Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Сравнительная характеристика строения и функциональных особенностей сыворотки крови в ряду ....

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Сравнительная характеристика строения и функциональных особенностей сыворотки крови в ряду ...."

г 7 С Ч •/

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК

ИНСТИТУТ ЭВОЛЮЦИОННОЙ ФИЗИОЛОГИИ И БИОХИШИ имени И.М.СЕЧЕНОВА

На правах рукописи

ОСТОЛОВСКШ Евгений Миронович

Щ 591.132.

СРАВНИТЕЛЬНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА СТР ФУНКЦИОНАЛЬНЫХ ОСОБЕННОСТЕЙ

сыворотки крови в ряду позь '•

03.00.04 - БИОХИМИЯ

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации ка соискание учной степени доктора биологических наук

САНКТ-ПЕТЕРБУРГ 1992

Работа выполнена на кафедре биохимии Ставропольского государственного университета имени М.В.Фрунзе'.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, проф. Р.Н. Этингоф; доктор биологических наук, проф. С.Н. Лкзловп доктор медицинских наук, проф. С.С. Михайлов.

Ведущее учреждение: Институт биохимии им. Л.Н.Баха РАН

Зашита состоится 05 1992 г. на заседании

специализированного совета Д 002.89.01 по присуждению ученс степени доктора биологических наук при Институте эволюционной физиологии I! биохимии ни. Н.М. Сеченова РАН, адрес -194223, Санкт-Петербург, проспект М. Тореза, 44.

С диссертацией можно ознакомится в библиотеке Института

Автореферат разослан "_" _ 1992 г.

Ученый секретарь специализированного Ученого совета, доктор биологических наук, проф.

М.Н.МАСТОВА

Отдол -е^ртац/й

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы. Вопросы эволюции относятся к числу общебиологических проблем, исследование которых в последнее время перенесено также на молекулярный уровень. С точки зрения систематики и зволвции особый интерес представляет детальное изучение л сопоставление структурных и физико-химических особенностей физиологически активных молекул, а такго систем, выполняющих в организме вагине и угот частично исследованные функции. Познание того, как эти молекулярные сястсыы возникли, в каком направлении пло их развитие, и как в ходе эволюции происходила интеграция вхсдяцих в систеиы элементов, представляют задачу больпоП теоретической важности.

При рассмотрении проблем сравнительной биохимии псо больнее внимание исследователей привлекают гомологичные белж: различных классов и видов тавотного trapa, йнтерзс к эволюционной кстсрж этих биополимеров обусловлен тен, чсо они шполняв? практтгчзскн одинаковые функции з различных организмах (Кроне, 1976; Km.íypa, 1985; Carlou, 1985; •.Viniv.-p.rter, 19S7).

Ранее Е.М.Крэпс (1967) сфор.мулировоя полопзикз, отраглщее общие принципы организации самых различных фунщкошлы:н>; систем: "Если природа нашла какой-то способ для решешггг оада^я, то она неукоснительно использует его на различная этапах 0полсф:пи.

фундаментальная разработка стого пологзнкя' прин&дясгж А.М.Уголвву (1985,1939). В hsR «втор убедительно доказал, чпо эволюциоанне преойрагозгияя'cr.ssa'n! с перэрлепрододзкп-з:? ушеср-залыггх Лушгционалмга б.иг с"5, истерто Ццспсзж; игл кодейк з «тетка:: отдельных предссг.г-атодсЛ, находящихся па рагтшх з-кша:-:

эволюционного развития.

Однако, эта концепция пока не получила должного развития на молекулярном уровне, и в частности, совершенно не затронута в вопросах эволюции альбумина.

Сывороточный альбумин является одним из объектов филогенетического анализа, основанного на исследовании специализации биополимеров. Данный белок ответственен за транспорт в кровяном русле биологически активных веществ, он обеспечивает нормальную вязкость, рН, онкотическоэ давление и объем циркулирующей крови, поддерживает азотистый баланс организма и является его питательным резервом. Альбумин сыворотки, ввиду своей адсорбционной активности, играет важную роль в рогуляции концентрации ионов Саг+ и Mg2+ в русле крови (Чегер,1975; Луйк,Лукьянчук,1981, Roda, Cappeiiini, Aldini et al., 1982; Троицкий,1985; Sodersard,Backstron,1937 ).

Вопросы эволюционного развития сывороточных альбуминов давно интересуют исследователей. Об этом свидетельствует постоянно увеличивающийся поток информации по их структуре и функциональной организации. Работами многих из них накоплен разнообразный материал, касающийся происхождения альбумина, его функциональной роли, а такве особенностей его структуры ( Sarich,l974j Broun,1977j Peters, 1977,1985; Carter,He Xiao-min, Kunson, 1939 ). Все эти исследования вплотную подводят к необходимости охарактеризовать структурно-функциональные особенности альбуминов в сравнительном аспекте. Однако, работы по изучению структурных и функциональных особенностей альбумина не носят систематического характера, часто охватывают небольшой круг объектов исследования. Более того, неко' торые важные аспекты проблемы, касающиеся консервативности или, наоборот, изменчивости отдельных отделов его конформационной

руктуры, вопросы внутримолекулярной регуляции хсмплексосбразо-ния с метаболитами, местонахождения и функциональной значкмсс-внутримолекулярноЯ связанной вода ранее фундаментально не ис-едовались. В этих обстоятельствах дальнейшее накопление иате-ала по характеристике альбуминов у животных разного уровня ор-низацяи и на различных этапах возрастного развития представля-ся весьма важным н актуальным.

Данная работа возникла как логическое продолжение ыноголет-х исследований по сравнительно-эволюционному изучении белков, в частности альбуиина, прозодихах на кафедре биохимии Симф-еро-льского государственного университета им. М.В.Фрунзе (Сорккна А., Остоловский Е.Н.,1978,1979; Остоловский Е.Ы.,1962,1964, 68,1990; Коногенко C.B.,1976,1960,1990; Толкачева Н.3.,1973, 65,1990). Основой для нее послужил накопленный ка кафедре 1Льпой фактический материзх по исследовании структуры альбумина сравнительно-онтогенетическом аспекте. Все эти исследования дотную подводят к необходимости охарактеризовать структурные и 'нкциональные свойства альбумина сыворотки крови псзвонсчкых в юцессах онто- и филогенеза.

В связи с теы, что з процессе эвэлгции характер свертывания ■липеп-гидноЯ цепи сохраняется значительно луч^е, чек ее аиино-слотный состав, одниц из подходов при изменил альбуминов в 1авкительно-эволгц;:снксм аспекте является анализ их фунхцно-льно-антизноЯ конфзрмациснноЯ структуры. Этот подход позволяет явить такие стру:::урлыс параметры, котсрые когут быть досто-рныни признаками вида, рода или класса .гнзеткых. Вместе с тем, авнктельно-бнохнунческиЯ анализ предоставляет возмсгнссть рас-отреть как частичные изменения, происходящие на урезке отдель-

ных компонентов макромолекулы Т5елка у организмов довольно далеко отстоящих друг от друга на эволюционной лестнице, так и получить целостное представление о направлении развития биополимера как целого. Кроме того, такой подход позволяет сосредоточить внимание на тех аспектах ассоциативной функции альбумина, которые имеют отношение к транспорту основных, традиционных для всех этапов развития этого белка, с момента его формирования, метаболитов, а также дает возможность рассмотреть альбумин с точки зрения его роли в регуляции концентраций этих веществ в организме животных и человека.

С указанных позиций в данной работе рассмотрены особенности химической и конформационной структуры, а также функциональной активности сывороточных альбуминов позвоночных разного эволюционного уровня - от круглоротых до млекопитающих. Кроме того, были исследованы альбумины сыворотки и ткани печени кроликов в различные периоды возрастного развития.

Цельв работы является сравнительно-биохимическое изучение молекулярной организации сывороточного альбумина ряда позвоночных в онто- и филогенезе, при этом оценивалась изменчивость как отдельных структурно-функциональных центров, так и всей макромолекулы в целом. В соответствии с этим, задачами работы были:

1. Изучить некоторые физико-химические параметры сыворотки крови и гомогенатов ткани печени, как среда функционирования и места синтеза альбуминов.

2. Исследовать аминокислотной состав альбуминов с целью выявления природы изменчивости этих белков как на уровне класса, так к

в разные периоды возрастного развития.

3. Охарактеризовать и сравнить между собой вторичную и третичную .

структуру альбуминов, включая содеретяие Х-спиралей, -структуры н неупорядоченных фрагментов, а такта непосредственно определить показатели ыикровязаости п спсцифичвских областях молекулы балка.

Сопоставить размеры гидрофильных каналов с содертацкиися в них молекулами связанной вода и выяснить ее функциональную роль. Изучить и сравнить связывагциз параметры рассматриваемых белков с фдуоресцент12а«! зо$5да»и, включая и термодинамические расчеты, рассмотреть влияние ионоа магния на внутримолекулярную структуру и функциональную аативкость сивороточшх альбуминов. . Использовать полученные экспериментальной данные для уточнения эволюционных взаимоотношения иагзду отдельными систематическими груплани швотшх, имея в виду, прежде всего, онтогенетические и филогенетические аспекта в структурной организации альбуминов.

Научная новизна. На большой сгхиериыеиталькои материале, ох-¡атавасщеа аспекта сито- (5 возраста« групп) и филогенеза (пред-¡тавитоли нруглоротих.риб, гемнозодюк, пресшкащжся, птиц и шекопитаючюс) с поиещьз сосреиеш-гых физико-химических и биох1ши-шских методов установлено, что макромолекула сывороточного Ельцина ряда позвоночных пр-здстазлла? собой сдоглсп гетерогенную :истеыу. Ошя дали основание утЕсрвдать, что молекула алъбунинов ¡остоит из гидрофобных областей и гидрофильных зон. Вперши пыяв-шю, что гидрофобная структура этих биополимеров обусловлено, по •файней мере, наличием областей двух разшх типов: наиболее гидрофобного ядра, универсального для класса и областей специфических, ¡вязанных с проявлением фуикцноналышх свойств белка. Показано, «то инкровязкость универсального ядра в десять и более раз преш-дает таковую для специфических гидрофобных областей.

Связанная вода, находящаяся во внутримолекулярных каналах (микропорах), влияет не только на форму и par ¡еры молекул, но непосредственно и на функциональные свойства специфических гидре фобных областей.

Впервые установлено, что комплексообразование сывороточных альбуминов с гидрофобными соединениями осуществляется в соответствии со специальным механизмом регуляции, в основе которого лежит принцип обратной связи на уровне системы состоящей из функционально активной молекулы белка и гидрофобного лигаида. Количественные аспекты химического взаимодействия мевду ними определяются количеством центров связывания и величиной анергии связи между ними. Показано, что введение в систему еще одного компонента (ионов магния) приводит в одних случаях к увеличению, а в других - к снижению количества центров связывания при взаимодействии альбуминов с этим лигандом. Это сопровождается обязательным и обратным изменением прочности химического взаимодействия мевду ними.

Ранее считалось, что сывороточные альбумины выступают одним из звеньев регуляции концентрации ионов магния в организме животных и человека. В настоящей работе показано, что ионы магния могут также воздействовать и на альбумин. Характер этого воздействия определяется размерами внутримолекулярные гидрофильных каналов с содержащимися в них молекулами связанной вода. А именно, 1 белки, содержащие в своей структуре значительное число молекул воды при ассоциации с ионами магния реагировали некоторым повышением показателя ыикровязкости специфических гидрофобных областей, тогда как альбумины с меньшим количеством воды, наоборот, при данной ассоциации снижали микровязкость этих участков.

Показано, что с возрастом под воздействием специфических ые-1болитов происходят внутримолекулярные перестройки, не затраги-шдие, однако, регулярные структуры белка. Такие перестройки 1зывавт изменение михровяэкости зон сорбции лшинофоров, наряду уменьшением числа центров связывания и увеличение константа )язывания, что ведет, вероятно, к снижению функциональной актив->сти сывороточного альбумина старых животных и гндрофобиэации 1лекулы белка в целом.

Впервые показано, что по ряду внутримолекулярных параметров мхроокрух&нне лшинофоров и михровязкость зон сорбции зондов) гацессы онтогенеза повторяют филогенетическое развитие молекулы ¡воро точного альбумина. По этим параметрам универсальные гидрониме ядра и специфические периферийные зоны практически внутри !асса неизменна, и лгать э классе илекопитакцих отпечена нексто-л пх вариация. Данные показатели йогу? быть использована в прак-ческих целях в качестве молекулярных маркеров для идентификации вороточного альбумина класса гивотных.

Скорость эволюционного развития разных гидрофобных участксз ет неоднозначно. Отмечены скачки филогенет;гческого развития утрхыолекулярноЯ структуры, особенно от класса преегнкапцихся я ¡щам и к классу :.!лекогп!тзс~:гх. По напеку ш-'енга, в отлэтпи ст гцесссп онтогенеза, в филогенезе тпт?гэ яд ет процесс г:г,Т£с*.гС::-•Д5ГЛ все:: зен, в результате нэ деГ.сияя »-'о?г.бс:п?тгз, а

шоккслотдах гачен, згз лгсцс-дуг-« длп бе.'::-. не:::? яози'ибкяй :а;:?ер. Вероятно, и дзлксу случае, си.ъбуу;:и с низкой :ьксй у р:-:б, с-кэтиг^нс ппг:~,гл-зг ас з клгссэ нгз-

Тссглтжсспал стзигачесач:: г.^Ссп-т. Прсг-сденэ

сравнительное исследование структурно-функциональных свойств сывороточных альбуминов позвоночных разного эволюционного уровня и различных возрастных групп, что дало возможность судить о их внутримолекулярной изменчивости.

Полученные результаты раскрывают важный аспект проблемы сравнительной биохимии сывороточных альбуминов, характериеуя события происходящие в ходе развития и становления их макромолекулярных систем, связанные в основном со структурно-функциональной специализацией определенных компонентов в зависимости от уровня их организации и развития, и как следствие - их функциональной нагрузки.

Эти данные имеют и более общее значение, обуслс::ленное вниманием современной науки к проблеме развития белковых систем вообще

Раскрыты некоторые неизвестные ранее аспект строения и функционирования сывороточного альбумина, касающиеся местонахождения в его структуре внутримолекулярной связанной вода, а также ее роли в регуляции-комплексообразования специфических гидрофобных полостей с лигандами. Это существенно, как для оценки структурно-функционального состояния данного белка вообще, так и с точки зрения проблем регуляции комплексообразования компонентов комплекса альбумин-лиганд.

Получены экспериментальные данные, которые позволили по новому охарактеризовать регуляцию комплексообразования альбумина -с некоторыми гидрофобными соединениями в зависимости от наличия в среде ионов магния. А именно, показано, что этот механизм регуляции имеет в своей основе принцип обратной связи, который реализуется в зависимости от числа центров связывания на молекуле белка и от энергии взаимодействия образующегося комплекса. Эта вза-

имосвязь имеет определенное практическое значение, позволяя предусмотреть особенности коиплексообразования, а следовательно транспорта и функциональной активности лигандов альбумина в организме с одной стороны, а также активно вмешиваться в этот процесс, изменяя концентрацию в среде ионов магния.

Раскрыты на молекулярном уровне аспекты внутримолекулярных перестроек в процессах онто- и филогенеза. Показано, что в обоих случаях, с возрастом, или с повышением уровня развития организма, идет процесс гидрофобизации макромолекулы сывороточного альбумина. Однако, эти процессы не однозначны. Нам представляется, что в случае онтогенеза процесс гидрофобизации молекулы белка носит негативный характер вследствие действия специфических метаболитов, что ведет к снигенип функциональной активности биополимера

ч

и позитивный - в филогенезе, как результат аминокислотных замен, определяемый генетически, к ведуций к расширении функциональных свойств альбумина у высокоорганизованных тавотных.

Впервыё\на молекулярном уровне показано, что процессы снто-генеза повторяют филогенез.

Результаты работа могут быть использованы в медицинской практике, так как полученные данные при патологии (цирроз печени, злокачественные опухоли печени и др.) показали,- что молекулярная организация белка претерпевает изменения и приобретает сходство с менее организованными по уровне развития сывороточными альбуминами (результата получены совместно с Н.В.Толкачевой).

При обсудцении вопроса о структурно-функциональной специализации сывороточных альбуминов ряда позвоночных в расчет должен - Сыть принят вывод о разной степени консервативности "универсального". гидрофобного ядра и более поверхностных структур гло-

булы. Вместе с тем следует подчеркнуть, что конфорыационная изменчивость анализируемых белков обладает значительно большей консервативность» по ¿равнение с их изменчивостью функциональной. Эти данные имеют достаточно важное теоретическое значение, подтверждая теорию эволюционной консервативности белков.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту

1. Функционально активная молекула сывороточного альбумина представляет собой гетерогенную систему, состоящую из гидрофобных областей и гидрофильных зон, в состав которых входит связанная структурированная вода. Связанная вода, находящаяся в структуре альбуминов влияет не только на форму и размеры внутренних областей макромолекул, но и непосредственно на функциональные свойства специфических гидрофобных областей.

2.- Внутримолекулярная гидрофобная структура альбуминов обусловлена наличием областей, по крайней мере, двух разных типов: периферийных зон и наиболее гидрофобного внутреннего ядра. Ыикрс вязхость универсального ядра в десять и более раз превосходит показатели микровязкости периферийных гидрофобных областей глобулы альбумина ряда позвоночных, включая и человека. Гидрофобные ядра мслекул альбумина являются "универсальными" для класса и могут служить его характеристикой. Структура периферийных участков имеет специфические для классов особенности.

3. Специфические, метаболиты организма старых животных вызывают внутримолекулярные перестройки в альбумине, которые не затрагивают регулярные структуры белка. Такие преобразования вызы-

. вают изменение микровязкости отдельных участков белковой глобулы, наряду с уменьшением числа центров связывания и увеличением константы связывания зондов с белком, что ведет к сниже-

нив функциональной активности альбумина. 1. По ряду внутримолекулярных параметров (микроохружение люминофоров и микровязкость зон сорбции зондов) показано, что в процессе онтогенеза повторяется филогенетическое развитие молекулы сывороточного альбумина. Данные показатели могут быть использованы в качестве молекулярных маркеров для идентификации сывороточного альбумина класса животных. 5. Скорость эволюционного развития гидрофобных участков идет неоднозначно. Отмечены скачки филогенетического раззития внутримолекулярной структуры, особенно от класса пресмыкающихся к птицам и к классу млекопитающих. В эволюции внутримолекулярной структуры от класса рыб до птиц преобладание имел структурно-функциональный фактор, в белке зге млекопитающих особенно успешно шло формирование структурно-кокформационного фактора, то есть гидрофобного ядра, э. На основании всего комплекса полученных данных высказано предположение, что комплексообразование сывороточных альбуминов с гидрофобными соединениями осуществляется специальными механизмами регуляции, в основе которых лежит принцип обратной связи на уровне функционально-активной молекулы белка. Предложены возможные механизмы регуляции комплексообразования альбумина с лигандами, гидрофобизации биополимера в процессах онтогенеза и. внутримолекулярной эволюции белка в ряду позвоночных.'

Апробация работы. Материалы диссертации были представлена и укладывались на 1У Всесоюзном биохимическом съезде (Ленинград, 973г.), на 1 Всесоюзном биофизической съэзде (Москва,1552г.), а УШ Совещании по эволюционной- физиологии памяти акад. Л.А.Среди (Ленинград,1932г.), на П и Ш Международной конференции "Зо-

да и ионы в биологических системах" (Бухарест,1982,1984 г.г.), на У1 Всесоюзном симпозиуме "Химия белков и пептидов" (Рига,1'^83г.), на У Республиканском съезде генетиков и селекционеров Украины (Умань,1986г.), на У и У1 Украинских биохимических съездах (Ива-но-1ранковск,1987г., Киев,1992г.), на У Всесоюзном съезде геронтологов и гериатров (Тбилиси,1989г.), на УШ Всесоюзной конференции "Магнитный резонанс в биологии и медицине" (Звенигород, 1990г.), на 1У Всесоюзном совещании "Люминесцентный анализ в медицине и биологии и его аппаратурное обеспечение" (Москва, 1992г.), на заседании Крымского отделения Всесоюзного биохимического общества (1990г.),

Апробация работы состоялась 16 октября 1990г. на заседании Секции молекулярных основ эволюции функций Института эволюционной' физиологии и биохимии имени И.М.Сеченова АН СССР.

Структура и объем работы. Диссертационная работа состоит из введения, литературного обзора, описания материалов и методов, 3 глав собственных результатов с их обсуждением, выводов и списка литературы (360 источников). Материал изложен на 237 страницах, содержит 30 рисунков и 32 таблицы.

Материалы и методы

Исследовали влияние процессов онто- и филогенеза на структурно-функциональные свойства сывороточного альбумина,

Объектоы исследования в онтогенезе служили кролики самцы породы серий великан в возрасте I, 30, 45, 90, 180 и 730 дней. В казедой ьозрастной группе было не менее 10 животных.

В филогенезе объектом исследования были половозрелые особи 6 классов животных. Класс млекопитающие: человек, крупный рогаты

скот (бык) Воз taurua, кролихи порода серый великан, крысы линии Вистар, свиньи S-аз scrofa н морские свинки Cavla anericar.a. Класс птида: гуси домашние Апзег алзег , куры породы Леггорн кросс 288, утки домашние Апаз platyrnyr-.-ha и голуби Coltraba Livia . Класс пресмыкающиеся: черепахи средне-азиатские Tnst-riz horegfleldi, ужи водяные natrix natrix и обыкновенные "atrix tesaelata. Класс земноводные: жаба серая Sufo bufo , лягушки травяные Нала tenporaria и озерные Нала redibur.da . Класс костные рыбы: кефаль обыкновенная "ugil ее-/г.а1из, карп Cy^rinua

carpio , толстолобик Hypophtalslchhys aolitrix и представитель класса круглоротае - минога речная La=petra fluviati-lis.

Материалом исследования служил альбумин, выделенный методом препаративного электрофореза в палиакриламиднси геле из сыворотки крови и гомогенатэв печени. Анализ чистоты и гомогенности выделяемых белков проводили при помощи аналитического элехтрофоре-за (Uaypep,I97I) и иммунохимическим методом (Гусев,1968).

•Для характеристики среды функционирования белка а сыворотке крови и ткани печени определяли протеолитическую актизность, используя в качестве субстрата денатурированный гемоглобин (Ситысо, 1971), величину рН потенцисметрическиа методом и суммарное количество беляз модифицированный методом Лоури ( Schacterls , Pollack, 1973).

Молекулярный вес исследуемых белков определяли иетсдсы гель-фильтрации в тонком слсе сефадекса G-100 " Superfine " (Соряи-на,Конспзнхо,1975).

Содзргз»п'0 доикскяслот опргдедядн ка автоматическом англнге-торе смклошгслот AAA-£51 (4ZCF) flsyxsc.rar«iini катодо.ч н ги:шо-

кислотный состав расчитывали по числу остатков аминокислот в молекуле белка.

Изофокусирование альбумина осуществляли в специальной аналитической колонке в градиенте pH 4,5-6,35, создаваемом маннитсм в различных концентрациях в борно-боратном буфере (pH 8,6) и плотности сахарозы (Троицкий,Завьялов,Абрамов,1974). Техника создания в колонке градиента плотности и pH была модифицирована (Соркина, Остоловский,Ивлев,1978).

Лиофилизированные образцы препаратов белка для инфракрасной спектроскопии готовили в прессовках с бромистым калием в соотношении белок:бромистый калий как 1:100. Измерения проводили в об-

т

ласти 4000-700 см~А на спектрофотометре "Specord-UR-20 (ГДР) при комнатной температуре (Остоловский,Задорожный,Бочаров,1982).

Методом ЯМР-спектроскопии проведено исследование состояния и структурной организации молекул адсорбированной вода в альбумине. Запись спектров протонного магнитного резонанса осуществлялась не ЯИР-спектрометре широких линий, модернизированным для биологических объектов (Габуда,Ржавин,1978).

Расчет размеров гидрофильных каналов, то есть диаметр микро-пор, в которых локализованы молекулы связанной вода, проводили путем анализа формы гистерезисной кривой, используя уравнение Мазура ( Ootolovaky,iUshin,Shadrin,1982).

Метод спектрололяриметрии дает возможность оценить .информационные характеристики белка к его пространственную конфигурацию Измерение параметров дисперсии оптического вращения прйаодили на спектрополяриметра ' " Perkin Einer " (ГДР) в спектре ртутной лам ш с ультрафиолетовой и видимой области спектра. Расчет процентного содержания упорядоченных структур в молекула белка проводил

гсльзуя упрощенное уравнение Ыоффита (Троицкий,1965).

С помощью ультрафиолетовой спектрофстоыетрии получена информа-i об отдельна группах (остатки тирозина) молекулы альбумина и

V

взаимодействие с другими группами. В качестве воздействия, вы-эающего возмущение (пертурбацию) спектров поглощения хромоформ-к групп белха использовали изменение температуры. Температурно-ртурбационную диффернециальную спектроскопию проводили с по-дью двухлучевого регистрирующего спектрофотометра " Snecord " r-vis (ГДР) в области длин волн 240-34Ü нм (Демченко,1981).

Гидрофобную структуру белков исследовали методом солюбилиза-и углеводорода (бензола) с помощью рефрактометра 'ИРФ-23 при ине волны 589 нм (Измайлова,Ребиндер,1974).

Внутримолекулярную структуру сывороточного альбумина изучали тодами люминесцентного анализа.

В качестве флуоресцентных зондов использовали 1-анилинонсф-яин-8-сульфонат (АНС), его магниевое производное (AHC-I/2- м,-) N-фенилнафгиламин (ФНА).

Способность нековалентного связывания исследуемых белков с ^неуказанными люминофора:«! определяли на спектрофотометрической ■■тановке 1Уроверова (ГУсев,1УроЕеров,Розанов и др.,1974). Интен-[вность свечения измеряли в максимуме полосы флуоресценции, дли-t волны света возбуждения для всех зондов составляла 365 нм.

Микровязкость различней участков белковой молекулы исследова-[ методом поляризации флуоресценции (Владнниров,Добрецов,1960).

Определение количества ектишнс центров и константа связыво-¡я люминофоров с белясм проводи"н .методом флуорсметрнческого [трования. Количественная' сценка реакций кснплс-ксссбразования ;счиивалась с использованием иетодп двойных обратных координат

(Данилов,Орлов,Ребров и др.,1976).

Термодинамические характеристики - энтальпию (а Н), свободную энзргию (дс ) и энтропию ( л Б ) связывания определяли при измерении температурной зависимости константы связывания, исход? из уравнения Вант-Гоффа (Владимиров,Добрецов,1980).

Результаты исследований и их обсуждение

I. Структурно-функциональная изменчивость альбумина в онтогенезе

1.1. Среда как фактор структурно-конформационной изменчивости альбумина. Известно, что сывороточный альбумин, синтезируясь в клетках печени, основные свои транспортные функции выполняет е русле крови. В связи с этим, с целью выяснения возрастных особенностей изменчивости среды нами исследовалось содержание общего белка, протеолитической активности и величины рН в сыворотке крови и ткани печени кроликов разного возраста (рис. I).

При исследовании протеолитической активности"сыворотки и ткани печени обращает на себя внимание четкая корреляция, установленная мевду уровнем белка и общей протеолитической активностью (г= 0,92). Очевидно, эти показатели связаны между собой

I ■

и регулируют в организме системы обмена белка. Следует также отметить, что у животных . 6-месячного возраста наблюдаются максимальные значения активности фермента как в сыворотке крови, так и в печени со смещением значений рН в более кислую область.

Закономерность полученных данных созвучна с общим физиологическим состоянием организма и с динамикой его развития.Вместе с тем, полученные результаты могут свидетельствовать о том, что уровень протеолиза и величина рН непосредственно могут вли-

Пл. инг

ИЛИ Г

140

О&ь» е«док, г X

Рис. I. Возрастная динамика изменений содержания белка, зели-чины рН и протеолитической активности (ПА) в сизорот-ке крови (А) и- печени (Б) кроликов

СЗ - сыворотка крови; ^^ - ткань печет'..

ять на структурно-функционалную изменчивость альбумина в процессе возрастного развития.

1.2. Характеристика ряда физических параметров молекулы альбумина и его аминокислотный состав. При определении коэффициента электрофоретической подвижности (Кдф) гомогенных фракций альбумина сыворотки и альбумина печени кроликов обнаружено, что с возрастом они подвергаются изменениям. Для альбумина печени характерным является постепенное увеличение Кдф к 2-летнему возрасту. Для сыворотки такой закономерности но наблюдается. Таким образом, величина К^ подвержена возрастным изменениям, что, вероятно,- связано с изменением суммарного поверхностного заряда молекулы белка в результате конформационной вариабельности.

Результаты исследований по определению молекулярного веса показывают, что его значения для исследуемых белков оказались типичными для альбуминов позвоночных животных и не подвергаются возрастным изменениям.

Анализируя аминокислотный состав альбумина сыворотки и альбумина печени (табл. I) в зависимости от возраста следует отметить вариабельность данного состава альбумина печени и стабильность в содержании аминокислот сывороточного альбумина. Это подтверждается и показателями индекса изменчивости, средние значения которого для альбумина сыворотки составили 94,1$, а для альбумина печени - 83,2$.

Проанализировав аминокислотный состав альбуминов и не обнаружив существенных изменений в зависимости от возраста, мы исследовали непосредственно содержание альбумина в сыворотке крови и ткани печени (табл. 2).

Из данных, представленных в таблице 2 следует, что содержание альбумина с возрастом в исследуемых тканях снижается. Но если сывороточный альбумин уменьшается у 730-дневных животных по срав-

Таблица I

Содержание аминокислотных остатков в альбумине сыворотки и печени хроликов разного возраста

Альбумин сыворотки

Альбумин печени

Возраст (дни) I : 30 :160 :730

Индекс изменчивости

Возраст (дни)

I : 30 :180 :

:Индекс -:изменчи-

730 :вости

Асп 35 34 34 35 97,1 35 32 30 33 85,7

Тре 20 22 20 21 90,9 22 22 22 25 88,0

Сер 35 34 33 34 94,3 38 37 35 39 • 89,7

Глу 57 55 57 58 94,8 54 60 55 57 90,0

Про 4 4 4 4 100,0 5 6 4 7 57,0

Гли 19 20 20 95,0 20 17 22 21 77,4

Ала 54 56 55 55 96,4 61 59 58 57 93,4

Вал 50 50 51 52 96,1 50 50 54 58 86,2

Нет I I I I 100,0 I I 2 2 5С,0

Иле 24 26 26 25 92,3 29 32 29. 33 ,94,2

1ей 60 59 62 63 93,7 66 69 65 62 94,2

Гир 24 22 24 23 91,7 20 20 20 20 100,0

>ен 31 30 31 29 93,6 35 36 35 38 92,1

15 15 15 14 93,3 14 15 16 17 62,4

[из 58 56 57 56 96,6 50 56 5С 52 89,3

рг 16 14 13 15 81,3 20 16 14 16 70,0

ряд -18 -19 21 -22 М=94,Х -18 -20 -21 -22 Ы-83,2

шш с 30-дноБ!СХт,1 всего на 201?, то з печени изменения носят лее глубокий характер и содержание балка, здесь падает на 72%. есой характер изменений, очевидно, СЕЯзан с увеличением вреиени

Таблица 2

Содержание альбумина {%) в сыворотке и экстрактах печени кроликов разного возраста

Белки Возраст

| I сут. : I мес. 6 мес. 1 2 года

Альбумин:

печени 8;4-0,56 6,5-0,49 3,2-0,73 1,8-0,61

сыворотки 58,2-1,10 54,3-0,96 48,5-1,32 43,6-0,88

. функционирования сывороточного альбумина в русле крови старых животных и снижением синтетической способности печени продуцировать альбумин, и как результат, эти изменения прямо или косвенно будут определять структурно-функциональную изменчивость молекулы сывороточного альбумина в различные периода возрастного развития.

1.3. Гидрофобная структура альбумина. При исследовании солю-билизирующей способности белков оказалось, что величина связывания углеводорода белком ( н ) у альбумина сыворотки значительно выше, чем у альбумина печени (рис. 2),.причем степень связывания зависит от возраста.

Полученные данные показывают, что величина Я для альбумина сыворотки с возрастом увеличивается, а для альбумина печени уменьшается. Наибольшие изменения значений наблюдаются в альбуминах младших возрастных групп (до 90 сут.), а затем по мере старения животных "изменчивость" солюбилизирующей способности белков становится меньшей. Таким образом, с возрастом происходит статистически достоверное увеличение общего объема гидрофобных полостей в молекуле сывороточного альбуыина.

Рис. 2. Солюбилизирувцая способность ( И ) альбумина сыворотки и альбумина печени кроликов разного возраста

I- Z- *An(t)

Отмеченные изменения в гидрофобной структуре альбуминов в зависимости от возраста вызывали естественную необходимость выяснить за счет чего это происходит. Для эгого методом температурно-пертурбационной дифференциальной спектроскопии определялась доступность остатков тирозина, расположенных на поверхности белковой глобулы. Показано, что у сывороточных альбуминов 90- и 180-дневных згивотных на поверхности экспонируется от 50 до 52Й ти-розилов, что практически соответствует нормальной конфигурации молекулы белка (Троицкий,Багдасарьян,1979; Борисенко,1990). Следует выделить такхе еце две возрастные группы, где это классичес-

кое соотношение нарушается более или менее основательно (рис. 4). У кроликов в возрасте 30 дней отмечено незначительное преобладание поверхностных тирозилов (~3 остатка), в то время как в альбумине двухлетних животных регистрируется более четков их пространственное перераспределение, с уходом значительной части тирозилов (~б остатков) в глубину молекулы белка. Такое перераспределение тирозинов может являться подтвервдением структурной изменчивости молекулы сывороточного альбумина именно за счет гидрофобной конформации.

Особо следует отметить, что для альбумина печени всех возрастных групп отсутствует пертурбационный эффект воздействия на тирозилы. Это может быть связано с большой компактностью молеку- ' лы белка печени, или неоднородностью электрофоретически гомогенного альбумина, выделенного из этой ткани.

1.4. функциональная гетерогенность альбумина. Результаты изоэлектрофокусирования показали, что белковые фракции альбумина ткани печени и альбумина сыворотки кроликов гетерогенны и в пределах рН 4,6-6,0 разделяются на три- пять компонентов (рис. 31 Среди них можно выделить фракцию, содержащую основную массу белка - главный компонент и несколько подфракций с различным содержанием белка в областях более или менее кислых рН по отношению к главному компоненту, то есть минорные компоненты (Соркина.Осто-ловский.Ивлев,1978).

Сывороточный альбумин по отношению к альбумину печени является менее гетерогенным белком. В возрасте от 30 до 90 дней он выделяется только одной фракцией, у 6-месячных, животных уг® можно заметить компоненты с р1 5,19 и 5,56 с незначительным содержанием белка (5 и 8%) и только у двухлетних животных появляются

lut

Q.OÍ a, с J

одч

fi S,53

/ /At'X

Ж J

pH

w

5.7

«

1.9

0,14 QI2 •»0,10

0.M 0Л6 ÜD1

paw p3M9 . f.Y /«

y

y

AC-S0\ S 42

рн

M

5.9 5.7 5.3 5.3

S.ï

V

ß » а нз nfoîw

25 30 î>5 40 ¡15 »«au

t

JO 31) <Q 50 Г-*"-1

0,-ir-0,K 0.12

o,w ам

5, Ш

55» yl 5,35 H<6 0.(1 П.Й

CUD 0.Ц B.CÓ 0,« №

J( 0J.MS

У! \ f\ y J \î I y l

y' i

w

M

5.5

5.6 M ÍJS i.0

P4<0Y

FЗ^АУ g.

AC-73Q

ib 2» го M it> Л-хга í'*

5.5

5.6 6.4 5.2 5,0 Vi U

(5 гь 55 К 53 CS

Рис. 3. Изоэлектрячискиз спеа^рк альс^гясгга енгсрекги (AG) и аявбушка та&вд'пгтодо (АЛ) жролкасп разного соярастгг

I - pH градиента; 2 - кривая сптгпсакой плотности; .3 - рефояусировгние пнка главного компонента.

дополнительные хорошо вграганные минорные компоненты в более кислой области по отношении к главной франции. Появление дополнительных минорных компонентов в альбумина половозрелых кроликов (возраст 180 дней) и их направленное перераспределение в более кислую область в белке старых аивотшос является доказательным фактом существования специфических возрастным группам модифицированных форы белка, которые возникает под воздействием метаболитов

Изоэлектрическая гетерогенность альбумина печени и возрастные изменения его изоэлектрического спектра могут свидетельствовать о неоднородности данной белковой фракции. В связи с этим можно допустить, что гетерогенность альбумина печени обусловлена наличием в нем альбумина, подготовленного к секреции, предшественника этого белха (проальбумина) и, возможно, продуктов деградации альбумина, имеющих близкую электрофорэтическую подвикность.

1.5. Онтогенетические особенности конформационной структуры и гидратационных свойств альбумина кроликов. Анализ полученных ИК-спектров альбуминов сыворотки и печени показал значительное их общее сходство. При юс рассмотрении в возрастном аспекте следует отметить заметную устойчивость спектров сывороточного белка, которые практически не изменяются у всех исследованных возрастных групп. В противоположность этому, ИК-спактры альбумина печени характеризуются выраженной зависимостью от возраста. Анализ характера поглощения сравниваемых белков позволяет утверздать, что -в своей структурной организации они содержат как упорядоченную,так и неупорядоченную конформациа, соотношение которых примерно одинаково. Следует отметить, что б процессе возрастного, развития,вероятно, регулярная упорядоченная структура изменений не претерпевает.

Методом дисперсии оптического вращения получена информация, согласущаяся с данными по ИК-слектроскопии. Показано, что происходящие в связи с возрастом конформационные изменения сывороточного альбумина кроликов не затрагивают вторичную структуру (рис. 4).

N моль/коль 30

80

70

60

50

/ ^

»V •

»

/

\

% ¿¿-спиралей и Тир

175

30 90

_1_

180

-4

3

4,2 _!_

50

25

730

Еозрад? /где/

Рис. 4. Онтогенетическая конформационнзя изменчивость .молекулы сывороточного алъбужна кроллхов

1 - солюбилизирукцая способность альбумина; -

2 - процент тирозина на. поверхности глобуш белка;

3 - процент сб-спиральных участков колекули альбумина.

Молекулы зода входят з состав большинства глобулярных белков, однако вопрос с форме вхождения их б структуру биополимеров зще

нэ реген окончательно. С помощью ЕМР-спектроскогши проведено сравнительное исследование состояния и структурной организации кэлехул адсорбированной вода в белках. Показано, что объемы мест локализации вода с возрастом претерпевают изменения, с их значительным снижением в молекуле сывороточного альбумина старых животных (табл. 3).

Таблица 3

Диаметр ыикропор в молекуле сывороточного альбумина кроликов разного возраста

Я*? характеристики Возраст (дни)

; 30- : 90 : 160 730

0 о т2-тх 10,5^0,03 8,2±0,5 8,2^0,5 6,0±0,3

Диаметр микро-иор, А 14,0-0,4 П,0±0,6 II,0^0,9 8,0^0,5

Уыеньсание диаметра ыяхропор в сывороточном белке 730-днев-шх животных может являться прямым доказательством того, что число молекул вода, входящих в состав биополимера снижается, в результате чего могут наступать конформационные перестройки в молекуле белка, ведущие к изменения функциональной активности.

1.6. Внутримолекулярные особенности структуры сывороточного альбумина. При сворачивании полипептидной цепи образуется гидрофобное ядро и гидратная оболочка белковой глобулы (Бреслер,1966). При этом плотное.ядро окружено оболочкой более рыхлой полипептидной цепи, содержащей также гидрофобные зоны, которые в отлична от стабильного ядра участвуют во внутримолекулярных конфорыацион-ных переходах белка ( Г.цг2а-ы,Я1*2,;ико1а1егг, 1961 )•

При исследовании микроокружения этих специфических зон с по-

мощью лдминисцентного анализа оказалось, что в процессе возрастного развития происходят внутримолекулярше перестройки структуры в местах локализации как АНС, так и <£НА, то есть непосредственно в ядре и периферийных гидрофобных участках (табл. 4).

Таблица 4

Интенсивность флуоресценции ( Р), ышфовязкость (1) число центров связывания ( п ) и константа связывания ( к с ) в сывороточных альбуминах кроликов разного

возраста

Вид исследования

Возраст (дни)

.30

45

90

160

730

%

АНС

«НА

Н , цуаз.

АНС

4НА

К Ю4. 1Г1 АНС

ФНА

а /моль АНС

2НА

19,4 34,0

0,0063 0,133

7.8 36,6

4.9 8,5

64,5 82,0

0,0072 0,191

9,3 39,0

5,8 9,3

100 100

0,0083 0,200

12,1 46,2

8,6 .11,3

90,0 100

80,2 90,3

0,0094 0,0083 0,191 0,093

11,8 44,2

8,4 11,4

14.5

51.6

6,2 10,3

Динамика изменения показателей интенсивности флуоресценции, по наяеыу мнению, может свидетельствовать, что в процессе возрастного развития идет становление и фор/ирование молекула сывороточного альбумина с приобретением ею, а результате вцутршоле-хулярных перестроек, самых эффективных структурно-фунхциональшх

чкачеств' (возраст 90 и 180 дней). Позже, в белке старых животных, вероятно, наступают необратимые изменения под воздействием специфических метаболитов, которые могут вести к снижению функциональной активности.

Обнаруженные внутримолекулярное изменения мнкроокружения люминофоров непосредственно влияют и на михровязкость этих зон в молекуле белка. При этом, становление внутреннего гидрофобного ядра идет значительно быстрее (зонд ФНА), чем периферийных гидрофобных участков (зонд АНС), со снижением этих показателей в молекуле сывороточного альбумина старых животных, и особенно во внутреннем ядре.

Необходимо отметить, что нами экспериментально подтверждена гипотеза ряда авторов о наиболее плотном гидрофобном ядре в молекуле белка (Бреслер,1966; luzzati,Witz,llikolaieff,1961) .

Отмеченные нами внутримолекулярные изменения оказывают также влияние на ряд функциональных параметров. Так максимальное число центров связывания отмечено для альбуминов крслихов 90- и 180-дневного возраста. В белках молодых и старых животных их несколько меньше. Константа связывания для обоих люминофоров с возрастом претерпевает изменения и наиболее высокие ее значения прясу-

альбуминая старых животных. Все вышеуказанные факторы могут вести к гидрофобизации молекулы альбумина за счзт более прочного коиплексообразования белка с метаболитами.

1.7. Обсуждение результатов. Биохимический механизм изменчивости белков при различных физиологических состояниях м,ожзт быть разным, однако он почти всегда связан с нарушением биосинтеза или постсинтетической модификациями (0столовский,1982; Троицкий, 1985; Борисенко,1990).

Возрастная вариабельность среда, а такта изменчивость альбуминов по ряду физических параметров н аминокислотному составу может вис :вать появление мношственжх форм белка. Появление до-полнителыых минорных компонентов в сывороточном альбумине физиологически зрелых кроликов и их направленное пэререспределениэ з более кислую область при изофокусировшгли являются доказательным фактом существования специфичных для возрастных групп моди-фицнрованшх форм белка, появляющихся под воздействием метаболн-тов.

Полученные данные свидетельствуют, что сывороточные альбумины разных возрастных групп гадают примерно одинаковый процент периодической конформации. Одновременно с этим, сывороточные альбумины старых ответных на поверхности глобулы содержат, по сравнению с другими возрастными группами, «еньизе количество пертур-бируемых тирозилов, что йога? являться подтверждением конформа-ционной изменчивости молекулы белка 730-днзвных тавотных, не связанных с регулярными структурами (рис. 4).

Характеризуя сывороточный альбумин как йолэнулу с менее гесткой структурой по сравнетго с альбукиноа печени, надо полагать, что в его молекуле появляются дополнительные гидрофобные области на поверхности глобулы, которые■обеспечивают более эффективный доступ лигандов к участкам связывания. Качественные

, >

структурные изменения сывороточного алъбушна с возрастом, связанные с увеличением общего объема гидрофобных областей, парораспределением тирозилов и уконыезгегем количества связанной вода возникают, скорее всего, в результата действия ыэтаболитов, которые своими гидрофобная! радикалами проиихшот .в поверхностные гидрофобше цели молекул белка, содержащие остатки -ифозина.

При этом, происходят внутримолекулярные перестройки этих областей с созданием дополнительных гидрофобных зон. Поскольку молекула белка имеет кооперативную структуру, то взаимодействие метаболита с белком может приводить к скачкообразному уменьшению жесткости белковой глобулы вообще и, как следствие, к уменьшению жесткости окружения тирозина.

Происходящие внутримолекулярные структурные изменения в молекуле сывороточного альбумина старых животных приводят к снижению функциональной активности белка - уменьшается число активных центров, с увеличением константы связывания. Происходит, очевидно,

Ч

нагрузка альбумина метаболитами и их более прочное удерживание молекулой белка на своей поверхности.•

Для альбумина, старых животных возможно появление специфических форм белка с пониженной функциональной активностью за счет гидрофобизации молекулы альбумина лигандами.

Становится очевидным, что молекулярные формы альбумина старых животных не в состоянии выполнять нормальную транспортную функция, что может представлять новую биологическую проблему - изучение фиэиолого-бирхиыических функций альбумина при различных функциональных состояниях и филогенетических уровнях развития организмов.

2. Филогенетические особенности структурных и функциональных свойств сывороточного альбумина 2.1. Характеристика среди функционирования альбумина и его некоторые Физические параметры. Физико-химические свойства альбумина в аспекте изучения их функциональной активности определяются в основном двумя факторами: непосредственно реализованной в структуре белка генетической программой и потенциальной возможностью макромолекул к изменчивости, б зависимости от уело-

вий их окружения. Полученные данные свидетельствуют, что уровень протеолитической активности сыворотки крови млекопитающих непосредственно зависит от величины рН (рис. 5).

V.

3

12-10

10-10-

а-ю-

6-Ю-

4-10

2-10"

ПА; >лкг Тир/мл

Кролик.

Бык Свинья Человек. Криса. И. свинка

Рис. 5. Взаимосвязь ыегщу величиной рН (о), протеолитической активностью ) ц обарш объемом гидрофобных

областей ( V , Е55Э ) молекула сывороточного альбумина млекопитающих

Показано такав, что отличий в величинах молекулярного веса, КЭф исследуемых сывороточных альбуминов нз отмечено. Содержание альбумина в сыворотке крови т.акгв находится в довольно у^ких границах, то есть от 48 до 52%. Все это моезт являться прямым доказательством того, что альбумины млекопитающих могут иметь гомоЛ1--

гичную структурную организацию и определенный набор довольно близких специфических функций.

2.2. Изоэлектрическая гетерогенность альбумина. При.фокусировании белки млекопитающих в пределах рН 4,25-5,93 разделяются на 3-7 компонентов. Наименее гетерогенен альбумин кролика, наиболее -альбумин сыворотки крови морской свинки (табл. 5). р1 главных компонентов отличаются ыеящу собой и исследуемые альбумины в зависимости от более кислых к менее кислым значениям рН можно расположить следующим образом: ...—»-АС быка...—»«-АС человека... —»-АС свиньи...—— АС крысы,..—АС кролика...—АС морской свинки...—

Следует также отметить, что минорные компоненты как более кислой (I - У), так и менее кислой СУП - X) зон, относительно главного компонента, представлены у исследованных альбуминов разным количеством фракций.

Вместе с тем, судя по данным фокусирования, можно с достаточной определенностью предположить, что наряду со значительным сходством структурно-функциональной организации альбумннов в пределах класса, между ними существуют и некоторые характерные отличия. В основе рассматриваемой гетерогенности, очевидно, в первую очередь, лежит наличие конформеров - альтернативных устойчивых кон-формационных состояний одного и того же белка рассматриваемого вида кивотных (Галь,Ыедьеши.Верецкеи,1982; Ригетти,1985). Поэтому,-обнаруженная микрогетерогенность мокет быть одним из проявлений видовой специфичности.альбуминов.

2.3. Аминокислотный состав н конфошационные особенности структуры альбумина. Одним из возможных направлений поиска мате-

Таблица 5

Характеристика изоэлектрических фракций альбумина сыворотки некоторых видов млекопитающих

pi изоэлектрических компонентов (Mim ) и их соотношение, %

альбумин 'Минорные компонента более кислой : зоны Главный компонент Шторные компонента менее кислой зоны

i I : п ш ; 1У ; у У1 УП УШ IX : X

Человека 4,36* 0,006 4,46* 0,010 4,59* 0,008 ■ - - 5,06* 0,004 - 5,39* 0,030 5,59* 0,005 -

8 4 6 - - 59 - 10 13 -

Быка 4,32* 0,01 - 4,63* 0,009 - - 4,95* 0,006 - 5,34* 0,010 5,55* 0,005 5,76* 0,010

7 - 9 - - 56 - 8 9 II

Свиньи 4,25* 0,008 5 4,47* 0,009 12 - - - 5,07* 0,001 61 5,82* 0,010 12 - 5,68* 0,006 10 -

Крисы 4,30* 0)020 5 4,64* 0,009 21 5,19* 0|015 68 ; 5,67* 0,010 6 ;

Кролика - - ' - - 5,19* 0,015 10 5,38* 0,010 65 - - 5,56* 0,020 25

Морской свинки 4,38* 0,009 - 4,56* 0,006 4,81* 0,010 5,09* 0,020 5,45* 0,010 - - 5,59* 0,010 5,93* 0,009

2 - 5 3 3 49 - - 18 20

риальной основы специфичности структуры белков и выявлением индивидуальных особенностей укладки полипептидной цепи являются методы аминокислотного анализа, ИК-спектроскопии и дисперсии оптического вращения.

Проанализировав качественный и количественный аминокислотный состав шести альбуминов млекопитающих, нам удалось обнаружить некоторые их особенности. К ним относится прежде всего то, что содержание почти всех аминокислот в альбуминах колеблется, причем такие ках Про и Мет исключительно широко, тогда как количество Лиз, Лей, Глу и Асп изменяется незначительно. Все изученные белки имеют очень близкие отрицательные значения суммарного поверхностного заряда молекул. Кроме того, суммировав количество Глу, Ала и Лей, как аминокислот характеризующихся наиболее сильной тенденцией к образованию «С,-спиральной к^нформации с одной стороны, и Вал, Мет и Иле, наоборот, склонных к организации £ -структуры, следует отметить, что во всех белках должна превалировать- -спиральная конформация (Попов,1989).

С помощью ИК-спектросокпии и дисперсии оптического вращения это предположение полностью подтвердилось. Полозкение максимума полосы Аыид В свидетельствует о том, что доля Р -структур в белках весьма незначительна (рис. 6).

Для данных белков, судя по частотам наиболее интенсивных компонент полос поглощения Аыид I и Акид П, очевидно, характерна относительно неупорядоченная рыхлая структура, в которой, однако, велика доля »¿-спиральных участков (Эллиот,1972; Чнргадзе, 1973). При стой структура альбуминов кролика, быка и свиньи, относительно упорядочена, чей белки человека, крисы и морской свинки (Болами,1963; .Остоловский.Задорогклй и-др.,1908). В ИК-

Рис. 6. Инфракрасные спектры и спектральнче характеристики сывороточных альбуминов человека (А) и быка (Б)

спектрах альбумина кролика, быка и свиньи достаточно отчетливо выражено поглощение вблизи 3400 см"**, что служит определенным указанием на наличие в структуре этих белков свободных групп, не участвующих в образовании водородных связей. Это в определенном смысле служит подтверждением, что белки кролика, быка и свиньи имеют структуру относительно менее госткую, чем альбумины человека, крысы и морской свинки.

Спектрополяриметрические данные показывают, что во всех белках примерно одинаковый процент периодической конформации. Полученные дисперсионные константы характерны для сывороточных альбуминов и свидетельствуют о значительном вкладе Л-спиральных участков в этих биополимерах (от 42,6 до 49,8%).

2.4. Гидрофобная структура и гндратационные свойства белка. Применив метод солюбилизации для определения общего объема гидрофобных полостей следует отметить, что альбумины кролика, быка и свиньи, связывая больше бензола, имеют и большие объемы гидрофобных областей по сравнению с другими исследуемыми белками, что обуславливает их менее жесткую структуру. Кроме того, следует подчеркнуть, что существует четкая зависимость между рН среды сыворотки, протеолитиче.ской активностью и макромолекулярной структурой альбумина млекопитающих - чем больше сдвиг рН сыворотки в кислую сторону, тем выше протеолитическая активность и тем больше объем гидрофобных областей молекул альбумина (рис. 5). •

Аналогия механизмов вымораживания диффузионной подвижности молекул адсорбированной вода и отсутствие заметного смещения температур при полном вымораживании воды, позволяет утверждать, что уровень видовой организации не влияет на природу адсорбционных взаимодействий молекул воды в исследованных белках. Б то же время, анализ интегральной интенсивности центральной компоненты и исследование температурной зависимости спектров ЯМР показал, что число молекул воды, локализованных в структуре белков определяется

видовой принадлежностью (рис. 7). Максимальный диаметр гидрофиль-о

шах каналов (II А) отмечен для альбумина кроликов, минимальный -■ о

1,6 А для альбуминов крысы.

3

90

Ю 70 60 50 40 X 20 10 0

Рис. 7. Диаметр микропор и температурная зависимость центральной компоненты спектра ЯМР альбуминов млекопитающих

2.5. Анализ внутримолекулярной структуры сывороточного альбумина. Флуоресцентный анализ позволяет изучать свойства микроокру-жзния люминофоров в белке. Обнаругено, что интенсивность флуоресценции наиболее гидрофобного ядра (зонд ФНА) во всех случаях приблизительно одинакова, и это позволяет утверцдать,- что занимаемые им области очень близки по размерам и степени гидрофобности. В то же время, результаты полученные при использовании зонда АНС свидетельствуют об определенной специфичности менее- гидрофобных областей, где локализуется этот зонд (табл. 6). Так, в частности, оказалось, что интенсивность флуоресценции в альбуминах морской свинки и кролика значительно ниже, чей в белках человека, быка, крысы, свиньи.

Показано, что микровязкость зон сорбции ФНА существенно пре-

I I

го з>Ь°с

восходит микровязкость областей занятых АНС. При этом, более высокие показатели микровязкости для окружения ФНА получены у альбуминов человека, быка, морской свинки и свиньи, более низкие определены в белках крысы, кролика и быка. При использовании зонда АНС также отмечена видовая специфичность по этому показателю

(табл' б)- Таблица 6

Интенсивность флуоресценции (* ), микровязкость (»1 >, число центров связывания ( п ) и константа связывания ( Кс ) в сывороточных альбуминах млекопитающих*

Вид иссле-1 белки

дований : ЧСА { БСА : кса : КрСА ССА { МСА

у . %• •

АНС 66,0 88,0 26,0 51,0 52,0 25,0

ФНА 91,0 99,0 94,0 95,0 91,0 100,0

^ , цуаз: •

АНС 0,014 0,009 0,009 0,012 0,009 0,013

ФНА 0,368 0,210 0,179 0,179 0,368 0,368

^ФШ/^АНС 26,0 23,0 20,0 15,0 41,0 28,0 '

п/моль:

АНС 7,75 10,81 8,40 3.34 8,90 19,95

ФНА 13,30 12,14 11,44 2,70 9,92 11,26

1 4 -т. «е- Ю М

АНС 11,75 9,24 8,45 12,77 10,80 14,45

ФНА 17,08 47,73 44,02 33,41 109,68 92,34

Примечание: и - КрСА - сывороточный альбумин крысы.

Б аспекте изучения функциональных особенностей альбуминов млекопитающих били исследованы некоторые параметры их комплексо-образования в реакциях зонд-белок. Оказалось, что максимальное число центров связывания с зондом ФНА свойственно молекуле сиво-

роточного альбумина человека,-в белках быка, кролика и морской свинки их обнаружено несколько меньше, в альбумине крысы зарегистрировано минимальное количество этих центров.

Результаты, полученные при использовании зонда АНС также не однозначны по своим значениям. Наибольшее число центров связывания обнаружено в альбумине морской свинки, средние значения отмечены в белках быка, кролика, свиньи и человека, тогда как минимальное количество активных центров и на этот раз зарегистрировано для альбумина крысы.

Другим информативным параметром изучения взаимодействия белков с любыми лигандами, в той числе и с люминофорами является константа связывания. Наиболее пысокпе ее значения Сэонд $НА) отмечены для белков свиньи и морской свинки," тогда как альбумин человека отличается от всех белхов наименьшим значенной этого показателя. В свою очередь константа связывшшя для АНС очень близки по своим значениям (табл. б).

с

2.6. Обсуждение результатов. Обнаруженные отличия ряда показателей среды, где функционирузт альбумин, позволили нам разделить изучаемые объекты на две группы. А пмоино, белки быка, кролика и свиньи (Еысокая протеолитичзская активность, более кислый значения рН) и альбумины крысы, морской свинки а человека (более низкая протеолитичесаал активность и мзнзэ кислые значения рН), что позволяет предположить налич:кз обуслозлешюй изменчивости у изучаемых белков.

• Информация полученная мзтодои фотсусироватя и анализа аминокислотного состава позволила установить наличие изменчивости на уровне класса, которая генетически детерминирована и реализуется на трансляционном уровне.

Обращает на себя внимание и тот фахт, что макромолекулы альбуминов млекопитающих значительно отличающиеся между собой по аминокислотному составу, в то же время имеют очень близкие пространственные структуры. Такая структурная организация в гомологичных белках, обеспечивающая выполнение однотипных функций, может иметь значительные различия в аминокислотном составе, которые, однако, не затрагивают критически необходимые инвариантные аминокислотные остатки ( Заг1сЬ ,1974; Ленинджер.1985). Такое-заключение находится в соответствии с данными по вторичной структуре сывороточных альбуминов.

Бедки человека, крысы и морсхой свинки имеют менее рыхлую конфоркацию и меньший объем гидрофобных областей, тогда как альбумины кролика, быка и свиньи отличаются от вышеуказанной группы менее упорядоченной структурой и большим объемом гидрофобных полостей.

Если исходить из предположения о существовании гидратной оболочки молекулы белха и ее наиболее гидрофобного ядра (Измайлова, Ребивдер,1974), то наибольшим сродством к такому ядру обладает зонд 4НА, что обусловлено его химическим строением. Рассматриваемые области очень близки по своим размерам и степени гидрофобности и содержат, вероятно, вблизи себя одинаковое количество молекул связанной воды. По нашему представлению они являются "универсальными" для класса и могут 'служить его характе-. ристихой (0столовский,Боцянский,Задорожшй,1988). В то же время следует отметить; что в струхтуре изучавшихся белков существуют гидрофобные области, по крайней мере, двух типов: универсальные - общие для всех альбуынков илекопитазвщкх н области специфические - характерные дгя каздого вида исследуешх образцов. Это хо-

pomo согласуется с современными представлениями о- консервативной изменчивости белков ( ¡íimura, Ohta ,1973). А именно, на внешнюю часть макромолекулы белка полагается меньше функциональных ограничений в смысле поддержания структуры и функции белка, чем на ее жизненно важное ядро.

Различна роль связанной воды, находящейся в структуре белка. С одной стороны, вода в известной мере влияет на форму и размеры внутренних областей молекул, а с другой стороны она, находясь непосредственно вблизи активных центров белка, влияет на их функциональные свойства.

Микровязкость зон сорбции ФНА существенно превосходит показатель микровязкости областей занятых АНС. Это может служить прямым доказательством, что именно гидрофобное ядро несет ответственность за поддержание определенной структурно-организационной кон-формации молекулы белка.

При изучении функциональной активности альбуминов оказалось, что количество центров связывания для ФНА в исследованных образцах, за исключением альбумина крысы отличается незначительно и составляет от 9,92 до 13,30 единиц (для КрСА п = 2,7). Что же касается зонда АНС, то для четырех альбуминов (ЧСА,БСА,КСА и ССА) количество центров связывания приблизительно одинаково и находится в пределах 7,75-10,81 единиц на молекулу белка. Для сывороточного альбумина крысы, как и в случае с ФНА, отмечено минимальное количество центров связывания, тогда как белок морской ' свинки содержит их максимальнее количество. На основании этого можно предположить существование определенных компенсаторных механизмов, обеспечивающих в конечном итоге универсальность гидрофобных ядер и специфичность периферийных участков. Во всех без исклю-

чения случаях прочность комплексообразовання альбуминов с зондами зависела от количества центров связывания. Так в частности, при минимальном количестве центров связывания как для АНС, так для ФНА отмечаются самые высокие показатели энергии связи (Б) и наоборот. В основе такой регуляции лежит принцип обратной связи на уровне функционально-активной молекулы белка.

Следует отметить и то, что почти во всех изучаемых белках центров связывания для ФНА больше чем для АНС, прочность связывания ФНА, как правило выше, и, наконец, во всех случаях константы связывания ФНА значительно выше таковых для АНС. Это весьма определенно и однозначно свидетельствует о более высокой ассоциативной способности универсального гидрофобного ядра по сравнению со специфическими периферийными гидрофобными зонами, и о предпочтительном связывании альбуминов с наиболее гидрофобными соединениями.

Таким образом, следует отметить, что механизм комплексообразовання люминофоров с альбуминами млекопитающих носит различный характер и во многом определяется внутримолекулярной структурной специфичностью. Это позволяет еще раз подчеркнуть, что исследуемые альбумины млекопитающих, включая и человека, наряду с безусловной близостью их структурно-функциональной организации, имеют и вполне определенные внутримолекулярные отличия.

3. О взаимосвязи процессов онто- и филогенеза и сопряженности эволюции молекулярной и ыорфо-функциональной

Если исходить из концепции, что эволюция происходит на основе наследственных изменений любых стадий онтогенеза и филогенез представляет собой генетический ряд онтогенезов, то полученные данные по внутримолекулярной структуре для онто- и филогенеза но

гут представляться одним из доказательных фактов этого положения на молекулярном уровне для альбумина (табл. 4,6, рис. 8).

Отчетливо заметна взаимосвязь этих процессов, если сравнить динамику онтогенетических изменений по внутримолекулярным параметрам (микроокружение люминофоров и микровязкость зон сорбции зондов) с аналогичными показателями, полученными в филогенезе.

»«и*»4

Рис. 8. Взаимосвязь процессов онто- и филогенеза на уровне внутреннего гидрофобного ядра (ФНА) и специфических периферийных зон (АНС) молекулы сывороточного альбумина

позвоночных альбумин сыворотки кроликов (онтогенез); о- альбумин сыворотки ряда позвоночных (филогенез).

В зависимости от уровня развития организмов иикроокружение ядра (Рфнд) и периферийных участков (F^q) изменяется, однако эти. изменения неоднозначны, хотя и имеют общую направленность, йикроокруяение гидрофобного ядра от класса рыб к' птицам меняется постепенно, и только от класса птиц к млекопитающим отмечены резкие скачкообразные изменения. Такая га тенденция набйпдаегся и по

показателям интенсивности флуоресценции для АНС. Однако, этот критерий резко возрастает у альбуминов птиц по сравнении с нижестоящими классами и по своим параметрам значительно приближается

копитащих как гомойотермных животных, по сравнении с белками пресмыкающихся, земноводных и рыб.

Ыикровязкость периферийных гидрофобных участков и универсальных для класса ядер также изменяется в филогенетическом аспехте. При этом, как и в случае онтогенеза развитие структурно-функционального фактора (АНС) и структурно-конформационного (ФНА) идет в одном направлении, но с различной скоростью.

Если допустить, что у сывороточного альбумина костных рыб,как основного качала современных позвоночных, эти факторы равноценны, то на основании экспериментальных данных и современных представлений о структурной организации альбумина ( Peters ,1985; Лихтенштейн,1989; Carter,Не Xio-ain,Munson,1989 ) можно предположить возможный путь его молекулярной эволюции в ряду позвоночных. Рассчитывая "филогенетический шаг" развития структурно-функцио-

между классам^ можно проследить эволюцию становления внутримолекулярной структуры и скорость ее развития в сопряжении с морфо-функциональнымк факторами (рис. 9).

Смена водной среда на наземную прямо отразилась и на молекулярной эволюции альбумина - отмечен резкий скачок мевду этими классами, с развитием как структурных, так и функциональных свойств белка.

Полная независимость от водной среды появилась у пресыыкаю-

к альбуминам млекопитающих. Это может быть связано со значительным повышением функциональной активности альбумина у птиц и мле-

нальных особенностей белка как разность отношений

•мавр*- _

грмп

лосголм»« —

0,011 I

1—,-_11_! П.'И .'Ш 11.IL 'И ГкЛЕИХСТЛПде 1 1 ! ■

К*»орейдом, *•< «моь «

„17 мг~ 15 ад. — «яр на ни орт шиш

Слффшм цпмнш груши, сохр«м-ци Солшо* «кю прюнамо» сю*-сучем» ар» таимцжш

Пэгут меиятк тшввр*- * ГпРЕОаЛЦПуЕО! |

туру (Ш п»»«де^4ч«С1Ш ^

- «-я ин 4гг ф ^ «д.

»•«Ц I ) АР •

мврмомыьиого ри> КШ 9Г Ы>ЯЦ0Я ф

&*Т»»мо н* инич Таал*-

~100иЛ.*т 1.3 и. ,д", I «1

ОИИЯ сг*Яй вО*мми|( шаця м «7-

щу, шым НШЕ

о. а» •

Рис. 9. Возможный путь молекулярной эволюции сывороточного альбумина в ряду позвоночных

щихся. Такой ход развития позвоночных сказался и на структурной

организации молекулы'альбумина, развитие факторов шло равномерно.

Способность к поддержанию постоянной температуры тела исторически сложилась независимо у гонойотермных - птиц и млекопитающих. У птиц выработался высокоэффективный механизм дыхания, для чего потребовался весьма интенсивный.метаболизм. Это прямо отразилось и на развитии альбумина. Последовал очередной резкий "филогенетический скачок" с мощным развитием у птиц структурно-функционального фактора.

У млекопитающих сформировался радикально новый и более совершенный тип размножения - живорождение. Вероятно, для этого потребовался альбумин с совершенной структурной организацией и широким спектром функций. В результате этого, от пресмыкащих к классу млекопитающих произошел следующий резкий скачок. При этом, наряду с энергичным развитием всех двизфтцих сил, произошло усиленное

_ О.СТ»!

формирование структурно-конформационного фактора.

Таким образом, в процессе филогенеза идет развитие и становление молекулы сывороточного альбумина. Очевидно, в результате аминокислотных замен и внутримолекулярных перестроек меняется общий

«

объем гидрофобных областей, количество связанной воды, форма и размеры глобулы белка. Надо полагать, что даже сравнительно далеко отстоящие друг от друга на эволюционной лестнице альбумины должны характеризоваться идентичностью ряда аминокислотных фрагментов в своей молекулярной организации. По существу, рассматриваемые аминокислота (или их совокупности) по концепции Уголева (1985,1989), по-видимому, представляют собой универсальные функциональные блоки, лежащие в основе темпов эволюции и определяющие структурную и функциональную стабильность биохимических систем вообще и альбумина в частности.

вывода

1. функционально активная молекула сывороточного альбумина представляет собой слоену» гетерогенную систему, состоящую из гидрофобных областей » гидрофильных зон, в состав которых входит связанная структурированная вода. Связанная вода, находящаяся в структуре альбумина моизт влиять ко только на форму и размеры внутренних областей, но и непосредственно воздействует на функциональные свойства специфических гидрофобных зон.

2. Впервые выявлено,,ч?о внутримолекулярная гидрофобная струи.-, тура ьльбу^ков обусловлена наличием областей, по крайней г.: ер с-, двух разных типов: пзрнфзриЛкых гидрофобных участхоз и наиболее гидрофобного внутреннего ядра.

3. Пцрофобше ядра макромолекул сльбуяпнэв рлда позгокочище

являются "универсальными" для класса и могут служить его характеристикой. Микровязкость универсального гидрофобного ядра в десять и более раз превосходит, показатели микровязкости периферийных гидрофобных областей глобулы альбумина позвоночных, включая человека. Молекулярная структура периферийных участков имеет специфические для классов особенности.

4. Периферийные гидрофобные участки связаны с проявлением основных функциональных свойств сывороточного адьбуыича. Универсальное внутреннее ядро, жизненно важнее в отношении поддержания кокформационной структуры, выполняет также и ряд основных функций белка у представителей ряда позвоночных.

5. На основании всего комплекса полученных данных высказано предположение, что комплексообразование сывороточных альбуминов с гидрофобными соединениями осуществляется специальными механизмами регуляции, в основе которого лежит принцип обратной связи на уровне функционально активной молекулы. Выявлена роль связанной вода

в регуляции процессов комплексообразования и взаимовлияния комплекса альбумин - лиганд.

6. Впервые показано, чте с возрастом под воздействием специфических метаболитов происходят внутримолекулярные перестройки, не затрагивающие, однако, регулярные структуры белка. Идет негативный процесс гидрофобизации молекулы сывороточного альбумина за счет снижения количества связанной вода и перераспределения тиро-зилов с поверхностных участков внутрь глобулы, в результате чего появляются дополнительные гидрофобные зоны.

7. Процесс гидрофобизации макромолекулы альбумина вызывает изменение иикрозязкости как внутреннего ядра, так и периферийных гидрофобных участков. При этом, уменьшается количество активных

центров за счет более прочного связывания зондов с белком, что приводит к понижению внутримолекулярной стабильности сывороточного альбумина, и как следствие - снижение функциональной активности белка старых животных.

8. Установлено впервые на молекулярном уровне, что по ряду параметров структурной организации белка (микроокружвние люминофоров и микровязкость зон сорбции зондов в постгмбриональном периоде развития организма процессы онтогенеза повторяют филогенетическое развитие молекулы сывороточного альбумина в ряду позвоночных.

9. Для каждого класса сывороточных альбуминов и белков возрастной группы существуют как универсальные ядра, так "и специфические периферийные зоны, которые по данным флуоресцентного анализа практически внутри класса или возрастной группы неизменны и могут служить молекулярными маркерами для возрастной группы или класса животных ряда позвоночных.

10. Установлено, что скорость филогенетического развития структурной организации молекулы сывороточного альбумина идет неоднозначно. Отмечена резкие эволюционные скачки от класса рыб к земноводным и, особенно от пресмыкающих к классам птиц и млекопитающих. При этом, у ельбушнов птиц мощное развитие подучил структурно-функциональный фактор, в то время как у белков млекопитающих преобладал фактор структурно-конфорыахщошшй.

11. В развитии внутримолекулярной структуры альбуминов от раб к классу птиц во всех случаях преобладает структурно-функциональный фактор. У белков млекопитающих особенно успешно идет формирование структурно-конфорыационного фактора, т.е. внутреннего ядра, естественно, с развитием периферийных зон. Очевидно, что сыворо-

точный альбумин от белка с низкой функционал,- ;ой активностью у

рыб, значительно повышает ее в классе млекопитающих.

Список публикаций по теме диссертации

1. Vredaj za euvanjc i trans^ort biolo3!-:ih uzoraka // Tcchnolc-

gija mesa. Yugoslavia. - 1975. - Л 7-3. - ?. 215-21G. (In con_T.cn -.v;.th V.Z.Iusov).

2. ¡'зоэлектрические спектры альбумина ткани печени и сызоротки кропи кроликов разного возраста // Укр.биохим.*урн. - 197с.-Т. 50, - .V 6. - С. 720-734. (Совм. с Д.А.Соркиной, В.Н.Ивле-

БЫМ) .

3. Белки сызоротки крови при спортивной тренировке // Укр.биохим. *урн. - 1978. - Т. 50. - № 6. - С. 723-727. (Совм. с А.У. Ефименко, Н.В.Толкачезой, А.В.Станевич).

4. Особенности структуры и свойств альбумина сыворотки крови и печени кроликов в октсгекезэ // Укр.биохим.журн. - 197?. -

Т. 51. -í 6. - С. 600-605. ('Совм. с Д.А.Соркиной, Б.А.Эадо-розным).

5. Изучение конформзцнониых изменений струн ту: и альбумина с помощь» EíP-спектроскопии. - В кн.: Актуальные вопросы магннто-биология. Симферополь. - 1979. - С. 46—»9. (Совм. с З.Н.Щербаковым, Е.Н.Миаиккм).

6. Некоторые особенности формирования молекулы сывороточного альбумина. - 3 кн.: Тезисы научных- сообщений 1У Всесоюзного биохим. съезда. Ц., Наука.- 1979. - Т. 2. - С. 14-15. (Совм. с Д.А.Соркиной).

7. Видовые особенности конформациокнсй структуры альбумина сыбо-рс, -и крови по данным Я.!?- и Ил-спектроскопии. - 3 кн.: Тезисы докладоз I Всесоюзного биофиз. съезда. М., Наука. -I9S2. - Т. I. - С. 87-86. (Совм. с Е.Н.У.:синым, З.Н.Щербаковым) .

б. Сравнительная характеристика структурах и функциональных особенностей альбумина кроликоз разного возраста. - 3 кн.: Вопросы эволюционной физиологии. Восьмое совещание по эволюционной физиологии. Л., Наука. - 1952. - С. 235.

9.- Аминокислотный осстаэ альбумина сызоротки и печени кроликов разного возраста // гурн.эволЕц.бисхим. и физиол. - 1952. -

Т. 18, - » 4. - С. 422-425.

10. Гидрофобная структура альбумина сыворотки крови и печени кроликов разного возраста // %рн.эволюц.биохим. и фиэиол. -1982. - Т. 18, - * 5. - С. 522-526. (Совы, с Б.А.Задороякым, Л.П.Бочаровым).

11. The comparision analysis of collagen, albumin and starch hydration by HMR-method. - Ins Second Interactional Conference "Water and ions in biological syszem". Abstacts. Bucharest, Romania.-- 1982. - P. 223. (In common with S.P.Habuda, E.N. Mishin et al.).

12. NMR-study of structural and function water properties in the Serum albumin. - Ins Second International Conference, "Water and ions in biological system". Abstacts. Bucharest, Roaanii.-1932. - P. 224. (In common with S.K. Minhin, G.!!. Shad-

• rin).

13. Конформационная структура альбумина сыворотки некоторых млекопитающих. - В кн.: Химия белков и пептидов. Тезисы докладов

У1 Всесоюзного симпозиума. Рига. - 1983. - С. 205-207. (Совм. с С.П.Афанасьевым).

14. Изменение гидратационных свойств сывороточного альбумина кроликов в онтогенезе // Биофизика. - 1983. - Т. 28. - Ш 5. -

С. 874-875. (Совы, с Е.Н.Мишиным, Г.Н.Шадриным).

15. NiE-study of structural on water proaerties in serum albumin mammalia. - In: 3-rd International Conference "Water and ions in biological system". Abstracts. Bucharest, Romania. -1984.- P. 161.

16. Инфракрасные спектры альбумина сыворотки некоторых млекопитающих. - В кн.: Природные комплексы Крыма, их оптимизация и охрана. Симферополь. - 1984. - С. 91-95. (Совы, с С.П.Афанасьевым, Б.А.Задорожным).

17. Структурно-функциональные особенности альбумина сыворотки и печени кроликов] - В кн.,: У съезд генетиков и селекционеров Украины. Тезисы докладов. Часть 5. Генетические осноеы селекции животных. Киев,, Наукова думка. - 1966. - С. 77-78.

18. Структурные особенности и гидратационные свойства альбумина сыворотки млекопитающих. - В кн.: У Украинский биохимич. съезд. Тезисы докладов. Часть 2. Киев, Наукова думка. - 1987.-