Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Сравнительное исследование плазмалогенов в фосфолипидах морских беспозвоночных

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидат биологических наук, Дембицкий, Валерий Михайлович, Челябинск

/0£и>

ЧЕЛЯБИНСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ МВ И ССО РСФСР, ИНСТИТУТ БИОЛОГИИ МОРЯ ДВНЦ АН СССР

На правах рукописи

Дембицкий Валерий Михайлович

СРАВНИТЕЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ПЛАЗМАЛОГЕНОВ В ФОСЗЮЛИПИДАХ МОРСКИХ БЕСПОЗВОНОЧНЫХ

Специальность 03.00.04 - Биологическая химия

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научные руководители: Академик- АМН СССР, профессор А.Н.Климов кандидат химических наук, доцент Б.Д.Небылицын

Челябинск - 1981

ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ

ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

2.1. Сравнительное содержание плазмалогенов и алкиловых эфиров в липидах морских беспозвоночных.

2.2. Сравнительное содержание плазмалогенов и алкиловых эфиров в липидах различных органов и тканей позвоночных.

2.3. Микросомальные ферменты, участвующие в метаболизме . плазмалогенных и алкиловых глицеролипидов.

2.4. Методы анализа фосфолипидов с простой эфирной связью и их производных.

2.4.1. Хроматографические методы анализа.

2.4.2. Химические и энзиматические методы анализа.

2.4.3. Спектральные методы анализа. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

3.1. Получение липидных экстрактов.

3.2. Приготовление стандартных фосфолипидов из различных источников.

3.3. Тонкослойная хроматография.

3.3.1. Препаративная ТСХ.

3.3.2. Микро-ТСХ.

3.4. Хроматографические проявляющие системы.

3.5. Колоночная хроматография.

3.6. Реагенты для обнаружения и идентификации различных липидов на хроматограммах,

3.6.1. Неспецифические реагенты." . 3.6.2. Специфические реагенты.

3.7. Газо-жидкостная хроматография.

3.7Л. Получение диметилацеталей жирных альдегидов. 3.7*2. Получение метиловых эфиров жирных кислот* 3.7.3» Получение изо пропилиден овых производных алкиловых эфиров глицерина.

3.8. Химические методы анализа.

3.8.1. Количественное определение фосфолипидов.

3.8.2. Количественное определение нейтральных липидов.

3.8.3. Определение алк-1-енил-глицерофосфатидов. 3..8.4. Определение алкил-глицерофосфатидов.

3.8.5. Определение сложноэфирных групп.

3.8.6. Определение этаноламина в виде динитрофенильных производных.

3.8.7. Мягкий щелочной гидролиз.

3.8.8. Восстановление липидов алюмогидридом лития.

3.9. Выделение необычных липидов из губки НаИсЬопаг1а рапл.сеа и офиуры ОрМига 8агвд..

3.10. Физико-химические методы анализа липидов и их производных.

3.10.1. ИК-спектроскопия.

3.10.2. Масс-спектрометрия.

3.10.3. ЯМР-спектроскопия. 4. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

4.1. Разработка методов анализа плазмалогенных форм в фосфоли-пидных классах.

4.2. Сравнительно-биохимическое исследование плазмалогенов в фосфолипидных классах морских беспозвоночных.

4.3. Связь между эволюционным положением морских беспозвоноч-. ных и их плазмалогенным составом фосфолипидных классов.

4.4. Сравнительное изучение фосфолипидного и жирнокислотного состава дальневосточных морских губок.

4.5. Установление структур необычного липида из морской губки Hali«h.on<iria panicea.

4.6. Исследование фосфолипидного состава офиуры Gphiura sarsi.

4.7. Изучение плазмалогенного состава фосфолипидных классов различных органов и тканей осьминога Octopus sp..

ВЫВОДЫ ЛИТЕРАТУРА

I. ВВЕДЕНИЕ

Исследование липидов является одной из наиболее бурно развивающихся областей современной биохимии и химии природных соединений. Важное значение липидов и прежде всего фосфолипидов, без которых не строится ни одна клеточная структура, не может протекать ни один сложный биологический процесс, в настоящее время общепризнано. Липиды являются не только структурными компонентами мембран, но и осуществляют регуляторные функции. К общим функциям фосфоли-пидов в клетке можно отнести роль фосфолипидов в мембранном транспорте и участие фосфолипидов в реакциях, катализируемых мембранными ферментами. Кроме того, большинство липидов полифункциональны, они участвуют во многих биологических функциях клетки. В связи с этим приобретает особую актуальность изучение индивидуальных ли-пидных классов, а точнее субклассов: диацильных, алкил-ацильных и алкенил-ацильных (плазмалогенов). Липиды мембран чрезвычайно разнообразны по характеру и составу, которые зависят не только от вида организма и типа клетки, но и от внутриклеточной локализации мембран. Необходимость исследования липидов с простой эфирной связью (этерные липиды) диктуется тем, что при некоторых заболеваниях содержание алкильных липидов значительно увеличивается по сравнению с липидами здоровых тканей С Snyser P., Snyder С., 1975 ). Так,Wood, Snyder (1969) показали, что в асцитных клетках Зрлиха содержание алкильных форм составило 29%, а плазмалогенных 15% в фосфатидилэтаноламине. bin et al.(1976) показали, что при болезни Волмана возрастает содержание алкильных липидов в печени С Lin et al., 1978 ) , селезенке и надпочечниках ( Lin et al., 1977) . Также обнаружено ( Qster, 1971,1972,1974; Hack, Helmy,19б7а,Ь) , что при инфаркте миокарда, ишемической болезни сердца ( Ротоа et al.,

1973,1977 ) и лейкемии ( Perreil, Radioff, 1972 ) общее содержание плазмалогенов значительно уменьшается в сердечной мышЦе млекопитающих.

В последнее время даже появился новый термин - плазмалогенная дистрофия ("плазмалогенная болезнь"), следствием которой могут быть атеросклероз (Oster,1971,1972 ) и инфаркт миокарда ( Miller et al., 1964; Oster, Hope-Ross, 1966; Oster, 1974 ).

Недавно Еппс и соавт. ( Epps et al., 1980 ) исследовали липид-ный состав сердечной мышцы собаки и показали, что при инфаркте миокарда в липидах сердца накапливаются необычные плазмалогенные фос-фатиды. При детальном исследовании этих липидов было показано, что они представляют собой N -ацелированные производные плазмалогенно-го ФЭ.

Целью настоящей работы является исследование липидов с простой эфирной связью (и прежде всего плазмалогенов) в морских беспозвоночных. Выбор объектов не случаен: морские беспозвоночные богаты как плазмалогенными, так и алкильными формами ..в основных фосфолипидных классах; относительная доступность беспозвоночных, а также большое разнообразие видов, которые относятся к различным систематическим группам, делает их весьма удобными объектами для изучения липидов. Представлялось интересным выяснить, как. распределяются плазмалогенные формы в фосфолипидах в связи с эволюционным положением животных, и выбрать наиболее интересные объекты для последующего детального физико-химического изучения* Получаемые при этом результаты представляют большой практический интерес в связи с решением проблемы богатейших биологических ресурсов мирового океана, а также использование морских беспозвоночных в качестве модельных объектов для исследования метаболизма липидов с простой эфирной связью, что представая-

ет интерес для медико-биологической науки и мембранологии.

Постановка работы требовала усовершенствования имеющихся методов определения плазмалогенов. После успешной реализации данной проблемы мы приступили к широкому скринингу морских беспозвоночных в различные времена года. В зимний период было исследовано 22 вида относящихся к 9 классам из б типов. В летний период было исследовано 60 видов, относящихся к 14 классам из 7 типов, и сделаны определенные выводы о распределении плазмалогенов в фосфолипидных классах. Когда картина распределения плазмалогенов в фосфолипидах была достаточно выяснена, мы приступили к анализу наиболее интерес ных, с точки зрения липидной биохимии, организмов. Мы установили строение неизвестных ранее фосфолипидов из морской губки Haliehon-dria panieea и офиуры Ophiura sarsi . Исследовали в этих фосфолипидах жирнокислотный, жирноальдегидный состав, а также состав алкиловых эфиров глицерина. Изучили фосфолипидный состав 6 видов и жирнокислотный состав 9 видов морских губок. Исследовали плазмало-генный состав фосфолипидных классов в различных органах и тканях осьминога Octopus sp.,

Работа состоит из введения, трех глав и выводов. В первой гла ве рассматриваются литературные данные о сравнительном распределении плазмалогенов и алкиловых эфиров в фосфолипидах морских беспоз воночных, позвоночных (для сравнения), биосинтез липидов, с простой эфирной связью, а также данные о методах изучения этерных липидов. Во второй главе описаны методики, которые мы использовали в ходе исследования, и разработанные нами. В последней, 3 главе, приводят' ся и обсуждаются результаты, полученные в ходе нашей работы.

СОКРАЩЕНИЯ В ТЕКСТЕ

$3 - фосфатидилэтаноламин.

§Х « фосфатидилхолин.

§С фосфатидилсерин.

ФИ - фосфатидилинозитол.

Ж « фосфатидная кислота.

ФГ - фосфатидилглицерин.

ДФГ - дифосфатидилглицерин.

СМ - сфингомиелин.

ЦАЭФ - церамидаминоэтилфосфонат.

Л$Э - лизофосфатидилэтаноламин.

Л#Х - лизофосфатидилхолин.

ЛФС - лизофосфатидилсерин.

ТСХ - тонкослойная хроматография.

Г1Х - газо-жидкостная хроматография.

БХ - бумажная хроматография.

ИК-спектрометрия - инфракрасная спектрометрия.

ДОА - диоксиацетон.

ДОАФ - диоксиадетонфосфат.

ЦДФ - цитидиндифосфат.

НАД4" - кикотинамидадениндинуклеотид.

НАД-Н восстановленная форма НАД+.

НАД§+ - никотинамидадениндинуклеотидфосфат.

НАДФ-Н - восстановленная форма НАДФ+.

2. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

Известны два основных типа простых эфиров глицерина: алкило-вые (Ш, 1У) и алк-1-ениловые (плазмалогены, I и П).

О CH5-0-CH=CH-R. О CH5-0-CH2-CH2-R,

M | il 1

RrC-0-ОН О R4-C-0-ÇH о

Н,е-о-?-о-<сн2)2-Х ^с-о-с-сна-йз

* оэ

(I) (Ж)

о

M

CHo-0-CH.-CHrfc

о

II

ch2-O-CH=CH-R

^-с-о-сн

о

II

ftt-C-0-CH

о

II

ц ¿-О- р-о- (CH2)rx W^C-O-C-CH2- R4

о®

(Я)

(I)

R, R.J, R2, R^, R^ - насыщенные или ненасыщенные углеводородные остатки. Группировка X может представлять собой аминоспирты этаноламин, холин или серии.

Природные липиды, содержащие алк-1-ениловые ( Feulgen, Rossen-beek, 1924; Peulgen, Voit, 1924 ) и алкиловые ( Tsujimoto, Toyama, 1922; ïoyaraa, 1922, 1924; Karnovsky et al., 1946 ) группы, найде ны были впервые в мембранных фосфолипидах. Не считая основной структурной функции всех мембранных фосфолипидов, специфическая

роль плазмалогенов и алкиловых эфиров еще не достаточно выяснена. Многие вопросы остаются еще открытыми: I, Почему ткани растений не содержат или содержат в следовых количествах алкоксилипидов? 2. Каковы функции плазмалогенов в мозгу? 3. Какие физиологические процессы могут влиять на состав углеводородных цепей алкоксилипидов в различных органах? Почему клетки раковых опухолей содержат значительно больший процент алкил-ацил-глицеридов, чем в клетках здоровых тканей? ( Mangold, 1979 ).

Глицеролипиды, содержащие простые эфирные связи, проявляют некоторые биологические свойства, такие, как стимулирование роста, нейрогенетическая активность, а также генопоэз. Кроме того, они могут использоваться как терапевтические агенты для защиты организма от радиоактивного излучения ( Piantadosi, Snyder, 1970 ). Также,возможно, что они играют важную роль при стрессах, т.к. плазмалогенная форма в глицеролипидах обладает меньшим поверхностным потенциалом, чем соответствующие диацильные аналоги ( Shah, Schalman, 1965 ). Показано, что при экспериментальном стрессе у крыс содержание плазмалогенов в фосфатидилэтаноламине уменьшается в таких органах, как мозг, сердечная мышца, причем наибольшее уменьшение отмечено в сердечной мыщце (Дембицкий, Рябинин, 1981).

Функции плазмалогенов в живых клетках еще не достаточно выяснены, но можно полагать, что они весьма существенны, т.к. содержание плазмалогенов в таких тканях, как мозг, сердечная мышца млекопитающих, высокое и достигает половины всех форм в отдельных фос-

фолипидных классах ( Klenk, Debuch, 1963; Horrocks, Sun, 1972; Horrocks, 1972) они также входят в состав других органов и тканей, правда, в меньшей степени, и найдены почти во всех живых организмах (Snyder, 1972; Goni et al., 1978 ). Известно, что миелин нервной ткани мозга человека содержит более 90$ плазмалогенной форма в Ф0 и до 73$ в ФС ( O'Brien, Sampson, 1965).

Miller et al. (1964), изучая липидный состав атеросклероти-ческих бляшек, показали, что содержание плазмалогенов в них уменьшается в процессе развития. Oster, Hope-Ross (1966) наблюдали уменьшение содержания плазмалогенов в липидах сердечной мышцы, без сопровождающегося некроза, при фатальном миокардиальном инфаркте.

Martinez, Bailabriga (1978) использовали плазмалогены и ганг лиозиды в качестве маркеров при миелинизации и синаптогенезисе,соответственно, при исследовании липидного состава головного мозга и мозжечка человека. Авторы показали, что концентрация ганглиози-дов в мозжечке выше, чем в мозгу, а общее содержание плазмалогенов было выше, чем ганглиозидов в обоих органах. Они также отметили, что при развитии мозга человека (от рождения до 14 лет) общее количество плазмалогенов и ганглиозидов увеличивается более, чем в 5 раз.

Kasp-Grochowska, Glynn (1977) изучали роль плазмалогенов в реакции между стрептококками и миокардиальными липидами. Они показали, что этанол-растворимые миокардиальные липиды реагируют с ан-ти-стрептококковой сывороткой крови в ряде иммунологических тестов.

Известно, что фосфолипиды играют весьма важную роль в реконструкции ионных насосов в митохондриях ( Racker, 1976 ). Автором показано, что для большинства мембранных систем оптимальная реконструкция получается при соотношении между двумя основными фосфолипи-дами $3 и $Х - 4:1. Автор также предполагает, что дальнейшие опыты по реконструкции ионных насосов могут оказаться весьма полезными для выяснения специфической роли фосфолипидов, и в особенности влияния таких минорных компонентов, как плазмалогены.

2.1. Сравнительное содержание плазмалогенов и алкиловых эфи-ров в липидах морских беспозвоночных.

Начало исследований плазмалогенов в липидах морских беспозвоночных относится к; концу 50-х годов. Как правило, авторы изучали качественный состав липидов и плазмалогенов лишь у отдельных представителей. Поэтому на основе отдельных качественных результатов трудно проследить закономерность распределения плазмалогенов в определенных классах,и тем более типах, морских беспозвоночных в свя зи с их систематическим и эволюционным положением.

Bergmann, Landownе (1958) исследовали фосфолипидный состав морского анемона Anthopleura elegantissima и показали, что основным фосфолипидом был сфингомиелин. Были обнаружены плазмалогены, которые, в основном, находились в §Х. Авторы сделали попытку выделить различные фракции фосфолипидов и охарактеризовали плазмалоген ный ФХ, используя ИК-спектроскопию.

Hartree, Mann (1959) показали, что фосфолипиды морского ежа Echinus esculentus содержали 15$ плазмалогенов.

Изучая яйца некоторых морских беспозвоночных ( Asterias, АгЪа-cia, Spisula ) , Раппорт (Rapport, 1962) определил, что общее содержание плазмалогенов в них было выше, чем в яйцах амфибий и цыпленка .

В начале 60-х годов Rapport, Alohzo (I960) провели первый сравнительный анализ плазмалогенов в общих липидных экстрактах II видов морских беспозвоночных: морском еже, анемоне, губке, звез де, кукумарии, крабе и моллюсках. Они показали, что плазмалогены находились преимущественно в фосфолипидной фракции, причем в нин-гидриннположительной фракции их содержание было выше, чем в холин-содержащей фракции. Из II исследованных беспозвоночных наибольшее содержание плазмалогенов в общих липидных экстрактах найдено в анемоне Metridium senile и в двустворчатых моллюсках: Муа arenaria, Mytilus edulia , и Eecten irradiarens , a

наименьшее в морской звезде Asterias forbesi. Rapport (1961) исследовал плазмалогенный состав липидов различных органов 8 видов моллюсков ( Busycon, Crassostrea, Loligo, Муа, Mytilue, Peetem, Spisula, Tenus ). Хотя липиды большинства органов имели высокие концентрации плазмалогенов, но наибольшее их количество найден© в липидах жабер (до 400ml /г липида; это составляет 30$ от веса органа). Эти результаты были подтверждены в работах Думонта ( Dumont, 19%), который нашел, что задние жабры китайского краба ( Eriocheir sinensis) содержали 87$ фосфолипидов (от общих липидов), причем большинство фосфолипидов было в виде ФХ-плазмалогена. На основании результатов работы Dumont (1958) предположил, что ФХ-плазма-логен играет важную роль в транспорте ионов.

Hack, Gussin (1960), Hack et al. (1962) провели качественный скрининг 46 видов морских беспозвоночных, относящихся к II типам, и показали, чт® основным липидным компонентом, содержащим плазмалогены, был §Э, который наиболее ярко окрашивался на хромато-граммах реактивом фелгена. ФХ содержал незначительные количества плазмалогенов. Все 5 видов исследованных моллюсков характеризовались тем, что зона, соответствующая §С, довольно сильно окрашивалась реагентом на свободные аминогруппы, т.е. ФС содержал плазма-логенные формы. В морском анемоне Metridium авторы обнаружили ФК, которая также содержала незначительное количество плазмалогенной формы.

При исследовании липидного состава морской полихеты ( Hereis verens, Pocock et al. (1969)нашли значительные количества плазмалогенов и алкидных эфиров как в нейтральных глицеридах, так и в фос-фоглицеридах, причем липиды полихеты содержали наибольшее количество нейтральных плазмалогенов, алкиловых эфиров глицерина и холин плазмалогена.

Mohri (1959, 1961), исследуя гаметы и сперматозоиды морских ежей, показал, что плазмалогены были, в основном, в §3, а в ФХ значительно меньше.

В литературе имеются лишь отдельные сведения о количественном содержании плазмалогенов в различных классах фосфолипидов мор