаций - 9,97 (бутифос) и 7,20 (бу-тилкаптакс) , превосходящих контрольный вариант штамма 15В-П4 в 2-3 раза, что свидетельствовало о высокой генетической активности испытуемых пестицидов бутифоса и бутилкаптакса.

Эти же пестициды были испытаны наш на индукцию митотичес-кого кроссинговера мевду геном ode 2 и его центромерой, также на диплоидных штаммах TI и Т2. Данные проведенных исследований сведены в табл. 7.

Представленные данные указывают на то, что штамм Т2 весьма чувствителен к действию бутифоса и индуцирует митотический крос-сингокер при всех испытанных нами концентрациях - от 0,1 до 0,001;?. Наиболее шсокая частота ющукции митотического кроссинговера между геном sde 2 и его центромерой была отмечена d случае, когда концентрация пестицида составляла 0,1%. Причем, по мора понижения концентрации бутифоса снижалась, соответственно, и частота индукции митотического кроссинговера (0,76). Другой характер взаимоотношений концентрации и частоты индукции бил отмечен но&н для штамма дрожкей Т2. Частота шздукции митотического кроссинговера, в данном случао была максимальной при низких концентрациях пестицида и.с увеличением концентрации препарата наблюдается снижение частоты индукции митотического кроссинговера.

Аналогичные донные были получены тшгке и при испытании другого дефолианта - бутилкаптакса. Для штамма дрояжей TI, максимальная частота "митотического кроссинговера (5,41) отмечена ч случао, когда концентрация препарата соответствовала 0,1%, в то время к ait та не частота митоигаеского кроссинговера для штамма Т2 тела обратный характер взаимоотношений, т.е. низкие концентрация (0,001$) вызывали более высокую частоту кроссинговера (2,22).

Результаты исследований показали также, что мутация в генз rod 54 штамма Т2 влияет на частоту митотического кроссинговера ;; 1:мге? непосредственное отношение к летальному эффекту.

Таблица ?

Индукция митотичсского кроссинговера под действием бутифоса и бутилкалтакса на диплоидных штаммах дрожжей Saicc^tcmyees1 cieevthat TI и Т2

Штп; ^.^Концентрация, cf t ) !Выживаемость, cf .'Количество! проверенных колоний целые: красные, розовые Колонии !секторные:красно-розо вые, красно-розовые-белые ¡Количество сегрегантньв "колоний

бутифос

TI Контроль 100 III60 - - -

0,1 1,02 6007 . 96 (1,59) 21 (0,34) 117 (1,94)

0,01 20,50 9950 • 90 (0,90) 24 (0,24) 114 (1,14)

0,001 78,91 10050 61 (0,60) 16 (0,15) 77 (0,76)

Т2 Контроль 100 13070 - - -

0,1 0,25 23375 168 (0,71) 35 (0,14) 203 (0,86:

0,01 14,30 15540 118 (0,75) •69 (0,44) 187 (1,20)

0,001 57,54 17084 НО (0,64) 79 (0,46) 189 (1,10)

бутилкаптакс

TI Контроль 100 I4I686 - - • -

0,1 3,25 1238 60 (4,84) 7 (0,57) 67. (5,41)

0,Р1 40,30 9367 161 (1,72) 9 (0,10) ' 170 (1,81)

0,001 95,10 8331 134 (1,61) 13 (0,16) 147 (1,76)

Т2 Контроль 100 158950 - - -

0,1 1,25 50692 ' 158 (0,31) 14 (0,03) 172 (0,34)

0,01 29,30 6983 150 (2,14) 12 (0,17) 162 (2,32)

0,001 79,10 7080 146 (2,06) II (0,16) 157 (2,22)

Примечание: в скобках - частота индукции митотичсского кроссинговера и обцей сегрегации, в процентах.

Таким образом, мутация rad 54 препятствует'восстановлению летальных повреждений под действием пестицидов и повышает частоту митотического кроссинговера.

Другой представитель класса пестицидов - кельтан, используемый в сельском хозяйстве в качестве протравителя, проявил себя в качестве мощного ингибитора роста дрожжей Saccharomyceo• cereviBiae (табл. 8). Уже незначительные концентрации кельтана (0,001%) приводили к падению выживаемости штаммов дрожжей TI и Т2. Пороговая доза кельтана на выживаемость дрожжей в обоих случаях составляла менее 1%.

Таким образом, кельтан на штамме Т2 не индуцирует митотичес-' кий кроссинговер между геном ade 2 и его центромерой, лишь незначительная индукция митотического кроссинговера наблюдалась на штамме TI (0,81).

Способность индуцировать митотический кроссинговер и общую сегрегацию между геном ade 2 и его центромерой характерно и для гидреля. Данные по действию гидреля на диплоидные штаммы дрожжей представлены также в табл. 8. Tait, штамм TI под действием гидреля индуцировал митотический кроссинговер с частотой индукции общей ыитотической сегрегации, равной 1,29% (в пересчете на количество клеток выживших после обработки гидрелем), в то время как штамм Т2, при концентрации препарата,равного 0,1!? индуцировал с высокой частотой (6,30) митотический кроссинговер и общую сегрегацию.

Следующим препаратом для изучения генетических эффектов, являлся фентиурам, широко пременяемый для замачивания■семян хлопчатника в предпосевной обработке. Препарат фентиурама состоит из 3-х активных компонентов: трихлорфенолята меди (ТХФМ) - 10%, тетраметилтиурамдисульфида (ТМТД) - 40%, гексохлорцикло-гексана (ГХЦГ) - 20% и каолина. В этой связи одной из целей исследований • являлось выяснение роли отдельных компонентов препарата в ицдукции митотического кроссинговера на диплоидных штаммах TI и Т2. Опыты показали, что лишь-один из компонентов фентиурама - ТХФМ проявлял значительную индукцию митотического кроссинговера 1,02% (табл. 9).

Препарат при высоких концентрациях индуцировал митотический кроссинговер между геном ade 2 и его центромерой, при этом мутация rad 54 влияла на летальные эффекты и препятствовала вое-

Таблица 8

Частота индукции общей ыитотичвской сегрегации и ыитотичёского кроссинговера у диплоидных штаммов дрокжей БаосЬаг<?шуоеБ сегеу1г1ае| - ТI и Т2 под воздействием гидреля и кельтана

Штаымы!Концен-!Выживае-!Количество про-!Целые красно-!Секторше красно-белые!Всего сегрегантных трация, мость, % смотренных-ко- . розовые и розово-белые . колоний

% ЛОНШ _____

кельтан

Т1 ■ Контроль 100 28350 - - -

0,1 0,96 8300 ■ б (0,07) - -

0,01 8,93 20548 ■ 15 (0,72) I (0,01) 6 (0,07)

0,001 60,05 21223 15 (0,71) 2 (0,09) 17 (0,81)

Т2 Контроль 100 48750 - - <

0,1 0,76 8376 6,(0,07) 2 (0,02) 8 (0,09)

• 0,01 11,85 68,16 10 (0,15) 2 (0,02) 12 (0,Г7)

0,001 47,95 11342 9 (0,08) 3 (0,02) 12 (0,10)

гидрель

Т1 Контроль 100 1363 - - -

0,1 20,02 5577 52 (0,93) 20 (0,93) 72 (1,29)

0,01 60,70 2552 10 (0,39) 7 (0,27) 17 (0,66)

0,001 97,35 1708 I (0,06) I (С,96)

Т2 Контроль 100 1640 - -

0,1 61,92 3558 147 (4,13) 77 (2,16) 224 (6,30)

0,01 . 80,48 2902 12 (0,41) 7 (0,24) 20 (0,68)

0,001 98,83 2497 4 "(О'.Т'бГ 2 (0.04) 6 (0,24)

Примечание: в скобках - частота индукции митотичзского кроссинговера и общей сегрегации, %.

Таблица 9

Частота индукции о^зй сегрегации и митотического кроссинговера у диплоидных штаммов дрогшей ¡>а(сКихстун{ сшиио* Т1 и Т2 под воздействием тиодана к ТХ2М

Птпмш^Концентрагля, Шыготвас-Жоличёствз Шелые красно-! Секторные красно-!Всего сегрегантдах

% мость, проверенных розовые розовые и розово- колоний _ %_коло/ГИЙ _красно-беляв_

ТХН.1

Т1 Контроль 100 1640 - - -

0,1 5,70 1езб 4 (0,21) 4 (0,21) 8 (0,43)

0,01 40,1 1328 6 (0,45) 5 (0,37) II (0,92)

0,001 77,7 1745 5 СО,27) 7 (0,38) 12 (0,61)

Т2 Контроль 100 . 1159 - - -

0,1 2,95 1193 4 (0,34) 5 (0,43) 9 (0,77)

0,01 30,66 1150 4 (0,33) 6 (0,50) 10 (0,83)

0,001 47,75 13С5 9 (0,65) с. (0,36) 14 (1,02)

издан -

•ТТ Контроль 100 35000 - - -

I О *эо О , Ои 3778 24 (0,63) т 1 (0,02) 25 (0,65)

0,1 25,56 18591 46 (0,24) 2 (0,01) 48 (0,25)

0,01 45,30 22870 69 (0.30) 2 (0,008) 71 (0,31)

0,001 90,8 22300 30 (0,13) I (0,004) 31 (0,13)

Т2 Контроль 100 40000 - - -

I 1,73 5210 3 (0,05) - 3 (0,05)

0,1 19,48 10691 6 (0,05) Г О (0,04) II (0,10)

0,01 49,И 15330 32 (0,22) I (0,006) 33 (0,21)

о.оот 67,59 4590 10 (0.21) I (0.02) II (0.23)

Примечание: в скобках - частота индукции митои<ческого кроссинговера и общей сегрегации, %.

становлению повреждений в ДНК. В свою очередь, ТХФМ на штамме Т2 индуцировал частоту общей сегрегации до 1,02 и, соответственно, на TI - 0,61.

В табл. 9 представлены также данные по испытанию еще одного пестицида тиодана на лццукцию митотического кроссинговера. Лишь высокие концентрации тиодана (0,1 и 1%) индуцировали на штамме TI митотический кроссинговер (0,66).

5. Определение действия пестицидов на генетическую активность бактериальных тест-систем

Тест-система Эймса (Атез, 1975) была, пожалуй, одной из первых, которая была использована для оценки и регистрации различных генетических событий происходящих в клетках 8а1воп®11я fchyphimnriura . Со временем были разработаны и получили признание тест-системы иа основе В. coli и дрожжей - ВассЬаготусапс.свгэ-viniap. Различный уровень клеточной организации перечисленных микроорганизмов позволяет учитывать на них широкий спектр разнообразных мутаций под воздействием химических соединений.

Сравнительный итаиз природы мутагенного действия пестицидов на различных тест-системах: Snlnonella thyphimurium, ,Е„ coli , Chlorella vulgaris и стали одним из предметов настоящих исследований. Результаты проведенных исследований на тест-системе Эймса (табл. 10) с использованием штаммов ТА 98, ТА 100 СаХлгпеНа thyphiourium . показали, что испытуемый препарат фен-тцурама полностью подавляет рост бактериальных клеток и обладает слабой цутагенной активностью. Составные части фецтиурама -TXJi' и ТЬГГД проявляли также слабую цутагенную активность при всех испытанных концентрациях. Мутагенная активность фептиурп-а не была увеличена при активации глпфосомальныш ферментами печени крыс (фракция S-9). Полученные данные Указывали на то, что генетическая активность испытанных пестгаидов и его аналогов зависела лшь от глгпгческой структуры препарата и не зависела от активации ферментам"; микросомальной фракции S-9. При сравнении степени f^/тагенного эффекта фентиурама и его составных частей было обнаружено, что ТМТД на тест-системах Salmonella thyphi-nuriua ТА 98 и ТА 100, обладал более сильным мутагенным действием, чем фентиурам. Препарат ТМТД обладал ДНК-повреудающим

действием. Наиболее значительным цутагенным эффектом, в ряду составных компонентов фентиурама обладал ТМТД, испытанный на двух штаммах Salmonella thyphimuriua ТА 96, ТА 100 и вызывавший мутации типа сдвига рамки считывания и замены пар оснований.

Таблица 10

Цутагенная активность пестицидов на различных тест-системах

Препарат

ISaccharomycee cerevieiae

I Salmonella

thTPhimuriura

(Chlorella J vulmarl8

TI I T2 115В-П4! 4538:!TA 1001 TA 98

Фентиурам ++ ++ 0 0 + + +

Составные части

фентиурама:

^-изомер ГХЦГ + + + - - +

ТХФМ + + 0 0 - - +

ТМТД + + 0 0 + + +

Вутифос +++ ++ •и- - + ++

Бутилкаптако +++ ++ +— +- - + +

Гидрель ++ +-Н - + - +

Дропп •м- + + + - + 0

Которан +- + 0 0 - + +

Толуин +— +- 0 0 - - -

Кельтан ++ V + 4" + + + +

Тиодан + + + + + + +

НММ ++Н- -ш - +++ +++ +++ -Н-+

Примечание: "+-" - очень слабое цутагенное действие; "+" - слабая цутагенная активность; "++" - значительная 1^'тагенная активность; "+++" - высокая цутагенная активность; "О" - мутагенное действие не изучалось.

При определении ДНК повреждакцего действия фентиурама и его составных частей нами было установлено, что фентиурам подавляет рост бактериальных культур при всех выбранных концентрациях за исключением начальной - 0,0001%. Аналогичным эффектом обладал также и ТХ5М являющийся, как бьшо сказано вьпе, компонентом фентиурама на двух индикаторных штаммах уР2 и УР6, Pol А, в то время как на штамме Е. coli , TXS>M обладал ДНК-повреждакцим эффектом при более высоких концентрациях (0,1 и 0,0Ш. Другой

компонент фентиурама-ТМТД подавлял рост штамма Е.ооНпри всех испытанных концентрациях. И, наконец, третий компонент фентиу-рама - ГХЦГ, не обладал ДНК-повреждающим эффектом на всех штаммах и при испытшши всех опытных концентраций.

Высокую генетическую активность на бактериальной тест-системе Salmonella thyphimurium проявил бутифос, бутилкаптакс, кельтан и тиодан, иццуцкрсвавшие мутации типа замены пар оснований. На тест-системе водоросли Chlorella w1 garia эти же пестициды ицдуцировали ауксотрофные и пигментные мутации. Таким образом, тест-системы Salmonella thyphimurium, Chlorella vulgaris наряду с тест-системой дрожжей Saccharoseз cereviaiae' позволяют всесторонне оценивать различные генетические эффекты под действием различных пестицидов.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В результате проведенных исследований показано, что НММ и отобранные для испытаний пестициды на радиочувствительных штаммах дрожжей Saccharoqyceo cereviaiae различной пловдности, индуцируют определенные типы генетических повреждений. На гаплоидных штаммах дрожжей мутация rad 54 увеличивает чувствительность к летальному действии НММ, причем разница с диким типом наиболее выраяена на диплоидном уровне. Эксцизионная репарация не принимает участия з ликвидации летальных повреждений, инду-цзфованных НММ. Отдельные этапы пострепликативной репарации, контрол!фуешё генами rad 54 и rad 2, могут участвовать в этом процессе.

Была изучена частота индуцированных НММ мутаций адеиинза-'Впскмости на гаплоидных штаммах I5B-H4, rad 2; rad 54 и хгэ 2Т Изучение показало, что мутанты rad2, rad 54 и хгз 2 по сравнению со штаммом 15В-П4 характеризовались погашенной частотой мутаций, особенно при высоких дозах мутагена. Такое явление объясняется, очевидно, тем, что нормальные продукты генов radi 2, rad> 54 и хгз 2 необходимы для возникновения мутаций аденшзави-симости, индуцируемых НММ, а пути репарации, блокируемые этими генами, принимают участие в НММ-индуцированном мутагенеза.

Для определения природы мутаций индуцированных НММ, был использован метод мекаллельной комплементации. У всех изученных штаммов'мутации в локусе ade 2 возникали в 3-4 раза чаще, чем

в докусе ade I« По частоте ieaky-Цуаций, мутанты достоверно не отличались от дикого типа. Анализ наших исследований показывает, что НШ у большинства штаммов индуцирует мутации типа замены пар оснований, »овации же радиочувствительности, не оказывают существенного влияния на природу ШМ-индуцированных мутаций в г.окусе ade 2.

Изучение рекомбинагенных эффектов НММ на диплоидных штаммах red 2, у которых блокирован эксцизионный путь репарации и rad 54 с блоком по пострепликативной репарации показало, что цутация rad 54 не влияет на частоту индукции и цитотического кроссинго-вара под действием НММ.

Высокая разрешающая способность дрожжевой тест-системы Sacoharonyces cerevieiae в регистрации различных генетических событий, позволила использовать её для определения генетической активности мутагенов окружающей среды.

Результаты исследований показали, что у всех изученных пестицидов самой высокой генетической активностью (5,38) обладает бутйфос. На гаплоидном птамие 15В-П4. БассЬагощусея cerevieiae бутифос индуцирует ауксотроф1ше мутации, цутации с дыхательной • недостаточностью, а также цутации,чувствительные к температуре. На диплоидных штаммах TI и Т2 бутифос индуцирует митотический кроссинговер и причем с высокой частотой на штамме Т2, несущий мутаиии rad 54. Частота индукгаи митотического кроссинговера при иоыи-. йтпго препарата была сравнима с частотой, которую может иНдуциреРАТь Н7_\!. Этот пестицид также индуцирует генные мутации У ßaloonella tbyphiauriuo ТА 98, ТА 100 И Chlorella vulgaria.»

Метаболическая активация (фракция S-9) не оказывает влияния на проявление генетической активности испытанных пестицидов на дрожжах Sacchaxocj сеа cerevieiae. В то время как на бактериальных штаммах Salmonella thyphimuriua, фракция s 9 увеличивает мутагеннув активность пестицидов. Высокая генетическая активность была отмечена и для гидреля. На дрожжевой тест-системе Saccharomycea cerevisiae пестицид индуцирует с высокой частотой (6,3%) митотический кроссинговер между геном ade 2 и его центромерой. Эта величина также практически сравнима с частотой индукция НММ. Низкие концентрации этого препарата (0,01%) на Chlorella vulgaris индуцировали (до 18%) ауксотрофные мутации.

Таким образом, изучение генетической активности испытанных пестицидов показало, что дрожжевая тест-система Saccharornycea oerevisiae может быть рекомендована в качестве универсальной тест-системы для регистрации различных химических соединений, применяемых в Узбекистане и в ряде других хлопкосеющих регионах.

швода

I. Показано, что цутации rad 2, rad 54 и хгв 2 снижают мутагенный эффект НММ. Изучение природа мутаций в локусэ ade 2 показывает, что они в основном представлены заменами пар оснований. Мутации радиочувствительности не оказывают влияния на природу НММ-индуцированных мутаций в локусе ade 2.

. 2. Выявлено, что мутация rad 2 не влияет на частоту мито-тического кроссинговера, а мутация rad 54 снижает частоту как общей митотической, так и реципрокной рекомбинации.

3. Показано, что испытание микросомальной активирующей смеси (фракцияБ-9) на дрожжах Baccharomycee cerevieiae не оказывает влияния на генетическую активность пестицидов, а также индукцию генных, хромосомных и цитоплазматических мутаций.

4. Установлено, что пестициды бутифос, бутилкаптакс, гид-рель индуцируют на диплоидных штаммах дрожжей с высокой частотой митотический кроссинговер мевду геном ade 2 и его центромерой , а также цитоплазматические мутации на гаплоидных штаммах 15В-П4 и rad 2.

5. Пестициды бутифос, бутилкаптакс, гидрель, тиодан, кель-тан, которая индуцируют на бактериальной тест-системе Salmonella thyphimurium мутации типа замены пар оснований.

6. Таким образом, дрожжевая тест-система Sacoharonyces oerevisiae, учитывая её значительные возможности в регистрации различных-генетических событий, может быть использована и рекомендована для выявления мутагенов окружающей среды.

Список работ, опубликованных по материалам диссертации

I. Ядгаров, Х.Т. Изучение детального и мутагенного действия №-нитрозометилмочевины на дрожжи Sacc-ha-ronruces oerevis^e ' // Тезисы доклада П съезда ВОГиС. -Ленинград. 1977. И. -С.98.

2. Ковальцова C.B., Федорова И.В., Ядгаров Х.Т. Генетические эффекты нитрозометилмочевины (НММ) на радиочувствительные дрожжи saocharooyoes cerevisiae // Тезисы доклада IX Международного генетического конгресса. -Москва.: 1978. П. т-С. 206.

3. Ядгаров Х.Т. Изучение генетических эффектов /Н-нитрозо-иэтилмочевины на дрожжи ßaccharomycea cerevisiae // Тезисы докладов П республиканской конференции молодых ученых-микробиологов. Ташкент, 1978, -С. 23.

4. Ядгаров Х.Т., Ковальцова C.B. Изучение генетических эффектов к-нитрозометилмочевины на дрожжи Baccharomyoes cerevi-eiae, Сообщение I. Влияние цутации радиочувствительности на летальный и рекомбиногенный эффекты // Генетика, 1979, т.XI, № II, -С. I944-1952.

5. Ядгаров Х.Т. Изучение генетических эффектов Н'-нитрозо-ыетилмочевюш на дрожжи БоооЬагооусеа cerevisiaa Сообщение П. Влияние цутаций радиочувствительности на летальный и цутагеншй эффекты// Генетика, -1981, т. ХУ1Ц » 3. -С. 405-410.

6. Захаров И.А., Королев В.Г., Иванов Е.Л., Грачев Д.М., Ковальцова C.B., Федорова И.В., Касинова Г.В., Шаншиашвили Т.Ы., Ядгаров Х.Т. Индукция пряшх генных цутаций у сахаромицетов. Сравнение эффективности различных мутагенов // Генетика, т.ХУЛ, 1961, Я 12. -С. 2134-2143.

7. WycaüP Ef.M., Ядгаров'Х.Т. Исс^едсвато генетических эффектов некоторых пестицидов на дро.тжовьо: тест-системах // 1У съезд ВОГиС. -Кааенев. 1981, ч.Г, -С. 341.

8. Мусаев Ш.У., Уланова Р.5., Ядгаров Х.Т. Сравнительное изучение генетических с<ффаг.тов пестицидов на дрогневых и бактериальных тест-систеиах // 1У съезд Уз ВОГнС. -Ташкент, 1981,, -С. 102.

9. Ядгаров Х.Т. Изучение генетических эффектов пестицида гидреля на дрожжевых тест-системах // Тезисы доклада Ш Республиканской научно-теоретической конференции молодых ученых-шкробнологов. -Ташкент, 1983. -С. 57.

Ю. Мусаев И.Ы., Ядгаров Х.Т,, Уланова Р.В., Гончарук О.В. Использование различных тест-систем для выявления генетических эффектов некоторых пестицидов. // Тезисы докладов Международной . коррекции "ЮНЕСКО" "Человек и биосфера" -Уосква, 1984, -С. 114.

П. Мусаев Ш.Ы., Ядгаров Х.Т., Гончарук О.В., Уланова Р.В, Исследование генетической активности агрохимккатов на различных тест-организмах. // Тезисы доклада заседания секции генетических аспектов проблемы "Человек и биосфера" МИТС ШГГ СССР. -Иркутск. 1984. -С. 36-37.

12. Ядгаров Х.Т. Изучение цутагенной активности некоторых пестицидов на хлорелле, // Тезисы доклада научно-теоретической конференции молодых ученых и специалистов АН УэССР. -Ташкент, 1984. -С. 17-18.

13. Ядгаров Х.Т. Использование различных тест-организмов для оценки мутагенной активности компонентов фентиурама. Тезисы доклада 1У съезда ВШ. -Алма-Ата. 1985. -С. 51.

14. Мусаев Ш.М., Ядгаров Х.Т. Использование дрожжевых тест-систем для определения генетической активности некоторых пестицидов. // Тезисы доклада У съезда УзОГиС. -Ташкент. 1986

15. Ядгаров Х.Т., Мусаев Ш.М., Уланова Р.В. Генетические эффекты агрохимикатов на различных микробных тест-системах,// Узбекский биологический журнал. -1991. № 10. -С. 95.

16. Ядгаров Х.Т. Сравнительное изучение генетических эффектов ряда фосфороорганических пестицидов на микробных тест-системах // Тезисы доклада У1 съезда ВОГиС. -Ташкент. 1992. -С. 75. *

УЗШИСТОН ФАНЛАР АКАДЕМИЯМ МИКРОБИОЛОГИЯ ИНСТИТУТИ

V ХОШАКБАР Т0Ж1УЛАТ0ВИЧ ЁДГОРОВ Биология фанлари номэоди илмий даражасини олиш учун тМёрлаган"н-нитрозометилмочевина ва айрим пестицидларни генетик фаоллигини ачит^и эамбуруги ßaooharomyces cereriaiae да ^иёсий урганиш" мавзуидаги диссертациянинг хулосалари

н -нитрозометилмочевина (НММ) ва айрим пестицидларни генетик фдоллиги диплоид ва гапловд радионурларга таъсирчая ачотч^и замбурури Saooharomyoes cerevisiae да'урганилган. ШМ ва пести-цидлар ачитци замбуруганинг гаплоид з;ужайраларида ген ^аада митохондриал мутацияларини г^узРатади. НММ гаплоид хужайраларикинг ДНКсида ГЦ ва AT я^фтларини урни алмаишши туфайли мутацияга олиб

келади. Узида радиотасирчан (rad 54) гени булган Bacaharomyces corevieiaeHKHr днплоид ва гаплоид штамиларини НММ цамда пести-цидларга ута таъсирчаилиги ант$ламган.

яш TI ва Т2 диплоид штаымларида пестицидлардан бутифос, бутил-каптакс, ТХФЫ, кельтан, тиодан, гидрель турли хил генетик узга-ришларга ^аыда цитоплазыатик цутадияларга ва ыитотик рекомби-нацияга олиб келади. Бутифос Saccharomycee cerevieiaemmr 15В-П4 гаплоид шташида ген з^ацца цитоплазыатик цутацияларки НММ мута-гени билан бир хил ча^иради., Ачитци заыбуругидан ташцари тест-систеыалар сифатида яна бактериал твст-систеиалар Salmonella tbyphlmuriua ва E.coli ^ам синалган. Бу тест-систеыаларда ф&цат ген цутацияларинигина анюрлаш цуыкин. Утказилган тажриба-лар шуни курсатдики Saooharoay.eee cereviei&e тест-систеиаларида эукариотик оргашзмларда ккмёвкй модцалар таъснркда буладиган хамыа генетик узгаришларни аницлаа ыуыкиндиги неботланган. Бу тест-система атроф цухитдаги хусусан циплок хужаяигида цуллашга цудгалланган ва янгидан олинган килёвий ыоддаларни генетик фаоллигини ани^лалда ^уллап тавсия цклинади.

IH6TITUTE О? MICBOBIOLOGT АСАШМ* OF 6СИИ0В ОТ REPUBLIC UZBEKISTAN

ЮШШАХВАН YADGAROV

сокРАВАТгге БТООТ о? qiaETic ACTXVITT OP

N-NITROZOl'ffiTHTbUKEA (NKU) AND PESTICIDES СИ YEAST BACCHAROOTCES CEKU/ISUE

SUHMAR3

Study of lethal effects of HMU on radiosensitive strains rad 2, rad and xrs 2 of Saccharomyces cerevisiae has shown, that the mutations rad 2 and rad increase sensitivity of these strains to low doses of mutagen. Mutations rad 2, rad and xro 2 decreases the mutagenic effect of NMU. The study of nature of mutations induced by NMU in locus rad 2 has shown, that thoy are mainly tha bases substitution. Mutations of radiosensitive don't infl^nce on the nature of NKU-induced mutations in locus ade 2.

It was aloo studied the effect of nutation rad 2 and rad in homozegoua strains survival, mitotic segregation and croosing-over induced by NMUin yeast. Mutation rad increased sensitivity to lethal effect, the frequencieo of RMU induced segregation and crossing-over were decreased in etra in> rad 54- rad The reoon-binagenic effect of NMIT on yeast was lower than under the action of U7 and cigamma rays.

The comparative study of peatioides grfiet'c activity on yeast diploid strains Saccharomyces cerevisiae showed that sons of posticedes (butifoe, gibrel, phentiura m, TCPC) could induce with high frequency the mithotic crossing-over between sde 2 genes and it's centronere. On bacterial teat-tsystea butifos, gidrel( butilcaptaks induce the frame-shift mutations. The butifos in compare with butilcapta&s coused the genstia mutations with high frequency (38?S). This frequency could be compare with the action of HHU.