Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Сравнительная характеристика нативного и рекомбинантного лигнолитического фермента - лакказы

ВАК РФ 03.01.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Сравнительная характеристика нативного и рекомбинантного лигнолитического фермента - лакказы"

На правах рукописи

003494 1 15

Логинов Дмитрий Сергеевич

СРАВНИТЕЛЬНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА НАТИВНОГО И РЕКОМБИНАНТНОГО ЛИГНОЛИТИЧЕСКОГО ФЕРМЕНТА-ЛАККАЗЫ

Специальность 03.01.04 - «биохимия»

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук

2 5 ¡ИДр 2070

МОСКВА 2010

003494115

Работа выполнена в лаборатории молекулярных основ биотрансформации Учреждения Российской академии наук Института биохимии им. А.Н. Баха РАН

Научный руководитель:

Официальные оппоненты:

Ведущая организация:

доктор биологических наук,

профессор

О.В.Королева

доктор химических наук,

профессор

А.П. Синицын

доктор биологических наук,

профессор

Л.А. Головлева

Учреждение Российской

академии наук Институт

молекулярной биологии

им. В.А. Энгельгардта РАН

Защита состоится «?У» С\и/и.г.Ш 2010 г. в «У[» часов на заседании

/

диссертационного совета (Д 002.247.01) при Учреждении Российской академии наук Институте биохимии им. А.Н. Баха РАН по адресу: 119071, Москва, Ленинский проспект, д. 33, строение 2.

С диссертацией можно ознакомиться в Библиотеке биологической литературы РАН по адресу: 119071, Москва, Ленинский проспект, д.33 стр. 1 Автореферат разослан ¿¿д. О О 2010 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук А.Ф. Орловский

Актуальность проблемы. В настоящее время ферментные препараты находят широкое применение в различных отраслях промышленности. Особый интерес для промышленного использования представляет лакказа (л-дифенол: кислородоксидоредуктаза, КФ 1.10.3.2), содержащая уникальный ансамбль из четырех ионов меди, которые формируют ее активный центр. Лакказа катализирует окисление субстрата - донора электронов, сопровождающееся восстановлением молекулярного кислорода до воды. Субстратная специфичность фермента может быть значительно расширена при использовании редокс-медиаторов. В присутствии редокс-медиаторов лакказы могут окислять нефенольные соединения различной природы. Как правило, значения редокс-потенциала Т1-центра лакказ (первичного акцептора электронов) лежат в диапазоне от +430 до +790 мВ, однако использование системы фермент-медиатор позволяет окислять соединения со значениями Е° выше +1100 мВ. Кроме того, медиатор действует как подвижный электронный переносчик, позволяющий окислять высокомолекулярные биополимеры, такие как лигнин и целлюлозу. По каталитическим свойствам, субстратной специфичности и биотехнологическому потенциалу лакказа -практически идеальный катализатор для «зеленой» химии. Тем не менее, промышленное использование лакказ ограничено прежде всего отсутствием их крупномасштабного производства и, как следствие, высокой стоимостью ферментных препаратов. Кроме того, большинство исследованных ферментов проявляют максимальную активность в кислой области рН, довольно низкую стабильность при нейтральных и щелочных рН, а также в присутствии органических растворителей, что значительно ограничивает возможности их использования в биосенсорных технологиях, биотопливных элементах и органическом синтезе. Традиционным подходом для решения такого рода проблем является создание высокоэффективных продуцентов гетерологичного белка. Гетерологичная экспрессия секреторных форм лакказ описана для большинства традиционно используемых эукариотических систем: Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris, Trichoderma reesei, Aspergillus oryzae, Aspergillus niger и др. Однако высокоэффективного штамма-продуцента рекомбинантной лакказы в этих эукариотических системах так и не создано, а полученные мутантные формы фермента не обладают желаемыми каталитическими характеристиками и стабильностью.

Для реализации стратегии получения эффективных рекомбинантных продуцентов лакказ необходимо сформулировать теоретические представления о механизмах биосинтеза и фопдинга сложных белков, в том числе металлоферментов, а также принципах их структурно-функциональной организации. В настоящее время для получения ферментов с измененными субстратными специфичностями, каталитическими свойствами и олигомерными структурами используют различные подходы белковой инженерии (рациональный дизайн, направленная эволюция). Для лакказ вышеперечисленные подходы оказались малоэффективными, поскольку ключевым этапом их реализации является получение высокопродуктивных рекомбинантных штаммов-продуцентов, которые синтезируют фермент, не уступающий природному

аналогу по стабильности и каталитическим характеристикам.

Таким образом, изучение процессов гетерологичной продукции лакказ является крайне актуальным для выяснения закономерностей фолдинга металлоферментов при секреции в зукариотических микроорганизмах. Наиболее перспективно для экспрессии гетерологичных белков использование мицелиальных грибов рода Pénicillium, способных секретировать в культуральную жидкость достаточно большие количества белка. Кроме того, использование системы Pénicillium позволет исследовать гетерологичную экспрессию лакказы в новом эукариотическом организме.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы было сравнительное структурно-функциональное исследование нативной лакказы Trametes hirsuta и фермента, гетерологически экспрессированного в Pénicillium canescens (рекомбинантный фермент).

Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

1. разработка эффективного протокола иммунохимического скрининга трансформантов;

2. разработка эффективной системы очистки рекомбинантного фермента;

3. определение физико-химических и каталитических свойств рекомбинантной лакказы;

4. структурная характеристика рекомбинантного фермента.

Научная новизна. Разработан высокочувствительный метод скрининга лакказ в культуральной жидкости на основе Вестерн блоттинга с использованием поликпональных антител.

Впервые проведено сравнительное исследование физико-химических и каталитических свойств нативной и гетерологически экспрессированной лакказы базидиального гриба Trametes hirsuta. Методом дифференциальной сканирующей калориметрии (ДСК) показано увеличение температурного оптимума и термостабильности рекомбинантной лакказы, обусловленное изменением углеводной части фермента.

Впервые решена структура гетерологически экспрессированной лакказы базидиального гриба Т. hirsuta с разрешением 2.3 А. В ферменте, экспрессированном в аскомицете P. canœnses, обнаружены дополнительный сайт гликозилирования (Asn377) и значительные отличия в строении углеводной части. Анализ структурных данных показал, что заселенность Т2 медного центра в рекомбинантной лакказе составляет 0.5, что может объясняться наличием в растворе молекул белка с отсутствующим ионом меди второго типа. На основании полученных данных выдвинута гипотеза о существовании специфических механизмов регуляции встраивания ионов меди в молекулу фермента.

Практическая значимость работы. Разработан высокочувствительный метод определения лакказ в культуральной жидкости, позволяющий проводить высокопроизводительный скрининг микроорганизмов - продуцентов фермента.

На основании установленной корреляции между степенью гликозилирования и термостабильностю лакказ возможна разработка подходов предварительного скрининга гетерологических систем экспрессии фермента для промышленных целей.

Результаты сравнительного структурного исследования натмвной лакказы и ее гетерологически экспрессированной формы могут быть использованы для разработки стратегии получения новых высокоэффективных рекомбинантных штаммов-продуцентов лакказ.

Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы были представлены на следующих международных и российских конференциях: The Third Baltic Sea region symposium and postgraduate course agro-biotechnology focused on root-microbe systems (St.-Petersburg, 2007), "Леса Евразии - Северный Кавказ", VIII Международная конференция молодых ученых, посвященная 270-летию со дня рождения лесовода А.Т. Болотова (Сочи, 2008), The Fifth Moscow International Congress "Biotechnology: State of the art and prospects of development" (Moscow, 2009), International Conference «Biocatalysis-2009» (Arkhangelsk, 2009), VII Национальная конференция «Рентгеновское, синхротронное излучения, нейтроны и электроны для исследования наносистем и материалов. Нано-био-инфо-когнитивные технологии» (Москва, 2009).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 3 статьи и 5 тезисов докладов на конференциях, получен 1 патент. Все статьи опубликованы в журналах, входящих в Перечень ведущих рецензируемых научных журналов и изданий ВАК РФ.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы (132 ссылки). Диссертация содержит 122 страницы печатного текста, включает 30 рисунков и 14 таблиц.

Список сокращений.

2,6-ДМП - 2,6-диметоксифенол;

АБТС - 2,2'азино-бис(3-этилбензотиазолин-6-сульфоновая кислота);

ДДС-ЭФ - электрофорез в денатурирующих условиях;

ДСК - дифференциальная сканирующая калориметрия;

ИОХ - ионообменная хроматография;

ИЭФ - изоэлектрофокусирование;

ПЭГ - полиэтиленгликоль;

РСА - рентгеноструктурный анализ;

ЭПР - электронный парамагнитный резонанс;

Mr - молекулярная масса;

pl - изоэлектрическая точка.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ

I. ПОЛУЧЕНИЕ ПРЕПАРАТА РЕКОМБИНАНТНОЙ ЛАККАЗЫ

1.1 Создание рекомбинантного штамма Pénicillium canescens, несущего ген лакказы базидиального гриба Trametes hirsute

Для получения эффективной экспрессионной системы грибных лакказ использовался широкий круг реципиентов (мицелиальные грибы, дрожжи, растения, бактерии). Гетерологичная экспрессия секреторных форм фермента в настоящее время апробирована на большинстве традиционно-используемых эукариотических систем: мицелиальные грибы - Aspergillus oryzae, A. niger, Trichoderma reseei, и дрожжи -Saccharomyces cenevisiae, Pichia pastoris, P. methanolica, Yarrowia lipoiytica, Kluyveromyces iactis. При этом в экспрессионных кассетах используются различные регуляторные фрагменты, а для полученных штаммов-продуцентов подбираются оптимальные условия культивирования. Но, хотя применение этих подходов обеспечивает рост продукции лакказы, до сих пор ни один штамм не обладает продукцией, удовлетворяющей требованиям крупнотоннажного производства. Возможные пути решения данной проблемы - использование других штаммов-реципиентов и штаммов-доноров.

В данной работе в качестве системы экспрессии лакказного гена (feci) базидиального гриба Trametes hirsute была выбрана гетерологичная белковая экспрессия в фибах Pénicillium canescens, поскольку их использование в качестве хозяев для крупномасштабной экспрессии (продукции) гетерологичных белков имеет ряд следующих преимуществ; 1)эти грибы способны секретировать достаточно большие количества белка в культуральную жидкость; 2)ферменты, продуцируемые ими, хорошо зарекомендовали себя с точки зрения безопасности для здоровья человека; 3) за многие годы использования этих грибов для крупномасштабных процессов ферментации накоплен значительный объем информации в данной области.

Основными этапами получения рекомбинантных ферментов являются: 1) выделение генов целевых ферментов; 2) создание экспрессионных плазмид с включенной структурной частью гена, которая состыкованна с фрагментами промоторных областей и нуклеотидными последовательностями, кодирующими сигнальные пептиды, и получение штаммов-трансформантов; 3) проведение скрининга и отбор клонов трансформантов с высоким уровнем экспрессии; 4) выделение и изучение свойств рекомбинантного фермента.

Первый и второй этапы были успешно осуществлены в ходе исследований, проводившихся совместно с лабораторией оптимизации экспрессии генов ИНБИ РАН. Для экспрессии гена lad T.hirsuta в грибе P.canescens использовали сильный промотор гена bgaS ß-галактозидазы P.canescens, ее лидерный пептид и терминатор транскрипции. Плазмиды pBGlac и pBGmlac, несущие интронированный и неинтронированный гены лакказы 1ас1 соответственно, были введены в геном мутантного по гену нитратредуктазы (niaD) штамма P.canescens РСА-10 путем котрансформации с плазмидой pSTA-10,

несущей комплементирующий ген niaD Aspergillus niger. Для проведения селекции клонов трансформантов P.canescens, характеризующихся наиболее высокой продукцией рекомбинантной лакказы, необходимо было разработать эффективную систему детекции лакказы в культуральных жидкостях P.canescens.

1.2 Разработка системы иммунодетекции лакказы для оценки уровня экспрессии целевого фермента в культуральной жидкости P.canescens

Поскольку иммуноферментный анализ является одним из наиболее точных и чувствительных методов детекции, то для определения лакказ в культуральных жидкостях трансформантов P.canescens были наработаны два препарата антител: к нативной лакказе из Т. hirsuta (гликозилированный антиген) и к лакказе из телец включения (дегликозилированный антиген). Тельца включения были получены путем клонирования «ДНК гена лакказы из Т. hirsuta и экспрессии его в клетках Escherichia coli.

Препараты антител характеризовались титрами 1:400 (иммуноген - нативная лакказа) и 1 : 1440 (иммуноген - лакказа из телец включения). Наблюдаемое различие титров может интерпретироваться как следствие того, что при иммунизации антигеном, обладающим только линейными детерминантами, сокращается число зпитопов, к которым индуцируется иммунный ответ и, соответственно, увеличивается специфичность препарата. Для оценки специфичности антител было изучено их взаимодействие с лакказами из базидиомицетов Т. maxima, Coriolus zonatus, Coriolopsis fulvocinerea и Steccherinum murashkinskyi, имеющими различный уровень гомологии с лакказой, выделенной из Т. hirsuta Данные по степени перекрестного реагирования антител представлены в таблице 1.

Таблица 1. Специфичность полученных антител к лакказам различных базидиомицетов.

Источник лакказы Гомология с лакказой Г. hirsuta по аминокислотной последовательности, % Перекрестное реагирование антител, %*

Иммуноген -нативная лакказа Иммуноген - тельца включения

Trametes hirsuta 100 100 100,0

Trámeles maxima 98 80 75,6

Coriolus zonatus 86 40 5,6

Coriolopsis fulvocinerea 85 20 2,8

Steccherinum murashkinskyi 67 3 0,0

* Величины рассчитаны по сравнению с максимальным титром для каждого препарата антител.

Препарат антител клакказе из телец включения обладает большей специфичностью к нативной лакказе Т. hirsuta, чем антитела, полученные к гликозилированному антигену. В то же время его специфичность к другим лакказам (процент перекрестного реагирования) значительно ниже. При взаимодействии с лакказой Т. maxima специфичность снижается на 25%, а чем дальше от Т. hirsuta находится штамм-продуцент по филогенетическому дереву (рис. 1), тем ниже процент перекрестного реагирования.

r-T.hirsuta

L T.maxima

C.fulvocinerea

-C.zonatus

-S.murashkinskyi

Рисунок 1. Филогенетическое положение базидиомицетов, использованных для определения специфичности антител к лакказе Т. hirsuta.

Такая же тенденция наблюдается и в случае антител, полученных к нативной лакказе Г. hirsuta, но степень перекрестного реагирования уменьшается более плавно. Это объясняется значительным сходством пространственной структуры лакказ базидиомицетов, вследствие чего при близкой структуре информационных детерминант в аффинность иммунного взаимодействия преимущественный вклад будут вносить линейные детерминанты, имеющиеся у нефолдированного фермента. Исходя из данных, представленных в таблице 1, можно считать, что при гомологичности аминокислотной последовательности лакказ от 90% их исследование можно проводить, используя антитела против одного из ферментов. При более низкой степени гомологии следует получать антитела на конкретный исследуемый фермент.

Для прямой иммунодетекции лакказы методом Вестерн блоттинга из полученных высокоспецифичных препаратов антител были синтезированы конъюгаты, меченные пероксидазой хрена. Рабочее разведение конъюгатов в методе Вестерн блоттинга составило 1:330 для антител к тельцам включения и 1:80 для антител к нативной лакказе Т. hirsuta. Оценку специфичности полученных конъюгатов проводили с использованием гомогенных по данным ДДС-электрофореза препаратов нативной (1 мкг) и

рекомбинантной (0.6 мкг) лакказ Т. hirsuta, культуральной жидкости фиба Т. maxima (3 мкг) и лакказы из телец включения (0.5 мкг) (рис. 2).

А

«Да Б

кДа

100

100

70

70

55

55

40

40

35

35

25

25

1 2 3 4 5

1 2 3 4 5

Рисунок 2. Вестерн блоттинг: А - конъюгат из антител к лакказе Т. hirsuta-, Б - конъюгат

из антител к лакказе из телец включения (1 - гомогенный препарат рекомбинантной лакказы; 2 - препарат лакказы из телец включения; 3 - культуральная жидкость гриба Т. maxima; 4 - гомогенный препарат лакказы Т. hirsuta; 5 - набор маркеров).

Как видно из рис. 2, для конъюгата, полученного на основе антител к лакказе из телец включения, характерен более низкий уровень неспецифического взаимодействия.

В результате применения разработанной системы детекции лакказ в культуральной жидкости трансформантов P.canescens методом Вестерн блоттинга для дальнейших исследований был отобран трансформант, обладающий максимальным уровнем продукции рекомбинантной лакказы - 20 мг/л.

II. ВЫДЕЛЕНИЕ И СВОЙСТВА НАТИВНОЙ И РЕКОМБИНАНТНОЙ ЛАККАЗ

2.1 Выделение нативной и рекомбинантной лакказ и сравнительная характеристика их биохимических и спектральных свойств

Был разработан протокол выделения рекомбинантной лакказы из культуральной жидкости гриба P. canescens. Протокол включает четыре основные стадии:

- предварительная очистка культуральной жидкости от небелковых примесей (нерастворимых веществ, углеводов, пигментов и т.д.), включающую осаждение белка 80% (от насыщения) раствором сульфата аммония, фильтрования, растворения осадка в буферном растворе и обессоливания диализом;

- грубое фракционирование культуральной жидкости, включающую ИОХ на носителе ДЭАЭ-вата;

- глубокая очистка методом ИОХ на носителе ДЕАЕ-Toyopearl 650М и анализ

специфической активности собранных белковых фракций, а также их анализ с помощью ДДС-ЭФ и ИЭФ;

- гель-фильтрация на колонке с носителем Супердекс-200 для окончательной очистки белковых фракций от пигментов.

В результате был выделен гомогенный по данным ДДС-ЭФ и ИЭФ препарат рекомбинантной лакказы (рис. 3) с удельной активностью по субстрату пирокатехину 91 ед/мг (препарат нативной лакказы с удельной активностью 125 ед/мг из культуральной жидкости гриба Т. hirsuta был выделен по разработанной ранее методике). Выход рекомбинантной лакказы оказался сравним со значениями, представленными в литературе, и составил 10% от общей активности в культуральной жидкости.

130

95

72

55

J5 23

(Г

А Б

Рисунок 3. ДДС-ЭФ (А) и ИЭФ (Б) выделенных лакказ: 1 - набор маркеров; 2 -рекомбинантный и 3 - нативный ферменты.

Биохимические характеристики выделенных ферментов представлены в таблице 2. Значения Мг и р1 рекомбинантной и нативной лакказ отличаются незначительно, что, видимо, связано с большей степенью гликозилированияи у рекомбинантной лакказы (до 16% по сравнению с 12% для нативного фермента).

Нативная лакказа Рекомбинантная лакказа

Т. hirsuta Р. canescens

Молекулярная масса, кДа 68 72

Изоэлектрическая точка 4.0 4.25

Степень гликозилирования, % 12 16

рН-оптимум

субстрат - пирокатехин 3.5-4.0 3.5-4.0

субстрат - сирингалдазин 4.5 4.5-5.0

Температурный оптимум, "С 45 55

Термостабильность при 50°С (1А), мин 530 600

Спектральные характеристики рекомбинантной лакказы соответствуют таковым нативного фермента. Оптический спектр имеет характерное плечо при 340 нм (ТЗ медный центр) и пик при 610 нм (Т1 медный центр), ЭПР-спектры и параметры сверхтонкого расщепления исследуемых лакказ представлены на рисунке 4 и в таблице 3 соответственно.

Таблица 3. ЭПР характеристики нативной и 25 2о 19

рекомбинантной лакказ. м 7

Т1 -центр Т2-центр

Лакказа 9„ А„ (Ю-3 см-1) 3,| \ (ю-з СМ"1)

Нативная лакказа 7". hirsuta 2.19 9.4 2.24 19.3

Рекомбинантная лакказа Р. canescens 2.19 8.4 2.24 17.6

301)0 32DÚ В(в|

Рисунок 4. ЭПР-спектры (1 -рекомбинантная лакказа из Р. canescens, 2- нативная лакказа из Т. hirsuta).

Уменьшение значения параметра Ац в ЭПР-спектре рекомбинантной лакказы по сравнению с аналогичным параметром для нативного фермента согласуется с литературными данными для других рекомбинантных лакказ.

Спектральные данные позволяют заключить, что полученный рекомбинантный фермент содержит все три типа ионов меди (Т1, Т2 и ТЗ медные центры), характерных для лакказ.

2.2 Влияние рН и температуры на активность ферментов

Значения рН- и температурных оптимумов активности гомогенных препаратов нативной лакказы из Г. hirsuta и рекомбинантной лакказы из Р. canescens представлены в таблице 2. Оба фермента проявляют максимальную активность при кислых значениях рН 3.5-4.5 и температурах 45-55°С. Помимо исследования влияния температуры на активность ферментов в течение непродолжительного времени (3 мин), нами была изучена способность нативной и рекомбинантной лакказ сохранять активность при продолжительном воздействии повышенных температур (при 50°С), что важно, в первую очередь, с точки зрения практического применения. Как видно из таблицы 2, период полуинактивации составляет около 9 и 10 часов для нативной и рекомбинантной лакказ соответственно. Видимо, изменение количества углеводов в молекуле рекомбинантной лакказы приводит как к увеличению температурного оптимума на 10°С, так и повышению ее термостабильности по сравнению с нативным ферментом. Действительно, при изучении тепловой денатурации нативной и рекомбинантной лакказ методом ДСК рассчитанное значение энтальпии для рекомбинантной лакказы превышает аналогичный параметр для нативного фермента более чем в 1,5 раза (табл. 4), что говорит о непосредственном участии углеводов в поддержании структуры молекулы лакказы.

В то же время не наблюдается отличий в значениях рН-оптимумов действия исследуемых ферментов. Как и в случае нативной, рекомбинантная лакказа обладает оптимумом действия при кислых значениях рН, характерных для большинства лакказ грибного происхождения. Следует также отметить, что рекомбинантная лакказа сохраняет до 80% активности в диапазонах рН 3.0-4.5 и 4.3-5.3 для субстратов пирокатехин и сирингалдазин соответственно, что свидетельствует о значительной рН-стабильности фермента.

Таблица 4. Данные ДСК анализа нативной и рекомбинантной лакказ.

Температура плавления,°С Энтальпия, кДж

Пик 1 Пик 2

Нативная лакказа Т. hirsuta 64,7 78,2 776

Рекомбинантная лакказа Р. canescens 67,8 74,8 1256

2.3 Каталитические свойства нативной и рекомбинантной лакказ

Кинетические параметры гомогенных ферментов, выделенных из культуральных жидкостей Т. hirsuta и Р. canescens, были определены по зависимости начальной скорости образования продуктов реакции от исходной концентрации субстрата в координатах Лайнуивера-Берка. Каталитические константы (кса1) для различных субстратов представлены в таблице 5.

Таблица 5. Кинетические характеристики нативной и рекомбинантной лакказ.

Субстрат Структура субстрата Нативная лакказа Т. hirsuta Рекомбинантная лакказа Р. canescens

Km. мкМ Kcat. с"1 kcat'Km х 104 М-1*с-1 Km. мкМ Kcat. с"1 kcat/Km х ю4 М-1*с-1

Гваякол ^осн, 119.6+ 11.9 24.2±1.7 20.2 140.1± 14.0 31.5+1.6 22.5

Гидрохинон 61.4± 6.1 62.8±4.4 102.2 79.9± 8.0 81.0+4.1 101.4

Пирокатехин Q-™ ^он 145.6± 14.6 403.3± 28.2 277.0 145.0± 14.5 403.0± 20.2 280.1

2,6-ДМП он Н3СО.А ОСН3 и 32.6± 3.3 260.0+ 18.2 797.5 29.6+ 2.9 265.0± 13.3 895.3

Синапо- вая кислота счцо 6.7± 0.7 174.0± 12.2 2618.4 6.8±0.7 175.0± 8.8 2576.2

К-ферри-цианид K4[Fe(CN)6] 65.3± 6.5 217.8± 15.2 333.4 74.6± 7.5 283.8± 14.2 380.5

АБТС ^-j а 28.5+ 2.9 91.4±6.4 320.7 25.3± 2.5 116.0± 5.8 459.4

Принимая во внимание предположение ряда авторов, что эффективность катализа лакказами пропорциональна разнице одноэлектронных окислительно-восстановительных потенциалов иона меди первого типа и окисляемого субстрата, полученные высокие

значения каталитических констант для пакказы из Т. hirsuta можно объяснить высоким значением редокс-потенциала иона меди первого типа в активном центре данного фермента, что согласуется с литературными данными. Тенденция повышения эффективности катализа в ряду субстратов фенольной природы (гваякол-гидрохинон-пирокатехин-2,6-ДМП-синаповая кислота) наблюдается и для нативной, и для рекомбинантной лакказ (см. табл. 5), максимальная эффективность наблюдалась для синаповой кислоты, а минимальная - для гваякола, что может быть объяснено теорией об индуктивных и мезомерных эффектах заместителей ароматического кольца.

При окислении субстратов нефенольной природы наблюдается увеличение каталитических констант для рекомбинантной лакказы в 1.3 раза (табл. 5), в то время как константы Михаэлиса остаются неизменными. Полученные данные могут быть объяснены изменением общего заряда белковой молекулы рекомбинантной лакказы за счет изменения углеводной части.

III. СРАВНИТЕЛЬНОЕ ИЗУЧЕНИЕ ТРЕХМЕРНЫХ СТРУКТУР РЕКОМБИНАНТНОЙ ЛАККАЗЫ ИЗ P. CANESCENS И НАТИВНОЙ ЛАККАЗЫ ИЗ Г. HIRSUTA

В нашей лаборатории ранее была получена структура нативной лакказы из Т. hirsuta (PDB ID: 3FPX). Поэтому полученире 3D структуры рекомбинантной лакказы из Р. canescens помогло бы установить на структурном уровне, чем обусловлены различия в свойствах нативной и рекомбинантной лакказ.

3.1 Подбор и оптимизация условий кристаллизации рекомбинантной лакказы

Кристаллизацию рекомбинантной лакказы проводили методом диффузии паров в

висячей капле. Капля состояла из равных объемов раствора белка в 0.02 М калий-фосфатной буферной системе рН 6.0-6.5 и противораствора.

Проведен широкий скрининг условий кристаллизации при двух температурах (4° и 24°С) с использованием коммерческих наборов противорастворов фирмы "Hampton Research" (США): Crystal Screen Kit I и II, Crystal Screen Kit Lite и Crystal Screen Kit Index.

Предварительно точка кристаллизации, в которой наблюдали образование игольчатых кристаллов рекомбинантной лакказы, соответствовала условиям: 0.2 М сульфат аммония; 0.1 М какодилат натрия, рН 6.5; 15% ПЭГ 8000. Для получения одиночных кристаллов варьировали значения рН буферной системы в диапазоне 5.0-7.0 и концентрацию осадителя (ПЭГ 8000) в диапазоне 10-20%. При повышении рН до 7.0 и концентрации ПЭГ 8000 выше 15% формировались кристаллы в форме друз. При снижении рН до 5.0 во всем диапазоне концентраций осадителя образовывались кристаллы в виде тонких иголок. Одиночные кристаллы рекомбинантной лакказы получали при следующих условиях: 0.2 М сульфат аммония; 0.1 М какодилат натрия, рН 6.0 и концентрации ПЭГ 8000, равной 15%.

3.2 Сбор и обработка дифракционных данных с кристаллов рекомбинантной лакказы

Сбор дифракционных данных был проведен на синхротроне DESY в Европейской

Лаборатории Молекулярной Биологии, Гамбург (Германия).

Набор данных с разрешением 2.3 А был собран с одного кристалла рекомбинантной лакказы на станции Х13 при температуре 100°К. При съемке кристаллов использовали следующий криопротекторный раствор: 0.2 М сульфат аммония; 0.1 М какодилат натрия, рН 6.0, 15% ПЭГ 8000 и 20% ПЭГ 600.

Решение структуры проводили методом молекулярного замещения (программа MOLREP). Для решения структуры рекомбинантного фермента в качестве модели использовали структуру нативной лакказы Т. hirsuta (PDB ID: 3FPX).

Структура была уточнена по программе REFMAC5, стадии кристаллографического уточнения чередовались с ручной корректировкой модели фермента.

Визуальная корректировка основывалась на анализе разностных синтезов Фурье с коэффициентами (2F0 - Fe, фс) и (F0 - Fe, фс), где F0, Fe - экспериментальные и рассчитанные модули структурных факторов, а фс - рассчитанные фазы структурных факторов. Статистические характеристики набора дифракционных данных и уточненной модели рекомбинантного фермента приведены в таблице 6.

Таблица 6. Статистические характеристики набора дифракционных данных и уточненной

модели рекомбинантной лакказы.

Характеристики Рекомбинантная лакказа Р. canescens

Разрешение, А 10.0-2.3 (2.4-2.3)*

Пространственная группа Р65

Параметры ячейки, А a=b=160.65, с=53.46

Полнота набора, % 98.5 (91.6)

1/ст 18.8 (5.6)

Р?тегде, % 6.5 (24.3)

РИ, % 16.3

[^гее, % 20.7

Среднее квадратичное отклонение длин валентных связей, А 0.017

Среднее квадратичное отклонение валентных углов, град. 1.43

*В скобках приведены значения параметров для данных с высоким разрешением

3.3 Сравнение пространственных структур нативной и рекомбинантной лакказ

Аминокислотные последовательности нативной и рекомбинантной лакказ по данным секвенирования и РСА полностью идентичны. При изучении аминокислотной последовательности нативной лакказы было выявлено 5 потенциально возможных сайтов гликозилирования (ЫХТ/в): Абп54, Азп217, АбпЗЗЗ, Абп377 и Азп436. Однако, как было показано при анализе пространственной структуры нативной лакказы, гликозилирование протекает только по четырем из них, сайт Абп377 остается негликозилированным. Сравнительный анализ пространственных структур исследуемых ферментов показал, что структура рекомбинантной лакказы близка к структуре нативного фермента. Эти структуры могут быть совмещены по координатам всех Са атомов с г.э.т.с!. 0.3 А (рис. 5).

«Ус Ь

. -i Ser181

ЛЬ - -Г'

-.....\ - , ' 'V С' ь.

lV,'; * ......•' - i

■ i

' - v

i

Рисунок 5. Наложение полипептидных цепей нативной (коричневая цепь) и рекомбинантной (зеленая цепь) лакказ.

При таком совмещении максимальное расхождение составило 1,5 А в петле, образованной аминокислотными остатками 178-181. При детальном рассмотрении данной петли было установлено, что Ser181 имеет ориентацию, отличную от структуры нативной лакказы, а также может находиться в двух конформациях, что, видимо, является причиной изменения хода полипептидной цепи в данном локусе.

Существенным отличием исследуемых структур является различное ветвление углеводных цепей и дополнительное гликозилирование по сайту, не задействованному в случае нативного фермента - Asn377 (табл. 7).

№ а/к остатка Нативная лакказа Т. hirsute Рекомбинантная лакказа P. canescens

54 1504Nag-1505Nag-1512Man-1515Мап I 1513 Man-1514Man I 1520 Man 1504Nag-1505Nag-1512Man

217 1506Nag-1507Nag-1508Man 1506Nag

333 1509Nag 1509Nag

377 Нет 1525Nag

436 1510Nag-1511Nag 1510Nag-1511Nag-1521Man-1522Man I 1523Man

При анализе единственных на сегодняшний день опубликованных пространственных структур нативной лакказы из аскомицета Мв1апосагриз а1Ьотусез и ее экспрессированной формы в аскомицетном грибе Тпс1юс1егта гееБв! были установлены отличия в качественном составе углеводных цепей, при этом сайты гликозилирования остаются неизменными.

Представленные данные свидетельствуют о том, что для получения рекомбинантного фермента с минимально отличающейся от нативного углеводной частью необходимо использовать организм, близкородственный к дикому штамму-продуценту.

3.4 Сравнение активного центра нативной и рекомбинантной лакказ

При анализе строения активных центров нативной и рекомбинантной лакказ было установлено, что в исследуемых ферментах координация иона меди Т1 одинакова (табл. 8).

Таблица 8. Координация иона меди Т1 в нативной и рекомбинантной лакказах.

Аминокислотный остаток Расстояние, А

Нативная лакказа Т. hirsuta Рекомбинантная лакказа P. canescens

His 395 2.01 2.02

His 458 2.05 1.99

Cys 453 2.24 2.27

Phe 463 3.63 3.75

lie 455 3.48 3.61

Как известно, на окислительно-восстановительный потенциал лакказы влияет природа аксиального лиганда и вторичная координационная сфера. Поскольку по

структурным данным ни строение, ни длина связей активного центра рекомбинантной лакказы не отличаются от нативной, можно предположить, что она обладает значением потенциала Т1 медного центра, сравнимым со значением для нативного фермента.

При изучении Т2ЯЗ медных кластеров рекомбинантной и нативной лакказ было установлено, что значения расстояний между ионами меди Т2/ТЗ медного кластера в рекомбинантной лакказе превышают значения для нативной (рис. 6). Этот факт может объясняться отсутствием кислородного лиганда внутри кластера.

11Ы54 НЫ11

г^НОН^Э /г.02 НкМЭ—ТЗа*^^ 4.04 Т?р Н|Ч400

19ХХ /'Чг.оз

НкСС

4.03> /4.12 НЫ52

Н|5б4

НкЗЭЗ

НЫ54

2.01

Н1$111

»¡566

Ш*ЗЭ8

Рисунок 6. Строение Т2/ТЗ медного кластера рекомбинантной (А) и нативной (Б) лакказ.

При анализе строения Т2/ТЗ медного кластера в опубликованных структурах лакказ установлено, что на расстояние между ионами меди внутри кластера оказывает влияние заселенность иона меди Т2. Для структур с низкой заселенностью иона меди Т2 характерно увеличение расстояний. В результате анализа карты электронной плотности Т2/ТЗ медного кластера рекомбинантной лакказы было установлено, что заселенность иона меди второго типа составляет 50%, тогда как у нативной лакказы - 80%. Таким образом, в препарате рекомбинантной лакказы могут присутствовать молекулы белка с удаленным ионом меди второго типа.

3.5 Расчетная модель взаимодействия нативной и рекомбинантной лакказ с субстратом АБТС

Представленное в разделе 2.3 кинетическое исследование окисления лакказами нефенолъного субстрата АБТС показало, что значение констант Михаэлиса для рекомбинантной и нативной лакказ по данному субстрату одинаковы, однако наблюдаются различия в значениях каталитических констант (см. табл. 5). Действительно, окисление АБТС лакказой происходит по принципу «пинг-понг» механизма и не зависит от геометрии субстрат-связывающего кармана, что согласуется с полученными данными РСА. Наблюдаемое увеличение каталитической константы, видимо, связано с перераспределением электронной плотности по поверхности белковой глобулы, обусловленным изменением углеводной части рекомбинантной лакказы. Для

проверки данной гипотезы было проведено моделирование взаимодействия нативной и рекомбинантной лакказ с молекулой АБТС. Расчеты докинга производились с помощью программы АиТОЭОСК (http://autodock.scripps.edu/). Входные файлы для программы АитСЮОСК были подготовлены с помощью программы \ZegaZZ.

Согласно расчетным данным и для нативной и для рекомбинантной лакказ (рис. 7) связывание молекулы АБТС с белковой глобулой в районе Т1 медного центра происходит в одном и том же положении и на одинаковом расстоянии от иона меди первого типа. Однако при моделировании возможного дальнейшего взаимодействия образующегося в результате окисления лакказой катион-радикала АБТС с белковой глобулой фермента было показано, что катион-радикалы АБТС связываются с поверхностью нативной и рекомбинантной лакказ в разных положениях. При этом в случае рекомбинантной лакказы расстояние между катион-радикалом АБТС и Т2/ТЗ медным кластером составляет 24.6 А, а в случае нативного фермента - 26.5 А. Как видно из рис. 7, причина этого различия заключается в разном строении углеводной цепи в положении Азп436, где в молекуле нативной лакказы находятся два остатка Ы-ацетилглюкозамина, а у рекомбинантной лакказы дополнительно образуется разветвленная цепь из трех остатков манноз (см. табл. 7).

Рисунок 7. Расчетная модель взаимодействия нативной (коричневая цепь) и рекомбинантной (зеленая цепь) лакказ с молекулой АБТС и катион-радикалом АБТС.

Подобное изменение возможного места связывания катион-радикала АБТС с молекулой рекомбинантной лакказы приводит к перераспределению зарядов на поверхности белковой глобулы (рис. 8). При этом, с одной стороны, происходит увеличение зоны положительного заряда в области Т1 медного центра, что в результате может приводить к увеличению скорости переноса электрона с поверхности белковой глобулы на Т1 медный центр. С другой стороны, уменьшение расстояния от катион-радикала АБТС до Т2/ТЗ кластера может приводить к снижению потенциала последнего и, соответственно, к увеличению скорости внутримолекулярного переноса электрона с Т1 медного центра на Т2/ТЗ кластер рекомбинантной лакказы. Совокупность этих процессов, по всей видимости, и обуславливает наблюдаемое увеличение значений каталитических констант для субстрата АБТС у рекомбинантной лакказы по сравнению с нативной.

Рисунок 8. Распределение заряда на поверхности нативной (А, Б - поворот структуры на

180° вокруг вертикальной оси, лежащей в плоскости рисунка) и рекомбинантной (В, Г-ловорот структуры на 180° вокруг вертикальной оси, лежащей в плоскости рисунка) лакказ после взаимодействия с катион-радикалом АБТС (синий цвет - положительный заряд, красный цвет - отрицательный заряд).

Выводы

1. Получены поликпональные антитела к нефолдированной лакказе Т. hirsuta, обладающие более высокой специфичностью по сравнению с антителами к нативному ферменту, что позволило разработать высокочувствительный метод скрининга лакказ в культуральной жидкости иммуноблоттингом.

2. Разработан эффективный протокол очистки рекомбинантной лакказы, позволяющий получить гомогенный фермент. Сравнительный анализ физико-химических свойств гомогенных препаратов нативной и рекомбинантной лакказ показал увеличение молекулярной массы с 67 до 72 кДа, pl с 4,0 до 4,3, температурного оптимума на 10°С, термостабильности на 70 минут и количества углеводов на молекулу с 12 до 16%. Значение энтальпии для рекомбинантной лакказы, рассчитанное по данным ДСК анализа, превышало аналогичный параметр для нативной более чем в 1,5 раза. Полученные данные свидетельствуют о разных механизмах гликозилирования лакказы для нативного и рекомбинантного штаммов-продуцентов.

3. Показано, что кинетические параметры окисления фенольных субстратов нативной и рекомбинантной лакказами практически одинаковы, в то же время установлено возрастание значений каталитических констант в 1.3 раза при окислении нефенольных субстратов рекомбинантным ферментом по сравнению с нативным.

4. Впервые решена структура базидиальной лакказы Trametes hirsuta, экспрессированной в аскомицет Penicillium canescens, с разрешением 2.3 А. Структуры нативного и рекомбинантного фермента могут быть совмещены по координатам всех Са атомов с r.s.m.d. 0.3 А, что указывает на отсутствие значительных отличий в ходе их полипептидных цепей.

5. Установлены различия в строении углеводной части нативной и рекомбинантной лакказ по сайтам гликозилирования Asn54, Asn217 и Asr>436 и наличие дополнительного сайта гликозилирования Asn377 у рекомбинантного фермента, что обуславливает его более высокие температурный оптимум и термостабильность.

6. Анализ карт электронной плотности активного центра нативной и рекомбинантной лакказ показал, что их Т1 медные центры имеют идентичную структуру. Заселенность иона меди Т2 составляет 0.8 и 0.5 для нативного и рекомбинантного фермента соответственно. Таким образом, в препарате рекомбинантной лакказы могут присутствовать молекулы белка с удаленным ионом меди второго типа.

7. Проведено компьютерное моделирование взаимодействия нативного и рекомбинантного фермента с нефенольным субстратом АБТС. Показано уменьшение расстояния от T2/T3 медного кластера до катион-радикала АБТС в случае рекомбинантной лакказы, обусловленное изменением строения углеводной цепи по сайту гликозилирования Asn436.

Список работ по теме диссертации

Патент

1. Королева О.В., Степанова Е.В., Федорова Т.В., Логинов Д.С., Черкашин Е.А., Беневоленский С.В., Вавилова Е.А., Чулкин A.M., Абянова А.Р., Бударина Ж.И., Юркова Т.В., Захарова М.В., Леонтьевский А.А., Солонин А.С., Пожидаева З.А. Рекомбинантная лакказа лигнинолитического гриба Trametes sp. и способ её получения. Заявка на патент № 2008123732 от 17.06.2008; решение о выдаче патента от 15.02.2010.

Статьи

1. Чулкин А.М., Логинов Д.С., Вавилова Е.А., Абянова А.Р., Зоров И.Н., Курзеев С.А., Королева О.В., Беневоленский С.В. Клонирование гена ед13 эндо-(1 -4)-р-глюканазы Penicillium canescens и характеристика рекомбинантного фермента. Прикладная биохимия и микробиология, 2009, том 45, № 2, с. 163-170.

2. Чулкин А.М., Логинов Д.С., Вавилова Е.А., Абянова А.Р., Зоров И.Н., Курзеев С.А., Королева О.В., Беневоленский С.В. Энзимологические свойства эндо-(1-4)-р-глюканазы Egl2p Penicillium canescens и характеристика структурного гена ед/2. Биохимия, 2009, том 74, вып. 6, с. 805-813.

3. Абянова А.Р, Чулкин A.M., Вавилова Е.А., Федорова Т.В., Логинов Д.С., Королева О.В., Беневоленский С.В. Гетерологичная продукция лакказы Trametes hirsuta в грибах Penicillium canescens. Прикладная биохимия и микробиология, 2010, том 46, №3, с. 342-347.

Тезисы

1. Loginov D.S., Kurzeev S.A., Vavilova Е.А., Chulkin A.M. Preliminary characterization of new recombinant laccase. The Third Baltic sea region symposium and postgraduate course agro-biotechnology focused on root-microbe systems, St.-Petersburg, June 25 - July 2, 2007, Volume of abstracts, p. 47.

2. Логинов Д.С., Абянова А.Р. Изучение перспективных ферментных препаратов лакказ для биотехнологического применения в целлюлозно-бумажной промышленности. «Леса Евразии - Северный Кавказ», VIII Международная конференция молодых ученых, посвященная 270-летию со дня рождения лесовода А.Т. Болотова, Сочи, 6-12 октября 2008 г., Сборник тезисов, т. 2, с. 93.

3. Loginov D.S., Fedorova T.V., Cherkashin Е.А., Stepanova E.V., Koroleva O.V. Molecular and biochemical research of laccases from Stecchennum murashkinskyi. International conference «Biocatalysis-2009», Arkhangelsk, June 19-24, 2009, Abstracts, p. 72.

4. Koroleva O.V., Loginov D.S., Cherkashin E.A., Fedorova T.V., Stepanova E.V., Chulkin A.M., Abianova A.R., Vavilova E.A., Benevolensky S.V. Novel approaches for design of industrial enzymes. The Fifth Moscow International Congress "Biotechnology: State of the art and prospects of development", Moscow, March 16-20, 2009, Congress proceedings, part 2, p. 274.

5. Поляков K.M., Федорова T.B., Логинов Д.С., Степанова Е.В., Королева О.В.

Рентгеноструктурные исследования с атомным разрешением лакказ базидиапьных грибов. VII Национальная конференция «Рентгеновское, синхротронное излучения, нейтроны и электроны для исследования наносистем и материалов. Нано-био-инфо-когнитивные технологаи», Москва, Ноябрь 16-21, 2009, Сборник тезисов, с. 46.

Подписано в печать 15 марта 2010 г. Объем 1,0 п. л. Тираж 100 экз. Заказ №219 Отпечатано в Центре оперативной полиграфии ООО «Ол Би Принт» Москва, Ленинский пр-т, д.37

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Логинов, Дмитрий Сергеевич

Оглавление.

Список сокращений.

1. Введение.

2. Литературный обзор.

2.1. История исследования лакказ.

2.2. Распространение в природе и физиологические функции лакказ.

2.3. Общая характеристика лакказ.

2.4. Структура и строение активных центров лакказ.

2.5. Субстратная специфичность лакказ.

2.6. Механизмы катализа.

2.7. Биосинтез лакказ.

2.8. Использование лакказ в биотехнологии.

2.9. Геномная организация лакказ.

2.10. Экспрессия грибных лакказ.

3. Материалы и методы.

3.1. Материалы.

3.1.1. Штаммы микроорганизмов и ферменты.

3.1.2. Носители.

3.1.3. Реагенты.

3.2 Методы.

3.2.1 Культивирование штаммов продуцентов лакказы.

3.2.2 Получение антигена - дегликозилированной лакказы (Ьас1).

3.2.3 Иммунизация.

3.2.4 Тестирование антисывороток методом непрямого ИФА.

3.2.5 Измерение пероксидазной активности в твердофазных системах.

3.2.6 Очистка поликлональных антител.

3.2.7 Определение специфичности полученных препаратов антител.

3.2.8 Синтез конъюгатов, меченых пероксидазой хрена (ПХ).

3.2.9 Вестерн блоттинг.

3.2.10 Выделение рекомбинантной лакказы.

3.2.11 Определение активности лакказы.

3.2.12 Определение концентрации белка.

3.2.13 Оценка гомогенности препаратов и определение молекулярной массы.

3.2.14 Определение изоэлектрической точки.

3.2.15 Спектральная характеристика.

3.2.16 Регистрация ЭПР-спектров лакказы.

3.2.17 Определение количества углеводов.

3.2.18 Определение температурного и рН-оптимумов активности лакказ и изучение их термостабильности.

3.2.19 Дифференциальная сканирующая калориметрия.

3.2.20 Определение кинетических параметров.

3.2.21 Подбор и оптимизация условий кристаллизации рекомбинантной лакказы.

3.2.22 Сбор кристаллографических данных и их обработка.62,

3.2.23 Визуализация белковых структур.

3.2.24 Динамическое светорассеяние.

3.2.25 Расчет модели взаимодействия нативной и рекомбинантной лакказ с субстратом АБТС.

4. Результаты и их обсуждение.

4.1. Разработка метода иммунодетекции лакказ.

4.2. Выделение нативной и рекомбинантной лакказ.

4.3. Изучение спектральных характеристик лакказ.

4.4. Сравнительная характеристика физико-химических свойств нативного и рекомбинантного ферментов.

4.4.1 рН-оптимум.

4.4.2 Термооптимум.

4.4.3 Термостабильность.

4.4.4 Дифференциальная сканирующая калориметрия (ДСК).

4.5 Каталитические свойства рекомбинантной лакказы.

4.6 Сравнительное изучение трехмерных структур рекомбинантной лакказы из Р. canescens и нативной лакказы из Т. hirsuta.

4.6.1 Решение и уточнение структуры рекомбинантной лакказы.

4.6.2 Сравнение последовательностей нативной и рекомбинантной лакказ.

4.6.3 Сравнение пространственных структур нативной и рекомбинантной лакказ.

4.6.4 Сравнение активного центра нативной и рекомбинантной лакказ.

4.6.5 Образование димерной формы.

4.6.6 Расчетная модель взаимодействия нативной и рекомбинантной лакказ с субстратом АБТС.

5. Выводы.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Сравнительная характеристика нативного и рекомбинантного лигнолитического фермента - лакказы"

В настоящее время ферментные препараты находят широкое применение в различных отраслях промышленности. Особый интерес для промышленного использования представляет лакказа (и-дифенол: кислородоксидоредуктаза, КФ 1.10.3.2), содержащая уникальный ансамбль из четырех ионов меди, которые формируют ее активный центр. Лакказа катализирует окисление субстрата — донора электронов, сопровождающееся восстановлением молекулярного кислорода до воды.

Впервые лакказа была обнаружена в соке японского лакового дерева Rhus vernicifera в 1883 году и к настоящему времени она насчитывает более чем столетнюю историю изучения [1]. На сегодняшний день выделено и охарактеризовано более 100 лакказ из различных источников: грибы, растения, насекомые и бактерии. Большая часть практически значимых лакказ выделены из базидиальных грибов, в которых этот фермент играет ключевую роль в процессах биодеградации лигнина, образовании пигментов, детоксификации и т.д. Лакказа является полифункциональным ферментом: в растениях функция лакказы связана с процессом синтеза лигнина; в насекомых она участвует в процессах склеротизации и детоксификации, в частности, при метаболических нарушениях, связанных с обменом железа [2]. Также было показано наличие лакказ или лакказоподобных ферментов в бактериях, однако, классификация и сам факт отнесения этих ферментов к лакказам все еще вызывает споры [3].

Лакказы обладают широкой субстратной специфичностью. Они способны катализировать окисление моно-, ди- и полифенолов, ароматических аминов и других соединений. Субстратная специфичность фермента может быть значительно расширена при использовании редокс-медиаторов. В присутствии редокс-медиаторов лакказы могут окислять нефенольные соединения различной природы. Как правило, значения редокс-потенциала Т1-центра лакказ (первичного акцептора электронов) лежат в диапазоне от +430 до +790 мВ, однако использование системы 6 фермент-медиатор позволяет окислять соединения со значениями Е° выше +1100 мВ [4]. Кроме того, медиатор действует как подвижный электронный переносчик, позволяющий окислять высокомолекулярные биополимеры, такие как лигнин и целлюлозу.

По каталитическим свойствам, субстратной специфичности и биотехнологическому потенциалу лакказа - практически идеальный катализатор для «зеленой» химии. Тем не менее, промышленное использование лакказ ограничено, прежде всего, отсутствием их крупномасштабного производства и, как следствие, высокой стоимостью ферментных препаратов. Кроме того, большинство исследованных ферментов проявляют максимальную активность в кислой области рН, довольно низкую стабильность при нейтральных и щелочных рН, а также в присутствии органических растворителей, что значительно ограничивает возможности их использования в биосенсорных технологиях, биотопливных элементах и органическом синтезе. Традиционным подходом для решения такого рода проблем является создание высокоэффективных продуцентов гетерологичного белка. Гетерологичная экспрессия секреторных форм лакказ описана для большинства традиционно используемых эукариотических систем: Saccharomyces cerevisiae [5], Yarrowia lipolytica [6, 7], Pichia pastoris [8, 9], Trichoderma reesei [10], Aspergillus oryzae [11], Aspergillus niger [12] и др. Однако высокоэффективного штамма-продуцента рекомбинантной лакказы в этих эукариотических системах так и не создано, а полученные мутантные формы фермента не обладают желаемыми каталитическими характеристиками и стабильностью.

Для реализации стратегии получения эффективных рекомбинантных продуцентов лакказ необходимо разработать теоретические представления о механизмах биосинтеза и фолдинга сложных белков, в том числе металлоферментов, а также принципах их структурно-функциональной организации. В настоящее время для получения ферментов с измененными субстратными специфичностями, каталитическими свойствами и 7 олигомерными структурами используют различные подходы белковой инженерии (рациональный дизайн, направленная эволюция). Для лакказ вышеперечисленные подходы оказались малоэффективными, поскольку ключевым этапом их реализации является получение высокопродуктивных рекомбинантных штаммов-продуцентов, которые синтезируют фермент, не уступающий природному аналогу по стабильности и каталитическим характеристикам.

Таким образом, изучение процессов гетерологичной продукции лакказ является крайне актуальным для выяснения закономерностей фолдинга металлоферментов при секреции в эукариотических микроорганизмах. Наиболее перспективно для экспрессии гетерологичных белков использование мицелиальных грибов рода Pénicillium, способных секретировать в культуральную жидкость достаточно большие количества белка. Кроме того, использование системы Pénicillium позволяет исследовать гетерологичную экспрессию лакказы в новом эукариотическом организме.

Целью настоящей работы было сравнительное структурно-функциональное исследование нативной лакказы Trametes hirsuta и фермента, гетерологически экспрессированного в Pénicillium canescens (рекомбинантный фермент).

Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

• разработка эффективного протокола иммунохимического скрининга трансформантов;

• разработка эффективной системы очистки рекомбинантного фермента;

• определение физико-химических и каталитических свойств рекомбинантной лакказы;

• характеристика рекомбинантного фермента на структурном уровне.

2. Литературный обзор

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Логинов, Дмитрий Сергеевич

5. Выводы

Получены поликлональные антитела к нефолдированной лакказе Т. hirsuta, обладающие более высокой специфичностью по сравнению с антителами к нативному ферменту, что позволило разработать высокочувствительный метод скрининга лакказ в культуралыюй жидкости иммуноблоттингом.

Разработан эффективный протокол очистки рекомбинантной лакказы, позволяющий получить гомогенный фермент. Сравнительный анализ физико-химических свойств гомогенных препаратов нативной и рекомбинантной лакказ показал увеличение молекулярной массы с 67 до 72 кДа, pl с 4,0 до 4,3, температурного оптимума на 10°С, термостабильности на 70 минут и количества углеводов на молекулу с 12 до 16%. Значение энтальпии плавления для рекомбинантной лакказы, рассчитанное по данным ДСК анализа, превышало аналогичный параметр для нативной более чем в 1.5 раза. Полученные данные свидетельствуют о разных механизмах гликозилирования лакказы для нативного и рекомбинантного штаммов-продуцентов. Показано, что кинетические параметры окисления фенольных субстратов нативной и рекомбинантной лакказами практически одинаковы, в то же время установлено возрастание значений каталитических констант в 1.3 раза при окислении нефенольных субстратов рекомбинантным ферментом по сравнению с нативным. Впервые решена структура базидиальной лакказы Т. hirsuta, экспрессированной в аскомицете Р. canescens, с разрешением 2.3 А. Структуры нативного и рекомбинантного фермента могут быть совмещены по координатам всех Са атомов с r.s.m.d. 0.3 А, что указывает на отсутствие значительных отличий в ходе их полипептидных цепей.

Установлены различия в строении углеводной части нативной и рекомбинантной лакказ по сайтам гликозилирования Asn54, Asn217 и

Азп436 и наличие дополнительного сайта гликозилирования Авп377 у рекомбинантного фермента, что обуславливает его более высокие температурный оптимум и термостабильность.

6. Анализ карт электронной плотности активного центра нативной и рекомбинантной лакказ показал, что их Т1 медные центры имеют идентичную структуру. Заселенность иона меди Т2 составляет 0.8 и 0.5 для нативного и рекомбинантного фермента соответственно. Таким образом, в препарате рекомбинантной лакказы могут присутствовать молекулы белка с удаленным ионом меди второго типа.

7. Проведено компьютерное моделирование взаимодействия нативного и рекомбинантного фермента с нефенольным субстратом АБТС. Показано уменьшение расстояния от Т2/ТЗ медного кластера до катион-радикала АБТС в случае рекомбинантной лакказы, обусловленное изменением строения углеводной цепи по сайту гликозилирования Азп436.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Логинов, Дмитрий Сергеевич, Москва

1. Nitta, К., К. Kataoka, and Т. Sakurai, Primary structure of a Japanese lacquer tree laccase as a prototype enzyme of multicopper oxidases. J Inorg Biochem, 2002. 91(1): p. 125-31.

2. Valderrama, В., et al., Evolutionary and structural diversity of fungal laccases. Antonie Van Leeuwenhoek, 2003. 84(4): p. 289-99.

3. Claus, H., Laccases and their occurrence in prokaryotes. Arch Microbiol, 2003.179(3): p. 145-50.

4. Fernandez-Sanchez, C., et al., Voltammetric monitoring of laccase-catalysed mediated reactions. Bioelectrochemistry, 2002. 58(2): p. 14956.

5. Necochea, R., et al., Phylogenetic and biochemical characterisation of a recombinant laccase from Trametes versicolor. FEMS Microbiol Lett, 2005. 244(2): p. 235-41.

6. Madzak, C., et al., Heterologous production of a laccase from the basidiomycete Pycnoporus cinnabarinus in the dimorphic yeast Yarrowia lipolytica. FEMS Yeast Res, 2005. 5(6-7): p. 635-46.

7. Jolivalt, C., et al., Expression of laccase Illb from the white-rot fungus Trametes versicolor in the yeast Yarrowia lipolytica for environmental applications. Appl Microbiol Biotechnol, 2005. 66(4): p. 450-6.

8. Hong, Y., et al., Expression of a laccase cDNA from Trametes sp. AH28-2 in Pichia pastoris and mutagenesis of transformants by nitrogen ion implantation. FEMS Microbiol Lett, 2006. 258(1): p. 96-101.

9. Colao, M.C., et al., Heterologous expression of led gene from Trametes trogii in Pichia pastoris and characterization of the recombinant enzyme. Microb Cell Fact, 2006. 5(31): p. 1-11.

10. Kiiskinen, L.L., et al., Expression of Melanocarpus albomyces laccase in Trichoderma reesei and characterization of the purified enzyme. Microbiology, 2004.150(Pt 9): p. 3065-74.

11. Sigoillot, C., et al., Natural and recombinant fungal laccases for paper pulp bleaching. Appl Microbiol Biotechnol, 2004. 64(3): p. 346-52.

12. Bohlin, C., et al., Heterologous expression of Trametes versicolor laccase in Pichia pastoris and Aspergillus niger. Appl Biochem Biotechnol, 2006.129-132: p. 195-214.

13. Nakamura, K. and N. Go, Function and molecular evolution of multicopper blue proteins. Cell Mol Life Sei, 2005. 62(18): p. 2050-66.

14. Kiefer-Meyer, M.C., et al., Cloning and sequence analysis of laccase-encoding cDNA clones from tobacco. Gene, 1996. 178(1-2): p. 205-7.

15. Solomon, E.I., U.M. Sundaram, and T.E. Machonkin, Multicopper Oxidases and Oxygenases. Chem Rev, 1996. 96(7): p. 2563-2606.

16. Givaudan, A., et al., Polyphenol oxidase from Azospirillum lipoferum isolated from rice rhizosphere: Evidence for laccase activity in non-motile strains of A. lipoferum. FEMS Microbiology Letters, 1993. 108(2): p. 205-210.

17. Alexandre, G. and I.B. Zhulin, Laccases are widespread in bacteria. Trends Biotechnol, 2000. 18(2): p. 41-2.

18. Jimenez, M., et al., Screening of yeasts isolated from decayed wood for lignocellulose-degrading enzyme activities. Mycological Research, 1991. 95(11): p. 1299-1302.

19. Singh Arora, D. and R. Kumar Sharma, Ligninolytic Fungal Laccases and Their Bio technological Applications. Appl Biochem Biotechnol, 2009.

20. Baldrian, P., Fungal laccases occurrence and properties. FEMS Microbiol Rev, 2006. 30(2): p. 215-42.

21. Morozova, O.V., et al., "Blue" laccases. Biochemistry (Mose), 2007. 72(10): p. 1136-50.

22. Ander, P. and E. K.-E., The importance of phenoloxidase activity in lignin degradation by the white-rot fungus Sporotrichum pulverulentum. Archives of Microbiology, 1976. 109: p. 1-8.

23. Eggert, C., U. Temp, and K.E. Eriksson, Laccase is essential for lignin degradation by the white-rot fungus Pycnoporus cinnabarinus. FEBS Lett, 1997. 407(1): p. 89-92.

24. Hermann, T.E., M.B. Kurtz, and S.P. Champe, Laccase localized in hulle cells and cleistothecial primordia of Aspergillus nidulans. J Bacteriol, 1983. 154(2): p. 955-64.

25. Panepinto, J.C. and P.R. Williamson, Intersection of fungal fitness and virulence in Ctyptococcus neoformans. FEMS Yeast Res, 2006. 6(4): p. 489-98.

26. Wood, D., Production, purification and properties of extracellular laccase of Agaricus bisporus. Journal of General Microbiology,, 1980. 117: p. 327-338.

27. Dittmer, J.K., N.J. Patel, and S.W. Dhawale, Production of multiplelaccase isoforms by Phanerochaete chysosporium grown under nutrientsufficiency. FEMS Microbiology Letters, 1997. 149(1): p. 65-70.

28. Nagai, M., et al., Important role of fungal intracellular laccase formelanin synthesis: purification and characterization of an intracellular109laccase from Lentinula edodes fruit bodies. Microbiology, 2003. 149(Pt 9): p. 2455-62.

29. Wang, H.X. and T.B. Ng, Purification of a novel low-molecular-mass laccase with HIV-1 reverse transcriptase inhibitory activity from the mushroom Tricholoma giganteum. Biochem Biophys Res Commun, 2004. 315(2): p. 450-4.

30. Fernandez-Larrea, J. and U. Stahl, Isolation and characterization of a laccase gene from Podospora anserina. Mol Gen Genet, 1996. 252(5): p. 539-51.

31. Bollag, J.M. and A. Leonowicz, Comparative Studies of Extracellular Fungal Laccases. Appl Environ Microbiol, 1984. 48(4): p.'849-854.

32. Munoz, C., et al., Laccase isoenzymes of Pleurotus eryngii: characterization, catalytic properties, and participation in activation of molecular oxygen and Mn2+ oxidation. Appl Environ Microbiol, 1997. 63(6): p. 2166-74.

33. Shleev, S.V., et al., Comparison of physico-chemical characteristics of four laccases from different hasidiomycetes. Biochimie, 2004. 86(9-10): p. 693-703.

34. Slomczynski, D., J.P. Nakas, and S.W. Tanenbaum, Production and Characterization of Laccase from Botrytis cinerea 61-34. Appl Environ Microbiol, 1995. 61(3): p. 907-912.

35. Kawasaki, N., et al., The significance of glycosylation analysis in development of biopharmaceuticals. Biol Pharm Bull, 2009. 32(5): p. 796-800.

36. Cambria, M., et al., Production, purification, and properties of an extracellular laccase from Rigidoporus lignosus. Protein Expr Purif, 2000. 18(2): p. 141-7.

37. Ducros, V., et al., Crystal structure of the type-2 Cu depleted laccase from Coprinus cinereus at 2.2 A resolution. Nat Struct Biol, 1998. 5(4): p. 310-6.

38. Mansur, M., et al., Identification of a laccase gene family in the new lignin-degrading basidiomycete CECT 20197. Appl Environ Microbiol, 1997. 63(7): p. 2637-46.

39. Quintanar, L., et al., Spectroscopic and electronic structure studies of the trinuclear Cu cluster active site of the multicopper oxidase laccase: nature of its coordination unsaturation. J Am Chem Soc, 2005. 127(40): p. 13832-45.

40. Hakulinen, N., et al., Crystal structure of a laccase from Melanocarpus albomyces with an intact trinuclear copper site. Nat Struct Biol, 2002. 9(8): p. 601-5.

41. Zhukova, Y.N., Voelter, W., Zaitsev, V.N., Bento, I., Stepanova,

42. E.V., Kachalova, G.S., Koroleva, O.V., Betzel, C., Lindley, P.F.,111

43. Mikhailov, A.M., Tishkov, V.I., Morgunova, E.Y., Crystal structure of laccase from Coriolus zonatas at 2.6 A resolution. Crystallography Reports, To be published.

44. Garavaglia, S., et al., The structure of Rigidoporus lignosus Laccase containing a full complement of copper ions, reveals an asymmetrical arrangement for the T3 copper pair. J Mol Biol, 2004. 342(5): p. 151931.

45. Piontek, K., M. Antorini, and T. Choinowski, Crystal structure of a laccase from the fungus Trametes versicolor at 1.90-A resolution containing a full complement of coppers. J Biol Chem, 2002. 277(40): p. 37663-9.

46. Ducros, V., et al., Structure of the laccase from Coprinus cinereus at 1.68 A resolution: evidence for different 'type 2 Cu-depleted' isoforms. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr, 2001. 57(Pt 2): p. 333-6.

47. Lyashenko, A.V., et al., Purification, crystallization and preliminary X-ray study of the fungal laccase from Cerrena maxima. Acta Crystallogr Sect F Struct Biol Cryst Commun, 2006. 62(Pt 10): p. 954-7.

48. Polyakov, K.M., et al., Structure of native laccase from Trametes hirsuta at 1.8 A resolution. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr, 2009. 65(Pt 6): p. 611-7.

49. Enguita, F.J., et al., Crystal structure of a bacterial endospore coat component. A laccase with enhanced thermostability properties. J Biol Chem, 2003. 278(21): p. 19416-25.

50. Kataoka, K., et al., Structure and function of the engineered multicopper oxidase CueO from Escherichia coli--deletion of the methionine-rich helical 7-egion covering the substrate-binding site. J Mol Biol, 2007. 373(1): p. 141-52.

51. Skalova, T., et al., The structure of the small laccase from Streptomyces coelicolor reveals a link between laccases and nitrite reductases. J Mol Biol, 2009. 385(4): p. 1165-78.

52. Pegasova, T.V., et al., Crystallization and preliminary X-ray analysis of a four-copper laccase from Coriolus hirsutus. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr, 2003. 59(Pt 8): p. 1459-61.

53. Eggert, C., et al., Molecular analysis of a laccase gene from the white rot fungus Pycnoporus cinnabar inns. Appl Environ Microbiol, 1998. 64(5): p. 1766-72.

54. Garzillo, A.M., et al., Structural and kinetic characterization of native laccases from Pleurotus ostreatus, Rigidoporus lignosus, and Trametes trogii. J Protein Chem, 2001. 20(3): p. 191-201.

55. Xu, F., et al., Targeted mutations in a Trametes villosa laccase. Axial perturbations of the T1 copper. J Biol Chem, 1999. 274(18): p. 12372-5.

56. Reinhammar, B.R., Oxidation-reduction potentials of the electron acceptors in laccases and stellacyanin. Biochim Biophys Acta, 1972. 275(2): p. 245-59.

57. Koroljova, O.V., et al., Laccase of Coriolus zonatus: isolation, purification, and some physicochemical properties. Appl Biochem Biotechnol, 1999. 76(2): p. 115-27.

58. Schneider, P., et al., Characterization of a Coprinus cinereus laccase. Enz Microb Technol, 1999. 25: p. 502-508.

59. Chefetz, B., Y. Chen, and Y. Hadar, Purification and characterization of laccase from Chaetomium thermophilium and its role in humification. Appl Environ Microbiol, 1998. 64(9): p. 3175-9.

60. Heinzkill, M., et al., Characterization of laccases and peroxidases from wood-rotting fungi (family Coprinaceae). Appl Environ Microbiol, 1998. 64(5): p. 1601-6.

61. Bulter, T., et al., Functional expression of a fungal laccase in Saccharomyces cerevisiae by directed evolution. Appl Environ Microbiol, 2003. 69(2): p. 987-95.

62. Palmieri, G., et al., A Novel White Laccase from Pleurotus ostreatus. Thejournal of biological chemistry, 1997. 272 ( 50): p. 31301-31307.113

63. Soden, D.M., J. O'Callaghan, and A.D. Dobson, Molecular cloning of a laccase isozyme gene from Pleurotus sajor-caju and expression in the heterologous Pichia pastoris host. Microbiology, 2002. 148(Pt 12): p. 4003-14.

64. Record, E., et al., Expression of the Pycnoporus cinnabarinus laccase gene in Aspergillus niger and characterization of the recombinant enzyme. Eur J Biochem, 2002. 269(2): p. 602-9.

65. Xu, F., et al., A study of a series of recombinant fungal laccases and bilirubin oxidase that exhibit significant differences in redox potential, substrate specificity, and stability. Biochim Biophys Acta, 1996. 1292(2): p. 303-11.

66. Galhaup, C., et al., Characterization of the major laccase isoenzyme from Trametes pubescens and regulation of its synthesis by metal ions. Microbiology, 2002. 148(Pt 7): p. 2159-69.

67. Garzillo, A.M., et al., Laccase from the white-rot fungus Trametes trogii. Appl Microbiol Biotechnol, 1998. 49(5): p. 545-51.

68. Jung, H., F. Xu, and K. Li, Purification and characterization of laccase from wood-degrading fungus Trichophyton rubrum LKY-7. Enzyme and Microbial Technology, 2002. 30(2): p. 161-168

69. Edens, W.A., et al., Purification and characterization of a secreted laccase of Gaeumannomyces graminis var. tritici. Appl Environ Microbiol, 1999. 65(7): p. 3071-4.

70. Quintanar, L., et al., Shall we dance? How a multicopper oxidase chooses its electron transfer partner. Acc Chem Res, 2007. 40(6): p. 445-52.

71. Bento, I., et al., Dioxygen reduction by multi-copper oxidases; a structural perspective. Dalton Trans, 2005(21): p. 3507-13.

72. Gayazov, R. and J. Rodakiewicz-Nowak, Semi-continuous production oflaccase by Phlebia radiata in different culture media Folia

73. Microbiologica, 1996. 41(6): p. 480-484.114

74. Rigling, D. and N.K. Van Alfen, Regulation of laccase biosynthesis in the plant-pathogenic fungus Cryphonectria parasitica by double-stranded RNA. J Bacteriol, 1991. 173(24): p. 8000-3.

75. Couto, S.R. and J.L. Toca-Herrera, Laccase production at reactor scale by filamentous fungi. Biotechnol Adv, 2007. 25(6): p. 558-69.

76. Kunamneni, A., et al., Laccases and their applications: A patent review. Recent Pat Biotechnol, 2008. 2(1): p. 10-24.

77. Barreca, A.M., et al., Laccase/mediated oxidation of a lignin model for improved delignification procedures. Journal of molecular catalysis. B, Enzymatic, 2003. 26(1-2): p. 105-110.

78. Pazarloglu, N.K., M. Sariisik, and A. Telefoncu, Laccase: production by Trametes versicolor and application to denim washing. Process biochemistry, 2005. 40(5): p. 1673-1678.

79. Minussi, R.C., G.M. Pastore, and N. Duran, Potential applications of laccase in the food industry. Trends in Food Science and Technology, 2002. 13(6): p. 205-216.

80. D'Annibale, A., et al., Oxirane-immobilized Lentinula edodes laccases: stability and phenolics removal efficiency in olive mill wastewater. Journal of Biotechnology, 2000. 77(2-3): p. 265-273

81. Mayer, A.M. and R.C. Staples, Laccase: new functions for an old enzyme. Phytochemistry, 2002. 60(6): p. 551-65.

82. Mita, N., et al., Laccase-catalyzed oxidative polymerization of phenols. Macromolecular Bioscience, 2003. 3(5): p. 253 257.

83. Gurcir, M., N. Akta, and A. Tanyolai?, Influence of reaction conditions on the rate of enzymic polymerization of pyrogallol using laccase. Process biochemistry, 2005. 40. (3-4): p. 1175-1182.

84. Nicotra, S., et al., Biotransformation of resveratrol: synthesis of trans-dehydrodimers catalyzed by laccases from Myceliophtora thermophyla andfrom Trametespubescens. Tetrahedron, 2004. 60(3): p. 595-600.

85. Bauer, C.G., et al., New enzyme sensors for morphine and codeine based on morphine dehydrogenase and laccase. Fresenius1 Journal of Analytical Chemistry, 1999. 364(1-2): p. 179-183.

86. Ghindilis, A., Direct electron transfer catalysed by enzymes: application for biosensor development. Biochem Soc Trans, 2000. 28(2): p. 84-9.

87. Jiang, X., et al., Immunosensors for detection of pesticide residues. Biosens Bioelectron, 2008. 23(11): p. 1577-87.

88. Park, D.H., C. Vieille, and J.G. Zeikus, Bioelectrocatalysts: engineered oxidoreductase system for utilization of fumarate reductase in chemical synthesis, detection, and fuel cells. Appl Biochem Biotechnol, 2003. 111(1): p. 41-53.

89. Barriere, F., et al., Targetting redox polymers as mediators for laccase oxygen reduction in a membrane-less biofuel cell. Electrochemistry Communications, 2004. 6(3): p. 237-241.

90. Ong, E., W.B. Pollock, and M. Smith, Cloning and sequence analysis of two laccase complementary DNAs from the ligninolytic basidiomycete Trametes versicolor. Gene, 1997. 196(1-2): p. 113-9.

91. Yaver, D.S., et al., Purification, characterization, molecular cloning, and expression of two laccase genes from the white rot basidiomycete Trametes villosa. Appl Environ Microbiol, 1996. 62(3): p. 834-41.

92. Wahleithner, J.A., et al., The identification and characterization of four laccases from the plant pathogenic fungus Rhizoctonia solani. Curr Genet, 1996. 29(4): p. 395-403.

93. Collins, P.J. and A. Dobson, Regulation of Laccase Gene Transcription in Trametes versicolor. Appl Environ Microbiol, 1997. 63(9): p. 34443450.

94. Castilho, F.J., et al., On the diversity of the laccase gene: a phylogenetic perspective from Botryosphaeria rhodina (Ascomycota: Fungi) and other related taxa. Biochem Genet, 2009. 47(1-2): p. 80-91.

95. Lobos, S., et al., Enzymology and molecular genetics of the ligninolytic system of the basidiomycete Ceriporiopsis subvermispora Current science, 2001. 81(8): p. 992-997.

96. Kojima, Y., et al., Cloning, sequence analysis, and expression of ligninolytic phenoloxidase genes of the white-rot basidiomycete Coriolus hirsutus. J Biol Chem, 1990. 265(25): p. 15224-30.

97. Saloheimo, M. and M.L. Niku-Paavola, Heterologous production of a ligninolytic enzyme: expression of the Phlebia radiata laccase gene in Trichoderma reesei. Biotechnol, 1991. 9: p. 987-990.

98. Berka, R.M., et al., Characterization of the gene encoding an extracellular laccase of Myceliophthora thermophila and analysis of the recombinant enzyme expressed in Aspergillus oryzae. Appl Environ Microbiol, 1997. 63(8): p. 3151-7.

99. Cassland, P. and L.J. Jonsson, Characterization of a gene encoding Trametes versicolor laccase A and improved heterologous expression in Saccharomyces cerevisiae by decreased cultivation temperature. Appl Microbiol Biotechnol, 1999. 52(3): p. 393-400.

100. Gelo-Pujic, M., et al., Electrochemical studies of a truncated laccase produced in Pichia pastoris. Appl Environ Microbiol, 1999. 65(12): p. 5515-21.

101. Brown, M.A., Z. Zhao, and A.G. Mauk, Expression and characterization of a recombinant multi-copper oxidase: laccase IV fi-om Trametes versicolor. Inorganica chimica acta, 2002. 331: p. 232-238.

102. Guo, M., et al., Optimization of the expression of a laccase gene from Trametes versicolor in Pichia methanolica. Appl Microbiol Biotechnol, 2006. 71(6): p. 848-52.

103. Yaver, D.S., et al., Molecular characterization of laccase genes from the basidiomycete Coprinus cinereus and heterologous expression of the laccase led. Appl Environ Microbiol, 1999. 65(11): p. 4943-8.

104. Kilaru, S., et al., Expression of laccase gene led in Coprinopsis cinerea under control of various basidiomycetous promoters. Appl Microbiol Biotechnol, 2006. 71(2): p. 200-10.

105. Otterbein, L., et al., Molecular cloning of the cDNA encoding laccase from Pycnoporus cinnabarinus 1-937 and expression in Pichia pastoris. Eur J Biochem, 2000. 267(6): p. 1619-25.

106. Alves, A.M., et al., Highly efficient production of laccase by the basidiomycete Pycnoporus cinnabarinus. Appl Environ Microbiol, 2004. 70(11): p. 6379-84.

107. Piscitelli, A., et al., Recombinant expression of Pleurotus ostreatus laccases in Kluyveromyces lactis and Saccharomyces cerevisiae. Appl Microbiol Biotechnol, 2005. 69(4): p. 428-39.

108. Faraco, V., et al., Heterologous expression of heterodimeric laccase from Pleurotus ostreatus in Kluyveromyces lactis. Appl Microbiol Biotechnol, 2008. 77(6): p. 1329-35.

109. Camattari, A., et al., Induction by hypoxia of heterologous-protein production with the KIPDC1 promoter in yeasts. Appl Environ Microbiol, 2007. 73(3): p. 922-9.

110. Li, F., et al., High production of laccase B from Trametes sp. in Pichia pastoris. World Journal of Microbiology and Biotechnology, 2007. 23(5): p. 741-745.

111. Hong, Y.Z., et al., Cloning of a laccase gene from a novel basidiomycete Trametes sp. 420 and its heterologous expression in Pichia pastoris. Curr Microbiol, 2007. 54(4): p. 260-5.

112. Rodriguez, E., et al., Isolation of two laccase genes from the white-rot fungus Pleurotus eiyngii and heterologous expression of the pel3 encoded protein. J Biotechnol, 2008.134(1-2): p. 9-19.

113. Hakulinen, N., et al., A near atomic resolution stmcture of a Melanocarpus albomyces laccase. J Struct Biol, 2008. 162(1): p. 29-39.

114. Laemmli, U.K., Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature, 1970. 227(5259): p. 680-5.

115. Huang, H.-W., et al., EPR and magnetic susceptibility studies of the trinuclear copper center in native and azide-reacted zucchini ascorbate oxidase. Journal of Inorganic Biochemistry, 1999. 75(1): p. 19-25.

116. Koroleva, O.V., et al., Isolation and study of some properties of laccase from the basidiomycetes Cerrena maxima. Biochemistry (Mosc), 2001. 66(6): p. 618-22.

117. R.Tinoco, M.A. Pickard, and R. Vazquez-Duhalt, Kinetic differences of purified laccases from six Pleurotus ostreatus strains. Letters in Applied Microbiology 2001. 32: p. 331-335.

118. Enguita, F.J., et al., Substrate and dioxygen binding to the endospore coat laccase from Bacillus subtilis. J Biol Chem, 2004. 279(22): p. 23472-6.

119. Parodi, A.J., Protein glucosylation and its role in protein folding. Annu Rev Biochem, 2000. 69: p. 69-93.

120. Hublik, G. and F. Schinner, Characterization and immobilization, of the laccase from Pleurotus ostreatus and its use for the continuous elimination of phenolic pollutants. Enzyme and Microbial Technology, 2000. 27: p. 330-336.

121. Hilden, K., T.K. Hakala, and T. Lundell, Thermotolerant and thermostable laccases. Biotechnol Lett, 2009. 31(8): p. 1117-28.

122. Koroleva, O.V., et al., Temperature-induced changes in copper centers and protein conformation of two fungal laccases from Coriolus hirsutus and Coriolus zonatus. Biochim Biophys Acta, 2001. 1547(2): p. 397407.

123. Bertrand, T., et al., Crystal structure of a four-copper laccase complexed with an arylamine: insights into substrate recognition and correlation with kinetics. Biochemistry, 2002. 41(23): p. 7325-33.

124. Giardina, P., et al., Laccases: a never-ending story. Cell Mol Life Sci, 2009.

125. Институт Биохимической физики им. Н.М. Эмануэля РАН); о инженеру-исследователю Храмеевой Е.Е. Учреждения Российской академии наук Института проблем передачи информации им. A.A. Харкевича РАН.

126. РАБОТА БЫЛА ВЫПОЛНЕНА ПРИ ФИНАНСОВОЙ ПОДДЕРЖКЕ:о Федерального агенства по науке и инновациям РФ (номергосударственного контракта 02.512.11.2258); о Министерства науки и образования (номер государственного контракта П1297).