Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Сравнительная характеристика вакцинного и эпизоотического штаммов реовируса теносиновита кур

ВАК РФ 03.00.06, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Сравнительная характеристика вакцинного и эпизоотического штаммов реовируса теносиновита кур"

МИНИСТЕРСТВ СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА И ПРОДОВОЛЬСТВИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ ДЕПАРТАМЕНТ ВЕТЕРИНАРИИ ВСЕРОССИЙСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ КОНТРОЛЯ, СТАНДАРТИЗАЦИИ И СЕРТИФИКАЦИИ ВЕТЕРИНАРНЫХ ПРЕПАРАТОВ

СРАВНИТЕЛЬНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ВАКЦИННОГО И ЭПИЗООТИЧЕСКИХ ШТАММОВ РЕОВИРУСА ТЕНОСИНОВИТА КУР.

На правах рукописи

УДК619:576.823.2- 063.8:616.76- 002:636.32/58

03.00.06 - вирусология

АВТОРЕФЕР АТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

МОСКВА 1997

Работа выполнена в отделе вирусологии Всероссийского научно исследовательского ветеринарного института птицеводства, на 1 птицефабриках различного технологического направления.

Научный руководитель - кандидат биологически наук,

Ведущая организация - Всеросийский научно-исследовательский технологический институт биологической промышленности (ВНИТИБП)

Защита диссертации состоится 1997 г. в часов на заседании

диссертационного Совета Д 120.85.01 при ВГНКИ по адресу г.Москва, Звенигородское шоссе, д.5

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВГНКИ

с.н.с. Трефилов Б.Б.

Официальные оппоненты - доктор биологических наук,

профессор Осидзе Н.Г.

кандидат ветеринарных наук, Смоленский В.И.

Автореферат разослан ' евраля 1997 г.

диссертационного совета

Ученый секретарь

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. К настоящему времени в литературе накопилось достаточно сведений о выделении реовирусов (около 11 серотипов) при разнообразных патологических процессах у птицы, проявляющихся в виде энтерита, синовита, миокардита, перикардита, сальпингита,"синдрома плохого всасывания" (Bains B.S. et al., 1974, Kouwenhoven В. et al.,1988, Sterner F.J. et al., 1989, Shirai J.et al.,1990, Belar S. et al., 1993).

Первые сведения о выделении реовируса у птиц относятся к 1954 г., когда Fahey J.E., Grawley J.F. изолировали вирус у цыплят с признаками хронической респираторной болезни.

Случаи заболевания артритом цыплят с определенной вирусной этиологией были впервые описаны в США (Olson N.O., Kerr K.M., 1966).

Впоследствии было показано, что агент, вызывающий заболевание, является реовирусом (Walker E.R. et al., 1972).Dalton P.J., Henry P. (1967) сообщили о случаях подобной болезни, которую они назвали тендо-синовитом, в Великобритании. Было обнаружено, что поражения, характерные для артрита, наблюдаются лишь на последних стадиях болезни (Kerr K.M., Olson N.O., 1969). О выделении реовируса, вызывающего разрыв сухожилия голени сообщили Jones R.C. et al.(1975). Авторы показали, что заболеванию подвержены лишь цыплята мясного типа. Однако случаи заболевания наблюдались и у товарных цыплят породы Белый Леггорн в Пенсильвании (Schwartz L.D. et al.,1976), a van der Heide L.(1977) описывал подобные случаи в Калифорнии.

Экономические потери в промышленном птицеводстве при рео-вирусной инфекции значительны и связаны с гибелью птиц, низкими привесами, плохой оплатой корма, снижением категорийности тушек, повышенной выбраковкой, уменьшением яйценоскости на 6 - 20 %, расходами на проведение ветеринарно-санитарных мероприятий по борьбе с

этой болезнью. В племенных хозяйствах отмечают снижение половой активности петухов, что способствует снижению оплодотворенности и выводимости инкубационных яиц (van der Heide L. et al., 1973, Dhillon A.S. et al., 1986).

Серологические и вирусологические исследования свидетельствуют о широком распространении реовирусных заболеваний среди птиц в хозяйствах РФ (отчеты ВНИВИП, 1990-1995 гг).

Цель работы.

Учитывая отсутствие данных об этиологической роли реовируса в патогенезе теносиновита кур и истинных масштабах его распространения в птицехозяйствах, а так же причиняемом ущербе, мы поставили целью сравнительное изучение некоторых биологических признаков вакцинного и эпизоотологических штаммов реовируса теносиновита.

В соответствии с поставленной целью в задачи наших исследований входило:

1. Изучить признаки, характеризующие патогенные свойства штаммов реовируса теносиновита кур для куриных эмбрионов и цыплят при разных путях введения.

2. Изучить признаки, связанные с особенностями внутриклеточной репродукции реовируса.

3. Изучить признаки, обусловленные свойствами поверхностной структуры реовируса теносиновита кур.

4. Выявить степень корреляции между различными признаками реовируса и патогенностью его для восприимчивых животных.

Практическая ценность. Впервые в нашей стране выделены штаммы вируса теносиновита кур. Дана сравнительная характеристика штаммам вируса и изучены антигенные взаимоотношения их. Изучена специфичность МФА и испытан метод для лабораторной диагностики реови-русного теносиновита кур. Изучение иммунобиологических свойств штам-

мов вируса дало возможность для отбора аттенуированного штамма при разработке средств специфической профилактики заболевания.

Апробация работы. Основные положения диссертации доложены на методических и ученых советах Всероссийского НИВИ птицеводства (1994,1995) на межрегиональном научно-производственном координационном совещании в Петрозаводске 2-4 марта 1994г., в Юрьевце на конференции " Вирусные болезни", 1995г.

Публикация результатов исследований. По теме диссертации опубликовано 4 научных работы.

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 133 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов. Работа иллюстрирована 21 таблицей, И рисунками. Список литературы включает 268 источника, в том числе 216 источников зарубежных исследователей.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

Материалы и методы исследований. Диссертационная работа выполнялась в соответствии с программой НИР Всероссийского научно-исследовательского ветеринарного института птицеводства (номер государственной регистрации 01.90.0060902) в период с 1992 по 1996 год в отделе вирусологии ВНИВИП, в 7 птицеводческих хозяйствах системы "Плем-птица" и "Росптицепром" различного технологического направления.

Свежие трупы или кусочки внутренних органов (печень, селезенка, почки) убитых или павших цыплят до 30- 40-суточного возраста хранили в морозильной камере холодильника при температуре минус -20 0 С до проведения вирусологических исследований.

штаммы реовируса теносиновита кур. Для сравнительного изучения иммунобиологических свойств вируса были использованы вакцинный и эпизоотические штаммы.

1. Вакцинный штамм 1133 получен из фирмы ТАД (Германия) на основе двустороннего сотрудничества ВНИВИП и указанной фирмой.

2. Эпизоотический штамм М-4 получен из вирусологической лаборатории Кубинской Народной Республики.

3. Эпизоотический штамм СП-73, любезно предоставленный В.В. Германом для совместного изучения, выделен от больных индюшат.

4. Эпизоотический штамм Рос -92 изолирован из внутренних органов трупов цыплят птицефабрики "Россия".

Указанные штаммы вируса поддерживали на 7-9-суточных развивающихся эмбрионах кур и в культурах клеток и хранили при температуре минус 20° С. Инфекционную активность штаммов вируса определяли методом титрования и вычисляли по Reed L.J. and Muench H. (1938).

Первично-трилсинизированную культуру куриных фибробластов готовили из кожно-мышечной ткани 10-суточных эмбрионов кур по методу Дульбекко и Фогт (1954) в модификации Янгнера (1954). В качестве ростовой питательной среды использовали среду 199 - 50 %, 0,5 % - ный гидролизат лактальбумина - 50 % (или среду Игла) с добавлением 5-10 % сыворотки крупного рогатого скота, а также пенициллина 100 ЕД/мли стрептомицина -100 мкг/мл. Концентрацию водородных ионов до 7,0 - 7,2 доводили 7,5 % - ным раствором двууглекислого натрия.

При работе с перевиваемыми культурами использовали клеточные линии L, ВНК-21, BGM и Vero. Матровую расплодку культур получали в институте цитологии (г.Санкт-Пегербург). Культивирование и пасса-жирование клеточных линий проводили по общепринятой методике.

Изучение антигенных различий штаммов вируса проводили в реакции нейтрализации в различных модификациях (Мс Bride, 1959, Gard, 1960).

Определение чувствительности к действию температуры.

Вируссодержащую суспензию готовили из хориоаллантоисной оболочки и одноименной жидкости зараженных куриных эмбрионов.

Вируссодержащую жидкость разливали в пробирки по 1 мл, а затем помещали в водяную баню с температурой 60° С. Прогревание проводили 0,5, 1, 2, 4 и 6 часов. По истечению указанных сроков пробы немедленно охлаждали. После чего проводили титрование прогретого и непрогретого штамма вируса на 8 - 9 - суточных эмбрионах кур.

Определение чуствительности к действию эфира проводили по методу, предложенному Andrewes С.H., Horstmann D.M. (1949). Неразведенную вируссодержащую суспензию наливали в пенициллиновые флаконы и смешивали с добавлением эфира pro narcosi в конечной концентрации 20 % (охлажденный в холодильнике при- 10 0 С). Флаконы плотно закрывали резиновыми пробками, встряхивали и ставили в холодильник при + 2° С. Смесь вируса с эфиром периодически встряхивали. Через определенные промежутки времени брали пробы для определения инфекционного титра вируса в опыте и контроле на куриных эмбрионах. Предварительно эфир удаляли из смеси испарением.

Определение чувствительности к действию хлороформа проводили по методу, описанному Feldman H.A., Wang S.S. (1961). Действие хлороформа испытывали в конечной его концентрации 10 %. Смесь вируса и хлороформа встряхивали в течение 1 часа при +4°С и выдерживали при той же температуре в течение 4 часов. Затем смесь центрифугировали при 3000 об/мин в течение 20 минут. Верхний интерфазный слой использовали для определения активности штаммов вируса на КЭ.

Гипериммунные сыворотки к штаммам получали на 120 суточных петухах по схеме Усманходжаева А., Закстельской Л. (1965), а иммуногенные свойства их изучали на 10-суточных цыплятах.

Получение люминесцирующей (флюоресцирующей) сыворотки

проводили по методике Coons А.Н. and Kaplan M.N. (1950), описанной И.Ф. Михайловым, С.И.Дьяковым (1961).

При проведении настоящих исследований изучали следующие маркеры штаммов вируса: патогенность для куриных эмбрионов (Pche); размер и характер поражений на хориоаллантоисе (Sehe , U); патогенность для 4-суточных цыплят (Pch4); способность размножаться в курином эмбрионе при 32° и 34° (rctche32, rctche34); терморезистентность(Т5б); устойчивость к действию эфира (Eth); хлороформа (Ch); способность к репродукции в культурах клеток (ТС); антигенную специфичность и степень нейтрализации антителами (Ag, An); иммуногенные свойства (IA).

Полученные данные подвергли вариационной статистике по методу Стьюдента-Фишера (А.И. Чистяков, 1966).

животные. В лабораторных опытах, для решения поставленных задач, было использовано более 2000 куриных эмбрионов, 200 суточных и 40 цыплят 120-суточного возраста, полученных из птицефабрик, благополучных в отношении инфекционных болезней.

ИЗУЧЕНИЕ ЭТИОЛОГИИ РЕОВИРУСНОГО ТЕНОСИНОВИТА КУР

Главной задачей в изучении суставной патологии у цыплят бройлеров и петухов-производителей, наблюдаемой в птицехозяйствах являлось выяснение этиологии. Клинические симптомы болезни и патолого-анатомичесие изменения внутренних органов и суставов у павшей, птицы в естественных условиях были сходны с описаниями в литературе при некоторых бактериальных болезнях (стафилококкоз, микоплазмоз, пасте-реллез), сопровождающихся поражением желудочно - кишечного тракта, печени, почек, скакательного сустава, но диагноз не был подтвержден бактериологическими исследованиями. В связи с этим требовалось установить (или исключить) вирусную этиологию болезни.

Изучение этиологии теносиновита путем воспроизведения заболевания в эксперименте на чувствительных цыплятах, изоляции возбудителя на куриных эмбрионах и в культуре клеток и его идентификации в реакции нейтрализации и обнаружения вирусного антигена в клетках методом флуоресцирующих антител показало, что возбудителем является реовирус.

СРАВНИТЕЛЬНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ВАКЦИННОГО И ЭПИЗООТИЧЕСКИХ ШТАММОВ РЕОВИРУСА ТЕНОСИНОВИТА КУР.

ПАТОГЕННОСТЬ ДЛЯ КУРИНЫХ ЭМБРИОНОВ (Рсье - признак).

Изучение патогенносги для куриных эмбрионов в качестве генетического маркера широко используется в исследованиях с вирусами человека и животных. При этом учитывается не только летальное действие вируса, но и способность его накапливаться определенных тканях эмбриона и характер патологических изменений.

Опыты по изучению патогенносги штаммов 1133, СП- 73, М- 4, Рос-92 проводили на 7-11-суточных КЭ. Заражение проводили в желточный мешок и аллантоисную полость оттитрованным вирусом в дозе 10 2 и 10 3 ЭИД50 в 0,2 мл. Вируссодержащую суспензию готовили из ХОА и одноименной жидкости инфицированных КЭ. После пяти суток инкубации при температуре 37° С , эмбрионы охлаждали при 4° С в течение суток и вскрывали.

При этом учитывали степень репродукции вируса титрованием, наличие поражений на хориоаллантоисе. Процент павших эмбрионов определяли ежедневным овоскопированием.

Инфицирующую активность штаммов устанавливали методом титрования. Полученные данные приведены в таблице 1.

Данные, представленные в таблице 1, показывают, что инфекционные титры штаммов существенно не отличались, однако при тировании в желточный мешок активность их была выше на 1,0 ^ ЭИДм в 0,2 мл (Р< 0,05).

Таблица 1

Результаты титрования штаммов вируса теносиновита на КЭ

при различных способах их заражения

Штаммы вируса Инфекционный титр ЭИД50 в 0,2 мл) вируса

Метод заражения

Ашшггоисная полость Р< Желточный мешок Р<

1133 5,15 + 0,3 0,05 5,8 + 0,5 0,05

СП- 73 5,0 +0,7 0,05 6,3 + 0,2 0,05

М-4 4,55 + 0,5 0,05 5,8 + 0,2 0,05

Рос-92 4,8 + 0,5 0,05 5,5 + 0,2 0,05

ХАРАКТЕР ИЗМЕНЕНИЙ В КУРИНОМ ЭМБРИОНЕ.

Исследованиями ряда авторов показано, что различные штаммы вируса теносиновита продуцируют неодинаковые по характеру и размеру поражения на ХАО.

Для изучения указанных маркеров заражали 7-9 дневные КЭ в дозе 100 ЭИД50 в 0,2 мл. Опыты показали, что вакцинный и эпизоотические штаммы вызывают два типа поражений на ХАО. Бляшки первого типа прозрачные в проходящем свете и характеризуются зернистой структурой. В центре поражений имеются небольшие гомогенные "ядра" некроза. Многие бляшки без некроза. Изменения второго типа-крупные, характеризовались наличием большого бесструктурного кратерообразного некрозного центра и прозрачным зернистым ободком по периферии.

В последующие сроки инкубации на ХАО, в местах формирования очагов поражения вирусом, обнаруживали выраженную сосудистую

реакцию и значительный отек соединительной ткани аллантоиса, при умеренной клеточной инфильтрации выстилающего аллантоис эпителия.

На следующем этапе к 4-5 дню инкубации, в местах формирования бляшек, ХАО теряла структурные формы за счет дифтерического воспаления и некротизации оболочки, на поверхности которой скапливались мочекислые соли.

У зараженных эмбрионов с 5-го дня были обнаружены признаки нарушения обмена веществ, сопровождающиеся трофическими расстройствами в системах и органах и проявляющиеся застойными явлениями в сосудистой сети печени, сердца и особенно почек, где, помимо отмеченного, у 50 % исследованных эмбрионов выявились диапедезные кровоизлияния. Подобные изменения у контрольных эмбрионов отсутствовали.

Таблица 2

Сравнительная характеристика вакцинного 1133 и эпизоотических

штаммов СП-73, Рос-92, М-4 по U и Sehe признакам

штаммы вируса множест. заражения ЭИД5о/0,2мл количество КЭ ИЗУЧЕННЫЕ МАРКЕРЫ

характер поражения (Ц) размер поражения (Sehe) Р<

1133 100 25 и + 0,97± 0,27 0,05

СП-73 100 25 и + 0,82+ 0,37 0,05

М-4 100 25 и ± 0,76 ±0,25 0,05

Рос-92 100 25 и- 0,84 ±0,36 0,05

Таким образом, изучаемые штаммы реовируса вызывали образование массивных бляшек с сероватым уплотнением (некрозом) в центре, диаметр бляшки 0,2-2 см и по периферии крупных единичных мелких бляшек размером 0,1- 0,3 мм, а также нарушение гемодинамики эмбрионов (Таблица 2).

Помимо различий в спектре патогенности изучаемых штаммов реовируса теиосиновита были обнаружены отличия в размере и характере поражений, индуцируемых ими на хороаллантоисной оболочке.

ПАТОГЕННОСТЬ ДЛЯ ЦЫПЛЯТ(Рсь - признак).

Известно, что патогенность вирусов для восприимчивого хозяина -весьма сложное свойство, представляющее собой суммарное проявление многих наследственных закрепленных особенностей вируса. При изучении патогенности вируса теносиновита для цыплят крайне важно учитывать метод заражения, поскольку каждый способ инфицирования характеризует особое свойство вируса.

Опыты по сравнительному изучению патогенности штаммов вируса теносиновита проводили двукратно на 4-суточных цыплятах мясной породы. Цыплят заражали культуральным вируссодержащим материалом в дозе 103 ТЦД50 /0,2 мл в подушечку лапы и 103 ТЦД50 /0,5 мл энтерально.

Результаты изучения патогенности испытуемых штаммов вируса для цыплят при инфицировании в лапу представлены в таблице 3. Таким образом, полученные данные свидетельствовали о том, что штаммы 1133, СП-73, М-4 и Рос-92 реовируса различались по патогенности для цыплят 4- суточного возраста и характеризовались как РсЬ-, РсЬ+ и РсЬ + соответственно.

Таблица 3

Патогенность штаммов вируса теносиновита для цыплят

Штаммы вируса Количество цыплят Инкубацион ный период Заболело абс. % Пало абс. % Характеристика штамма

1133 10 4 1 10,0 0 0 РсЬ -

СП-73 10 3-5 8 80 1 10 РсЬ +

М-4 10 3-5 8 80 0 0 РсЬ +

Рос- 92 10 4-6 4 40 0 0 РсЬ +

Контроль 10 - - - -

СПОСОБНОСТЬ К РЕПРОДУКЦИИ В КУРИНОМ ЭМБРИОНЕ

ПРИ РАЗЛИЧНОЙ ТЕМПЕРАТУРЕ(гс^е-иризнак).

Репродукция вирусов в восприимчивых клетках происходит в оптимальном температурном режиме и является наследственно закрепленным свойством (Dubes G.R., Chapín М., 1956).

Учитывая, что особенности репликации реовируса теносиновита при различных температурах культивирования в литературе освещены недостаточно, нами проведено изучение ret - признака штаммов вируса.

При пассажировании штаммов вируса в куриных эмбрионах при 32° репродукция их происходила в низких титрах и характеризовалась как rctche32 -(штамм 1133) и rctche32± (штамм СП-73, М-4, Рос-92).

По данным культивирования при 34° штаммы характеризовались как rctche34 +. Индекс подавления репродукции вируса равнялся 1,14+ 0,2 lg ЭИДзо в 0,2 мл (Р<0,05).

Культивирование штаммов вируса теносиновита при пониженной температуре приводило к снижению патогенности их для куриных эмбрионов. Подобные данные были получены другими авторами для вирусов полиомиелита и осповакцины (Sabin A.B., 1960, Kirn A., Braunwald I., 1964, Платонов В.Г., 1967), реовируса птиц (van der Heide et al.,1985), которые использовали этот феномен при получении аттенуированных вариантов вирусов.

СПОСОБНОСТЬ К РЕПРОДУКЦИИ В КУЛЬТУРЕ КЛЕТОК (ТС - признак).

Способность вирусов, наряду с репликацией, вызывать цитопатический эффект в чувствительных культурах клеток, является их наследственным биологическим признаком.

Чувствительность различных клеточных культур к штаммам представлена в таблице 4. Результаты опытов показали, что вакцинный и эпи-

зоотические штаммы вируса адаптировались к условиям культивирования в культурах клеток куриных эмбрионов (фибробласты и клетки печени) и перевиваемых линий (ВНК-21, ЕЮМ,Уего) с первого пассажа. Репродукция штаммов сопровождалась характерным цитопатогенным действием. В культурах ККЭ ЦПД проявлялось через 24 - 48 часов, однако наиболее чувствительными оказались КПКЭ. В клетках перевиваемых линий ЦПД наблюдалось через 48 - 72 часов у штамма 1133, через 72 - 96 часов у СП-73 и через 120-144 часа у штаммов М-4 и Рос -92.

Таблица 4

Чувствительность первичных и перевиваемых культур клеток к

штаммам вируса теносиновита кур при Р < 0,05.

Наименование культур клеток Индекс чувствительности клеток, И

Штаммы вируса

1133 СП-73 М-4 Рос-92

Фибробласты куриного эмбриона 1 1 1 1

Клетки печени куриного эмбриона 1,027-1,045 1,027-1,045 1,059-1,076 1,025

ВНК-21 0,83 0,854 н.и. н.и.

BGM 0,827-0,863 0,925 н.и. н.и.

Vero 0,909 0,944-1,0 1,062-1,122 0,076

L 0,272 н.и. н.и. н.и.

Примечание : н.и. - не исследовали

Цитопатические изменения были характерны для острой формы инфекции и выражались в деструктивных изменениях в цитоплазме, появлении оксифильной зернистости в ней, образованием округлых клеток, синцития и гибели клеток.

УСТОЙЧИВОСТЬ К НЕКОТОРЫМ ФИЗИЧЕСКИМ И ХИМИЧЕСКИМ

ФАКТОРАМ.

Определение маркера штаммов вируса как чувствительности к физико-химическим факторам может быть использован как групповой признак при идентификации вновь выделенных вирусов ( Апскечуев С.Н. е1 а!.. 1961, Соорег Р., Ве11а1: АЛ., 1961).

Таблица 5

Сравнительная характеристика устойчивости штаммов 1133, СП-73, М-4

Рос-92 реовируса теносиновита к действию эфира, хлороформа и 1°С.

Штаммы вируса Инфекционный титр, ТЦД» Кии, % ТЦД 50

Физико - химические факторы

эфир характеристика хлороформ характеристика температура 60° С характе ристиха

1133 6,5 + 0,25 ЕШ+ 6,5 ±0,25 сь+ 6,25 ±0,1 Тео+ 1

СП-73 5,1 +0,15 Е&+ 5,1 ±0,15 С11+ 5,25 ±0,17 Тбо+ 1

М-4 5,0 ±0,3 ЕЛ+ 5,0 ±0,3 сь+ 5,0 ±0,3 Тбо+ 1

Рос-92 4,5 ±0,2 ЕШ+ 4,5 ±0,2 сь+ 4,75 ± 0,2 Тбо+ 1

Данные, представленные в таблице 5, свидетельствовали о том, что эфир, хлороформ и прогревание при 60° С не снижали инфекционный титр штаммов вируса, константа кинетики инактивации была 1,0. Штаммы характеризовали как СЬ+, ЕШ+ и Тбо +.

Свойство резистентности штаммов реовируса к хлороформу было использовано нами в последующей работе для первоначальной изоляции возбудителя.

Таким образом, устойчивость вируса к эфиру и хлороформу свидетельствовала также о том, что изучаемые штаммы вируса не содержат в своем составе липидов.

АНТИГЕННЫЕ СВОЙСТВА (специфичность и степень нейтрализации специфической антисывороткой).

Проблема антигенной структуры реовирусного теносиновита кур помимо большой теоретической важности представляет в настоящее время существенный практический интерес.

При изучении этиологии случаев заболевания теносиновитом в период массовой вакцинации против него, а также вопросов репликации вакцинных штаммов в организме и их распространение среди птиц, при исследовании генетической устойчивости вакцинных штаммов должны быть получены доказательства происхождения выделенных штаммов от вакцинных или эпизоотических.

Ag, An - признаки широко используются в качестве генетического признака при изучении внутритиповых антигенных различий штаммов вируса (Мс Bride W.D., 1959, Гендон Ю.З., 1964).

Применяя метод Gard S. (1957), основанный на выявлении разницы в титрах при нейтрализации штаммспецифической сывороткой гомологичного и гетерологичных штаммов, и кинетический метод, предложенный Мс Bride W.D. (1959), нам удалось выявить некоторые различия в степени нейтрализации между штаммами реовируса теносиновита кур (таблица 6).

Полученные данные показывают, что в скорости течения реакции нейтрализации штаммспецифическими сыворотками гомологичного и гетерологичного штаммов существенных различий между штаммами не наблюдали. Однако, сыворотка к штамму Рос-92 в низкой степени нейтрализовала гетерологичные штаммы 1133 и М-4, индекс нейтрализации равнялся 0,7 и 0,67 lg, а ИН к гомологичному штамму был 2,0 lg. Низкая скорость нейтрализации была у сыворотки к штамму СП-73 по отношению к штамму М-4 (0,92 lg). Сыворотки к штаммам 1133 и М-4 нейтрализовали почти в равной мере гомологичный и гетерологичные штаммы.

Таблица 6

Результаты изучения антигенных различий между штаммами вируса теносиновита

кур в реакции нейтрализации

Штаммы 1133 СП-73 М-4 Рос-92

вируса ИН, Показатель к ИН, Показатель к ИН, Показатель к ИН, Показатель к

18 достовер- по Мак н достовер- по Мак 1« достовер- по Мак ь достовер- по Мак

эид» ности Брайду ЭИД50 ности Брайду ЭИД50 ности Брайду эид» ности Брайду

1133 1,3 >2 3,2 1,05 >2 2,82 3,7 >2 3,28 0,7 >2 2,62

СП-73 1,2 >2 2,99 1,67 >2 3,58 1,25 <2 3,12 1,44 >2 3,23

М-4 1,0 >2 2,87 0,92 >2 2,98 1,75 <2 4,08 0,67 <2 2,76

Рос-92 1,25 >2 3,45 1,4 >2 3.67 1,36 >2 3,59 2,0 >2 4,93

Примечание: ИН - индекс нейтрализации, К- константа нейтрализации

Таким образом, полученные результаты констатируют, что изучаемые пггаммы родственны в антигенном отношении, но имеют незначительные различия в скорости и степени нейтрализации.

ИММУНОГЕННАЯ АКТИВНОСТЬ.

Основными показателями производственной ценности штаммов вирусов служат: их клиническая безвредность, способность к интенсивной репродукции в условиях массового производства в КК и развивающихся КЭ и иммуногенная активность.

Закономерности формирования гуморального иммунитета при реови-русной инфекции птиц изучены недостаточно.

Результаты, представленные на рис.1 показывают, что у привитых цыплят отмечалась выраженная сероконверсия. Уровень вируснейтрализу-ющих антител нарастал в зависимости от сроков после иммунизации и дозы штамма вируса.

Кривая накопления ВНА в сыворотке крови иммунизированных цыплят штаммом 1133 имела тенденцию к двукратному нарастанию титра, достигая максимального значения к 21-му дню. Отмечена прямая зависимость величины титров от дозы вакцинного штамма вируса.

2.5-,

ТЦД50

Ряд 1 - 14 дней, ряд 2 - 21 день. Рисунок 1. Кинетика накопления ВНА в сыворотке крови вакцинированнных штаммом 1133 цыплят.

Таблица 7

Сводная таблица сравнительных характеристик вакцинного и эпизоотических штаммов реовируса

теносиновита кур

Штаммы вируса Патогеиносгь (Р-признак) для: ПРИЗНАКИ Терморезистентность Чувствительность к: Цитопатогенная активность ■ ПРИЗНАКИ

куриных эмбрионов 4-сут. цыплят и §сЬе ГС1сЬе (Т56 - признак) эфиру (ЕЛ-признак) хлороформу (СЬ- признак) (ТС- иризнак) Аё Ап 1А

1133 РсЬе + Р сЬ ~ + 14*32 " ГС1з4 + + 7СсЬе+ + +

СП-73 РсЬе + Р сЬ + + тз2-- ПЛ 34 + + ТСсЬе+ + + +

М-4 РсЬе- Р сЬ + + Ш32± ПЛ34 + + + +

Рос-92 РсЬе " РсЬ± — +, - пЛзг1 ПЛ 34 + + + + +

Таким образом, изучаемые штаммы реовируса теносиновита вызывали положительную иммунологическую перестройку в организме цыплят, индуцируя существенную сероконверсию.

Определение корреляции между биологическими признаками, определяемыми in vitro, и патогенностью для восприимчивых животных.

Знание генетических признаков и выяснение взаимосвязи между ними, реовируса теносиновита, особенно между патогенностью и признаками, определяемыми in vitro, открывает широкие перспективы для создания стабильных аттенуированных вариантов, обладающих иммуногенными свойствами.

В связи с этим при изучении свойств вакцинного и эпизоотических штаммов с целью отнесения их в группу патогенных и апатогенных нами был изучен комплекс признаков, коррелирующих с патогенностью (таблица7).

Обобщенные данные показывают определенную корреляцию между отдельными маркерами и вирулентностью штамма для эмбрионов и цыплят, но она не является абсолютной, ибо эта корреляция носит скорее частный штаммовый характер.

5. ВЫВОДЫ.

1. Впервые в нашей стране от цыплят выделены и идентифицированы штаммы реовируса тиц по антигенным свойствам, отличающиеся от реовирусов млекопитающих. Заболевание, вызываемое ими, названо реовирусным теносиновитом кур.

Вирусная этиология доказана воспроизведением болезни у чувствительных цыплят путем введения в подушечку лапы суспензии патологического материала и синовия, не содержащих бактерий и кокков, контактного заражения здоровых цыплят от больных, пассируемостью

возбудителя в куриных эмбрионах и культуре клеток и подтверждена воспроизведением болезни у цыплят изолированным вирусом.

2. Метод флуоресцирующих антител специфичен для обнаружения вирусного антигена в патологическом материале при реовирусном теяо-синовите кур и может быть использован при изучении патогенеза заболевания и как диагностический тест.

3. Изученные штаммы реовируса теносиновита имеют некоторое различие в патогенности для 7-9 -суточных развивающихся куриных эмбрионов при разных способах заражения их и способности образовывать бляшки на хориоаллантоисной оболочке. Штаммы индуцировали в основном, крупнобляшечные поражения ( Sehe +) и единичные мелкие бляшки (Sehe-).

По характеру поражений на хориоаллантоисе штаммы были обозначены как U+ (1133 и СП-73), U± (М - 4) и U - (Рос-92).

4. Штаммы реовируса теносиновита кур различаются по патогенности (PCh - признак) для 4- суточных цыплят при инфицировании в подушечку лапы и характеризуются как Pch- (1133), Pch - (Рос-92) и Р ch + (СП - 73 и М-4).

При гистологическом исследовании установлены клеточные инфильтрации в различной степени интенсивности в органах и тканях инфицированных цыплят.

5. Культивирование штаммов реовируса птиц при пониженной температуре в куриных эмбрионах показывает, что вакцинный штамм 1133 характеризуется как ret chc32-, rctchtj4+, а эпизоотические штаммы СП-73, М-4 и Рос-92 - ret сЬе»± и ret«*1^ (Р<0,05).

Последовательные пассажи при пониженной температуре (32° и 34°) приводят к существенному снижению патогенности штаммов вируса теносиновита кур для развивающихся куриных эмбрионов.

6. Вакцинный 1133 и эпизоотические штаммы СП- 73, М- 4 и Рос - 92 вызывают острую форму инфекции в различных культурах клеток,

обусловливая полную деструкцию и гибель клеток ( ТО при Р<0,05). Имеются различия в биологической активности в зависимости от вида культуры клеток.

Клетки печени и фибробласты куриных эмбрионов и перевиваемые линии клеток Vero оказались наиболее чувствительными к реовирусу птиц при И= 1,025 - 1,075; 1,0 и 0,076 - 1,122 соответственно (Р<0,05), а клетки L - слабочувствительными.

7. Изученные штаммы реовируса теносиновита кур обладают повышенной устойчивостью к воздействию физико-химических факторов, их константа кинетики инактивации равняется единице.

8. Штаммы реовируса теносиновита кур родственны в антигенном отношении, но имеют незначительные различия в специфичности и степени и скорости нейтрализации гомологичным и гетерологичным штаммспеци-фичными сыворотками (Р< 2).

9. Штаммы реовируса теносиновита кур индуцируют синтез вирус-нейтрализующих антител в организме цыплят, вызывая иммунологическую перестройку. Уровень антител зависит от дозы и штамма иноку-лируемого вируса.

10. Обнаруживается определенная корреляция между некоторыми генетическими признаками (U, rctche34 , ТС) и патогенностью для куриных эмбрионов и цыплят (Pche, Pch) у исследованных вакцинного и эпизоотических штаммов реовируса теносиновита кур.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ.

На основании проведенных исследований предлагаются:

1. В целях успешной изоляции реовируса теносиновита кур из патологического материала(пораженные суставы, селезенка, почки и печень) рекомендуется использовать 7-9 -суточные развивающиеся куриные эмбрионы и клеточные культуры куриных эмбрионов. Оптимальный метод заражения - это в желточный мешок куриного эмбриона.

2. Для экспресс-диагностики реовирусного теносиновита кур (обнаружения вирусного антигена в патматериале) может использоваться метод флуоресцирующих антител.

3. Материалы работы использованы при селекции аттенуированного вакцинного штамма реовируса и разработке средств специфической профилактики реовирусного теносиновита кур.

4. Материала, изложенные в диссертации, используются в учебном процессе на курсах повышения квалификации ветеринарных специалистов ВНИВИП.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Трефилов Б.Б., Шурчилов А.Ф., Мытарова Н.В. МФА для обнаружения реовируса теносиновита кур// Пробл. вет. проф. в пром. птицеводстве / Тез. докл. межрег. научно-произв. совещ. -Петрозаводск - Спб. - Ломоносов, 1994 - С.7.

2. Мытарова Н.В., Трефилов Б.Б. Королев A.M. Экспериментальный реовирусный теносиновит кур// Пробл. вет. проф. в пром. птицеводстве / Тез. докл. межрег. научно-произв. совещ. - Петрозаводск - Спб. - Ломоносов, 1994 - С.7.

3. Мытарова Н.В., Трефилов Б.Б. Изучение иммунобиологических свойств вируса теносиновита кур // Пробл. вет. проф. в пром. птицеводстве / Тез. докл. межрег. научно-произв. совещ. -Петрозаводск - Спб. - Ломоносов, 1994 - С.9.

4. Трефилов Б.Б., Сарбаева Н.В. Антигенная специфичность и степень нейтрализации штаммов вируса теносиновита кур// Вирусные болезни сельскохозяйственных животных/ Тез.докл.всер. научно-практич.конф. 1721 апреля,- Владимир, 1995. - С. 272.

Подписано к печати 10.02.97. Тираж 100 экз.

Отпечатано в ризоцентре НГ1К " Объединение Вента"