Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему

Создание форм льна-долгунца на основе генетической трансформации AGROBACTERIUM TUMEFACIENS

ВАК РФ 06.01.05, Селекция и семеноводство

Автореферат диссертации по теме "Создание форм льна-долгунца на основе генетической трансформации AGROBACTERIUM TUMEFACIENS"

2 НДР 1997

На правах рукописи ЧИКРИЗОВА Ольга Федоровна

СОЗДАНИЕ ФОРМ ЛЬНА-ДОЛГУНЦА НА ОСНОВЕ ГЕНЕТИЧЕСКОЙ ТРАНСФОРМАЦИИ

АОЯОВАСТЕШиМ ТиМЕРАСШЫБ

06.01.05 —Селекция и семеноводство 03.00.23 — Биотехнология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата сельскохозяйственных наук

МОСКВА 1997

Диссертационная работа выполнена во Всероссийском научно-исследовательском институте льна.

Научный руководитель — кандидат сельскохозяйственных наук, старший научный сотрудник А. В. Поляков.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор В. В. Мазин, кандидат сельскохозяйственных наук М. Е. Каминская.

Ведущая организация—'Всероссийский научно-исследовательский институт сельского хозяйства центральных районов Нечерноземной зоны РФ. у/,

Защита состоится . . . Г7. ^Г ^Г^Г . . 1997 г.

Л/Г ^

в .'¡.О. . . . часов на заседании диссертационного совета Д 120.35.04 в Московской сельскохозяйственной академии им. К- А. Тимирязева.

Адрес: 127550, Москва И-550, Тимирязевская ул., 49. Ученый совет ТСХА.

С диссертацией можно ознакомиться в ЦНБ ТСХА.

Автореферат разослан . .'-¿¿-¿/ЯТК^ . . 1997 г.

Ученый секретарь диссертационного совета — р

кандидат сельскохозяйственных____С-,!

наук , / и " Р. Р. Усманов

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Лен-долгунец является важной технической культурой комплексного использования, имеющей большое значение в народном хозяйстве России. Ведущая роль в интенсификации льноводства принадлежит селекции, позволяющей сочетать в одном сорте высокую продуктивность, качество и комплексную устойчивость к болезням и полеганию (Александрова Т.А., Марченков А.Н., 1994).

Основные методы селекции льна-долгунца, базирующиеся на традиционных приемах - подборе пар для скрещиваний, гибридизации и отборе в расщепляющихся популяциях, остаются трудоемкими и продолжительными. С целью усовершенствования селекционного процесса.в последние годы активно начали проводиться комплексные исследования по использованию биотехнологии. Это культура пыльников или микроспор (Nichterlein К. et.al., 1991; Tejklova Е., 1996; Poliakov А.,1995) и эм-бриокультура при межвидовой и внутривидо-вой гибридизации (Poliakov

A. at.al., 1995; Поляков A.B., Егорова Е.Г., 1996), культура протопластов (Baracat М., Cocking Е., 1985), сомаклональная вариабельность (Marshal, Courduries et.al.,1991) и клеточная селекция (McHughen А., Swarts М.А., 1984), а также генная инженерия (Drapper J., Scott R., Armitage P., 1988; Mlynarova L., Pretova E., 1993).

Благодаря генной инженерии стало возможным вводить чужеродные ДНК в растительные клетки и в сравнительно короткие сроки целенаправленно создавать трансгенные растения с принципиально новыми признаками: устойчивость к болезням, вредителям и гербицидам (Шевелуха В.С.,1992; Скрябин К.Г., 1995). Успешно проведены работы по созданию модельных трансгенных растений подсолнечника, зерновых, люцерны, сахарной свеклы, картофеля и др. (Гапоненко А. и др., 1991; Левенко Б.А. и др., 1991; Денейко .В. и др., 1991; Илюбаев С.У. и др., 1991; Корниенко О.В. и др., 1991; Сидоров В.А., 1991; Кучук Н.В., 1991; Картель H.A. и др., 1991). Созданы растения табака, устойчивые к вирусам (Ривкин М.И. и др., 1991). Ведется целенаправленный перенос в клетки картофеля четырех генов устойчивости: к колорадскому жуку, вирусам, бактериозам и грибной инфекции (Шевелуха B.C., 1992J

Получены трансгенные гербицидоустойчизые растения сои, сахарной свеклы, гороха, фасоли, табака (Левенко Б.А., Марьюшкин

B.Ф., Стехин И.Н., 1991; Левенко Б.А., Богомолова Н.М. и др., 1991; Кучук Н.В. и др., 1991; Падегимас Л.С. и др.,1991; Скрябин К.Г., 1995; Пастернак Е.Ю. и др., 1991).

На основе генетической трансформации получены трансгенные растения масличного льна, устойчивые к канамицину (Drapper J., 1988; McHughen A., Jordan М., 1989; Mynarova ., Pretova A., 1993). Созданы формы, устойчивые к хлорсульфурону (Jordan М.С., 1987;

McHughen A., 1989; 1991; 1992) и глифосату (Jordan M.C., 1987; McHughen A.,1991), которые в полевых испытаниях проявили высокую устойчивость, а на обычном фоне не уступали исходным сортам масличного льна по урожаю семян. Однако, на льне-долгунце подобные работы не известны. Наши исследования показали, что отличительной особенностью льна-долгунца от масличного льна в условиях in vitro, является его пониженная морфогенетическая активность. В сязи с этим, необходима адаптация метода трансформации применительно ко льну-долгунцу.

Цель исследований. Интенсификация селекционного процесса льна-долгунца на осове создания траьсгенных форм и оптимизация условий трансформации с помощью A. tumefaciens на примере передачи генов устойчивости к канамицину (NPT-II) и хлорсульфурону (ALS).

Для достижения поставленной цели решали следующие задачи :

- оптимизировать условия получения трансгенных растений с помощью Agrobacterium tumefaciens применительно ко льну-долгунцу; получить трансгенные растения льна-долгунца;

- разаботать методику оценки трансгенных растений льна-долгунца на примере устойчивости к канамицину и хлорсульфурону;

- изучить устойчивость форм льна, полученных на основе скрещиваний обычных сортов льна-долгунца с трансгенными формами масличного льна, выделить источники гербАадоустойчивости для селекционной практики;

- изучить трансгенные гербицидоустойчивые формы льна-долгунца, по основным хозяйственно-ценным признакам.

Научная новизна и практическая ценность исследований. Впервые созданы трансгенные формы льна-долгунца с повышенной устойчивостью к канамицину и гербицидам группы хлорсульфурона, не уступающие по продуктивности исходным родительским сортам льна-долгунца, которые могут быть использованы в селекции в качестве геноисточиков устойчивости. Оптимизированы условия и установлена возможность генетической трансформации л^на-долгунца А. tumefaciens на примере введения маркерного гена MPT-II,'придающего растениям устойчивость к канамицину, что позволит получать трансгенные растения льна-долгунца. Разработана методика оценки на устойчивость к канамицину в культуре ткани и на проростках, а также к хлорсульфурону на проростках и вегетиру'ющих растениях, позволяющя значительно повысить эффективность селекционного процесса при отборе устойчивых форм льна-долгунца.

Апробация результатов диссертации. Основные результаты докладывались на заседании кафедры биотехнологии ТСХА, на III Всесогаз

ном симпозиуме " Новые методы биотехнологии растений " (г.Пущино, 1995), Всероссийском съезде по защите растений " Защита растений в условиях реформирования агропромышленного комплекса: экономика, эффективность, экологичность" (Санкт-Петербург, 1995).

Публикации. Основные материалы и результаты диссертации изложены в б печатных работах, 3 статьи находятся в печати.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части (4 главы), общих выводов, предложений производству, списка использованной литературы, включающего 185 наименований, в том числе 65 иностранных авторов. Работа изложена на 157 страницах машинописного текста, содержит 23 таблицы, 25 рисунков и 11 приложений.

УСЛОВИЯ И МЕТОДИКА ПРОВЕДЕНИЯ ИССЛЕДОВАНИЙ

Получение трансгенных форм льна-долгунца велось в двух направлениях : первое, заключалось в агробактериальной трансформации льна-долгунца на примере введения маркерного гена NPT-II, придающего растениям устойчивость к канамицину; второе, предусматривало передачу и экспрессию генов канамицино- (NPT-II) и гербицидоустойчивости (ALS), используя методы традиционной селекции.

Материалом для исследований служили сорта: льна-долгунца -Дашковский 2, Р-736, Белинка; масличного льна Norlin, McGregor и трансгенные формы масличного льна: 12, W, L, устойчивые к канамицину (ген NPT-II) и хлорсульфурону (ген ALS), которые были получены в Саскет-чеванском университете (Канада) в лаборатории профессора Мак Хюгена (A. McHughen).

В исследованиях по генетической трансформации льна-долгунца использовали Agrobacterium tumefaciens штаммов: А 281 (pTiBo 542) pGa 482 и LBA 4404 pBI 121, содержащие маркерный ген неомицин-фосфотрансферазы II (NPT-II), предоставленные нам Филиалом Института биорганической химии РАН (г. Пущино) и Институтом молекулярной биологии РАН (г. Москва). Размножение и культивирование агробактерий проводили по общепринятой методике (Маниатис Г. и др., 1984).

Трансформацию проводили методом кокультивирования с агробак-териями, используя в качестве эксплантов гипокотильные сегменты. Растительный материал выращивали на агаризованных модифицированных питательных средах на основе MS (Murashige, Skoog, 1962). Фитогормо-ны и антибиотики использовали в концентрациях (мг/л): БАП -1,0; НУК-0,05; канамицин (Km) - 50 -300; клафоран (KI) - 100-500; карбенициллин (Kb) - 100-500. Активность неомицинфосфотрансферазы II (NPT-II) on -

ределяли по общепринятой методике (Генная инженерия растений, 1991; Drapper J. et all., 1988; Маниатис, 1984).

Простерилизованные семена льна-долгунца проращивали при температуре 22-24 С без доступа света на жидкой MS-среде или дистиллированной воде. В качестве селективного агента добавляли канамицин (500-1000 мг/л) или гербициды: Препарат-1 (100-200 мг/л) и Метрон (50200 мг/л).

Вегетационные опыты закладывали в сосудах Митчерлиха. В почву вносили минеральные удобрения из расчета: N 250 Р 500 К 250 мг/сосуд. Норма высева составляла 50 семян на 1 сосуд. Обработку гербицидом Препарат-1 осуществляли путем его предпосевного внесения в почву, а так же опрыскиванием растениий льна в фазы "всходов " и "елочки" из расчета 10-75 г/га (по д.в.). Повторность опытов была четырехкратная. Все наблюдения и исследования вели согласно "Методике вегетационного опыта с гербицидами" (Войтехова В.А., 1968).

Реципрокные скрещивания льна-долгунца с трансгенными формами масличного льна проводили по общепринятой для льна-долгунца методике (Рогаш, Дунаева, 1970). Сортовую однородность селекционного материала проверяли в луночном питомнике согласно методике ВНИИЛ (1968). В качестве стардартов использовали новые сорта льна-долгунца, внесенные в Государственный реестр: Алексим и А-29.

■ Метеорологические условия в годы проведения исследований были различными. Вегетационный период 1994 г. был холодным с избыточным количеством осадков в первые декады мая, июня и засушливым с повышенными температурами воздуха в конце июля и первую декаду августа. Метеорологические условия 1993 и 1995 гг. были удовлетворительными для выращивания пьна-долгунца.

Экспериментальные данные обрабатывали методом дисперсионного и регрессионного анализа на ПЭВМ с использованием пакета программ "БИОСТАТ" и "STATGRAPH1CS", а так же по методикам, опубликованным у ряда авторов (Доспехов Б.А., 1979; Зудин Д.В., 1987; Плохин-ский H.A., 1970; Седловский А.И. и др., 1982).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Трансформация льна-долгунца с помощью АцгоЬасШ'шт Пшс^ас/спз на примере введения гена ЫРТ-Н. На сортах льна-долгунца Дашковский 2 и Белинка проведена серия экспериментов по трансформации с использованием модельных векторов А. ^теГасюпэ штаммов 1ВА 4404 (рВ1121) и А 281 (рТ1Во 542) рСА 482, несущих маркерный ген устойчивости к канамицину - ЫРТ-П. Изуча

лись три способа инокуляции эксплантов льна-долгунца агробактериями, преусматривающие использование нелораненных (Basiran N., 1987; Draper J., 1988; Mlynarova L., 1993), проколотых и с частично удаленным эпидермисом (McHughen А., 1989, 1991; 1992; Dong J-Z., 1991) гипоко-тильных сегментов.

Исследования показали, что наибольшей регенерационной способностью обладали трансформированные экспланты льна-долгунца с частично удаленным эпидермисом (табл.1). Было отмечено, что эффективность инокуляции гипокотильных сегментов льна-долгунца A. tumefaciens и дальнейшая регенерация на их основе зависит от продолжильности предкультивирования эксплантов на питательной среде, т.е от их возраста. Изучались экспланты трех возрастов: 7-8, 8-9, 9-10 дней. У гипокотильных сегментов льна-долгунца 7-8 дневного возраста очень легко удалялся эпидермис, не повреждая других слоев растительных тканей. Каллусогенез на их основе протекал достаточно активно и сопровождался образованием почек и побегов в среднем у 53 % трансформированных эксплантов.

Таблица 1.

Характеристика эксплантов льна-долгунца сорта Белинка в зависимости от способа инокуляции А. tumefaciens LBA 4404 pB1121 (Km -.100 мг/л, Сх - 200 мг/л, Kb -200 мг/л, п = 70)

Способ повреждения г. с * Длина г. е., Получено г.с. с новообразованиями Образовалось почек, побегов, шт Рост каллуса, балл

мм шт % + 2 sp всего на 1 г с. +

Без повреждений " 1-2 9 12.7+8.0** 9 1.0 ++

Удаление 50 % эпидермиса 8-10 38 54 3+12.0** 44 1.2

Прокалывание 8-10 0 0 0 0 +

Примечание: * г.с. - гипокотильный сегмент; ** - различия существенны при р = 0,05.

Состав питательной среды оказывал существенное влияние на процесс регенерации. Индукция почек и побегов на инокулированных А. ^гг^ааепз гипокотилях льна-долгунца на селективной среде МБВ5 2", была в среднем в 1,7 раза выше, чем на среде МБ с таким же содержанием канамицина (50 мг/л).

При изучении действия антибиотиков на регенерацию растений льна-долгунца при подборе селективных сред было установлено, что на

6-8 неделе от начала культивирования, все используемые антибиотики в разной степени ингибировали процесс побегообразовая. В контроле выход, регенерантов составил 71 %. Добавление в среду 25, 50, 100 и 200 мг/л Km снижало выход регенерантов в 1,3; 1,3; 5,5 и 50 раз соответственно. Действие канамицина (Х1) на образование побегов было наиболее значимым (R=0,90) и доказано из множественного линейного уравнения плоскости регрессии: Y= 65,2 - 0,36 Х1 - 0,001 Х2 + 0,003 ХЗ. Клафоран (Х2) и карбенициллин (ХЗ) практически не оказывали отрицательного влияния на индукцию побегов.

В результате исследований было выявлено, что отбор предположительно трансформированных эксплантов льна-долгунца эффективнее проводить на селективных питательных средах, содержащих 50-100 мг/л канамицина, 200 мг/л карбенициллина и 200 мг/л клафорана и получено 29 растений-регенерантов.

Рис. 1. ЫРТ-П -активность трансгенного каллуса льна-долгунца: 1 -экстракт бактериальных клеток, содержащих ЫРТ:И; 2,6 - экстракты из нетрансформированных тканей льна (контрольные образцы);

. 3,4,5,- экстракты из каллусной ткани льна, трансформированные штаммом А 281 (р"ПВо 542) рйА 482; 7 - экстракт каллусной ткани гербицидоустойчивой формы льна БТГ-ГУ-10 (Я4 № х Дашков-ский2).

Поскольку селекция на канамицин не дает полной гарантии получения трансгенного каллуса и побегов, после культивирования на среде с канамицином, их дополнительно проверяли на ^Т-Н-активность. Из трех проанализированных образцов, инфицированных плазмидой А 281 (р"ПВо 542) рвА 482, положительный сигнал давали два трансформанта (рис. 1). В трансгенном каллусе (дорожки 3, 4, 5) МРТ-И - активностью обладал белок с такой же электрофоретической подвижностью, как и бактериальный фермент (дорожка 1).

1

2 3 4 5 6 7

Оценка устойчивости льна-долгунца к канамицину и гербицидам

Экспресс-оценка льна в культуре ткани на устойчивость к канамицину Гипокотильные сегменты длиной 8-10 мм, полученные от побегов, в стерильных условиях помещали на агаризованные питательные среды, содержащие 50-300 мг/л канамицина. В течение последующих 30-ти суток наблюдали за регенерационной активностью исследуемых эксплантов. На основе эксплантов трансгенных форм льна (12, \Л/, Б-1) на различных канамициносодержащих средах была отмечена повышенная морфогенетическая активность по сравнению с обычными сортами льна ( Белинка, ГМогПп).

Таблица 2

Морфогенез льна на селективных средах (п=100) _

Концентрация канамицина, мг/л

Генотип 0 50 100 200 300 г II

число почек и побегов, шт/эсп

. опыт 1

Белинка 1.35 0 0 0 о

Б-1 1.15 0.95* 0.25 0 0 -0.84 70.69

12 1.65 1.00» 1.00* 0.70* 0.5* -0 89 79 21

\У I 35 0.75* 0 25 0 2 0 0 -0.72 52,16

1.20 0.05 0 0 0 -0 69 44 80

НСР 0.5 0 70 0 43 061 0.39

опыт 2

Белинка 1.45 0 0 0 0

12 1 50 1.10* 0 80* 0.80* 0 60* -0 84 70,25

Р1 12 X Белинка 1.25 0.25 0 0 0 -0 69 47 60

Р2 12 X Белинка 1 45 0.40* 0.35* 0 0 -0.74 54.66

Р1 БелинкаX12 1.35 035 0.25* 0 0 -0 78 61.18

Р2 Белинка X 12 1.40 0.20 0.15 0 0 -0.68 46.10

НСР 0 5 0.40 0 24

Примечание: * - достоверно на 5% уровне.

Особенно выделялась форма 12. Индукция новообразований на основе ее эксплантов была самой высокой. Даже при наличии в питательной среде 200-300 мг/л канамицина, на каллусе образовывались почки и

лрбеги (табл. 2). У формы Б-1, полученной в результате трансформации сорта льна-долгунца Белинка A. tumefaciens штамма LBA 4404 PB1121, почки и побеги образовывались на среде, содержащей 50 мг/л и 100 мг/л канамицина. У сортов льна Белинка и Norlin регенерация наблюдалась только в контроле.

При тестировании гибридов льна первого и второго поколений комбинаций 12 х Бе-инка и Белинка х 12 , а также их родительских форм (Белинка и 12) было отмечено, что наибольшая регенерационная активность при культивировании гипокотилей на селективных средах, наблюдалась у исходной трансгенной родительской формы 12 (табл. 2).

У другого родителя (Белинка) она отсутствовала, а у гибридов льна первого и второго поколений обеих комбинаций была зафиксирована промежуточная реакция на канамицин. На основе их гилокотильных сегментов при наличии в среде 50 мг/л и 100 мг/л канамицина формировался плотный каллус светло-зеленой окраски, а на нем - почки и побеги. Такая реакция у гибридов льна на действие канамицина свидетельствует об экспрессии у них гена канамициноустойчивости (NPT-II), переданного от устойчивого родителя (12).

Экспресс-оценка льна на устойчивость к канамицину и гербицидам при проращивании семян Одним из эффективных в селекции является метод отбора на стадии проростков (Кутузова С.Н.,1993; Хотылева Л.В., 1989; Войтехова В.А., 1987), который на самых ранних стадиях онтогенеза позволяет отбирать нужные селекционеру генотипы. Исходя из этого, семена трансгенных генотипов льна проращивали на растворах с канамицином (500 мг/л, 1000 мг/л) или гербицидами (50-200 мг/л): Пре-парат-1, Метрон.

Концентрации канамицина подбирались экспериментально, а гербицидов - исходя из оптимальной дозы, рекомендованной к применению (10 г/га по д.в.). В контроле семена проращивали на стерильной дистиллированной воде. На седьмые сутки проводили учет проросших семян.

При прорастании семян на растворе канамицина с концентрацией 500 мг/л у сортов льна Белинка, Дашковский 2, Р-736, McGregor, Norlin было отмечено снижение их всхожести по отношению к контролю в среднем на 50 %. Увеличение селективной нагрузки в два раза привело практически к полной потере всхожести у перечисленных сортов.

У трансгенных форм 12, W и L при наличии 500 мг/л канамицина, всхожесть семян была на уровне 83-92 %, а при 1000 мг/л канамицина -60-88 %. Аналогичная тенденция по устойчивости изучаемых генотипов просматривалась по длине корешков.

Оценка гибридов первого и второго поколения комбинаций 12 х Белинка и Белинка х 12, а также их родительских форм показала, что у ус

Еелинко 12*Бел. Ьел*12

12 Р2 12-бел. Р2 Бел*12

Концентрация канамицина, мг/л: а - о ш - 5оо

-1000

Рис. 2. Влияние канамицина на всхожесть семян л' на у гибридов первого и второго поколений (п = 200).

| оо

а о

ш £ о

ё со

80

60|

40 20 О

Бедикко 1 Г1 12'Бел. I Г—а." 12

12 Р2 12"5ел. Бел/Ч2

Концентрация Препарата -1 мг/л:

т о ^-100 ^-2оо

Рис. 3. Влияние гербицида Препарат -1 на всхожесть семян у гибридов льна (п = 200).

тойчивых родителей и у устойчивых гибридов наблюдался один тип реакции на действие канамицина и хлорсульфурона (Препарат-1). Потеря всхожести их семян на фоне антибиотика по отношению к контролю была на уровне 25% (500 мг/л Кт) и 45% (1000 мг/л Кт). У исходного сорта льна-долгунца Белинка, она была равна нулю (рис. 2).

На растворе 100 мг/л Препарата -1 у гибридов Р1 12 х Белинка и )г2 12 х Белинка всхожесть семян была соответственно 76 % и 73 %, а у гибридов Белинка х 12 и ?2 Белинка х 12 была одинаковой и составляла 72 % (рис. 3). При наличии в растворе 200 мг/л Препарата-1, всхожесть семян у гибридов П и Г2 в комбинации 12 х Белинка была на уровне исходного устойчивого родителя (12) и равнялась 69 %, а в обратной комбинации Белинка х 12 соответствовала 50 %. Такая реакция гибридов на действие канамицина и Препарата-1 указывает на наличие у них устойчивости к канамицину и хлорсульфурону, переданную им от устойчивых трансгенных родителей.

Данные исследования позволили отобрать из 32 изучаемых форм льна - 18 устойчивых к хлорсульфурону. Их семена, проросшие на растворе с концентрацией 200 мг/л Препарата -1 укореняли в почву и выращивали до получения семян, которые в последствие подвергали повторной оценке с целью отбора более устойчивых к гербициду форм.

В результате чего было выделено 7 высокоустойчивых к хлорсульфурону форм льна (БТЛ-ГУ-1, БТЛ-ГУ-2, БТЛ-ГУ-3, БТЛ-ГУ-4, БТЛ-ГУ-6, БТЛ-ГУ-7, БТЛ-ГУ-10), некоторые из них также показали повышенную устойчивость к метсульфуронметилу при проращивании на растворах с концентрациями 100-200 мг/л Метрона.

Оценка форм льна-долгунца на устойчивость к гербицидам группы хлорсульфу - рона в вегетационном опыте. Потомство растений, прошедших тестирование на гербицидоустойчивость в лаборауорых условиях, изучали в вегетационном опыте на фоне гербицида.

Исследования позволили выявить, что самым жестким фоном для отбора форм льна с повышенной устойчивостью к хлорсульфурону было внесение 50 г/га (по д.в.) Препарата-1 в почву перед посевом и обработка растений в фазу "всходов" (1-2 см). Была подтверждена повышенная устойчивость к гербициду у форм БТЛ-ГУ-1, БТЛ-ГУ-2, БЛТ-ГУ-3, БТЛ-ГУ-4, БТЛ-ГУ-5, БТЛ-ГУ-6, БТЛ-ГУ-7. В данных условиях у перечисленных образцов общая высота растений снизилась в.среднем на 10 %, а число семян с одного растения и содержание волокна в стебле остались на уровне контроля (табл. 3). Рост растений исходных родительских и стандартных сортов льна-долгунца был почти полностью ингибирован действием гербицида. Лен плохо всходил, наблюдалась гибель проростков, отмечался хлороз листьев, резкая задержка в росте и развитии. В даль

нейшем от основания стебля отрастали очень слабые и низкорослые с уменьшенным соцветием, редкими листьями побеги. На стебле сформировалось не более 1 коробочки.

Таблица 3

Характеристика растений льна, подвергшихся предпосевной обработке Препаратом-1.

1995 г.

Генотип Доза Препарата, - 1, г/га Число растен ий, шт. Высота растений, см Техн. длина раст., см Масса техн. части раст., мг Число коробочек с 1 раст , шт. Число семян с 1 раст., шт. Масса волок на, мг Содержание волокна в стебле, %

А-29 1ICP05 0 50 17 17 82.3 27 0 22.3 73 5 19.0 25 2 506,8 41.0 2 8 0.2 23 5 0 144,0 0 28.4 0

БТЛ-ГУ-3 НСР05 0 50 19 19 72.5 69.2 4.3 58 8 53 1 6 3 436.2 632.3 76 8 4 47 0 70 2 ¡21 0 224 1 27.7 28.2

БТЛ-ГУ-6 НСР05 0 50 20 20 80.0 70 0 7.1 66 0 56 2 8 3 589 5 556.7 7.8 10.7 3 0 57.3 78.3 10.8 199 8 191.9 3.2 29.5 29,0 1.6

Примечание: * - семена льна-долгунца сорта Алексим не проросли; ** -достоверно на 5 % урозне.

У относительно устойчивых к Препарату-1 трансгенных форм льна, в целого, общая высота растений снизилась на 20-30 %, а семенная продуктивность с 1 растения на 23 %. Из них на данном селективном фоне наряду со слабыми, неустойчивыми, были отобраны единичные высокорослые растения, которые в экстремальных условиях не снижали свою продуктивность по семенам и волокну в сравнении с контролем (табл.4). Так же было замечено, что они превосходили типичные растения в контроле по массе технической части и семенной продуктивности, что было

Таблица 5

Характеристика растений формы льна-долгунца БТЛ-ГУ-10-1, подвергшихся послевсходовой обработке гербицидом Препарат-1 (п=20), 1996 г.

Конц-я Высота Техннч. Масса Число Число Масса Содер-

Генетт Препа- расте- длина техн коробо- семян с волок жание

рата - ний,см растен , часн чек с 1 1 рас- -на, волокна.

1. г/га см раст.. расте- тения, мг %

мг ния, шт. шт.

Алека 1м 0 90.8 73.6 1012.5 10.0 64.3 354 3 35.0

50 32.0 29.0 110.5 0 0 - -

А-29 0 84.2 70.2 877.5 8 1 60.2 297.3 34.0

50 28.0 23.0 104 6 0 0 - -

БГЛ-ГУ- 0 87.7 79.9 841.0 11.3 73.5 267.5 31.8

10-1 50 64.7» 49.9* 734.9* 12.1 89.7 224.2 30.5

НСР 0.5 28.5 19.5 283.5

Р 5.2 2.3 8.9

Примечание: * -достоверно на 5 % уровне значимости при сравнении на фоне гербицида (Ят=2,09).

Таблица 6

Коэффициенты корреляции (г) для сравнительной характеристики методов оценки на гербицидоустойчивость. 4

Сравниваемые методы оценки г гг

По ре-енерационной способности гипокотильных сегментов-по всхожести семян 0.77*' 2.96

По регенерационной способности пшокотнльных сегментов-по продуктивности растений 0.68* 2.95

По всхожести семян - по продуктивности растений 0.65* 2.70

Примечание: * - достоверно на 5 % уровне (Гг =2.37)

Таблица 7

Характеристика лучших гербицидоустойчивых форм льна-долгунца по основным хозяйственно-ценным признакам 1996г.

Высота растений, Техническая длина, Масса технической части, Число короб-чек с 1 растен, Число семян с 1 растения, Содержание волокна,

Генотип см % к исх. долгунц. родителю см % к исх. долгунц. родителю мг % к исх. долгунц. родителю шт % к исх. долгунц. родителю шт. % к исх. долгунц. родителю У. % к исх. долгунц. родителю

БТЛ-ГУ-1-1

(Белинка X \У) 73.3 92.4 69.0 95.3 326.0 100.2 2.3 115.0 9.5 104.0 24.6 86.3

БТЛ-ГУ-4-1

(Белинха X \У) 68.1 85.9 64.9 90.0 287.0 88.2 2.1 105.0 14.0 153.8 24.4 85.6

БТЛ-ГУ-6-1

(12 X Белинка) 65.3 82.3 61.9 86.2 238.8 73.8 2.2 110.0 12.5 ¡37.4 23.8 85.3

Белинка 79.3 41.0 335.6 2.2 9.1 28.5

БТЛ-ГУ-10-1

(Дашк. 2 X V/) 75.3 92.2 70.3 92.6 317.5 97.3 3.0 107.1 20.5 166.6 28.9 94.4

БТЛ-ГУ-3-1

(V/ X Дашк. 2) 76.4 93.6 71.1 93.7 396.0 121.3 3.8 135.7 23.3 189.4 26.2 85.6

Дашкозскин 2 81.6 75.9 326.2 2.8 12.3 30.6

V/ 60.2 53.0 274.3 2.4 15.0 22.6

12 64.7 60.7 296.0 2.3 14.7 19.3'

Алексии (£0 74.6 61.0 335.6 2.2 13.2 36.7

Сравнение различных методов оценки сортов и форм льна-долгунца на гирбицидоустойчивость свидетельствует о том, что ее можно осуществлять как вегетационным, так и лабораторным методами. Коэффициенты корреляции составили 0,77; 0,65; 0,68 (табл.6).

Изучение гербицидоустойчивых форм льна-долгунца по основным хозяйственно-ценным признакам

Лучшие формы льна, отобранные из Р4 и Р5 по устойчивости к хлорсульфурону были оценены по хозяйственно-ценным признакам в условиях луночного посева (табл. 7). Стандартом являлся сорт льна-долгунца Алексим. При сравнении с исходными сортами льна-долгунца было отмечено, что гербицидоустойчивые формы уступают им по общей высоте на 8-17 %, а по массе технической части растений некоторые из * них (БТЛ-ГУ-1-1) находятся на уровне или несколько превосходят (БТЛ-ГУ-3-1) долгунцовых родителей. По отношению к стандарту, они уступали по высоте в среднем на 2-12%, а некоторые (БТЛ-ГУ-7-1, БТЛ-ГУ-18-1, БТЛ-ГУ-10-1, БТЛ-ГУ-3-1) были на его уровне. По семенной продуктивности у всех гербицидоустойчивых форм наблюдалось преобладание урожайности семян с одного растения по отношению к исходным родителям льна-долгунца и стандарту в среднем на 50 %. Содержание волокна в стебле у гербицидоустойчивых форм по сравнению с долгунцовыми родителями было несколько ниже (на 15-25 %) и в среднем составляло 26,0 %. У формы БТЛ-ГУ-10-1 (\Л/ х Дашковский 2) было на уровне 28.9 %. Такое содержание волокна в стебле растений, позволяет отнести их к долгунцовому типу.

ОСНОВНЫЕ ВЫВОДЫ

1. Созданы формы с повышенной устойчивостью к канамицину и гербицидам группы хлорсульфурона, не уступающие по продуктивности стандартному и родительским сортам льна-долгунца, которые могут использоваться в качестве исходного материала в селекции.

2. Проведена трансформация льна-долгунца с помощью А. {ипг^асюпэ на примере введения маркерного гена ЫРТ-И, придающего растениям устойчивость к канамицину. Получены растения-регенеранты. Экспрессия введенного гена доказана наличием активности неомицин-фосфотрансферазы II (ЫРТ-И).

З.Отимизированы условия получения трансгенных растений с помощью A. tumefaciens применительно ко льну-долгунцу: определены условия (способ инокулирования, возраст эксплантов, состав питательной среды и режим ее стерилизации) для повышения регенерационной активности тканей in vitro; подобраны концентрации канамицина (50 мг/л и 100 мг/л), клафорана (200 мг/л) и карбенициллина (200 мг/л), позволяющие эффективно вести отбор трансгенных эксплантов.

4. Разработана методика экспресс-оценки в культуре ткани, с помощью которой на фоне 50-200 мг/л канамицина можно отбирать устойчивые генотипы льна.

5. Использование методики экспресс-оценки при проращивании семян на растворах канамицина (500 мг/л, 1000 мг/л ) или гербицидов: Препарат-1 (100-200 мг/л), Метрон (50-100 мг/л) способствует отбору устойчивых форм льна.

6. Изучение растений льна с использованием жесткого гербицидно-го фона (50 г/га (по д.в.) Препарата-1, внесенного в почву перед посевом, и в период "всходов") позволило выделить формы с повышенной устойчивостью к хлорсульфурону, а из относительно устойчивых - отобрать единичные растения с повышенной продуктивностью. В результате обработки гербицидоустойчивых форм льна-дол1унца Препаратом-1 в дозе 75 г/га (по д.в.) в фазу "елочки", получены жизнеспособные растения, которые формировали семена.

7. У устойчивых родительских форм и устойчивых гибридов льна, при оценке в культуре ткани, проростков семян и вегетирующих растений, наблюдалась одинаковая реакция на действие селективного агента (канамицин, Препарат-1, Метрон), что свидетельствует о передаче генов устойчивости к канамицину (NPT-II) и гербициду (ALS) от трансгенных родителей гибридам. Трансгенная природа гербицидоустойчивой формы льна БТЛ-ГУ-10 доказана наличием активности неомицин-фосфотрансферазы II (NPT-II).

8. При скрещивании сортов льна-долгунца с трансгенными формами масличного льна, общая высота растений у гибридов первого поколения наследовалась промежуточно, уклоняясь при этом в сторону высокорослого родителя, а по семенной продуктивности в сторону высокоурожайного по семенам. Содержание волокна в стебле чаще всего наследовалось по типу неполного доминирования, уклоняясь при этом в сторону менее волокнистого родителя.

9. Оценку образцов пЪ устойчивости к гербицидам можно осуществлять как вегетационным, так и лабораторным методами (in vitro).

Предложения для селекционной практики

1. Для создания сортов льна-долгунца, устойчивых к гербицидам группы хлорсульфурона в качестве исходного материала использовать формы: БТЛ-ГУ-1, БТЛ-ГУ-2, БТЛ-ГУ-3, БТЛ-ГУ-4, БТЛ-ГУ-5, БТЛ-ГУ-6, БТЛ-ГУ-7, БТЛ-ГУ-10 и др.

2 Для повышения эффективности селекционнной работы при создании устойчивых форм льна-долгунца использовать методику оценки на селективных фонах при проращи-вании семян (100-200 мг/л Препарата-1; 50-100 мг/л Метрона) и вегетирующих растений (50 г/га по д.в. Препарата-1, внесенного в почву перед посевом или в фазу "всходов").

3. Использовать в селекционной практике адаптированный ко льну-долгунцу метод получения трансгенных растений, основанный на генетической трансформации Agrobacterium tumefaciens.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Поляков A.B., Чикризова О.Ф. Влияние ауксинов на ризогенез у побегов льна Н Сб. научн. трудов ВНИИЛ.- Торжок, 1991,- № 27,- С.20-23.

2. Поляков A.B., Чикризова О.Ф. Влияние способа стерилизации питательной среды и регуляторов роста на морфогенез льна-долгунца в культуре ткани // Сб. научн. трудов ВНИИЛ.- Торжок, 1994,- № 28,-С.131-135.

3. Чикризова О.Ф. Выделение растительной и ллазмидной ДНК для электропорации льна // Сб. научн. трудов ВНИИЛ.- Торжок, 1994,- № 28.-С.135-138.

4. Чикризова О.Ф., Поляков A.B., Кудрявцев H.A. Создание генои-сточников льна-долгунца, устойчивых к гербицидам // Тез. докл. Всероссийского съезда по защите растений " Защита растений bv условиях реформирования агропромышленного комплекса: экономика, эффективность, экологичность " ( Санкт-Петербург, декабрь 1995г. ).- Санкт-Петербург, 1995,-С.268.

Чикризова О.Ф., Поляков A.B. Оптимизация условий получения трансг. 'X растений льна-долгунца, устойчивых к гербицидам группы хлорсульфурона // Сельхоз. биология,- 1996,- № 3.- С. 117-121.

6.Чикризова О.Ф., Поляков A.B., Кудрявцев H.A. Оценка устойчивости льна к хлорсульфурону на селективных фонах, получение генои-сточников по этому признаку // Агрохимия.- 1997,- №1.- С.72-75.