Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Сравнительно-цитологическое исследование оогенеза турбеллярий - представителей отряда LECITHOEPITHELIATA

ВАК РФ 03.00.25, Гистология, цитология, клеточная биология

Автореферат диссертации по теме "Сравнительно-цитологическое исследование оогенеза турбеллярий - представителей отряда LECITHOEPITHELIATA"

ИНСТИТУТ ЦИТОЛОГИИ РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК

дд На правах рукописи

- 1 МАИ 1993

БОГОЛЮБОВ Дмитрий Сергеевич

СРАВНИТЕЛЬНО-ЦИТОЛОГИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ООГЕНЕЗА ТУРБЕЛЛЯРИЙ — ПРЕДСТАВИТЕЛЕЙ ОТРЯДА ЬЕС1ТНОЕР1ТНЕЫАТА

Специальность: 03.00.25 — Клеточная биология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

САНКТ-ПЕТЕРБУРГ

1993

Работа выполнена в лаборатории морфологии клетки Института цитологии Российской академии наук.

Научные руководители: доктор биологических наук М: Н. Грузова; кандидат биологических наук О. А. Тимошкин.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, член-корр. РАН А. Л. Поленов; кандидат биологических наук И. М. Дробышева.

Ведущее учреждение: Институт биологии развития им. Н. К. Кольцова РАН.

на заседании Специализированного совета Д.002.73.01 при Институте цитологии РАН по адресу: 194064, С.-Петербург, Тихорецкий пр., 4.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института цитологии РАН.

Защита состоится

1993 г. в

часов

Автореферат разослан

1993 г.

Ученый секретарь Специализированного совета, доктор биологических наук

Л. Н. Писарева

© Институт цитологии РАН.

ОБЩАЯ ШЛКГЕРИСГШ. РЛБ01У

АШМЖОота_темм. Отряд Lccithoopithoiinta, по мнению специалистов, является одним из наиболее загадочных, несмотря на то, что интерес исследователей-зоологов к этой группе расиич-1шх червей не ослабевает на протяжение более 150 лет (Тшошадн, 1991). Тем на менее, остаются да сук пор открытыми многие вопросы. В частности, совершенно недостаточно изучены половач система и гаметогенез яецитоэпителиат. Электронно-микроскопические данннз касаются лишь строения кожга-глыппчлм'о мешка (Hoiolngor, 1963) Tyler, 197i'; Тимошкяи, Г991) и протожхГридяальной системы (Raisinger, 1960; Щз^эг, 1981) Тякоптош и др., 1989).

Наиболее существенной чертой представителей отряда Lecitho-epitheiiata является развитие ооцита внутри стабильных фолликулов; при этом яйцеклетка оказывается окруженной эпителиоподобным слоем клеток, которые ухе давно в литература называют "желточными", - что и определяет название отряда: Lecithoepithelirata (Reisinger, 1926;'Karling, 1968). Цятологяческяе доследования аеиских гонад лецитоэпителтат, которые ранее пе проводились, с одной стороны, помогают в решении таких острых проблем, лежащих 'в основе сугубо зоологической дискуссия о составе и филогении отряда bectthoepithaiihta, как вопрос о природе вспомогательных ■ клеток у представителей семейства Prorliynchidse и насколько ве-' .дико сходство фолликулярных образований проргнхвд и других тур-беллярий. С другой стороны, подобные исследования представляют • 'новый (Тактический материал для сразиительно-цитологического подхода я изучению морфофункциональннх взаимоотношений половых и .'вспомогательных-клеток tietazoa л способствуют расширению пред- . ставлеллй о типах оогеяеза.■

Сравнительно недавно О.А.Тимошгащш (1984 а, б; 1988; 1991; Timoohicin, 1991) <5нл открыт в озере Байкал автохтонный очаг видообразования проринхид. Байкальские представители семейства Frorhynohidfte по целому ряду признаков, прежде вазга по экологическим, существенно отличаются от своих небайкальских сородичей. Поэтому в качество объектов выбраны массовые и широко распространенные виды как байкальских эндемиков, так и космополит-пне, с тем, чтобы о большей уверенностью судить о возможности распространения тех или иных выв'одов на представителей группы в целом. - * '

Цель и задачи работы. Цель работы - исследование ультраструк-турноЯ организации женских гонад представителей семейства Его-гЬупсЫйае, их половых и вспомогательных клеток на примере некоторых байкальских и небайкальских видов рода йеосеаЬгорЬога. В работе поставлены следующие основные задачи.

1. Характеристика природы фолликулов, составляющих их клеток

и обсуждение, возможных взаимоотношений ооцита. со вспомогательными клетками. .

2. Определение типа оогенеза проринхид с точки зрения общепринятой его классификации.

3. Сравнение полученных результатов с имеющимися в литературе' данными о фолликулоподобных образованиях представителей других турбеллярий.

Научная новизна результатов. Впервые проведено детальное све-тооптическое и электронно-микроскопическое исследование женских гонад, ооцитов и вспомогательных клеток Ьеса^оерп^ЪеНб-Ьа в Динамика на примере как некоторых байкальских эндемиков, так и видов-космополитов - представителей семейства ЕгогЬупсмаае. Выяснено, что .клетки, образующие эпителиоподобные стенки фолликулов, . представляют собой, с одной стороны, желточные клетки . (вителло-циты) 1игЬе11аг1а ИеоорЪога; с другой стороны -они обнаруживают некоторые черты сходства как с■фолликулярными клетками, так и с трофацитами. Описан не имеющий аналогов тип оогенеза. Обнаружена, морфофункцяональная специализация поверхности желточных клеток: развитие'микроворсинок и формирование пиноцитозных пузырьков. Впервые показана также микропиноцитозная активность» ооцитов у турбеллярий. Описаны особые межклеточные связи между вителлоцита-ми, а также между последними и ооцитом.'Впервые получены данные плоидности желточных клеток плоских червей.

Научная и практическая значимость. Проведено сравнительно-цитологическое исследование женских гонад и оогенеза турбеллярий-. проринхид, которое связано с несколькими независимыми проблемами как клэточной биологии и биологии развития, так'и зоологии, систематики и филогении. В,работе затрагиваются, с одной стороны, Проблемы взаимоотношений половых и вспомогательных клеток в ооге- ■ не за"; вопросы меточной дифференцировки, с другой - делается по. пытка подвести черту под многолетней дискуссией .о составе thoвpithвlietв. %

Рабата содержит, новые, не известные ранее данные об организации йоцитов и вителлоцитов плоских червей.'.'К известным ранее'

i i

типам оогенеза добавлен уник&яышй сэгонэз, характеризующий целую группу турбедтгярий. На основании сравнения собственных ультраструктурных дашшх об организации <йо.чдеткулов Prorhynchídna л литературных сведений о строении женских гонад и мор{>офункцяональ-ннх взаимоотношениях ооцитов и вителлоцитов других турбеллярий предложена'частичная ревизия отряда Lacithoepitheliafca.

Специальный интерес и большое практическое значение представляют исследования эндемичных для озера Байкал животных. Изучение байкальских эндемиков является одним из условий правильной оценки биологических процессов, протекающих в озере, знание которых требуется для решения проблемы рационального использования водных ресурсов Байката,' ряда экологических и природоохранных задач. Массовые', широко распространенные беспозвоночные, к которым ' относятся эндемичные для Байкала ресничные черви - представители семейства ProrhjrochidGe, могут служить возможными биоиндикаторами в условиях усиливающегося в последнее время антропогенного воздействия на уникальную экологическую систему озера (Тимошкин, 1988). Вместе с тем, изучение биологии и размножения байкальских проринхид затруднительно без знания организации их женской половой системы.

■ ' Некоторые результаты работы используются в спецкурсе "Иро-эмбриональное развитие" на кафедре эмбриологии Санкт-Петербург-' ского государственного университета.

Апробация работы. Материалы работы докладывались на Всесоюзной конференции "Функциональная морфология матки" (1991 г.). и научных .семинарах лаборатории морфологии клетки Института ци-.'толог'ия РАНГ в 1990 - 1992 гг.

Публикации. По'теме диссертации-опубликованы 3 работы. I статья находится в печати'.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из двух томов. Первый том включает 7 разделов (введение; обзор литературыj ма- 1 теряал и методики; результаты и обсуждение; три раздела, посвящен-пые.обсуждению некоторых общих результатов исследования; выводы), а также список литературы Í4Z4 наименований, в том числе 84 -иностранные работы). ' Текст-дисоортацшг изложей на к>& страницах. Второй том - иллюстрированное приложение, содержащее 30 рисунков, объединяющих 4 схемы и ^г световдо.я электронные микрофотографии. .

МАТЕРИАЛ И МЕТОДИКИ .

Материалом для настоящего исследования послужили 7 видов турбеллярий - представителей рода Geocenfcrophora (отряд Lec.i-thoepitheliata, семейство Prorhynchidae):, G. incognita Timosh.cin et Sabrovskaáa, 1984-j G.intersticialis (Eimoshkin, 19B4-; G.poríí-rievna Timo shit in et ßabrovskaja, 1954-; G.uagini Timoshkin, 1984-; G.wasiliewi limoshkin, 1991; G.baltica (Kennel, 1883); G.sphyro-cephala de Han, 1876. Первые 5 видов в списке - байкальские эндемики, G.báltica и G.ephyrocephala - космополиты. Использованы обычные методики- сбора и видового определения червей (Тташт, 1988; 199Г).

Для световой микроскопии использованы стандартные гистологические и гистохимические методики. Материал фиксировали жидкостями Буэна, по Чиаччяо и в смеси абсолютного спирта и ледяной уксусной кислот« (3:1) и заливали в парафин. Дяя общеморфологических целей применяли окрашивание срезов кислым гематоксилином Май-эра (с докраокой эозином), триокснгематеяном Ганзеяа, по Меллен-дорфу и модифицированному методу Гомори (Акшлченков, 1973). Нуклеиновые 'кислоты выявляли с помощью окрасок галлоцианин-хромовымь квасцами или метиловым зеленым-пирошшом по Унна; ДЦК выявляла реакцией Фельгена, а также с использованием люминесцентного окрашивания по Hoechst и DAPI (Sahar,' latt, 19SO; Schweizer, ^980); в последнем случае препараты просматривали и фотографировали с помощью микроскопа "Лшам-Р8". Углеводы выявляли с помощью рав-РЭакции (в том числа на полутонких срезах). Суммарные белки выявляли окраской бромфеноловнм синим, 'липиды - окраской Суданом Ш,

Для цйтафотометрического исследования препараты диссоциированных на отдельные клетки фолликулов окрашивали по методу Федь-гена; оптическую плотность ДНК-фуксинового комплекса в ядрах определяли методом сканирования '(Arpoскин, Папаш, IS77) с. помощью микроскопа-пигофотометра SMP-зо (объектив х40) фирмы "Opton1 со счетно-апаллтичвской приставкой ibas-i. В качестве стандарта при определении плоадщости использовали тетраплоидные по количеству ДНК ядра сперматоцитов I порадка. •

• •. Для изучения РНК-синтетичаской активности оодитов р вителло цитов применяли авторадиографпческую методику о. использованием ^-уридина с удельной активностью 37 мКи/ммоль. Результаты получены при инкубация чорвей с удаленным передним концом тела "

<

,'G.báltica) в растпоре пред?ч'эственнака при дозэ облучения в 50 мкКп/мл в точенно 0.5, Г.5, 3 и 5 ч.

На ультраструктурногл уровне изучены наиболее подробно О.рос--•irievae, G.báltico, 5. nphyrocoplinla П отчасти- G. Incógnita IT r.infcernticialia. • Дет электронной макрос копни материал фиксировали в 1% глутаралъдогпде на 0.Г5 М лакодплатаом буфере при 4° 0 в течение ночк, прэшвалп в 0.1 гл буасро и дофлксироваля в тэчапио 2-4 ч в 2% растворе 0зэ1у пл 0,15 f! <уфзре при комнатной температур з, обезвоживал:: в оггупах, пр^.ч-ппли через ацетон к заключал!' в Эяон 812. :>льтр.' тонки-? ерозч тголучзли, контрастировали ураянл-ацетатом и цг.трато-л сяпнпа и просматривали а ялектрочинх микроскопах JE!¡~7A, Ж1-1С03 алц 2®ЗЫ. ш-500 по обычяой методике. Для выявления ИИ и ДПП проводили обработку сгизо;? раствором егта по Бернару (Bemhord, 19S9). Для фэрмзнтптавного переваривания J®K материал, фиксирование.! в г.зутпрзльдегиде, после короткой промывки буфером обрабатывали- в течение I ч 0.1 % раствором ЭДКазн » присутствии ненов llg2+.

РЕЗУЛЬТАТЫ IÍ ОБСЗТдаИИЕ ' Обшая характеристика капских. гонад

Кэпскгга. гонады геоцентрофор, как и остальных проринхид, . представлены одиночным мешковидным гермовителлярпои, который ¡злеет собственную хорошо внраненную-стенку клеточной природы; однако границы между отдельны?,га метками достоверно не обнаружены нк «а •световом, пи на ультраструктурном уровне.

По длине гэрмоштэллярия обнаруживается определенная зональность, отвечающая стадиям развития фолликулов и, соответственно, последовательным стадиям оогенеза. Можно выделить до а стадий фор-мяровалил и созревания фолликулов и соответствую«!« им зон герло- _ внтеллярйя, следующих .друг за другом в проксимоднстальном направлении (рис.1). I

Г. Зачатковая зона. Расположена в заднем конце гонады и характеризуется морфологической "однородностью составляющих ее клеток. Делений клеток в этой зоне не обнаружено.

' 2. Зона рэзмнокония витзллоцитов. В этой области впервые четко обнаруживаются различия между жэлточнгага «латками и вступившими в рост ооцитани. Среди витоллоцитов наблюдаются клетки, находящиеся в состояния митоза.

(ЯР* жЩь © щ N Щвйш & ^^¡АЫ^;:".1.') ¥ щшшщ

ЗАЧАТКОВАЯ та ЗШ - размножения вителлоцитов Ь = ы з: -о о £ С а: 5 г > о = а зс эе зон/, ещорттавнык щвттвв зона зрелых - фвллвщвв

тп мцт

ша ваши щ о в пиша . та большого ¡мота ввввша

зона . врвввтвлтвнЕза В ВИТЕтоЦИТАХ та ввшвтгеввзя В ВИТЕЛЛОЦИТАХ

Рие.1. Схема зональности гермовителлярия Сгеосеп1ггорЬоге /по:- Боголюбов и др., 1990, е изменениями/

3. Зона формирования фолликулов. Наиболее характерная черта згой области - начало закономерного расположения желточных клеток вокруг ооцита. Следует подчеркнуть, что в перечисленных выше трех зонах гергловителляркя фолликулу еще отсутствуют.

4. Зона сформированных фолликулов. Эта зона характеризуется присутствием фолликулов как стабильных комплексов, образованных ооцитом и окружающим его эяиталггоморТяш слоем желточных ¡слеток.

5. Зона зрелых фолликулов. Для нее характерно завершение роста ооцита и достижение вителлоцитами их терминальной диф^а'рея-цировки.

Приведенной зональности соответствует определенная зональность в ходе ооганвза и вителлогедаза (до отношению к вителло-цитам). На основании общепринятой в эмбриологии периодизация процессов оогенеза и глейоза в герг.ювителлярии геоцонтро£ор ж различаем два зоны (рис.1).

Г. Зона малого роста. Эта область совпадает с зоной размножения вителлоцитов..В ядрах ооцитов этого участка гермовителлярия представлены стадии лептотены, злготены, пахитены профазы мейоза.

2. Зона большого роста. Ядра ооцитов в этой зоне находятся на стадии дигоготеяы профазы глейоза. Дистальную часть зоны большого роста (охватывающую наиболее развитые сформированные фолликулы и зону зрелых фолликулов) можно определить как зону вителло- , генеза в желточных клетках. В проксимальной части зоны большого роста желточные включения в цитоплазме вителлоцитов полностью отсутствуют.

Клеткч,. окружающее ооциг в гояаде проршшад, представляют собой' настоящие желточные клетки ТигЪвИвг1п МгоорЬога. По нашим наблюдениям' (см.ниже) они синтезируют и запасают в своей цитоплазме большое количество различных резервных воществ. Этот вывод подтверждают и наблюдения других авторов над откладкой сложных яиц и эмбриональным развитием различных РгогЬупс^ааэ -(£И;е1пЬоск, . ЛизэегЬо*ег, 19^9; Не1в1п(тег, 1968; Кэ1з1псег еЪ о1,, 1974). , /

■ Ооцита и вчтвллотшты г

-Общая характеристика мор^дтаамгга ооцитов и вителлоцитов. На ультраструктурном уровне былгг подробно исследованы лишь дис-талыше зоны-горгловятел-гярия (особзлно подробно - зона зрелых фолликулов - У Я,рогГ1гхагае, а.Ъя11;:).с>а П 0.!зрЬугосерЬа1в). I

. .зачатковой зоне все метки шглядят морфологически •одинаковыми и имеют удлиненную форму. Большую часть клетки занъ-мает базофилы-юе ядро, в котором имеется два пиропшофилышх яд рышка примерно одинаковой величины.

В зона размножения желточных клеток утрачивается однородность клеточного состава: вступившие в рост ооциш четко отличаются от уже детерминированных вителлоцитов своими' крупными размерами и пузыревидными ядрами, в которых тлеется два гетероморфных ядрышка. В зоне размножения желточных клеток ооцгкы проходят стадии профазы мейоза, соответствующие периоду малого роста, и вступают в стадию диплотены. Среди желточных клеток наблюдаются митотические деления.

В зоне формирования фолликулов ооциты представляют собой крупные метки,'часто расположенные в гонадэ по соседству друг с другом, чего никогда не происходит на более поздних стадиях, когда ооциты отделены друг от друга слоями желточных -клеток. Желточные клетки обнаруживают тенденцию группироваться вокруг ооцита. Начинается формирование фолликулов. В 'этой зоне завершаются деления желточных клеток, и далее по длине гермови-теллярия они не возобновляются.

Специализированных контактов в зоне формирования фолликулов между ооцятамя и вителлоцитами не обнаружено. Ооплазма малодиффе-ренцироваиа и заполнена большим количеством свободных рибосом и митохондрий. Видны также отдельные профили шероховатого эндо-плазматического ретикулума (шЭПР) и в той или иной степени развитые комплексы Гольджи. Уже па этой стадии в ооплазме исследованных С.рогПгЛвуае и О.ЬаИ:1са обнаруживаются единичные включения; при этом появление первых включений происходит без видимой ктопографической связи с какими-либо клеточными органоидами. Ос-: нову этих ранних включений составляют липиды.,

В цитоплазме вителлоцитов йз зоны формирования фолликулов какие-либо включения отсутствуют. Йрактически весь объем желточной .клетки занимает ядро. Вителлоциты имеют очень'длинные, часто разветвленные цитоплазматические отростки, которые окружают соседние желточные клетки и ооциты. Микровороннки на поверхности , клет.ок отсутствуют. В цитоплазме желточных клеток видны профили шЭПР, более многочисленные, чем в цитоплазме ооцятов,, находящихся на той же стадии формирования фолликулов, отдельные комплексы Гольджи. Цитоплазма вителлоцитов также богата свободными рибосомами. ■ •'

1 ' . В зоне Сформированных фолликулов происходит значительное увеличение объема ооштазш яйцеклоток. Ооцпт ¡тоет видимые на светооптичооком уровне цигоплазмамтескяе отрос пси, которые проникают между гелточными клетками, окружавдгми яйцо эпите лиоморфнш слоем. На повэрхпос-гп згрлгочгп« клеток, обращенной к стенке гонады, появляются редкие, неветвящшся короткие кроворсинкн. В цитоплазма желточных клеток дальнейшего развития достигает сеть шЭПР и в некоторой степени комплексы Гольджи: увеличиваются. размеры и количество диктносом.

В дистальных участках зоны сформированных фолликулов в желточных клетках начинаются процессы синтеза и запасания резервных веществ. В цитоплазме ооцнтов описываемых фолликулов также' продолжает возрастать число профилей глЭПР, которые, однако, по-прск-нему представлены и основном в вида отдельных цистерн, и комплексов Гольд»!,' образующих многочисленные везикулы. Несколько возрастает количество и размеры включений.

Зона зрелых фолликулов. В отой зоне ооцпт я его ядро окрыляются. Ооплазматлческие отростки на светоопткческом уровне не выявляются. Ня разу не удалось наблюдать образования ■ глетафазноЛ пластинки, делений созревания ооцита или образования направительных телец. Очевидно, в период созревания ооцит вступает уже после откладки кокона.

Оопиты в зоне зрелых Лоллтсудов. В ооцитах из зоны зрелых^ ' фолликулов в ходе вителлогенэза дальнейшего развития, по сравнению с предыдущими стадиями, достигает система шЭПР и комплексы ■ Гольдки, которые располагаются практически равномерно по всему объему ооплазмы, главным образом - в непосредственной- близости от формирующихся включений ( рис.2). Дистальныо -отделы диктиосом . образуют многочисленные мелкие пузырьки, которые сливаются между собой и'о-формирующимися включениями..Активный синтез и запаса- • ние резервных веществ в виде включений, имеющих различное морфологическое строение, является наиболее заметной особенностью структуры цитоплазмы как ооцятов, так и вителлоцитов из зоны зрелых фоллшсулов.

В ооплазме■геоцентрофор первые включения появляются на довольно ранних стадиях - еще в зоне разшокения вителлоцитов, ко-• гда оогглазма слабо дифференцирована, в ней отсутствуют такие органоиды, как зютоплазматическип ретикулуи и комплексы Гольд-г:л. По своему химическому составу эти включения представляют собой лшидные капли. Начиная с дистальных областей зоны оформи*

рованных фолликулов, включения внгллцят неоднородными по своей структуре. Основную их часть занимает по-прежнему липидный компонент. Гястозшическиш методами выявлено присутствие в состапе включений в ооцитах геоцентрофор, начиная с описываемой стадам, кроме липидов, некоторого количества белков и углеводов.

Характерной особенностью вителлогешшх ооцитов геоцентрофор являются морфологические видоизменения митохондрий: в них значительно уменьшается количество и размеры крист, ыатрикс становятся электронно-прозрачным, в нем нередко обнаруживаются шого-дластгогчатие миелиноподобные структуры. Видоизмененные (дегенерируйте?) митохондрии в виде больших скоплений окружают формирующиеся желточные включения (ряс.2: м?). Однако роль таких митохондрий в вителлогенезз не ясна. В области формирования желточной глобулы в ооплазме можно обнаружлть, таким образом, следующие органоиды: цистерны шЭПР, активно Функционарущяе'комплексы Гольджи, многочисленные видоизмененные митохондрии и многопластинчатые тела, а в более поздних ооцитах, кроме того, -пористые пластинки (рис.2 ).

Б зрелых фолликулах выражено периооцитное пространство, ширина которого может достигать 0.1 мш. В поверхностном слое ооплазмы близ оолемми обнаруживается большое .количеотво мелких, около 100 нм в диаметре, пузырьков. В ооцитах о,ЪаШ.с'б удалооь' проследить образование таких пузырьков путем впячивания с последующей отшнуровкой от оолемми. Таким образом, обнаружена пияоци-тозная активность на поверхности ооцита. . '

Желточные клетки в зона зрелых Фолликулов. Как' и у других ■' высших турбеллярйй, у геоцентрофор основное количество резервных' веществ синтезируется и запасается вителлоциташ. По сравнению с ооцитом, существенным отличием .цитоплазмы этих клеток является присутствие в ней нескольких типов включений, а не одного, как в ооплазме. .

По ультраструктурным особенностям цитоплазмы вителлоцитов . обнаружены межвидовые отличия в.balti.cn и 0.рогПг1еуаб, с од-, ной стороны, от 0.вр11угосерЬа1а - с другой. Так, в желточных клетках й.брЬугосериа1а мощного развития достигает шЭПР, цио- , ■ терны которого образуют обширные многослойные структуры, в которых может насчитываться до.20 профилей. В цитоплазме вителлоцитов й'.Ьатс.а и й.рогПг1е*рв обнаружены три типа включений: два типа желточных глобул (рис.2:. в1, в2 ) предположительно углеводно-белковой и.углеводно-лшшдной природы и электронно-

стад»

ertSS™

о "«/n i -3 -re-.

Зо.0.©^ • ./re " LiW'' (fJ.^"W r'.4i¿

o

■o oo ._.Loo - т^гаго

o

• : ..•. . "o-* ® " ■ ■■ Qo,: Д** °

^PfP^O-;: -'И!9• '-

- • - • • O • V V ¿ц

•-:к,

» • - -si

-'':•.•-•■ т.'.!':.-:.•.:..•■•.■; '■•-}{• : • .

'■I'

Рис.2. .Citoria ультрасоружгурной оргачазацпи фолликула Gooccatrowhora па примззз !}.4orf.J:4ovee

'и

Плотные мелкие включения (рис.2: вЗ), представляющие собой, гю-'влдимому, скорлуповне гранулы. В вителлоцитах О.БрЬугооерЬа1а, кроме того, имеется особый тип желточных включении, в составе которых присутствуют кристаллоподобные структуры.

С началом синтеза цит.оплазматических включений мощного развития в цитоплазме виталлоцитов достигает бэдокоинтезируиций аппарат, особенно у 0.8рЬутосерЬа1а, и активно функционирующие комплексы Гольджи. Б цитоплазме вителлогенных желточных клеток, кроме включений, многочисленны разнообразные по форме и размерам пузырьки и вакуоли. Некоторые из них, окруженные двойной мембраной, как и в ооцитах, представляют собой, вероятно, видоизмененные митохондрии.

Поверхность желточных маток геоцеитрофор, в отличие от ви-теллоцитов других плоских червей, в высокой степени специализирована. Она покрыта длинными микроворсинками, либо образует' более сложно устроенные цитоплазматстческие ветвящиеся выросты, что во много раз увеличивает ее площадь (рис.2: мв). В основании микроворсиной'' обнаружено образование пиноцитозных пузырьков.

Весьма своеобразными особенностями отличаются связи между желточными клетками в составе фолликула, а также шалу желточной клеткой и ооцитом. Так, соседние желточные клетки образуют огг-ростки, каддый из которых вдавливает стенку соседнего, вятеллоцита так, что оказывается охваченным его наружной мембраной. Это обра. зоваяие, в свою очередь, охвачено вакуолью с электронно-прозрачным содержимым,'мембрана которой тесно примыкает к инвагиниррван-ной наружной мембране ее клетки (рис.2:- ва). В чбласти вершины каждого отростка мембраны соседних в'ителлоцитов также тесно при- • мыкают друг к друпу, Описываемые отростки часто группируются по > два и по три, причем в таких случаях они располагаются в противоположных направлениях.

Специализированные' связи между ооцитом и желточными клетками представляют собой многочисленные короткие булавовидные отро-' стки (рис.2).. Как и в предыдущем случае, в состав такого кон-, такта зходат вакуоль, ' которая охватывает отросток ооцита с при. мыкающей к нему мембраной желточной клетки. ■ •• . Ультраструктура ядер ооцитов и вителлопитов "'Ядро ооцита (рис.2: ДО). Напомним, что на ультраструк- ' турном уровне исследованы стадии фолликулогенеза, которые охватывают лишь одну стадию в развитии''ооцита: длительную диплотеку. Лишь однажды в нашем'материале оказался расположенный в самой

каудальной части гонада ооцит G.incognita на стадии поздней па-хитеяы: в его ядре был виден синаптонемпый комплекс. В целом ядро ооцита в ходе формирования и развития фолликула мало изменяется в морфологическом плана. Наиболее заметные изменения претерпевают ядрышки ооцита.

, В ядрах клеток зачатковой зоны гермовителлярия обнаруживают--ся два одинаковых по размеру ядрышка. В молодых ооцитах из зоны размножения желточных клеток так х:е присутствуют два ядрышка, однако уже а этой зоне-л особенно в зоне формирования фолликулов вместе с общим увеличением объема ядра ооцита наблюдается увеличение размеров только одного аз ядрышек. Второе ядрышко становится фябршшгрным, вакуолизируется и исчезает. В ядре ооцитов из зоны зрелых фолликулов всегда присутствует только одно из ядрышек. Оно имеет округлую форму, увеличивается в объема и достигает к концу 'периода роста ооцита у крупных видов около 15 мкм в диаметре. Яд-ршшсо более молодых из исследованных ооцитов тлеет ретикулярное строение. В его составе различимы как фибриллы 20-30 8 толщиной, так и гранулы, до 170 Ä в диаметре. От поверхности ядрышка в кариоплазму отделяются агрегаты гранул, которые затем распадаются на отдельные прорибосомныа частицы.

По маре своей работы, в дистальной части зоны сформированных фолликулов внешний вид ядрышка, заметно изменяется, и оно приобретает очень характерное строение, мало менящееся в дальнейшем вплоть до завершения ооцитом своего роста в гермовителлярии. На срезах,' проходящих черэз центр ядрышка, всегда отчетливо видны' 3 характерные области. Волыдую .часть ядрышка занимает центральная гомогенная сердцевина средней электронной плотности, состоящая из плотно упакованных тончайших фибрилл. Не исключено, что эта стру-. ктура представляет собой гипертрофированный фибриллярный центр. Еа окружает фибриллярное кольцо большей электронной плотности. И, наконец, самая периферическая область - гранулярная зона, представляющая собой отделяющиеся.в кариоплазму кластеры, гранул. В дальнейшем эта область постепенно исчезает, так что в зоне зрелых фолликулов.ооциты зачастую имеют ядрышки, состоящие лишь из огромной тонкофибриллярной сердцевины и узкой, более плотной, фибриллярной периферической кайлы . (рис.2).

Морфодинямика'ядрышка свидетельствует о затухании синтеза рРНК-к средним этапам даплотенн. Это подтверждают н предварительные авторадаографическиа данные: на более ранних стадиях ядрышко

ооцита включает 3Н-уридин, позднее включение метки обнаруживается лить в периферической гранулярной части и, наконец, фибриллярные ■ ядрышки ооцитов, заканчивающих рост, практически не включают предшественник.

■Хроматин в дяплотенных'ядрах ооцитов гэоцентрофор при окраске по Фельгену, Hoechst и DAM выявляется в виде диффузной се-• ли тонких тяжей и нескольких конденсированных глыбок. На ультраструктурном уровне гетерохроматиновые таыбки различной формы разбросаны по всему ядру. Кариоплазма выгладит ?аполнениой плотными гранулами РНП диамзтром 400 К л прорибосошыми частицами; при 1 обработке ДНКазой или edta . эти гранулы сохраняются, а в ядра становится хорошо заметной разветвленная сеть фибрилл толщиной

20-60 Я. . ' , \

Ядро ооцита окрушно. оболочкой, перфорированной многочисленными ядерными порами. Четко выражен фиброзный слой (ламина) (рис.2), который в ядрах ооцитов G.baitica имеет толщину 40-60 им. При обработке НОТА гош ДНКазой ламина сохраняется и, тем' самым, • Може? 'быть легко ¡отличима от связанного с ней пристеночного гетерохроматина. В зоне зрелых фолликулов (в- период .активного вителлогенеза в ооцитах) посредством ядерной оболочки осуществляется передача веществ из ядра в цитоплазму. Одним из ее способов является непосредственный транспорт тонкофибриллярного материала через ядерные порг. В этом случае вблизи ядерной оболочки формируются перинукдеарнне тела (ряс.2: пт). ' ■

Другтл морфологическим проявлением перехода веществ из ядра . 'в ооплазму является отпочковывание от ядерной оболочки пузырьков, 'I-I.5 мкм в диаметре. В их формировании пршн ?,рт участие обе мембраны ядерной оболочки и ламина (рис.2: ал:). Образующиеся ■ 'пузырьки заполнены ге'тороморфным содержимым, прэдпе питательно РНП. По своему происхождению и особенностям строения образующееся пузырьки практически ничем не отличаются от так называемых акцессорных, или добавочных, ядер (accessory nuclei), .характерных для ооцитов некоторых. насеко?.кх (см., например: B.iii&ski, 1989).

В желточных метках не наблюдали образования ни -акцессорных ядер, ни перпнуклезрных тел.

Ядро к о, 'л точно и к л о т к и. В хода формирования- и развп- • ?пя фолликулов o.wnslliewi,. G.wosini, G.incocnitn, G.porXirievnft Л G.bnlt'icfi .чпра ллгеляоцитоз морфологически пзг.тмотся мало.' • Ядро мт^л'лоц'лтл. (-кто.2: ЛВ) зачоляоно плоиина Г'глЗкамя гзте-

г'Л'чулэми раз.тлч г>го ртзмора.

Для желточных клеток G.báltica, а Также G.porfirievae и, по-видалому, всех остальных байкальских 'эндемиков (за исключением G.intoraticialis) характерно сохранение функционально активных ядер вплоть до самих поздних этапов развития этих клеток в гермо-вителлярпи.

В ядрах зрелых вителлоцитов G.baltica и a.porfirievae за- . метно крупное ядрышко округлой (формы, имеющее на ультраструктурном уровне ретикулярное строение с хорошо выраженным гранулярным компонентом. В ядрышках желточных клеток этих видов различимы 1-2 центрально расположенные скопления фибриллярного материала средней электронной плотности,' представляюцие собой, вероятно, фибриллярные центры. Авторадиографически выявлено, что в ядрах самых зрелых вителлоцитов G.baltioa происходит синтез НТК.

Среди изученных видов у европейской ff.sphyrocephnla и байкальской G.intsraticíaiis происходит инактивация ядер зрелых желточных клеток, что связано с образованием в них кристаллопо-добных тел, постепенно занимающих практически весь объем ядра. Особенно ярко это видно на препаратах, окрашенных'по Hoachst и БАР1 ¡ эти же методы хорош демонстрируют отсутствие ДИК в упомянутой структуре. Это кристаллоподобиоа тело не окрашивается пиро-нином и галлоцианином, но дает слабую реакцию на белки и полисахариды. Среди 7 исследованных на светооптическом и/или ультраструктурном уровне видов геоцентрофор образование в ядрах зрелых желточных клеток кристаллоподобного тела обнаружено лишь у G.sphy-rocephala и G.intorstioialis. Кроме' того, при просмотре гистологических препаратов не исследованных нами байкальских эндемиков G.olgee■ и G.ievanidorum (любезно предоставлены О.А.Тимощкиным) у этих двух видов образования таких тел отмечено не было..Из ли-' TepáTypn известно о существовании кристаллоидов (именуемых "Rie-sennucleolen") В ядрах ЖелТОЧНЫХ КЛ9Т0К шноевропейской G.appla-nata (Heisinser, 1975), а за пределами г/рбеллярий - у некоторых цестод (Hackiewioz, 1968} 1972). Вопрос о происхождении и роли кристаллоидов в ядрах желточных клеток плооких червей остается открытым.

О плояднооти желточных клеток. Проведенное цитофотомэтриче-ское исследование ядер желточных клеток из зоны сформированных фолликулов G.wasiiiewi показали, что .из 47 проанализированных ядер. 15 содергат количество Д1К равное 2с, а'32 - 4с. Ядер, содержащих промежуточное (2в-4-й) количество №. а также превы-

шающее 4с, в выборке не оказалось. Таким образом, наше предположение q Значительном увеличении содержания. ДИК в. ядах вителло-цитов^, что характерно для трофоцитов многих животных, нз подтвердилось.. . .

, ' . О Формировании желточных включений в оошгтах и вителлонитах '

; В.ооцитах всех изученных видов геоцентр'офор на всех этапах развития'в гонаде .'обнаружены'включения только одного типа, интерпретированные', как 'желточные.' То есть в ооцитах прорияхид не об. разуются ни кортикальные, ни скорлупбвые гранулы, найденные в ооплазме ШОГИХ iurbcllariji Neoophora (Qr'enigni-, 1938). Езлточ-' ше включения начинают формироваться в дистальной части зоны сформированных фолликулов, причем их образование связано с ли-пидшдш каплями, которые появляются значительно раньте.

Развитие в ооплазме витедлогенных осцитов геоцентрофор гранулярного эндоплазматического ретпкулума. и коаплоксов Годьджк, 'формирующих пузырьки, котбрые сливаются о ..телточньпли глобулами, свидетельствует о синтезе по крайней мера части желточных белков . (и углеводов) самим ооцитом. Аутосинтеткческпй механизм образования желтка свойственен практически всем изученным турболляриям, как Archoophora, так и îïej.ophore. При этом ни у одного изучен-" ного к настоящему времени вида турбеллярий- не было обнаружено микропиноцитоза на поверхности ооци'та (см.: GremiRni, 1988). Описанные проявления пиноцитозной активности ооцитами геоцеятро-фор делают их яйцеклетки отличными по этому признаку от ленских половых клеток других 'турбаллярий. И хотя использование только ■ морфологических методов не-позволяет точно установить, какие вещества поступают в состава пиноцитозяых пузырьков в ооцит и участвуют ли они в'формировании желточных глобул, можно предполо- .> жить, по аналогии с другими животными, что часть желточных белков у геоцентрофор (и, вероятно, других Proriiynchidae ) имеет .экзогенную природу. •; ■ •

В цитоплазме желточных меток среди обнаруженных в ней нескольких типов включений некоторые из них также могут быть интерпретированы как желточные. Несомненно, ими .являются, например, включения "2-го -ппа" в цитоплазме вптоплоцитов ' .G.porfirievae и • G.bnlUcn. Они тоют, в отличие от икпшэний "1-го типа",

совершенно гладкую поверхность, окрушни четко, различимой мембраной. В составе включений 2-го типа отсутствуют липиды, но обнаружены белки и углевода. Четко прослежено образование этих включений за счет комплексов Гольдам, как это происходит в ооцитах с эндогенным синтезом желтка. Включения 1-го типа в витэллоцитах в.рог1з.г1еуа9 и б-ЬаН^са внете напоминают включения в ооплаз-. ме. Мембрану, окружающую эти включения, достоверно обнаружить не удается. Гистохимическими методами выявлено, что основу включений 1-го типа составляет, липидный компонент. Не обнаружено присутствия в этих включениях значительного количества белка,' по в периферической части выявляются углеводы. Включения 1-го типа рассматриваются как своеобразный тип желточных включений, поскольку они оказались более сложно устроенными, чем обычные лишадше капли ("липидные тела") в вителлоцитах многих турбеллярий.

Таким образом, в вителлоцитах геоцентрофор запасаются желточные включения предположительно углеводно-белковой и углеводно-лшшдной природы.

Не представляется возможным однозначно'интерпретировать включения "3-го типа" В вителлоцитах , в.рогЗПг1еуае И (г.ЪаИ^са. Это мелкие, 0.2-0.4 мкм в диаметре, окруженные мембраной гранулы. В отличие от включений первых двух типов, они появляются лишь в наиболее зрелых желточных'клетках и всегда имеют одинаковые размеры, -не изменяющиеся в ходе их развития. Предположительно, , они представляют собой скорлуповые гранулы.

Большим разнообразием отличаются включения в цитоплазме зрелых желточных клеток 0.зрЬугооерЬа1а. Однако, по-видимому, и здесь некоторые включения могут быть интерпретированы как желточные и скорлуповые.

'■ Специализация поверхности вителлогенннх желточных клеток геоцентрофор (образование на ней микроворсинок или более сложно устроенных ветвящихся цитоплазматических выростов и линоцитоз У .их основания) свидетельствует о получении клеткой веществ извне. Однако нельзя определенно сказать, какие вещества поступают в клетку, какова их дальнейшая судьба (в частности, попадают ли они из цитоплазмы вителлоцртов в периооцитное пространство, из которого затея поглощаются ооцитом) и какова их возможная роль

по'отношению к фондирующимся в цитоплазме желточной клетки в!слю-• ^

чениям. '

Обсуждается возможное участие стенки гермовитэллярия в обеспечении экзогенными предшественниками желтка ооцитов и вителлоци-

ТОВ Geocentrophora. *

О происхождении желточных клеток

Среди исследователей плоских червей широко, распространено мнение, что желточные клетки турбеллярий представляют собой абортивные ооциты, утратившие способность к развитию и,специализированные-к синтезу и запасанию.в цитоплазме резервных включений (Karling, 194-Q; Иванов, Мамкаев, 1973). Источником же половых клеток у турбеллярий, по современным представлениям, служат мало-• дифференцированные клетки паренхимы' - необласты (Стефан-Дюбуа, 1968), которые мигрируют в соответствующие области тела, где 1 вступают в г.аметогенез. . • •

"У проринхид ооциты и вителлоциты становятся впервые различи-' мы. лишь' на стадии, когда женские половые клетки вступают в мэйоз. .' При этом нб обнаружены клеточные деления в слепо замкнутрй кау-дальной части гэрмовителяярия - "зачатковой зоне". Приблизительно такая же ситуация'наблюдается в оогенезе кишечнополостных. Так, у гидры тоже впервые различаются уже ооциты Г порядка (Honogger •et al., 1939); прп этом предполагают, что у Cnidaria период оогониальных делений совпадает с периодом размножения i-клеток (Айзенштадт, Маршак, 1974),- служащих источником всех, за иоклто- . чением эпителиально-мышечных, .клеточных типов (Полтева, 1981), , в том числе ооцитов и своеобразных питающих клеток (nurso ceils). На основании этих и других рассуждений -предложено для плоских червей, по крайней мере проринхид, не называть желточные клетки "абортивными ооцитами", а лишь указывать', что ооциты и вителлоциты имеют общее происхождение, дифференцируясь из.необластов, ■ ' которые Ф.Стефан-Дюбуа (1968) считает соматическими или называет "сомато-лоловыми" клетками. .

К вопросу о классификации оогенеза бепсеп-Ьгпр^пгя-Спавнительная характеристика Фолликулоподобных образований донских гонад некоторых ТцгЬеПяПа с Филогенетическими замечаниями

Предложенная в начала века классификация гаметогенеза (Ког-веЛвИ;, Не1с1вг, 1902), несмотря на свою ограниченность, до сих пор широко применяется при исследовании оогеиэза а той или иной группе животных как отправной базис для понимания особенностей развития ооцита в каждом конкретном случае с морфологической и функциональной точек зрения.

На основании классификации Коршельта и Гайдара оогенез большинства турбеллярий следует рассматривать как типичный солитарный, даже у ТцгЪе11аг1а ИеоорЬога, имеющих .специализированные келточ-■ ные клетки: в общем случае их на следует рассматривать как вспомогательные клетки в оогеиезе.

В то же время, оогенез проринхид обнаруживает черты алиментарного оогенеза. При зтом вителлоциты этих червей имеют черты сходства как с трофоцитами, так и с фолликулярными клетками, являясь одновременно настоящими желточными клетками ТигЬвИаг1в НаоорЬога.

О трофоцитами эти клетки.отчасти сближает, во-первых, их общее с- ооцитамл происхождение, во-вторых, эти клетки проявляют высокую.синтетическую активность. В частности, их ядра синтезируют РНК, о чем свидетельствует интенсивное включение в них 3Н-ури-^ дина. В-третьих, в ядрах вителдоцитов геоцентрофор.наблюдается • увеличение содержания ДНК, что характерно.для ядер трофоцитов (см. : Айзенштадт, Маршак, 1969; Бродский, Урываева, 1981;- Айзан-. штадг, 1984 ); В. вителлоцитах аеосвпЪгорЬог» оно весьма, незна-. чительное - на более чем в 2 раза. Однако у. тэх животных, у которых на'растущий ооцит приходится много питающих клеток, заметного .увеличения содержания ДНК в их ядрах не происходит (Алзенштадт, Маршак, 1969 ).

Одним.Из признаков, отличающих вителлоциты геоцентрофор и трофоциты беспозвоночных животных с дутриментарным оогенэзом, является, во-первых, отсутствие межклеточных мостов между желточными клетками и ооцитом. Во-вторых, по крайней маре большая часть . синтезированных ими веществ запасается в их собственной цнтоплаз-: ме я,- таким образом, их ¡функция "адресована" не к яйцу, а к развивающемуся зародышу.

С фолликулярными клетками вителлогдиты геодентпофор облшкает высокая правильность их эпителиального расположение вокруг оощг-та, наличие морфологической связи их с растущим ооидтом и друт с другом в виде своеобразно устроенных межклеточных связей и свидетельства получения оощлом веществ путем микропиноцитоза из пери-ооцитного пространства. В то же время, от обычных фолликулярных

• jure ток их отличают особенности, характерные для. желточных клеток плоских червей: общее происхождение с ооцитами, а также синтез

и запасание в цитоплазм резервных включений, что не характерно для фолликулярных 1слеток,

Характер.формирования фолликулов проринхид не имеет аналогов среди других групп ресничных червей. До недавнего времени счита-■ли, что фолликулы, стопки которых образованы вителлоцитами, фор- 1 . мируются в гермовите.-хлярияА представителей семейства Gnosonasi-1 midas (Reisinger, 1926; Martens, Schoolcs.ort, 1935). По мнению.

• Т.Керлинга (Kerlins, 196В), это один из важнейших признаков,' объединяющих гпозонезшид и проринхид в'пределах одного таксона

. Lecithoepitheli'atа. В. настоящей' время "фолликулярность" женских гонад остается единственным признаком, благодаря которому' таксон becithoepitheliata (Prorhyrtchidaa + Gnoraonosimidoe) ЭЩ2 существует. Появившиеся недавно электронно-микроскопические данные, •касающиеся строения женских гонад. Gnosonesimidae (Schockiert et al., 19B7; Gremigni, 198в),- подтверждают высказанное ранее предположение (iCarling, 1968) -'о том, что в действительности "фолликулы" гнозонеэимид не являются стабильными образованиями гг отсутствует какая-либо морфофункцконалшал связь между ооцитами и вителлоцяташ.

Сравнение ультраструктурных особенностей строения гериови-'' телляриев Prorhynohidae ( собственнее данные ) И Gnosonocimidao. (Greraiçni, 1988) позволили провести частичную ревизию системы bccithoepitheliata (Боголюбов,, Тимоикин, 1993), а именно: вывести Gao sono sinidae из состава, таксона и считать их отдельном отрядом ïurbellaria ¡feoophora - отрядом GnoBonesinida Karling, 1968. Таким образом, Prorhynohidae остаются единственным на сегодняшний - день семейством в отряде Lecíthoepitholiata.

вывода

1. Представители семейства РгогЬупоЬАйав СГигЪеНаПа, Lecithoepitheliйta) тлеют своеобразную организацию яйцевого фолликула, отличную от описанных в литературе фолликулов других беспозвоночных животных: стенка таких фолликулов образована специализированными желточными клэткаш (вптеллоцитамя). Ооциты и вителлоциты имеют общее' происхождение.

2. Фолликулы РгозЛупс!и<1ае сходны у разных видов, но существенно отличаются от фолликулоподобяих образований представителей других таксонов ТигЪеНаг^а,. Фолликулы проринхид - стабильные образования, в которых желточные клетки и ооциты тесно связаны мевду собой на только морфологически, но и функционально.

3. По своей организации вителлоциты РгогЬупсЬХйае отличаются от желточных клеток изученных к настоящему времени Р1а1;11е:1га:1п«1еа! они находятся в тесной морфологической взаимосвязи мевду собой.и

о ооцитом с помощью своеобразных межклеточных связей и имеют высоко специализированную поверхность: развитие па ней микроворсинки и проявления пиноцитозной активности.

,4. Ооциты РгогЬупсЫЛае сохраняют способность к запасанию в ооплазмэ небольшого количества желточных включений, при этом основное количество эндогенного желтка образуется аутосинтетиче-ски. Кортикальные, скорлуповые гранулы и иные включения, кроме желточных, в ооплазме не обнаружены. В цитоплазма вителлоцитов обнаружено несколько типов включений, в том числе различные по ультраструктуре и химическому составу желточные глобулы. Проявления микропиноцитозной активности, обнаруженные на поверхности ооцитов' и вителлоцитов, свидетельствуют о-возможном получении ими гетеросинтетических предшественников желтка.

'1 5.Вителлоциты характеризуются низкой степенью плоидности и цредставляют собой диплоидные и тетрашгоиднне клетки.

6. Предложена частичная ревизия отряда ЬеоИЛоврЗ^ЬеИаЪа! • семейству йпозопеа1т1<1ав придан ранг отряда (вповопвШтХ&а КагИпв, 1968). Ргогьупомаав остаются единственным семейством ' в отряде Lebithoepithaliata. '

Материалы диссертации отражены в следующих работах:

I. Боголюбов Д.С. Элёктронно-микроскопнческое исследование ооге«еза байкальской турбеллярии Gaocentrophöra porfirievae. //Цитология. Г99Х. Т.33, № 9. С.54-55. .2. Боголюбов Д.С., Габаевй Н.С., Мамкаев' Ю.В., Тимоижин' O.A.

.МорфОдинамлка гонад и гаметогенез байкальских проринхид (Turbel-larin, Lecithoepitheliata). //••Тр.' ЗИН-АН ССОР. 1990. Т.221. ! 0.126-149. ' . , , ' . ■

. 3. Боголюбов. Д.С., Грузова М.Н. Ультраструктура ядер ооцитов И, витедл'оцитоэ турбеллярий рода Geocentrophora (Lecithoepithali-&t'a\ Prorhynchidae). //'Цитология. 1993, в печати.

,'4. Боголюбов Д.С., Тимодкия O.A.' Сравнительная характеристика женских гонад becithoepithlsliata (Plathelminthes) о выводами о таксономии отряда. // Зоол. яда. ,1993, Т.72,- № 2. C.I7-26.